KR20170018994A - Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법 - Google Patents

Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170018994A
KR20170018994A KR1020150112362A KR20150112362A KR20170018994A KR 20170018994 A KR20170018994 A KR 20170018994A KR 1020150112362 A KR1020150112362 A KR 1020150112362A KR 20150112362 A KR20150112362 A KR 20150112362A KR 20170018994 A KR20170018994 A KR 20170018994A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
str
amplification
dna
locus
penta
Prior art date
Application number
KR1020150112362A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101716108B1 (ko
Inventor
최철용
함선규
우광만
김세용
서보영
Original Assignee
대한민국(관리부서 대검찰청)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(관리부서 대검찰청) filed Critical 대한민국(관리부서 대검찰청)
Priority to KR1020150112362A priority Critical patent/KR101716108B1/ko
Publication of KR20170018994A publication Critical patent/KR20170018994A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101716108B1 publication Critical patent/KR101716108B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/151—Modifications characterised by repeat or repeated sequences, e.g. VNTR, microsatellite, concatemer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/143—Magnetism, e.g. magnetic label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

법과학 DNA 시료는 물리적으로 손상이 심한 경우가 많고 매우 적은 농도로 존재하므로 STR(Short Tandem Repeats) 프로파일(profile)을 얻는데 문제가 된다. 본 발명은 선행 증폭 방법이 증폭산물의 길이가 긴 유전좌위(loci)의 STR 패턴을 복구할 수 있는 강력한 수단임을 확인한 것으로서, 본 발명의 방법은 손상된 DNA 시료로부터 STR profile을 얻는데 매우 유용하다. 또한, DNA의 손상 정도나, 손상된 패턴에 따라서 사용할 프라이머(primer)를 선택할 수도 있으며, 사용할 프라이머의 종류 선택과 프라이머 농도와 각각의 비율을 조절하여 선행 증폭하는 등으로 응용될 수 있다. 본 발명의 분별 선행 증폭을 통해 손상이 심하고 농도가 적은 시료에서도 STR 패턴을 실효성 있게 분석할 수 있게 되어, 관련 분야에 널리 응용될 수 있을 것이다.

Description

STR 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법{Forensic profiling by differential pre-amplification of STR loci}
본 발명은 STR(Short Tandem Repeats) 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법에 관한 발명으로서 유전자 감식 분야 및 법의학적 타이핑(forensic typing) 분야에 속한다.
개체 식별을 위한 유전자 감식은 90년대 초반부터 연쇄중합반응(Polymerase Chain Reaction; 이하 PCR이라 함)을 이용한 Amp-FLP(Amplication Fragment length Polymorphism) 타이핑 방법이 본격적으로 사용되고 있으며, 이러한 원리는 강력사건을 대상으로 한 법의학적 타이핑(Forensic typing)이나 DNA 데이터베이스 구축에도 적용되고 있다.
유전자 감식 분야에서는 짧은연쇄반복(short tandem repeat; 이하 STR이라 함)이 활용되는 경우가 많은데, 법과학 분야에서 주로 사용되는 STR은 사람의 유전체(genome)의 비암호화 영역(non-coding region)에 존재하며, 이는 2~13개의 염기서열이 하나의 단위가 되어 수백 번 반복되는 미세위성체(microsatellite)이다. STR은 개인마다 핵심반복단위(core repeat unit)의 반복수(repeat number)가 다르게 나타나고 개인마다 고유한 값을 가지기 때문에 개인 식별과 혈연 관계의 확인 등의 목적으로 많이 활용하고 있다.
STR 분석법은 법과학적 분석법 중 가장 자주, 광대하게 사용이 되고 있으며, 그 분석 결과는 범죄 현장에 존재하는 혈흔, 정액, 머리카락, 침 등을 포함한 생물학적 증거로 종종 법정에서 사용되고 있다. STR 분석을 통해 얻어진 DNA profile은 화재나 홍수, 오래된 유해, 토막 살인 등으로 인해 얼굴이나 지문으로 개인식별이 어려운 사건에서 개인식별에 특히 유용하게 사용된다. 뿐만 아니라 이러한 STR 분석법은 식물의 종을 분류하는데도 응용되는데, 마리화나의 DNA 정보를 통하여 발견된 마리화나의 분류뿐 아니라 뿌리, 줄기, 씨앗 등의 위치 또한 구분이 가능하다.
현재 법과학 실무에서는 PCR로 얻은 증폭 산물을 전기영동법으로 분리하여 길이의 차이에 따른 STR의 반복 수를 조사하여 STR 유전자형을 분석하고 있는데, 이때 여러 STR 유전좌위에 대한 증폭 산물이 동시에 얻어질 수 있도록 다중증폭 PCR(multiplex PCR)이 많이 이용된다. 이러한 분석법은 미세한 염기 차이도 구별이 가능한 해상도를 갖고 있어 증폭 산물의 길이를 정확하게 확인할 수 있으며, 형광표지자가 부착된 프라이머(primer)를 이용하여 증폭 산물을 자동화된 장비에서 쉽고 빠르게 검출할 수 있다. 그러나 이 방법은 증폭 산물의 염기서열을 확인할 수 없을 뿐 아니라 사용할 수 있는 형광표지자의 수 및 증폭 산물의 크기에서 제한이 있다. 기존의 염기서열을 분석하는 방법인 Sanger 기반의 염기서열 분석법은 정확하게 염기서열 정보를 얻을 수는 있지만, 개인유전체 분석(personal genome analysis) 등 대용량의 DNA 염기서열 정보를 얻어야 하는 연구 분야에 적용하는 것은 분석에 걸리는 시간, 노동력, 비용 측면에서 비효율적인 면이 있었다.
