JP6082141B2 - Dna試料の分類 - Google Patents
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Description
(A)メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及び/又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによりDNA試料を消化すること;
(B)少なくとも1つが制限遺伝子座である、少なくとも2つのゲノム遺伝子座を増幅する、消化されたDNA上でPCRを実施すること;
(C)各増幅産物のシグナル強度を測定すること;
(D)前記遺伝子座により生成されたシグナル強度間の「シグナル比」を計算すること;
(E)種々のDNA区分に対応する基準値に対するシグナル比を比較すること、
を含む、DNA試料を分類する方法であって、ここで、基準値が前記シグナル比に最も対応する区分が、DNA試料の区分であると判定される。すなわち、例えば、特定のDNA区分の基準値の値に対するシグナル比の値の近似値は、DNA試料の分類上の区分を示す。従って、シグナル比が基準区分の値に近い値を有する場合、−シグナル比及び基準値の間の値における類似性に基づいて−試験を行ったDNA試料が、特定の型の区分由来である可能性が高い。従って、特定のDNA区分についての特定の基準値に最も対応し、又は最も近いシグナル比は、そのDNA試料が特定のDNAの分類上の起源由来であると期待させる。例えば、シグナル比及び区分基準値を比較する方法については、例えば、試験DNA試料を1つ以上の基準区分に分類し得る確率分布及び尤度確率の計算方法を説明する、アルゴリズム及びソフトウェアと標題の付いた項を参照されたい。
(A)メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及びメチル化依存性制限の少なくとも1つでDNA試料を消化すること:
(B)前記消化されたDNAから少なくとも2つの遺伝子を増幅することであって、少なくとも1つの遺伝子座が制限遺伝子座であり;
(C)各増幅産物のシグナル強度を測定すること;
(D)増幅産物間のシグナル強度間のシグナル比を計算すること;及び
(E)種々のDNA区分の基準値に対するシグナル比を比較すること、
を含むDNAの分類法であって、特定のDNA区分の基準比の値に対するシグナル比の値の近似値が、DNA試料の分類上の起源を示す方法である。
(1)PowerPlex(登録商標)16 HS(カタログ番号DC2100、DC2101)、PowerPlex(登録商標)16(カタログ番号DC6530、DC6531)、PowerPlex(登録商標)2.1(カタログ番号DC6470、DC6471)、PowerPlex(登録商標)16 BIO(カタログ番号DC6540、DC6541)及びPowerPlex(登録商標)ES Systems(カタログ番号DC6730、DC6731)からなる群から選択されるPromega Corporationの市販キット;
(2)SGM、SGM+、AmpFlSTR Identifiler、AmpFlSTR Profiler、AmpFlSTR ProfilerPlus、AmpFlSTR ProfilerPlusID、AmpFlSTR SEfiler、AmpFlSTR SEfiler Plus、AmpFlSTR Cofiler、AmpFlSTR Identifiler Direct、AmpFlSTR Identifiler Plus、AmpFlSTR NGM、AmpFlSTR Y−filer、及びAmpFlSTR Minifilerからなる群から選択される、Applied Biosystemsの市販キット;又は
(3)Investigator ESSPlex、Investigator ESSPlex SE、Investigator Nonaplex ESSPlex、Investigator Hexaplex ESSPlex、Investigator Triplex AFS QS、Investigator Triplex DSF、Investigator IDplex、Investigator Decaplex SE、Investigator HDplex、Investigator Argus X−12、Investigator Y−12 QS、Investigator DIPplexにより入手できる。
(1)D3S1358/D18S51、
(2)D3S1358/D7S820、
(3)D3S1358/Penta_D、
(4)D3S1358/TPOX、
(5)D3S1358/FGA、
(6)TH01/Penta_D、
(7)D21S11/D18S51、
(8)D21S11/D7S820、
(9)D21S11/Penta_D、
(10)D21S11/AMEL、
(11)D21S11/TPOX、
(12)D21S11/FGA、
(13)D5S818/D18S51、
(14)vWA/D18S51、
(15)D5S818/Penta_E、
(16)vWA/Penta_E、
(17)D5S818/D7S820、
(18)D5S818/Penta_D、
(19)D5S818/TPOX、
(20)D5S818/FGA、
(21)D13S317/D7S820、
(22)D13S317/Penta_D、
(23)D13S317/TPOX、
(24)D13S317/FGA、
(25)D16S539/D7S820、
(26)CSF1PO/D7S820、
(27)vWA/D7S820、
(28)D8S1179/D7S820、
(29)D16S539/TPOX、
(30)D16S539/FGA、
(31)CSF1PO/Penta_D、
(32)CSF1PO/TPOX、
(33)vWA/Penta_D、
(34)AMEL/TPOX、
(35)AMEL/FGA、
(36)vWA/D8S1179、
(37)vWA/TPOX、
(38)vWA/FGA、
(39)D8S1179/TPOX、及び
(40)D8S1179/FGA。
(B)分類毎に、ステップ(A)において得られた確率スコアの結果である、カテゴリ尤度スコアを計算する;及び
(C)可能性のあるカテゴリ毎のカテゴリ尤度スコアを、全てのカテゴリ尤度スコアの合計値で除算し、尤度スコアを正規化する;
ここで、各カテゴリの信頼性は、正規化されたカテゴリの尤度スコアである。
SD1f(AAGAGCCCATCAGGCAGGTC);
SD1r(GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
SD2f(CTCCAGAACTGGAACTTCCTG);
SD2r(GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
SD3f(TGGAGGACAATGCCCTGGTG);
SD3r(GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
SD4f(CCCTCCGAGTGGCCAGCAG);
SD4r(GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
SD5f(CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG);
SD5r(ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
SD6f(TACAGACAAATCACTCAGCAGC);及び
SD6r(GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT);
(b)反応バッファ;
(c)Hha1制限エンドヌクレアーゼ;
(d)DNAポリメラーゼ
(d)分類作業のためのプロトコルを記載した書類
別の実施形態では、キットには制御DNA試料がさらに含まれる。
(1)SD1f(AAGAGCCCATCAGGCAGGTC)及びSD1r(GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
(2)SD2f(CTCCAGAACTGGAACTTCCTG)及びSD2r(GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
(3)SD3f(TGGAGGACAATGCCCTGGTG)及びSD3r(GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
(4)SD4f(CCCTCCGAGTGGCCAGCAG)及びSD4r(GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
(5)SD5f(CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG)及びSD5r(ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