또한, STR분석을 통한 정확한 DNA profiling은 손상된 법의학적 증거로 인해 어려움을 겪고 있다. 생물학적 증거가 외부 환경에 노출된 기간이나 노출된 환경의 상태에 따라서 DNA는 물리적, 화학적 손상을 받게 된다. 사람의 세포나 조직에 존재하는 DNA는 de-purination, nucleotide oxidation, DNA strand cross-liking, 또는 DNA의 화학적 변화 등의 다양한 병변이 존재한다. DNA의 상태 또한 종종 이중나선의 물리적 절단으로 인해 단편화가 일어난다. DNA 절단 효소로 인한 손상이나 단편화는 오랜 시간이 지난 생물학적 증거에서 추출된 법과학적 증거에서 종종 나타나는 현상인데, 증폭산물의 길이가 긴 STR 유전좌위는 가장 먼저 그리고 가장 크게 영향을 받게 되므로 DNA 단편화에 가장 민감한 부분이라 할 수 있어서, 손상된 법의학적 증거를 사용하여 STR 분석을 하였을 때 증폭산물의 길이가 커질수록 형광단위(fluorescence unit)의 높이가 낮아지는 현상이 일반적으로 나타나게 된다.
이러한 문제점을 극복하기 위해 증폭산물의 길이를 일정 크기 이하로 줄인 Mini-STR 분석법이 개발되었고 이 방법을 통해 손상된 DNA에서 효과적으로 STR 분석을 도출해 내고 있으나, 기존의 STR 데이터 베이스와 호환이 되지 못하는 등 단점이 존재한다. DNA 회복 효소를 통해 화학적으로 손상된 DNA를 복구하여 효과적인 STR 분석을 도출하기 위한 방법도 개발이 되어 있으나 DNA 손상시 변형이 일어나 복구가 어렵기 때문에 이러한 방법으로도 완전한 STR profile이 얻어지기 힘들다는 제한이 있다. 손상된 DNA의 분석 효율을 증가시키기 위한 방법으로 혼성화를 통해 STR 유전좌위를 풍부화하는 방법 또한 제시되고 있으나 이 방식 또한 깨끗한 STR profile을 얻기 위해서 매우 많은 양의 DNA가 필요하다는 단점이 있다.
오래된 생물학적 시료나 법과학적 시료는 일반적으로 손상이 진행되어 있고 그 시료의 양도 매우 적은 편이기 때문에 효과적으로 STR profile을 복구할 수 있는 실험방법의 개발이 매우 중요하다. 이에, 본 발명자들은 바이오틴화 프라이머를 사용하여 타겟 STR 유전좌위를 선 증폭한 뒤 스트렙타비딘 자성 비드를 사용하여 추출하여 STR 분석에 사용, 손상된 DNA에서 효과적인 STR profile을 얻을 수 있는 새로운 방법을 개발하였고, Primer간의 비율 조절을 통해 손상된 DNA에서 증폭산물의 길이가 긴 유전좌위의 STR profile을 복구할 수 있으며 증폭산물의 길이에 따른 분별 선행 증폭을 통해 손상된 법의학적 혈액 시료에서 효과적인 STR profile을 얻었을 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, STR(Short Tandem Repeats) 유전좌위(loci)의 분별 선행 증폭을 통해 유전자를 감식하는 새로운 방법을 마련함으로써, 손상이 심하고 시료의 양이 매우 적은 유전자에 대해 보다 정확한 감식 결과를 제공할 수 있는 방안을 제시하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은
1) 분석 대상이 되는 DNA 시료에서 타겟(target) STR(Short tandem repeats) 유전좌위를 하나 또는 둘 이상 결정하는 단계;
2) 단계 1)에서 결정된 STR 유전좌위에 대응되는 프라이머들을 이용하여 증폭시키는 선행 증폭 단계;
3) 자성비드(magnetic bead)를 이용하여 단계 2)의 선행 증폭을 거친 산물 중 자성비드에 결합된 타겟 STR 유전좌위를 회수하는 단계;
4) 프라이머를 이용하여 단계 3)을 거친 유전좌위를 다시 증폭시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 증폭된 산물로부터 STR을 분석하는 단계;를 포함하는, 손상된 DNA로부터 STR 프로파일(profile)을 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법을 이용하여 STR 프로파일(profile)을 분석한 결과를 평가함으로써 특정 생물을 판정하거나 특정 인물의 신원을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 STR(Short Tandem Repeats) 유전좌위(loci)의 분별 선행 증폭을 통해 유전자를 감식하는 새로운 방법을 제공함으로써, 손상이 심하고 시료의 양이 매우 적은 유전자에 대해 보다 정확한 감식 결과를 도출할 수 있으므로, 개체 식별, 범죄 현장에서의 용의자 추적 및 신원 확인 등 다양한 법과학 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 STR(Short Tandem Repeats) 유전좌위를 선행 증폭하는 방법을 간단히 도면으로 나타낸 것이다.
도 1b는 하나의 STR 유전좌위(locus)를 선행 증폭 하였을 때의 STR 분석 효율을 비교한 도이다.
도 1c는 D18S51, Penta E, D16S539, CSF1PO, Penta D, D8S1179, TPOX 및 FGA 8개의 유전좌위에 대한 멀티플(multiple) 선행 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 D18S51과 Penta E의 프라이머를 1:1 비율과 0.5:1 비율로 하여 각각 선행 증폭시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 D16S539, CSF1PO 및 Penta D의 프라이머를 1:1:1 및 0.5:1:1.5의 비율로 각각 선행 증폭시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 D8S1179, TPOX 및 FGA의 프라이머를 1:1:1 및 0.5:1:1.5의 비율로 각각 선행 증폭시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 2d는 8개의 유전좌위(D18S51/D16S539/D8S1179: CSF1PO/TPOX: Penta E/Penta D/FGA)의 프라이머를 각각 0.5:1:1.5 및 1:2:3의 비율로 각각 선행 증폭시킨 결과를 나타낸 도이다(*표시는 다른 색의 fluorescence로 인한 pull-up peak).
도 3a는 증폭산물의 길이가 짧은 그룹(D18S51, D16S539, D8S1179, TPOX)과 길이가 긴 그룹(Penta E, CSF1PO, Penta D, FGA)로 나뉘어 선행 증폭한 결과를 나타낸 도이다(*표시는 다른 색의 fluorescence로 인한 pull-up peak).
도 3b는 더 극심한 손상을 입은 DNA의 분별 선행 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 대검찰청에서 보관하던 손상된 혈액 DNA 시료(42번)를 사용하여 Multiple 선행 증폭, 증폭 산물의 길이가 긴 STR 유전좌위(Penta E, CSF1PO, Penta D 및 FGA)그룹을 선행 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 대검찰청에서 보관하던 손상된 혈액 DNA 시료(76번)로 도 4a에서와 같이 분석한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 양태로서
1) 분석 대상이 되는 DNA 시료에서 타겟(target) STR(Short tandem repeats) 유전좌위를 하나 또는 둘 이상 결정하는 단계;
2) 단계 1)에서 결정된 STR 유전좌위에 대응되는 프라이머들을 이용하여 증폭시키는 선행 증폭 단계;
3) 자성비드(magnetic bead)를 이용하여 단계 2)의 선행 증폭을 거친 산물 중 자성비드에 결합된 타겟 STR 유전좌위를 회수하는 단계;
4) 프라이머를 이용하여 단계 3)을 거친 유전좌위를 다시 증폭시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 증폭된 산물로부터 STR을 분석하는 단계;를 포함하는, 손상된 DNA로부터 STR 프로파일(profile)을 분석하는 방법을 제공한다.
STR을 사용한 DNA 분석은 사건현장이나 자연재해 시 채취된 법의학적 증거를 통한 개인 식별에 매우 유용하게 사용되고 있으나, 사건 현장에서 오래 노출이 되어 있었거나, 손상된 생물학적 증거에서 추출한 DNA는 손상이 되어 조각이 났으므로 STR의 분석이 어렵다. 본 발명에서는 바이오틴화 프라이머를 사용하여 STR 유전좌위를 선행 증폭한 뒤 자성비드로 회수하여 다시 증폭하는 방법이 손상된 DNA의 STR 분석효율을 증가시키는 효과적인 방법이라는 것을 확인하였다(실험예 1 및 도 1 참조).
또한, 증폭산물의 길이가 긴 유전좌위의 경우 상대적으로 손상을 받기 더 쉽기 때문에 STR의 정확한 분석이 어려운데, 본 발명자들은 선행 증폭 시에 증폭산물의 길이에 따라 각각의 프라이머의 비율을 조절한 결과, 보다 길이가 긴 유전좌위에 대해서도 정확한 STR 분석이 가능함을 확인하였다(실험예 2 및 도 2 참조).
아울러, 증폭산물의 길이에 따라 길이가 긴 그룹과 짧은 그룹으로 나눈 뒤 각각 선행증폭을 하여 심각하게 손상된 법과학 DNA 샘플에서 효과적으로 STR 분석 효율을 증가시킬 수 있었다(실험예 3, 도 3 및 도 4 참조)
따라서, 손상이 심하고 길이가 긴 유전좌위가 포함된 DNA 시료일 지라도 본 발명의 STR 유전좌위 분별 선행증폭을 통해 효과적으로 STR 프로파일 분석이 가능함을 명확히 알 수 있다.
일반적으로 두 번 증폭하는 방식의 경우 STR 키트를 사용하여 전체적으로 한 번 더 증폭을 하는 방법이므로, 그만큼 비특이적(non-specific)인 peak들이 상당히 많이 나오게 된다. 그러나, 본 발명의 방법은, 확인하고자 하는 STR 유전좌위들만 선택적으로 소량 취하여 선행 증폭한 뒤, STR 분석을 진행하는 것이므로 비특이적(non-specific)인 peak들의 발생이 적으며, 자성비드를 이용하여 타겟 STR 유전좌위를 수집할 때 세척과정을 거치므로 PCR 과정을 방해하는 요인들을 제거할 수 있다는 점에서 일반적인 증폭방식과 큰 차이가 있다. 또한 본 발명에서는 단순히 증폭을 2번 반복하는 것이 아니라 길이가 긴 유전좌위와 길이가 짧은 유전좌위에 해당하는 프라이머의 상대적 양을 조절하여 증폭되는 PCR산물의 양을 조절할 수 있다는 것을 보였으며(실험예 2 및 실험예 3 참조), 이 결과를 통해 본 발명이 여러 유전좌위를 동시에 분석해야 하는 DNA 프로파일링에는 매우 획기적인 기술임을 규명하였다.
상기 시료는 DNA를 포함하는 모든 생물학적 시료(biological sample)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 머리카락, 체모, 손톱, 발톱, 타액, 눈물, 소변, 대변, 콧물, 구강세포, 상피세포, 골조직, 피부조직, 근육조직, 내장조직, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수, 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로부터 분리된 DNA 시료인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 시료 중 DNA량은 50 pg 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 STR 유전좌위는 D18S51, D16S538, D8S1179, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), CSF1PO(Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene), Penta E, Penta D 및 FGA(Human fibrinogen alpha chain)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 프라이머들은 형광물질이 표지된 것, 표지되지 않은 것 및 둘 모두로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 선행 증폭시 증폭 산물의 길이에 따라 프라이머의 비율을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 손상은 물리적, 화학적 또는 생물학적 손상을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 손상은, 상기 단계 2)의 선행 증폭을 거친 산물의 길이가 짧은(100 bp 이상이며 150 bp 미만) 유전좌위의 형광 단위(fluorescence unit) 값을 길이가 긴(300 bp 이상이며 460 bp 미만) 유전좌위의 형광 단위 값으로 나눈 수치가 5 이상 10 이하인 것일 수 있고, 이러한 수치가 클수록 손상의 정도가 심한 것으로 평가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계의 2)의 선행 증폭은 STR 유전좌위 중 Penata D, Penata E 및 FGA 등과 같이 380 bp 보다 긴 유전좌위를 대상으로 증폭하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 단계 2)의 선행 증폭은 STR 유전좌위 중 D18S51, D16S538, D8S1179 및 TPOX 등과 같이 315 bp 미만의 짧은 것과 CSF1PO, Penta E, Penta D 및 FGA 등과 같이 315 bp 이상의 긴 것을 구별하여, 각각의 프라이머들을 이용하여 따로 분별 증폭시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
아울러, 본 발명의 다른 양태로는, 상기 방법을 이용하여 STR 프로파일(profile)을 분석한 결과를 평가함으로써 특정 생물을 판정하거나 특정 인물의 신원을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 방법을 이용하여 손상이 심하거나 길이가 긴 유전좌위를 가진 STR을 포함하는 DNA 시료일 지라도 효과적인 STR 프로파일이 가능하므로, 주변 환경이나 시간의 경과에 따라 훼손이 심할 수도 있는 시료에서도 STR 분석과 증폭된 유전자의 평가 및 유전자형 결정을 통해 보다 효과적으로 신원 확인, 개인 식별 및 특정 생물 판정이 가능함을 확인하였다.