(6)SD6f(TACAGACAAATCACTCAGCAGC)及びSD6r(GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT)。
(a)少なくとも1つの精液特異的遺伝子座を増幅するためのプライマー
(b)DNAプロファイリングに使用される少なくとも1つの遺伝子座を増殖するプライマー
(c)反応バッファ
(d)Hha1制限エンドヌクレアーゼ
(e)DNAポリメラーゼ
(f)分類実施のためのプロトコル文書。
(a)少なくとも1つの精液特異的遺伝子座を増幅するためのプライマー
(b)DNAプロファイリングに使用される少なくとも1つの遺伝子座を増幅するためのプライマー。
(a)以下の通り表記された遺伝子座を増幅するための順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーミックス
1.L91762(順方向GCAGCAGGCCGCGGAGAAG(FAM);逆方向AGCAGCTGTGCCGGGCCAG)
2.L68346(順方向CAGCAACAGCACCCAGCTTG(JOE);逆方向CACAGGCTCAGTCGCGGATC)
3.L50468(順方向AGGAAACCTCAGTAGCAAAATTG(JOE);逆方向GCGAGACTTTAGGTGTGCATC)
4.L14432(順方向CGTAGGCTGCGGTGAGCTC(FAM);逆方向GATCCATGCCCGCTGGGATG)
5.L4648(順方向CAGCCTAGACGTCAAGTTACAG(JOE);逆方向ACGACCTCCGGATCCAACTG)
6.L39664(順方向CCCAGCTGGTTGGACATGTTG(FAM);逆方向CACTTCCTTCGTGGACGCC)
7.L30139(順方向GAGAAGCGGGAGGATGAGAC(FAM);逆方向CCGCATCTCCTCCGTCCTG)
8.L55429(順方向GCCTTCAGCAGGAAGTCCAC(JOE);逆方向CCTGTGCCTCACACAGACTC)
9.L62086(順方向GTGCATGGTGTCTGGTACTTC(FAM);逆方向GAAGCTCTCGTGGACTACTTG)
10.L76138(順方向CAGCCTGCTCTTCACTGCAG(JOE);逆方向AGAGGCCGATGAAGCCGTAG)
11.L15952(順方向CTCCCTGATTTACGACAAGTTC(FAM);逆方向GACAGTATGCTGATGCTTCTTG)
12.L36599(順方向AAGGGCAGAGTTCCGCTGTC(FAM);逆方向CGGATGCAGGAGGATCCTAG)
13.L26688(順方向CGGACCAGATTGCTGGTCAC(JOE);逆方向CGACCTTGCCAGATGTTTGAC)
14.L81528(順方向AGCCTCATCCACACTGACCAG(JOE);逆方向TCAGAGCTCTCCTATCTGGAC)
15.L36556(順方向GCCAGGCCGTTGATGATGAC(JOE);逆方向GAATATGGAGCCCTGGGCAG)
(b)反応バッファ
(c)Hha1制限エンドヌクレアーゼ
(d)DNAポリメラーゼ
(e)分類を行うためのプロトコル文書。
(A)各DNA試料をメチル化感受性及び/又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで消化する;
(B)少なくとも1つが制限遺伝子座である、少なくとも2つのゲノム遺伝子座を増幅する、消化された各DNAに対しPCRを行う;
(C)DNA試料毎に、各増幅産物のシグナルの強度を決定する;
(D)DNA試料毎に、遺伝子座により生成されるシグナルの強度間の「シグナル比」を算出する;
(E)対応するシグナル比の定量的比較を行うことによりDNA試料間の異なるメチル化度を算出する。
1.GCAGCAGGCCGCGGAGAAG;
2.AGCAGCTGTGCCGGGCCAG;
3.CAGCAACAGCACCCAGCTTG;
4.CACAGGCTCAGTCGCGGATC;
5.AGGAAACCTCAGTAGCAAAATTG;
6.GCGAGACTTTAGGTGTGCATC;
7.CGTAGGCTGCGGTGAGCTC;
8.GATCCATGCCCGCTGGGATG;
9.CAGCCTAGACGTCAAGTTACAG;
10.ACGACCTCCGGATCCAACTG;
11.CCCAGCTGGTTGGACATGTTG;
12.CACTTCCTTCGTGGACGCC;
13.GAGAAGCGGGAGGATGAGAC;
14.CCGCATCTCCTCCGTCCTG;
15.GCCTTCAGCAGGAAGTCCAC;
16.CCTGTGCCTCACACAGACTC;
17.GTGCATGGTGTCTGGTACTTC;
18.GAAGCTCTCGTGGACTACTTG;
19.CAGCCTGCTCTTCACTGCAG;
20.AGAGGCCGATGAAGCCGTAG;
21.CTCCCTGATTTACGACAAGTTC;
22.GACAGTATGCTGATGCTTCTTG;
23.AAGGGCAGAGTTCCGCTGTC;
24.CGGATGCAGGAGGATCCTAG;
25.CGGACCAGATTGCTGGTCAC;
26.CGACCTTGCCAGATGTTTGAC;
27.AGCCTCATCCACACTGACCAG;
28.TCAGAGCTCTCCTATCTGGAC;
29.GCCAGGCCGTTGATGATGAC; 及び
30.GAATATGGAGCCCTGGGCAG
31.AAGAGCCCATCAGGCAGGTC
32.GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG
33.CTCCAGAACTGGAACTTCCTG
34.GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC
35.TGGAGGACAATGCCCTGGTG
36.GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC
37.CCCTCCGAGTGGCCAGCAG
38.GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG
39.CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG
40.ACGTAGAAGGACCCGAGGAC
41.TACAGACAAATCACTCAGCAGC
42.GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT
43.GGACGAGTTAACTTCCTTAATTTC
44.GTTTCTTCGCGGAACCTGGTTTAACTTC。
1.L91762(順方向GCAGCAGGCCGCGGAGAAG (FAM);逆方向AGCAGCTGTGCCGGGCCAG);
2.L68346(順方向CAGCAACAGCACCCAGCTTG(JOE);逆方向CACAGGCTCAGTCGCGGATC);
3.L50468(順方向AGGAAACCTCAGTAGCAAAATTG(JOE);逆方向GCGAGACTTTAGGTGTGCATC);
4.L14432(順方向CGTAGGCTGCGGTGAGCTC(FAM);逆方向GATCCATGCCCGCTGGGATG);
5.L4648(順方向CAGCCTAGACGTCAAGTTACAG(JOE);逆方向ACGACCTCCGGATCCAACTG);
6.L39664(順方向CCCAGCTGGTTGGACATGTTG(FAM);逆方向CACTTCCTTCGTGGACGCC);
7.L30139(順方向GAGAAGCGGGAGGATGAGAC(FAM);逆方向CCGCATCTCCTCCGTCCTG);
8.L55429(順方向GCCTTCAGCAGGAAGTCCAC(JOE);逆方向CCTGTGCCTCACACAGACTC);
9.L62086(順方向GTGCATGGTGTCTGGTACTTC(FAM);逆方向GAAGCTCTCGTGGACTACTTG);
10.L76138(順方向CAGCCTGCTCTTCACTGCAG(JOE);逆方向AGAGGCCGATGAAGCCGTAG);
11.L15952(順方向CTCCCTGATTTACGACAAGTTC(FAM);逆方向GACAGTATGCTGATGCTTCTTG);
12.L36599(順方向AAGGGCAGAGTTCCGCTGTC(FAM);逆方向CGGATGCAGGAGGATCCTAG);
13.L26688(順方向CGGACCAGATTGCTGGTCAC(JOE);逆方向CGACCTTGCCAGATGTTTGAC);
14.L81528(順方向AGCCTCATCCACACTGACCAG(JOE);逆方向TCAGAGCTCTCCTATCTGGAC);
15.L36556(順方向GCCAGGCCGTTGATGATGAC(JOE);逆方向GAATATGGAGCCCTGGGCAG).