상기 방법에는, 상기한 일 양태의 단계를 모두 포함하되 단계 5) 이후에 증폭된 대립 유전자들을 평가하고 이를 통해 각각의 대립유전자형을 결정하여 특정 생물 또는 특정 인물을 식별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 유전체( genomic ) DNA 추출
HeLa 세포주로부터 genomic DNA를 추출하였다.
구체적으로, 10% 우태혈청이 추가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 CO₂배양기를 통해 37℃, 5 % CO₂조건으로 48시간 동안 HeLa 세포를 배양하였고, 이렇게 배양한 세포를 스크레퍼로 긁어서 이펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮긴 후, 1X PBS로 두 번 씻어서 배지 성분을 제거하였다. 이렇게 준비된 세포로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Cat. No. 51304, QIAGEN, Hilden, DEU)의 protocol에 따라서 genomic DNA를 추출하였다.
또한, 혈액 DNA 시료는 1995년도에 페이퍼 타월에 떨어뜨린 혈흔에서 추출한 것으로서 20년이 경과된 유전체(genomic) DNA을 사용하였는데, 구체적으로, 혈흔이 묻은 페이퍼 타월을 2~3개 정도의 구멍을 내어 그 조각들을 1.5 ml tube로 옮긴 뒤, QIAamp DNA Mini Kit의 protocol에 따라서 세포로부터 genomic DNA를 추출하였고 추출된 genomic DNA는 다음 실험에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
< 실시예 2> 초음파를 이용한 DNA 단편화
손상된 DNA의 모델을 제작하기 위하여 초음파를 이용한 sonication을 통해 DNA를 단편화시켰다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 의해 추출한 시료에 대해 Ultrasonic Processors (Cole Parmer, Vernon Hills, USA)를 사용하여, 얼음 내에서 15초 간 초음파 처리 후 15초 간 쉬는 것을 60회 반복하여 단편화를 유도하였다. 이렇게 초음파 처리 한 DNA는 0.8% 아가로즈 젤에 전기영동 하여 그 크기를 확인하였다. 즉, 상기 과정을 거친 시료와 Qubit® dsDNA HS assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 Qubit® fluorometer (Invitrogen)를 사용하여 DNA의 단편화 수준을 측정하였다. 본 발명에서는 평균 200 내지 300 bp 정도 크기로 단편화된 DNA가 생성됨을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 실험을 진행하였다.
< 실시예 3> 프라이머 (primer) 설계
단편화된 DNA 시료를 증폭시키기 위해 필요한 요소인 프라이머를 설계하였다.
구체적으로, STRbase (http://www.cstl.nist.gov/strbase/)에서 PowerPlex® 16 System 키트(Promega, Madison WI, USA)에 대한 프라이머 서열 정보를 참고하여 프라이머를 설계하였다. 모든 프라이머는 5' 위치에 바이오틴을 첨가하였고, 제작된 각각의 프라이머 서열은 다음과 같다.
서열번호 STR 유전좌위 Primer sequence(5' - 3')
1 CSF1PO-F CCG GAG GTA AAG GTG TCT TAA AGT
2 CSF1PO-F30 CCG GAG GTA AAG GTG TCT TAA AGT GAG AAA
3 CSF1PO-F35 CCG GAG GTA AAG GTG TCT TAA AGT GAG AAA GAA TA
4 CSF1PO-TG TGC TAA CCA CCC TGT GTC TCA GTT TTC CTA
5 CSF1PO-R ATT TCC TGT GTC AGA CCC TGT T
6 CSF1PO-R30 ATT TCC TGT GTC AGA CCC TGT TCT AAG TAC
7 CSF1PO-R35 ATT TCC TGT GTC AGA CCC TGT TCT AAG TAC TTC CT
8 CSF1PO-R40 ATT TCC TGT GTC AGA CCC TGT TCT AAG TAC TTC CTA TCT A
9 D18S51-F25 TTC TTG AGC CCA GAA GGT TAA GGC T
10 D18S51-F35 TTC TTG AGC CCA GAA GGT TAA GGC TGC AGT GAG CC
11 D18S51-R30 CTA CCA GCA ACA ACA CAA ATA AAC AAA CCG
12 D18S51-R40 CTA CCA GCA ACA ACA CAA ATA AAC AAA CCG TCA GCC TAA G
13 D18S51-Tm60 CCT AAG GTG GAC ATG TTG GCT
14 D18S51-Tm67 ACA GAG AGA AGC CAA CAT GTC CAC C
15 D18S51-GC54 GCC ATG TTC ATG CCA CTG CAC TTC
16 D18S51-TG CGT CAG CCT AAG GTG GAC AT
17 Penta D-F GAA GGT CGA AGC TGA AGT G
18 Penta D-R ATT AGA ATT CTT TAA TCT GGA CAC AAG
19 D21S11 TGT ATT AGT CAA TGT TCT CCA GAG AC
20 D16S539-F GGG GGT CTA AGA GCT TGT AAA AAG
21 D16S539-R GTT TGT GTG TGC ATC TGT AAG CAT GTA TC
22 D16S539-R35 GTT TGT GTG TGC ATC TGT AAG CAT GTA TCT ATC AT
23 Penta E-F ATT ACC AAC ATG AAA GGG TAC CAA TA
24 Penta E-R TGG GTT ATT AAT TGA GAA AAC TCC TTA CAA TTT
25 D8S1179-F ATT GCA ACT TAT ATG TAT TTT TGT ATT TCA TG
26 D8S1179-R ACC AAA TTG TGT TCA TGA GTA TAG TTT C
27 TPOX-F GCA CAG AAC AGG CAC TTA GG
28 TPOX-R CGC TCA AAC GTG AGG TTG
29 FGA-F GGC TGC AGG GCA TAA CAT TA
30 FGA-R ATT CTA TGA CTT TGC GCT TCA GGA
< 실시예 4> STR (Short Tandem Repeats) 유전좌위의 선행 증폭(Pre-amplification)
선행 증폭(Pre-amplification)을 통해 일반적인 STR 분석보다 효과적으로 분석이 가능함을 입증하기 위해 선행 증폭을 실시하였다.
구체적으로, 2 ng의 손상된 DNA, 각각 0.2 uM 에서 0.6 uM 의 biotinylated target locus primer, 10X PCR Gold®bufferⅡ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 0.05 mM의 dNTPs mix, 1.5mM MgCl2 , 1.25U Ampli Taq Gold® DNA polymerase (Applied Biosystems), 그리고 증류수로 구성된 총 50 ul reaction volume으로 선행 증폭을 실시하였다. 선행 증폭은 MycylcerTM Thermal cycler (BIO-RAD, USA)을 이용하였고, 95 ℃에서 10분 pre-denaturation, 95 ℃에서 15초 denaturation, 60 ℃에서 30 초 annealing, 72 ℃에서 30초 extention을 6 내지 16 사이클(cycle) 시킨 뒤, 72 ℃에서 5 분 final extention을 거쳤다.
반응이 끝난 후, 선행 증폭된 샘플은 자성비드(magnetic beads)를 통해 용리(elution)시킨 뒤, STR 타이핑(typing)을 실시하였다. STR 타이핑은 PowerPlex® 16 System 키트를 사용하였다. PCR 산물은 변형 폴리머 POP-4TM (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 포함하는 ABI 3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 검출하였으며, Gene Mapper ID v3.2 Analysis 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 이용하여 결과를 분석하였다. ABI 3130XL Genetic Analyzer의 분광 조정(spectral calibration)을 위해 The PowerPlex® Matrix Standards 3100/3130(Promega, Madison WI, USA)를 사용하였다. 상기의 과정은 도 1A와 같이 간략히 표현될 수 있다.
< 실시예 5> 자성비드를 이용한 바이오틴 태그 된 DNA조각의 추출
선행 증폭된 산물을 스트렙타비딘으로 코팅된 자성비드를 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 상기 증폭산물을 250 μl 1X Pyromark 결합 완충 용액 (QIAGEN, Hilden, DEU) 과 10 ul 자성비드(Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하여 비드와 증폭산물이 결합하도록 하였다. 이 때 사용 된 이때 사용된 비드는 미리 1X Pyromark 결합 버퍼로 세척해 두었다. 결합 이후, 비드-타겟 유전좌위 복합체를 실온에서 800 μl 0.5X Pyromark 결합 완충 용액 (QIAGEN)로 3회 세척하였다. 결합 완충 용액을 완전히 제거한 뒤, 비드 복합체를 10 μl 증류수에 다시 용해하여 90℃에서 2분 가열하였다. 가열 이후, 비드를 자석으로 수집하여 용출된 타겟 DNA를 포함하는 상층액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 비드 혼성화에 의해 회수된 DNA를 PowerPlex® 16 HS System (Promega)로 증폭한 다음, ABI 3130XL Genetic Analyzer에서 검출하였다.
< 실험예 1> 손상된 DNA의 STR 유전좌위 선행증폭 후 STR 분석
상기 실시예에 의한 분석 결과를 도 1c를 통해 확인하였는데, 도 1c의 왼쪽 패널은 정상적인 HeLa cell DNA의 STR 분석 결과이고, 가운데 패널은 초음파 처리를 통해 손상시킨 DNA의 STR 분석 결과이며, 오른쪽 패널은 8개의 STR 유전좌위(locus)를 제외한 증폭산물의 길이가 짧은 7개의 STR 유전좌위(D3S1358, TH01, D21S11, D5S818, D13S317, D7S829, vWA(von Willebrand factor A))는 증폭되지 않음을 확인한 것이다.
도 1c의 분석을 통해 손상된 DNA의 STR 프로파일은 상대적으로 증폭산물의 길이가 짧은 것 보다 긴 것들이 더 많은 영향을 받는 것을 확인하였다(도 1c, 중간 패널).
또한, 선행 증폭 방식의 sensitivity를 확인하기 위해서 일반적인 STR 분석과, 하나의 STR locus를 선행 증폭 한 뒤 STR 분석을 한 결과를 비교하였는데, 손상된 DNA를 50, 100, 500 pg 을 사용하여 선행 증폭의 STR 분석 효율을 확인하였다. D8S1179의 선행증폭을 시행한 결과, 일반적인 STR 분석 시 필요한 양인 500 pg보다 더 낮은 농도임에도 불구하고 STR 패턴을 관찰할 수 있었다(도 1b). D18S51에서도 비슷한 결과를 볼 수 있었다. 또한, 16개의 STR loci 중 가장 길이가 긴 Penta D 또한 sensitivity가 증가한 것을 볼 수 있었다(도 1b). 500 pg의 손상된 DNA를 사용하여 일반적인 STR 분석을 하였을 때 확인이 어려웠던 Penta D 의 긴 allele의 형광 단위(fluorescence unit)를 100 pg을 사용하여 선행증폭을 한 뒤 STR 분석을 하였을 때 깨끗하게 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 손상된 DNA를 사용하여 STR분석을 할 시 특이적인 STR locus를 선행증폭 하는 것이 매우 효과적임을 알 수 있다.