16.SD1(順方向AAGAGCCCATCAGGCAGGTC(FAM);逆方向GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
17.SD2(順方向CTCCAGAACTGGAACTTCCTG(FAM);逆方向GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
18.SD3(順方向TGGAGGACAATGCCCTGGTG(FAM);逆方向GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
19.SD4(順方向CCCTCCGAGTGGCCAGCAG(FAM);逆方向GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
20.SD5(順方向CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG(FAM);逆方向ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
21.SD6(順方向TACAGACAAATCACTCAGCAGC(FAM);逆方向GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT);及び
22.L16264(順方向GGACGAGTTAACTTCCTTAATTTC(FAM);逆方向GTTTCTTCGCGGAACCTGGTTTAACTTC)。
本発明は、遺伝子座特異的プライマーを用いるDNA源と商業的に利用可能な酵素との区別を可能とする方法及びアッセイに関する。進歩的アッセイの根本的態様は、特定のDNA源から増幅された少なくとも2つの遺伝子座から生成されるシグナルを比較することであり、それにより、1つの実施形態においては、天然由来であるか又は人工的であるかを示す数的比率が最終的には得られる。本発明のアッセイはまた、例えば、DNAの生理学的又は病理学的に異なる源を区別するため、及び異なる組織を区別するために使用され得る。
その後、組織を同定する遺伝子座のパネルを、蛍光で標識したプライマーを用いて消化されたDNAからPCRにより増幅し、増幅産物の一定分量をキャピラリー電気泳動により分離する。Hha1で消化したDNAを伴う状況において、メチル化レベルのより高い遺伝子座はより効率的に増幅される。その理由は、より多くのDNA分子が消化から保護され、電気泳動で比較的強いシグナルを生成するからである(図1B、遺伝子座A)。逆に、メチル化度のより低い遺伝子座は、低効率で増幅され、電気泳動で比較的弱いシグナルを生成する(図1B、遺伝子座B)。
本発明の技術は、本明細書を通じて記載されるいくつかの定義を用いて本明細書に記載される。定義されないものに関しては、本明細書に記載される技術及び科学用語は全て、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を概して有するものとする。本明細書で使用されているように、特に言及されない限りにおいて、単数形の「a」「an」及び「the」には、複数の言及が含まれる。よって、例えば、「1つの核酸(a nucleic acid)」は、「1つ以上の核酸」について述べている。
2.標的配列のPCR増幅の産物
3.標的の循環配列のローリングサークル増幅(RCA)の産物
4.分子クローンの産物(例えば、大腸菌でクローン化されたプラスミド)
5.1〜4の任意の方法により、又はそれらの組み合わせにより生成された他のDNA断片から集めたDNA断片。係る集合体は、以下の任意の方法(又はそれらの組み合わせ)により達成される。すなわち、アニーリング、連結、重合である。集合化の方法にはまた、DNA分子の切断のステップ(例えば、制限エンドヌクレアーゼ、機械的せん断等)も含まれる
6.PCRによるゲノム全体の増幅(WGA)、及び/又は、プライマー伸長プレ増幅(PEP−PCR)、縮重オリゴヌクレオチドをプライマとするPCR(DOP−PCR)、T7ベースのDNA直線増幅(TLAD)、アダプター連結PCRを含む、連結仲介PCR(LMR)ベースのWGA法による産物
7.複数の置換増幅(MDA)、及び制限並びに補助循環式ローリングサークル増幅(RCA−RCA)によるWGAの産物。Repli−G(Qigen社)及びGenomiPhi(GE Healthcare社)の商用キットが本方法を採用している
8.1〜7の任意の方法による産物の混合物
9.合成(例えば、Ssslメチラーゼ)後に、全産物又は一部産物がin vitroでメチル化される1〜8の任意の方法による産物
10.天然DNAと混合される、1〜8の任意の方法による産物
11.天然DNAと混合される、9の方法による産物。
1つの態様では、本発明は、天然DNA試料と人工DNA試料とを区別する方法を提供する。本発明の一般的スキームは以下の通りである。本方法では、インプットとしてDNA試料を受理する。DNAに対し、1つ以上の生化学的ステップを含む手順を施し、その後シグナル検知を行う。手順の最後のステップにおいて、DNAが天然か人工的かを判断するために、シグナルを解析する。別の態様では、本発明は、DNAプロファイルが天然DNAのものであることを認証するための方法を提供する。本発明の一般的スキームは以下の通りである。本方法は、インプットとして、プロファイリング(例えば、Identifilerで)を経たDNA試料を受理する。DNA試料に対し、1つ以上の生化学ステップを含む認証手順を施し、その後シグナル検知を行う。手順の最後のステップで、DNA試料のプロファイリングと認証の双方から得たデータを解析する。シグナル解析により、DNA試料から得たプロファイルが、天然(in vivo)DNAを表しているか、又は人工的(in vitro)DNAを表しているかどうかを判断する。
ヒトゲノムのメチル化は、5−メチルシトシンの形で起こり、CG配列の一部であるシトシン残基に限定されている(他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されない)。
メチル化特異的PCRは、重亜硫酸塩配列決定法と同じように、重亜硫酸塩処理したDNA上で実施されるが、所望のゲノム領域を配列する必要がないメチル化解析の方法である。代わりに、重亜硫酸塩処理したDNA中の選択領域が、同一のゲノム標的にアニールするよう設計された2セットのプライマーを使用したPCRによって増幅される。プライマー対は、未変換の5−メチルシトシンのみを補完する配列を含むことにより「メチル化特異的」であるよう、また逆に、メチル化されていないシトシンから転換されたチミンを補完して「非メチル化特異的」であるよう設計される。メチル化は、増幅達成における異なるプライマー対の相対的効率により決定される。
メチル化感受性エンドヌクレアーゼによるDNAの消化は、重亜硫酸塩転換を実施する必要なく、ゲノムDNAに直接応用し得るメチル化解析の方法である。この方法は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、メチル化されたDNAを未変化のまま保ちつつ、メチル化されていないDNAのみを消化するという事実に基づいている。消化の後、メチル化レベル、ゲル電気泳動、及び特定の遺伝子座のPCR増幅を含む、多様な方法によってDNAのメチル化レベルを解析し得る。