이러한 방법을 여러 개의 STR loci로 확대시켜 보기 위해 증폭산물의 길이가 200 ~ 450 bp가 되는 8개의 STR loci를 선택하였다. 선행 증폭 이후 STR분석을 진행한 결과, 상대적으로 증폭산물의 길이가 짧은 D18S51, D16S539, D8S1179, TPOX의 fluorescence peak의 높이가 상당히 증가하였으며, 증폭산물의 길이가 긴 locus들은 상대적으로 증가 폭이 적음을 확인하였다(도 1c). 8개(D18S51, D16S539, D8S1179, TPOX, CSF1PO, Penta D, Penta E 및 FGA)의 STR locus는 특이적으로 풍부화가 됨을 알 수 있었고, 이러한 결과를 보았을 때 타겟 STR loci에 해당하는 primer를 사용하여 선행 증폭하는 방식이 매우 특이적인 실험이라는 것을 알 수 있다.
또한, 이러한 방식이 multiplex PCR 에서 상대적으로 증폭 산물의 길이가 짧은 locus는 잘 증폭되는 것에 비해 증폭산물의 길이가 긴 Penta D, Penta E 및 FGA는 하나의 locus 만 선행 증폭하는 것보다 그 효율이 떨어지는 것을 알 수 있었다(도 1b).
< 실험예 2> 증폭산물의 길이가 긴 STR 유전좌위(loci)의 효율성을 증가시키기 위한 primer 비율 조건 확인
손상된 DNA에서 증폭산물의 길이가 긴 STR loci의 불균형한 증폭은, 시료 내의 STR loci의 농도가 상대적으로 낮기 때문에 발생하므로, 증폭산물의 길이에 따라서 DNA template의 농도가 다른 문제점을 해결하기 위해 증폭산물 길이가 긴 loci의 primer의 농도를 높여 primer간의 비율을 조절해 보았다.
그 결과, D18S51과 Penta E의 pirmer농도가 각각 0.4 uM일 때의 형광피크(fluorescence peak)의 높이는 D18S51이 더 높았다. 그러나, D18S51의 primer의 농도를 0.2 uM로 줄이자, Penta E의 peak높이가 높아졌다(도 2a). 비슷한 결과가 D16S539, CSF1PO, Penta D를 선행 증폭한 것에서도 관찰되었다(도 2b). D8S1179, TPOX, FGA를 포함한 실험에서, D8S1179의 primer 농도를 줄이고(0.2 uM), FGA primer의 농도를 높이자(0.6 uM), D8S1179의 fluorescence peak 높이가 낮아지고, FGA의 fluorescence peak가 높아지는 결과가 관찰되었다(도 2c).
종합해 보면, 선행 증폭 시에 Primer의 농도를 변화시켜주면, STR 분석 시 관찰되는 fluorescence unit에 변화를 줄 수 있다는 것을 알 수 있다.
이러한 변화를 총 8개(D18S51, D16S538, D8S1179, TPOX, CSF1PO, Penta E, Penta D 및 FGA)의 STR loci로 확대시켜 보았다. 상대적으로 짧은 길이를 가지는 D18S51, D16S538, D8S1179 의 경우 primer의 농도를 0.2 uM로 반으로 줄이고, 길이가 긴 Penta E, Penta D, FGA의 경우 primer의 농도를 0.6 uM로 1.5배 증가시켰다.
그 결과, primer의 농도에 따른 fluorescence peak의 변화를 관찰할 수 있었다(도 2d, 중간 패널). 또한, 선행 증폭 시 추가하는 primer 간의 비율을 1:2:3 (D18S51, D16S538, D8S1179 0.4 uM : TPOX, CSF1PO 0.8 uM : Penta E, Penta D, FGA 1.2 uM)로 변화시켜, primer의 총 농도를 2배 증가시켰다. 그 결과 fluorescence peak 높이의 증가가 뚜렷하지 않고, non-specific peak 또한 발생하게 되어, 선행 증폭 시 primer간의 비율뿐만 아니라 첨가하는 총 농도의 양 또한 STR loci의 선행 증폭 효율에 영향을 준다는 것을 확인하였다(도 2d, 오른쪽 패널).
< 실험예 3> 손상된 DNA의 분별 선행 증폭을 통한 STR 분석 효율의 증진 확인
손상된 DNA의 정도는 degradation index로 나타낼 수 있는데, 일반적으로 증폭산물의 길이가 짧은 locus의 fluorescence unit 값을 증폭산물의 길이가 긴 locus의 fluorescence unit로 나눈 값을 의미하며, Degradation index (DI)가 5미만일 때가 가장 일반적인 STR 패턴이라고 본다. 도 2d처럼 5 < DI < 10 일 때의 손상된 DNA는 선행 증폭하면 STR분석을 통해 STR profile을 얻을 수 있으나, DI > 10 정도로 심각하게 손상을 입은 DNA 시료의 경우, 증폭산물의 길이가 긴 locus의 STR 패턴은 선행 증폭으로 복구가 되지 않음을 알 수 있었다.
도 1b와 도 2a 내지 도 2d를 보게 되면, 여러 개의 STR locus를 동시에 선행 증폭 할 때, 증폭 하는 STR locus의 개수에 따라서, STR peak 복구율이 영향을 받음을 확인할 수 있다.
이를 통해 STR loci를 증폭 산물의 길이에 따라서 짧은 그룹 (D18S51, D16S539, D8S1179 및 TPOX)와 긴 그룹 (Penta E, CSF1PO, Penta D 및 FGA)로 나누어 각각 선행 증폭을 진행하였다. 긴 그룹만 분별 선행 증폭을 하자, STR loci의 peak가 효과적으로 개선이 되었다(도 3a, 오른쪽 패널).
이러한 분별 선행 증폭법이 더 심각한 손상을 입은 DNA 시료에서도 적용이 되는지 확인하기 위해서, 초음파 처리를 더 진행하여 평균 200 bp로 손상을 인위적으로 주었다. 이렇게 더 심각한 손상을 입은 DNA의 경우 Penta E와 Penta D의 STR peak 패턴이 완전히 사라짐을 확인하였다(도 3b, 왼쪽 패널). Mutiple 선행 증폭을 진행을 하였음에도 불구하고, 상대적으로 증폭산물의 길이가 짧은 loci들에 비해서, Penta E, Penta D의 STR 패턴이 완벽하게 개선이 되지 않았다(도 3b, 중간 패널). 그런데, Penta E, CSF1PO, Penta D, FGA의 각각 primer 한 쌍을 사용하여 선행 증폭을 진행하자, 각각의 STR fluorescence peak이 완벽하게 개선이 되는 것을 확인 하였다(도 3b, 오른쪽 패널).
이러한 결과를 통해, STR loci의 증폭 산물 길이에 따라서 분별 선행 증폭을 하는 방법과 multiple 선행 증폭을 조합함으로써, 심각한 손상을 입은 DNA 시료의 STR 분석 효율을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 4> 실제 DNA 시료를 이용하여 분별 선행 증폭에 의한 STR 분석 실시
상기한 분별 선행 증폭 방법이 실제 손상된 법과학 DNA 시료에서도 적용이 되는지 확인을 하기 위해서 법과학 혈액 DNA 시료를 사용하여 분별 선행 증폭법을 시행하였다.
구체적으로, 법과학 혈액 DNA 시료는 대검찰청에서 STR 분석 결과를 제공받아 실험에 적합한 시료들을 선택하였다. 총 82개의 혈액 DNA 시료 중 42번과 76번을 선택하여 실험을 진행하였다. 2 ng의 42번 시료를 사용하였고, D18S51, Penta E, D16S539, CSF1PO, Penta D, D8S1179, TPOX, FGA, 총 8개의 STR loci를 동시에 선행 증폭 하였다. 선행 증폭 된 loci는 자성비드를 사용하여 수집하였고, 일반적인 STR 분석을 통해서 보기 어려웠던 D18S51, D16S539, D8S1179, TPOX의 STR 패턴을 확인할 수 있었다(도 4a, 왼쪽 패널).
더 나아가 Penta E, CSF1PO, Penta D, FGA 만을 분별하여 선행 증폭하여 STR 패턴을 확인할 수 있었다 (도 4b, 오른쪽 패널). 일반적인 STR 분석을 하였을 때는 Penta E, Penta D의 정확한 fluorescence 패턴이 관찰되지 않았다. 그러나, 그 외의 STR loci는 선행 증폭 이후의 fluorescence 패턴과 일반적인 STR fluorescence의 패턴이 정확하게 일치하였다. 같은 실험을 76번 혈액 DNA 시료를 사용하여 한번 더 진행하였으며, 같은 결과를 관찰할 수 있었다(도 4b). 이러한 결과를 통해서 분별 선행 증폭을 통한 STR 분석법이, 일반적인 STR 분석법으로는 STR 패턴을 확인할 수 없을 정도로 극히 손상된 DNA 시료의 STR 패턴을 확인하는데 효과적이라는 것을 확인하였다..
이러한 결과를 통하여, 증폭 산물의 길이가 긴 STR loci는 loci에 특이적인 primer를 사용하여 선행 증폭을 통해 충분히 증폭될 수 있다는 것을 알 수 있었다. 결과들을 종합하면, 선행 증폭법은 법과학 DNA 시료에 응용될 수 있으며, 이를 통해 그동안 분석하기 어려웠던, 증폭 산물의 길이가 긴 STR loci의 fluorescence 패턴을 복구할 수 있다는 것을 알 수 있다.
<110> THE REPUBLIC OF KOREA(SUPREME PROSECUTORS' OFFICE) <120> Forensic profiling by differential pre-amplification of STR loci <130> 15p-07-023 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-F <400> 1 ccggaggtaa aggtgtctta aagt 24 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-F30 <400> 2 ccggaggtaa aggtgtctta aagtgagaaa 30 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-F35 <400> 3 ccggaggtaa aggtgtctta aagtgagaaa gaata 35 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-TG <400> 4 tgctaaccac cctgtgtctc agttttccta 30 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-R <400> 5 atttcctgtg tcagaccctg tt 22 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-R30 <400> 6 atttcctgtg tcagaccctg ttctaagtac 30 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-R35 <400> 7 atttcctgtg tcagaccctg ttctaagtac ttcct 35 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO-R40 <400> 8 atttcctgtg tcagaccctg ttctaagtac ttcctatcta 40 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-F25 <400> 9 ttcttgagcc cagaaggtta aggct 25 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-F35 <400> 10 ttcttgagcc cagaaggtta aggctgcagt gagcc 35 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-R30 <400> 11 ctaccagcaa caacacaaat aaacaaaccg 30 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-R40 <400> 12 ctaccagcaa caacacaaat aaacaaaccg tcagcctaag 40 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-Tm60 <400> 13 cctaaggtgg acatgttggc t 21 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-Tm67 <400> 14 acagagagaa gccaacatgt ccacc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-GC54 <400> 15 gccatgttca tgccactgca cttc 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51-TG <400> 16 cgtcagccta aggtggacat 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penta D-F <400> 17 gaaggtcgaa gctgaagtg 19 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penta D-R <400> 18 attagaattc tttaatctgg acacaag 27 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D21S11 <400> 19 tgtattagtc aatgttctcc agagac 26 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D16S539-F <400> 20 gggggtctaa gagcttgtaa aaag 24 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D16S539-R <400> 21 gtttgtgtgt gcatctgtaa gcatgtatc 29 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D16S539-R35 <400> 22 gtttgtgtgt gcatctgtaa gcatgtatct atcat 35 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penta E-F <400> 23 attaccaaca tgaaagggta ccaata 26 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penta E-R <400> 24 tgggttatta attgagaaaa ctccttacaa ttt 33 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8S1179-F <400> 25 attgcaactt atatgtattt ttgtatttca tg 32 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8S1179-R <400> 26 accaaattgt gttcatgagt atagtttc 28 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPOX-F <400> 27 gcacagaaca ggcacttagg 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPOX-R <400> 28 cgctcaaacg tgaggttg 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA-F <400> 29 ggctgcaggg cataacatta 20 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA-R <400> 30 attctatgac tttgcgcttc agga 24

Claims (12)

1) 분석 대상이 되는 DNA 시료에서 타겟(target) STR(Short tandem repeats) 유전좌위를 하나 또는 둘 이상 결정하는 단계;
2) 단계 1)에서 결정된 STR 유전좌위에 대응되는 프라이머들을 이용하여 증폭시키는 선행 증폭 단계;
3) 자성비드(magnetic bead)를 이용하여 단계 2)의 선행 증폭을 거친 산물 중 자성비드에 결합된 타겟 STR 유전좌위를 회수하는 단계;