上述のとおり、本発明の1つの特定のアッセイは、制限消化されたDNAにポリメラーゼ連鎖反応を実施することで生成された、一組の遺伝子座特異的な増幅産物からのシグナル強度の定量的比較に関与する。図1A、B参照。強度の数的比率は、例えばDNA試料が精液又は非精液組織から採取されたかどうかなど、鋳型DNAのカテゴリに対応する。例えば、一実施形態において、遺伝子座1及び遺伝子座2は、蛍光標識したプライマーを使用して増幅し、電気泳動により分離することができ、シグナルの強度は、遺伝子座に対応するピークの相対蛍光単位(rfu)である。図1B、C参照。シグナルの強度は、ソースDNA鋳型から採取した遺伝子座1及び遺伝子座2の増幅の成功度に対応する。2つの増幅産物間のrfuを比較することにより、増幅産物量の比率を反映する比率である、シグナル比を算出することができる。
従って、本発明の1つの態様は、例えば、遺伝子座#1対遺伝子座#2;遺伝子座#1対遺伝子座#3;遺伝子座#1対遺伝子座#4;遺伝子座#2対遺伝子座#3、遺伝子座#2対遺伝子座#4、などの連続した遺伝子座ペア間の比率を算出するために、蛍光PCRによって生成された複数のDNA遺伝子座増幅産物の蛍光強度が互いに比較される「シグナル比」を得ることである。天然に対する人工の性質のDNA試料を検査するためにこの技術を使用する場合、シグナル比増幅反応で使用されるプライマーは、天然DNAにおいて異なってメチル化された遺伝子座ペアを増幅するように選択される(例えば、天然DNAにおいて、第1は90%メチル化され、第2は30%メチル化された、など)。
1.推定遺伝子座の選択は、3つの様式のうちいずれかにおいて実施することができる。
(i)文献において、適切なカテゴリ(例えば異なる組織など)において異なって発現される(mRNAデータ)ことが示された、遺伝子の転写開始部位に最も近い遺伝子座を選択する。
(ii)文献において、異なるカテゴリ間で(例えば組織など)異なってメチル化されることが示された遺伝子座を選択する。
(iii)ランダムなゲノム遺伝子座を選択する。
2.推定遺伝子座のためのプライマーを設計する。
3.推定遺伝子座の「情報性」を経験的に試験する。それぞれの推定遺伝子座に対し、推定遺伝子座ともう1つの推定遺伝子座の間、あるいは、推定遺伝子座と未消化制御遺伝子座の間のシグナル比を算出する。
4.前記アッセイで使用するために「情報価値のある」遺伝子座(例えば、そのシグナル比が、異なるDNAカテゴリにおいて、有意に異なる遺伝子座)を選択する。
本発明の方法の第2の考慮は、メチル化の状況によって、メチル化感受性及び/又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによって切断又は消化されていない遺伝子座を選択することである。例えば、もしその遺伝子座におけるDNAの認識配列がメチル化されていて、DNA鎖を切断することができなければ、エンドヌクレアーゼが選択される。このように、メチル化された遺伝子座(1)と、及びメチル化されていない遺伝子座(2)の関係において、HhaI又はHpaIIのようなエンドヌクレアーゼは、遺伝子座(1)を消化しないが、遺伝子座(2)は消化する。従って、シグナル比アッセイにおける増幅のための遺伝子座の選択は、各遺伝子座内のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列の存在も考慮してよい。
本発明のシグナル比アッセイは、メチル化解析の他のアプローチと比べていくつかの優位性と利点を有し、従って当業者は、このシグナル比アッセイを利用し得る、多様で有利な使用方法を認識するだろう。例えば、アッセイは、鋳型DNAの濃度、サーモサイクラーの製造元、及びPCR条件における変化、及び阻害剤の存在の結果として変動するアンプリコンシグナルレベルの絶対強度に依存する場合に固有の、多様な「ノイズ」因子に対して非感受性である。代わりに、アッセイで算出されるメチル化比率は、そのような因子に依存しない。というのは、解析される2つの遺伝子座が同一の反応において共増幅され、従ってそのような不同性の影響を受けやすいからである。このように、本発明の方法は、ゲノム標的又はアンプリコンの絶対的定量化を必要とせず、またアッセイは、検量線又はいかなる外部制御の必要もない、単一の独立型反応である。
前記解析の迅速性は、例えば、標的遺伝子座の複数ペアの増幅により生成された、多数の増幅産物を分離するためのキャピラリー電気泳動の使用などを考慮すると明白である。上記のとおり、本シグナル比アッセイは、複数の遺伝子座で実施し得る、そしてそれぞれの場合において、シグナル比は、各遺伝子座ペアに対して個別に算出される。例えば、もし4つの遺伝子座(A、B、C、D)が反応において共増幅された場合、例えば、A/B、A/C、A/D、B/C、B/D、C/Dなど、6つの異なるシグナル比が算出され得る。
多様なCODIS、PowerPlex(登録商標)16、及び鑑定で一般的に使用される他の遺伝子座のために本明細書で提供される配列、例えば、配列番号1〜25は、STR鑑定で一般的に使用されるゲノム遺伝子座のものであり、本明細書において、(1)あらゆるシトシン−グアニン(CG)ジヌクレオチドの位置、(2)天然DNA中の遺伝子座におけるすべてのCGジヌクレオチドのメチル化レベル、及び(3)その特定の遺伝子座に対するメチル化感受性及びメチル化依存性制限酵素プロファイルを決定するために解析された。従って、本出願の本文中に含まれる配列表は、当業者に、本発明の比率を生成するアッセイ方法に基づいて使用し得る、特定のメチル化感受性及びメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼの同定に関する指導を提供する。例えば、「vWA」CODIS及びPowerPlex(登録商標)16で増幅された遺伝子座のための751長のヌクレオチド配列である、配列番号8は、1つのみのCGジヌクレオチドを、位置571に含む。そのCG及びそのすぐ隣に接するヌクレオチドは、BssKI、HpaII、Nt.CviPII酵素の認識配列を提供し、配列番号26〜32は、本発明者らによって、天然及び人工DNA試料間で有意に異なる値を持つシグナル比を生成することが発見されたゲノム遺伝子座である。配列番号33〜54は、異なる組織から採取されたDNA試料間で有意に異なる値を持つシグナル比(p=0.05の閾値を使用したKolomogorov−Smirnov試験に基づく)を生成することが、本発明者によって発見されたゲノム遺伝子座である。
一実施形態において、シグナル比及び/又は表現率の算出(例えばDNAプロファイルが天然DNAを表すかどうかを決定するための)は、キャピラリー電気泳動装置上で実行される蛍光PCRの増幅産物のシグナル強度解析に基づいて実施される。キャピラリー電気泳動装置の出力は、二進法のコンピューターファイルである(例えば、アプライドバイオシステムズ社のキャピラリー電気泳動装置の場合はFSAファイル)。このファイルは、各サンプリング時点(データポイントと呼ぶ)の関数としての、各蛍光体の相対的蛍光単位(rfu)であるチャネルデータを含む、キャピラリー電気泳動の実行に関する情報を含む。
1.各色素チャネルのシグナルから、400〜500bpsの範囲でのそのチャンネルの平均rfuレベルとして定義されるベースラインレベルを差し引き、キャピラリー電気泳動装置の分光キャリブレーション法で得られたマトリックスに基づいて、蛍光体間の分光重複を除去する。
2.期待される遺伝子座サイズ、−0.5bp〜+0.5bpの範囲における最大rfuレベルとして定義される、解析される遺伝子座それぞれのrfuレベルを得る。
3.遺伝子座ペア中の第1及び第2遺伝子座のrfuレベル間の比率として定義される、遺伝子座ペア一組の間のシグナル比を計算する。(ゼロ除算を回避するため、50未満のrfuレベルをもつすべての遺伝子座に対し、50rfuのレベルを割り当てる)。
4.工程3で算出された各比率、及び各組織型に対して、測定された比率での参照確率関数の値(以下参照)として定義される確率スコアを算出する。
5.各組織型に対し、工程4で得られたその組織に対する個別の確率スコアの積として定義される、複合確率スコアを算出する。(nは、シグナル比の数を表す)。
6.各組織型に対し、その組織の複合確率スコアと、すべての組織の複合確率スコアの合計との間の比率として定義される、尤度スコア(DNA試料がその組織に由来する尤度を表す)を算出する。最も高い尤度スコアを持つ組織が、その試料の源と考えられる。
ある特定の組織中のある特定の遺伝子座ペアの参照確率関数とは、その組織型の天然DNA試料中で測定されたシグナル比のセットに当てはめたガンマ分布関数である。
鋳型DNAの不完全消化は、試料中の阻害因子の存在の結果発生しうるため、実際の消化レベルの解析をアッセイに組み込むことは有用である。これは、少なくとも1つの「消化された制御遺伝子座」と、少なくとも1つの「未消化の制御遺伝子座」を組み込むことにより達成し得る。消化された制御遺伝子座とは、すべての可能性のある組織中の天然DNAにおいて、メチル化されていないことが知られているゲノム遺伝子座である。未消化の制御遺伝子座とは、すべての可能性のある組織中の天然DNAにおいて、メチル化されていることが知られている遺伝子座か、又はアッセイに使用されるエンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座かの、どちらかである。消化された制御遺伝子座と、未消化の制御遺伝子座間のシグナル比は、アッセイにおける実際の消化レベルと相関している。適切な消化が発生したかどうかを調べることにより(もしそうでない場合は、解析を中止する)、また、遺伝子座の実際のrfuレベルを、完全な消化が起こった場合に得られたであろうrfu値を表す値に変更することにより、前記アルゴリズムはこのような遺伝子座を利用することができる。もし、この変更を実施する場合、シグナル比は、変更されたrfu値から算出する。
A.生体組織の採取
血液(静脈血/月経血)、唾液、精液、皮膚の表皮、尿、及び腟分泌物を志願者から採取した。実験に勧誘したすべての参加者からインフォームドコンセントを得た。
有機抽出を使用して、DNAをすべての試料から採取した。回収したDNA量をQuantifiler(商標登録) Human DNA定量キット(アプライドバイオシステムズ社)と、7300リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ社)を使用して決定した。
ランダムなCpG島(GCコンテント>=0.5であり、また少なくとも8CGsである、>=200bpの領域として定義される;測定された/期待されるCpG比率>0.6に対応する)を、この作業のために開発されたソフトウェアプログラムを使用して調査した。これらからHhaI認識配列を含むCpG島が、最初のスクリーニング用に選択された。HhaI認識配列に隣接するプライマー(18〜28bps)を、温度64〜66℃で、アンプリコンサイズ66〜150bps用に設計した。蛍光標識した順方向プライマー(FAM又はJOE)を、インテグレーテッドDNAテクノロジーズ社(Integrated DNA Technologies)から購入した。各遺伝子型のプールされたDNA試料(それぞれが10個体から採取されたDNAを含む)の増幅により得られたシグナルと比較することにより、遺伝子座の差次的メチル化をペアでスクリーニングした。有意な差次的増幅パターン(すべての組織型において測定された最大のシグナル比が、測定された最小比率の3倍より大きい、として定義される)を示した遺伝子座を、多重化のために選択した。合計で、205の遺伝子座をスクリーニングし、そのうち、38が有意な差次的増幅パターンを示した。これらから、16の遺伝子座を実験で使用した。独立型の組織同定アッセイには、有意なノイズ無く共増幅され得る15の遺伝子座を使用した。複合精液検出及び鑑定アッセイには、2つの遺伝子座(独立型アッセイにも使用したL68346と、L16264)を使用した。
独立型のアッセイ実験において、各DNA試料はHhaIにより消化され、同一の反応においてPCR増幅に付した。反応は、30U HhaI(ニューイングランドバイオラブス社(New England Biolabs))、2.5U AmpliTaq Gold(アプライドバイオシステムズ社)、2.5μg BSA(ニューイングランドバイオラブス社)、各0.2mMのdNTP、各0.1〜0.3μMのプライマー、2.5μl反応緩衝液(150mM Tris−Hcl、15mM MgCl2)、及びDDWから成り、総容量25μlである。複合型組織同定−鑑定実験における反応化合物は、プライマーを除いて、独立型アッセイにおけるものと同一であり、プライマーは、それぞれの0.2μMの精液同定プライマーと、ProfilerPlus(アプライドバイオシステムズ社)の5μlプライマーセットと合わせて使用した。反応(独立型及び複合型アッセイ双方のための)は、GeneAmp(R)PCRシステム9700(アプライドバイオシステムズ社)中で実施し、使用した熱サイクルプログラムは:37℃で15分間、95℃で11分間、続いて94℃で1分を28サイクル、59℃で1分間、72℃で1分間、続いて最終伸長工程の60℃で45分であった。1.5μlの増幅産物、24.5μlのHiDi ホルムアミド(アプライドバイオシステムズ社)、及び0.5μlのROX size standard(アプライドバイオシステムズ社)を含む混合物を、変性させ、(95℃で3分間、その後即座に3分間氷上で)、製造者の指示に従って、ABI 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ社)上で実行した。得られたすべての電気泳動図を、社内で開発されたソフトウェアで解析し、また複合型組織同定−鑑定実験で得られた電気泳動もまた、GeneMapper ID−X解析ソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)を使用して解析した。
組織同定のためのデータ解析は、入力としてfsaファイルを受け入れ、最も可能性が高い源組織を出力する、社内で開発されたソフトウェアにより実施された。混合試料中の精液のパーセンテージの導出は、鑑定遺伝子座(profiling loci)と組織同定遺伝子座に基づいて実施された。鑑定遺伝子座(profiling loci)に基づく導出は、精液の寄与者に対応する対立遺伝子のrfu値の合計を、4つの遺伝子型付けされた対立遺伝子をもつSTR遺伝子座中のすべての対立遺伝子のrfu値の総計で割ることにより実施された。組織同定遺伝子座に基づく導出は、まず混合物のすべての可能なパーセンテージ(未消化のDNAのシグナル比に基づき、1%の増加量で0〜100%)に対する期待されるシグナル比を計算することにより実施され、そして前記アルゴリズムにより、期待されるシグナル比が測定されたシグナル比に最も近い、精液のパーセンテージが提供される。
各試料20ナノグラムを、総反応容積20μl中の、0.01U DNAseI(アンビオン社(Ambion))、2μl 10X DNAseI緩衝液(アンビオン社)により37℃で10分間消化し、続いて75℃で10分間、熱失活した。それぞれの消化されたDNA試料1ナノグラムを、次いで複合型組織同定−鑑定アッセイに付した。
組織型によるDNA分類−独立型アッセイ
本実施例では、本分類方法を「組織同定アッセイ」と命名する。組織同定アッセイは、組織間で異なってメチル化された遺伝子座のパネルを使用し、表1(図7)に示されるように、DNA試料の最も可能性の高い源組織を特定する。アッセイのスキームのひとつを図1Aに示す。問題とする法医学的な試料から得たDNA1ナノグラムを、DNAを認識配列GCGCにおいて、それがメチル化されていない場合のみ切断する(メチル化された目標を未変化に保ったまま)HhaIメチル化感受性制限酵素で消化する。次いで組織同定遺伝子座のパネルを、蛍光標識したプライマーを使用して、消化されたDNAからPCRによって増幅し、一定分量の増幅生成物をキャピラリー電気泳動によって分離する。より高いメチル化レベルをもつ遺伝子座はより高い効率で増幅され(より多くのDNA分子が消化から保護されるからである。)、電気泳動図(図1B、遺伝子座A)において、比較的強力なシグナルを生成する。逆に、より低いメチル化レベルをもつ遺伝子座はより低い効率で増幅され、電気泳動図(図1B、遺伝子座B)において、比較的弱いシグナルを生成する。
シグナル比に影響を及ぼすノイズ因子の解析
実施例1に記載されたアッセイは、組織間で異なってメチル化された遺伝子座の利用に基づいており、それに対するシグナル比の値は一般的に組織特異的である(図1C)。しかし、異なる個体間におけるメチル化レベルの自然な変異性、及び/又はDNA鋳型濃度の差などのPCRに関連する人為的現象の結果として(例えば、ピペット操作エラー及び確率的影響の結果として)、異なってメチル化された組織においても、測定されたシグナル比にはいくらかの重複がある可能性がある。これらの「ノイズ」因子それぞれの影響は、組織間の平均シグナル比の差である「シグナル」との関係において解析された。精液と血液間のシグナル比の値の差が平均10倍である2つの遺伝子座を選択した。1ng及び2ngのDNAを鋳型として用い、異なるPCRを同一の精液試料に実施した。これらの増幅により得られた比率を、互いに、及び異なる血液試料の増幅により得られた比率と比較した。異なるPCRと、異なる量の入力DNAを使用して得られた比率間の差は、異なる組織から得られた比率間の差よりも、一桁以上もより小さかった(図1D)。
複合精液検出及びDNA型鑑定
本実施例では、DNAは、精液及び非精液の2つのうちの1つに分類された。非精液とは精液以外のすべての組織を指す。分類は同一の反応において、DNA型鑑定と一緒に実施される。
経年及び劣化したDNA試料の分類
法医学型試料への応用に対する概念実証として、20ヶ月経過したステイン(コットン上の血液及び精液)から抽出した2つのDNA試料において、独立型の組織同定アッセイ(実施例1に記載)を実施した。両試料は新鮮な試料と同様に良好に増幅し(図5)、前記アルゴリズムは、両試料の組織起源を正確に同定した。劣化したDNA試料をシミュレートするため、2つの追加のDNA試料(血液及び精液)を、部分消化をもたらす条件下において、DNAseIによる消化に付した。これらの試料を次いで、複合型の精液検出及び鑑定アッセイで解析した。DNAseI消化により、両試料中のより大きなSTR中に、それらのプロファイルが部分的であるような、対立遺伝子の脱落が生じた。血液試料中、D3S1358とアメロゲニン対立遺伝子のみが型付けされ、精液試料においては、対立遺伝子の脱落はFGA、D21S11、D18S51、D13S317及びD7S820において測定された(図6)。より小さな組織同定遺伝子座は、期待されるパターンで首尾よく増幅し、前記アルゴリズムは、これらの試料中の精液の存在/不存在を正確に同定した。
複合型鑑定及びDNA分類
この特定のアッセイは、通常のDNA試料鑑定(Promega PowerPlex16キット使用)、及び天然対人工DNAカテゴリへのDNA分類の、双方を使用する。
SR1(TPOX/D8S1179のシグナル比)、SR2(D3S1358/Hypo23のシグナル比)、及びRR(OCA2/D3S1358の表現率)。
これらのパラメーターの閾値を表6に示す。
複合鑑定及びDNA分類(MDA対非MDA)
この特定のアッセイはDNA試料の通常の鑑定(Promega PowerPlex16キットによる)と、MDAカテゴリ(多置換増幅対他の(非MDA)タイプのDNAによって合成された人工DNA)へのDNA分類、双方を使用する。
DNA→PowerPlex16プライマーミックスを使用したマルチプレックスPCR→増幅産物のキャピラリー電気泳動装置上での分離→GeneMapperID−X ソフトウェアでのデータ解析。
RR1(vWA/D18S51の表現率)、RR2(CSF1PO/Penta_Dの表現率)、及びRR3(D21S11/D7S820の表現率)。
複合表現スコアを、以下の通り、これらの3つの比率に基づいて算出した。
CRS=3√R1*R2*R3
複数のMDA試料、及び非MDA試料の解析に基づいて決定された閾値は1.5であり、それゆえ1.5以上のCRS値を有する未知の試料は、「MDA」として分類し、一方、1.5未満のCRS値を有する未知の試料は「非MDA」として分類される。
MDA試料のCRS値=2.04
非MDA試料のCRS値=0.91
閾値に基づき、両試料を正確に分類した。
独立型精液検知キット
キットで使用されたアッセイは、入力としてDNA試料を受け入れ、次いで生化学的手順を経て、さらに専用ソフトウェアによってシグナル解析される。アッセイの出力は、DNA試料(精液又は非精液)のカテゴリ、及び、出力されたカテゴリがDNA試料の真のカテゴリである可能性を表す、統計的信頼水準である。
0.6μM SD1f(AAGAGCCCATCAGGCAGGTC);
0.6μM SD1r(GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
1.75μM SD2f(CTCCAGAACTGGAACTTCCTG);
1.75μM SD2r(GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
1.25μM SD3f(TGGAGGACAATGCCCTGGTG);
1.25μM SD3r(GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
1.75μM SD4f(CCCTCCGAGTGGCCAGCAG);
1.75μM SD4r(GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
1.75μM SD5f(CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG);
1.75μM SD5r(ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
0.9μM SD6f(TACAGACAAATCACTCAGCAGC);及び
0.9μM SD6r (GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT)の5Xプライマーミックスを含むチューブ1;
順方向プライマー(例えば、SD_fなど)は蛍光で標識した
10X反応緩衝液(150mM TRIS−HCl、15mM MgCl2、各0.2mMのdntp、2.5μg BSA)を含むチューブ2;
HhaI制限エンドヌクレアーゼを含むチューブ3;
対照精液DNA試料を含むチューブ4;
対照非精液DNA試料を含むチューブ5;
DNAラダーを含むチューブ6;及び
化学物質安全性データシート(MSDS)。
(a) 各反応に対して、0.2mlチューブ(提供されていない)中で、以下の成分:5μl 5Xプライマーミックス、2.5μl 10X反応ミックス、0.5μl HhaIエンドヌクレアーゼ、0.5μl DNAポリメラーゼ、0.5ng DNA、及びDDW(蒸留水)を、総容積25μlに混合する
(b) さらに、検査済みのDNAに、供給された精液DNAを使用した陽性対照精液反応、供給された血液DNAを使用した陽性対照非精液反応、DNAの代わりにDDWを使用した陰性対照反応、及び、HhaIの代わりにDDWを使用した消化制御反応を構成する
(c) サーマルサイクラー中に反応チューブを置き、以下のプログラム:37℃で15分間、95℃で11分間、続いて94℃30サイクルで1分間、59℃で1分間、72℃で1分間、続いて、最終伸長工程の、60℃で45分間、及び25℃での保持を実行する
(d) それぞれの増幅後反応に対して、1.5μlの生成物を、24.5μlのホルムアミド、及び0.5μlのfluorescent size standardと、新しい0.2mlチューブ中で混合する
(e) 試料を95℃で3分間変性させ、次いで即座に氷上で3分間冷却する
(f) 変性した試料を、以下のパラメーターを使用して、キャピラリー電気泳動装置にかける
モジュール=GS STR POP4(1mL)F;
Inj.secs=5;
Inj.kV=15;
Run kV=15;
Run C=60;
実行時間=24分
(g)TissueIdentifier解析ソフトウェアで、出力の.fsaファイルを解析する。
Claims (16)
- (A)少なくとも1つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは少なくとも1つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによりDNA試料を完全消化すること;
(B)前記消化されたDNAの少なくとも2つのゲノム遺伝子座を増幅することであって、少なくとも1つの該遺伝子座が、異なるDNA区分で特異的にメチル化される制限遺伝子座であり、したがって該DNA試料中で少なくとも2つのゲノム遺伝子座のそれぞれにおいて増幅産物を生成すること;
(C)前記各遺伝子座における該増幅産物のシグナル強度を測定すること;
(D)前記増幅産物の該シグナル強度間のシグナル比を計算すること;
(E)既知のDNA区分における該少なくとも2つのゲノム遺伝子座の増幅産物のシグナル強度の比を表す1又は複数の基準値を提供すること;及び
(F)該シグナル比と該基準値とを比較して、シグナル比と最も近い基準値のDNA区分が前記DNA試料の区分であると決定すること、
を含み、
前記少なくとも2つのゲノム遺伝子座が、可能性のある異なるカテゴリに対し明確なシグナル比を生成し、
ゲノム標的又はアンプリコンの絶対的定量化は必要とせず、標準曲線または標準DNAは必要とせず、および
任意のゲノム遺伝子座における実際のメチル化度は示さない、
ことを特徴とする、DNA試料を分類する方法。 - 前記DNA区分が、組織型、細胞型、生理学的状態、病的状態、年齢、民族性、性別、メチル化レベル、種、細胞系、天然のDNA及び人工的に合成したDNA、病的状態の発症の危険性、胎児の状態、病気の予後、治療効果を示す傾向、細胞系継代培養の影響、および薬剤に対する反応からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記組織型又は前記細胞型が、血液、唾液、精液、表皮、尿、血漿、毛髪、月経血、膣細胞及び/又は分泌物、汗、大便、脳、食道、肺、胃、心臓、十二指腸、肝臓、胆のう、腸、腎臓、副腎、膀胱、尿道、結腸、睾丸、卵巣、子宮、膣、筋肉、腱、靭帯、脂肪、軟骨、骨、内皮細胞、子宮頸部、リンパ、甲状腺、下垂体、小脳及び胸部からなる群から選択され、前記病的状態が、癌、炎症、自己免疫疾患、代謝異常、感染症、変性疾患、ホルモン不均衡、異常なDNAメチル化により特徴づけられる疾患、ICFの神経発達障害(免疫不全、動原体不安定及び顔面異常)、レット症候群及び脆弱性X症候群から選択され、前記胎児の状態が、プラダー−ウィリ症候群、アンジェルマン症候群、ベックウィズ・ブィーデマン症候群、脆弱X症候群、ラッセルシルバー症候群、新生児一過性糖尿病、アルブライト遺伝性骨ジストロフィー、マックーン−オルブライト症候群、遺伝性非クロム親和型パラガングリオーマ、母親性及び父親性UPD14症候群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記1または複数の基準値が、1または複数のDNA区分の存在を表す、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA区分が、精液及び非精液の混合物由来である、請求項4に記載の方法。
- 前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、AatII、Acc65I、AccI、AciI、AClI、AfeI、AgeI、ApaI、ApaLI、AscI、AsiSI、AvaI、AvaII、BaeI、BanI、BbeI、BceAI、BcgI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZ17I、Cac8I、ClaI、DpnI、DrdI、EaeI、EagI、Eagl−HF、EciI、EcoRI、EcoRI−HF、FauI、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HincII、HincII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpy166ii、Hpy188iii、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、MmeI、MspA1I、MwoI、NaeI、NarI、NgoNIV、Nhe−HFI、NheI、NlaIV、NotI、NotI−HF、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PleI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、SalI、SalI−HF、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TfiI、TscI、TseI、TspMI及びZraIからなる群から選択され、前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがHhaIであり、前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、McrBC、McrA及びMrrAからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- シグナル強度が、キャピラリー電気泳動の際に測定される、増幅産物の蛍光レベルである、請求項1に記載の方法。
- 工程(B)及び(C)がリアルタイムPCRより実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)が、蛍光標識されたプライマーを用いて行われ、各遺伝子座の増幅産物のシグナル強度は、各増幅産物の蛍光レベルである、又は
前記工程(B)が、さらに蛍光標識されたプローブを各遺伝子座の増幅産物とハイブリダイズすることを含み、前記増幅産物のシグナル強度は、前記産物のプローブのハイブリダイゼーション後に測定する蛍光レベルである、
請求項1に記載の方法。 - DNAの分類とDNAプロファイリングを同時に実施することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記消化および増幅の工程を、1つの試験管内で同時に実施する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従ってDNA試料の区分をするためのキットであって、
(1)少なくとも2つの遺伝子座の増幅のためのプライマー;及び
(2)反応バッファ、(3)対照DNA、(4)メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ、および(5)分類を実施するための書面によるプロトコル、を含むキット。 - 分類分析を実施するための分析ソフトウェアを更に含む、請求項12に記載のキット。
- 以下を含む、請求項1に記載の方法に従って精液または非精液としてのDNA試料を分類するためのキット:
(a)以下のプライマーを含むプライマー混合物;
SD1f(AAGAGCCCATCAGGCAGGTC);
SD1r(GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
SD2f(CTCCAGAACTGGAACTTCCTG);
SD2r(GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
SD3f(TGGAGGACAATGCCCTGGTG);
SD3r(GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
SD4f(CCCTCCGAGTGGCCAGCAG);
SD4r(GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
SD5f(CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG);
SD5r(ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
SD6f(TACAGACAAATCACTCAGCAGC);及び
SD6r(GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT)
(b)反応バッファ;
(c)HhaI制限エンドヌクレアーゼ;
(d)DNAポリメラーゼ;および
(e)分類を実施するための書面によるプロトコル。 - (1)SD1f(AAGAGCCCATCAGGCAGGTC)及びSD1r(GTTTCTTGTCGAGCAGCACGTGGATGATG);
(2)SD2f(CTCCAGAACTGGAACTTCCTG)及びSD2r(GTTTCTTAACTTGGAGACGACGGCATC);
(3)SD3f(TGGAGGACAATGCCCTGGTG)及びSD3r(GTTTCTTGGCTTCACCTGCGACCGTCTC);
(4)SD4f(CCCTCCGAGTGGCCAGCAG)及びSD4r(GTTTCTGACCACTGCCGTGGGAATG);
(5)SD5f(CTTCTCAGCCAATGGGAAGAG)及びSD5r(ACGTAGAAGGACCCGAGGAC);
(6)SD6f(TACAGACAAATCACTCAGCAGC)及びSD6r(GTTTCTTGTCTGACACTCGGTTGTAGGTATT)からなる群から選択される、少なくとも1つの順方向(f)及び逆方向(r)プライマー対の組合せを含む、請求項1に記載の方法に従って精液又は非精液としてのDNA試料を分類するためのキット。 - (a)以下に示す遺伝子座を増幅するための順方向及び逆方向プライマーを含むプライマー混合物:
1.L91762(順方向 GCAGCAGGCCGCGGAGAAG(FAM);逆方向 AGCAGCTGTGCCGGGCCAG)
2.L68346(順方向 CAGCAACAGCACCCAGCTTG(JOE);逆方向 CACAGGCTCAGTCGCGGATC)
3.L50468(順方向 AGGAAACCTCAGTAGCAAAATTG (JOE);逆方向 GCGAGACTTTAGGTGTGCATC)
4.L14432(順方向 CGTAGGCTGCGGTGAGCTC(FAM);逆方向 GATCCATGCCCGCTGGGATG)
5.L4648(順方向 CAGCCTAGACGTCAAGTTACAG(JOE);逆方向 ACGACCTCCGGATCCAACTG)
6.L39664(順方向 CCCAGCTGGTTGGACATGTTG(FAM);逆方向 CACTTCCTTCGTGGACGCC)
7.L30139(順方向 GAGAAGCGGGAGGATGAGAC(FAM);逆方向 CCGCATCTCCTCCGTCCTG)
8.L55429(順方向 GCCTTCAGCAGGAAGTCCAC(JOE);逆方向 CCTGTGCCTCACACAGACTC)
9.L62086(順方向 GTGCATGGTGTCTGGTACTTC(FAM);逆方向 GAAGCTCTCGTGGACTACTTG)
10.L76138(順方向 CAGCCTGCTCTTCACTGCAG(JOE);逆方向 AGAGGCCGATGAAGCCGTAG)
11.L15952(順方向 CTCCCTGATTTACGACAAGTTC (FAM);逆方向 GACAGTATGCTGATGCTTCTTG)
12.L36599(順方向 AAGGGCAGAGTTCCGCTGTC(FAM);逆方向 CGGATGCAGGAGGATCCTAG)
13.L26688(順方向 CGGACCAGATTGCTGGTCAC(JOE); 逆方向 CGACCTTGCCAGATGTTTGAC)
14.L81528(順方向 AGCCTCATCCACACTGACCAG(JOE);逆方向TCAGAGCTCTCCTATCTGGAC)
15.L36556(順方向 GCCAGGCCGTTGATGATGAC(JOE);逆方向 GAATATGGAGCCCTGGGCAG);
(b)反応バッファ
(c)HhaI制限エンドヌクレアーゼ;
(d)DNAポリメラーゼ;および
(e)分類を実施するための書面によるプロトコル、
を含む、請求項1に記載の方法に従って血液、唾液、精子、又は表皮としてのDNA試料を分類するためのキット。
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