4) 프라이머를 이용하여 단계 3)을 거친 유전좌위를 다시 증폭시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 증폭된 산물로부터 STR을 분석하는 단계;를 포함하는, 손상된 DNA로부터 STR 프로파일(profile)을 분석하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 시료는 DNA를 포함하는 모든 생물학적 시료(biological sample)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 머리카락, 체모, 손톱, 발톱, 타액, 눈물, 소변, 대변, 콧물, 구강세포, 상피세포, 골조직, 피부조직, 근육조직, 내장조직, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수, 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 시료 중 DNA량은 50 pg 이상 500 pg 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 STR 유전좌위는 D18S51, D16S538, D8S1179, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), CSF1PO(Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene), Penta E, Penta D 및 FGA(Human fibrinogen alpha chain)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머들은 형광물질이 표지된 것, 표지되지 않은 것 및 둘 모두로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 선행 증폭시 증폭 산물의 길이에 따라 프라이머의 비율을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 손상은 물리적, 화학적 또는 생물학적 손상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 손상은, 상기 단계 2)의 선행 증폭을 거친 산물의 길이가 100 bp 이상이며 150 bp 미만인 유전좌위의 형광 단위(fluorescence unit) 값을, 선행 증폭을 거친 산물의 길이가 300 bp 이상이며 460 bp 미만인 유전좌위의 형광 단위 값으로 나눈 수치가 5 이상 10 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계의 2)의 선행 증폭은 STR 유전좌위 중 380 bp 보다 긴 유전좌위를 대상으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 선행 증폭은 결정된 STR 유전좌위 중 315 bp 미만의 것과 315 bp 이상의 것을 구별하여, 각각의 프라이머들을 이용하여 따로 분별 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 방법을 이용하여 STR 프로파일(profile)을 분석한 결과를 평가함으로써 특정 생물을 판정하거나 특정 인물의 신원을 확인하는 방법.

KR1020150112362A 2015-08-10 2015-08-10 Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법 KR101716108B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150112362A KR101716108B1 (ko) 2015-08-10 2015-08-10 Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150112362A KR101716108B1 (ko) 2015-08-10 2015-08-10 Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170018994A true KR20170018994A (ko) 2017-02-21
KR101716108B1 KR101716108B1 (ko) 2017-03-15

Family

ID=58313680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150112362A KR101716108B1 (ko) 2015-08-10 2015-08-10 Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101716108B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990064640A (ko) * 1999-04-22 1999-08-05 김태정 한국인 집단에서 변별력을 가진 에스티알 유전자좌들로 구성된 콰드루플렉스 피씨알 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식방법
KR101008828B1 (ko) * 2010-03-12 2011-01-19 대한민국 한국인 집단에서 변별력을 가진 16개의 짧은 반복 단위 유전좌위들 및 성염색체 유전좌위를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식 방법
KR101457983B1 (ko) * 2014-05-15 2014-11-06 대한민국 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 상염색체 분석 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990064640A (ko) * 1999-04-22 1999-08-05 김태정 한국인 집단에서 변별력을 가진 에스티알 유전자좌들로 구성된 콰드루플렉스 피씨알 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식방법
KR101008828B1 (ko) * 2010-03-12 2011-01-19 대한민국 한국인 집단에서 변별력을 가진 16개의 짧은 반복 단위 유전좌위들 및 성염색체 유전좌위를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식 방법
KR101457983B1 (ko) * 2014-05-15 2014-11-06 대한민국 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 상염색체 분석 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ham SK., et al., Electrophoresis. Vol.35(21-22), pp.3158-3164. (2014. 10. 1.)* *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101716108B1 (ko) 2017-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101823368B1 (ko) 돈육내 다가 불포화지방산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
EP2635706B1 (en) Method for detecting the presence of a dna minor contributor in a dna mixture
US9624542B2 (en) Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (FFPE) samples by quantitative PCR
JP6100933B2 (ja) アレリックラダー遺伝子座
WO2011032054A2 (en) Analysis of y-chromosome str markers
EP3676401B1 (en) A primer for next generation sequencer and a method for producing the same, a dna library obtained through the use of a primer for next generation sequencer and a method for producing the same, and a dna analyzing method using a dna library
CN108913757B (zh) 一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用
CN108070658B (zh) 检测msi的非诊断方法
KR101777161B1 (ko) 개의 고관절이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 멀티플렉스 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법
KR20180053743A (ko) 짧은 호모폴리머릭 반복서열의 개선된 검출법
WO2009083989A1 (en) Methods for dna authentication
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
KR101716108B1 (ko) Str 유전좌위의 분별 선행 증폭을 통한 유전자 감식 방법
KR101686438B1 (ko) 육질 및 스트레스에 대한 내성이 강화된 흑돼지 및 그의 제조방법
EP4107287A1 (en) Novel y-chromosomal short tandem repeat markers for typing male individuals
KR101854896B1 (ko) 토종견 품종 확인용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
CN105886497A (zh) 多态性短串联重复基因座等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用
KR101341943B1 (ko) Ｓｔｒ 검출용 키트 및 이를 이용한 ｓｔｒ 검출 방법
RU2818323C2 (ru) Способ получения полноразмерной последовательности митохондриальной ДНК человека с использованием набора олигонуклеотидов методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК
KR100901817B1 (ko) 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한한우 개체 판별방법
JP5530185B2 (ja) 核酸検出方法及び核酸検出用キット
KR101823376B1 (ko) 돈육내 스테아릭산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
KR20180052237A (ko) 단일염기다형성 분석을 이용한 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물
JP2009089687A (ja) 遺伝子多型の識別方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant