KR100901817B1 - 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한한우 개체 판별방법 - Google Patents

한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한한우 개체 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우개체 판별방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Multiplex-PCR을 수행할 수 있으므로 한우의 개체 동일성 검사를 신속하고 용이하게 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 검정력을 가지는 PCR용 프라이머 세트, 상기 프라이머를 이용한 한우 개체 판별방법 및 판별키트를 제공한다.
한우, 생산이력체계, Multiplex-PCR, 프라이머

Description

한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 개체 판별방법{A PRIMER SETS FOR CONSTRUCTING TRACEABILITY IN HANWOO AND METHOD OF SELECTING HANWOO BY USING THE SAID PRIMER SET SAME}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Multiplex-PCR에 사용할 수 있는 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트에 이용할 프라이머의 선택 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머의 선택을 위한 프라이머 세트의 통계 분석 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 각 대립유전자의 크기를 이용한 Multiplex-PCR용 프라이머 세트 설계 과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자의 개수에 따른 두 개체간의 동일할 확률(MP 값)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 한우를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 분석한 한우를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 개체 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Multiplex-PCR이 가능한 8종의 프라이머 세트 및 이를 이용하여 한우 혈액으로부터 추출한 DNA에 대해 Multiplex-PCR을 수행하여 한우의 개체 동일성 검사를 수행함으로써 신속하고 용이하게 한우의 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
한우는 우리나라 고유의 품종으로 우리나라의 축산업을 주도하는 유일한 재래가축인 동시에 질적인 면에서 국제적인 경쟁력을 잠재하고 있는 것으로 인정받고 있는 가축 품종이다. 한편, 축산시장의 개방화가 가속화되면서 수입 쇠고기 및 생육의 수입이 자유화됨에 따라 값싼 수입육으로 인해 국내산 쇠고기의 소비가 점차 위축되면서, 국내 축산업 특히 한우 사육과 관련된 축산업의 어려움이 가중되고 있다. 이러한 어려움은 단순히 한우와 수입육의 가격차에 의한 것이라기보다는, 젖소고기의 한우육 둔갑육판매, 이표조작으로 인한 질병검사 조작과 원산지표시의 불투명으로 인하여 소비자의 신뢰도가 낮아져, 한우 판매 시장의 위축되기 때문이다. 특히, 한미 FTA 협상으로 이러한 현상이 가속화 되어, 국내 축산업의 어려움은 더욱 더 가중될 것으로 예상되고 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 한우와 젖소 또는 수입육 등을 구 별하고, 한우육의 품종 혹은 개체를 정확하게 식별할 수 있는 기법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
외국의 경우 상기와 같은 문제점을 근본적으로 해결하기 위한 방안으로 생산이력추적체계(traceablility)를 모색하고 있으며, 현재 일본, 호주, 프랑스 및 미국 등에서는 생산이력체계를 이미 구축하고 있다. 상기와 같은 외국의 예를 고려하면, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 기술 개발의 요구는 최종적으로 한우의 생산·도축·가공·유통과정의 각 단계별 정보를 기록·관리, 문제발생시 이동경로를 따라 추적 또는 소급하여 신속한 원인규명 및 조치를 가능하게 하는 생산이력체계의 구축을 목표로 한다.
현재 국내에서는 마이크로세틀라이트(microsatellite DNAs)을 이용하여 개체 DNA typing을 수행함으로써 한우의 생산이력체계를 위한 시스템 구축을 시도하고 있다.
상기 마이크로세틀라이트는 전체 염색체 DNA에서 약 40 %정도 분포되어 있고, 다양한 polymorphism을 가지므로, 이를 이용할 경우 품종간 또는 개체간의 동정이 이루어질 수 있다(A. Arana et al., Meat traceability using DNA markers: application to the beef industry. Meat Science 61:367 - 373(2002)). 현재 마이크로세틀라이트에 대한 연구는 대부분 외래품종을 대상으로 진행되고 있다.
한편, 동물에 대한 개체의 동일성 검사에 사용되는 기존 방법은 혈액형 및 생화학적인 지표의 다형성 분석방법이 사용되어 왔다. 그러나 소에 있어서 혈액형검사는 정확한 부계혈통을 결정하지 못하는 단점이 있다(GLowatzki-Mullis et al., Microsatellite-based parentage control in cattle. Anim. Genorne. 26, 7-12.(1995)). 이로 인해, 소에 있어서 개체의 동일성 검사는 DNA 다형성(DNA polymorphism)에 기초하여 개발된 다양한 유전적 분석방법들에 의해 수행되고 있다(Peelman, L et al. Evaluation of the genetic variability of 23 bovine microsatellite markers in Four Belgian cattle breeds. Anim. Genet. 29, 161-167(1998)).
상기한 바와 같이 소의 개체의 동일성 검사에 사용되는 다양한 유전자 분석방법들 중, DNA 마커(marker)로 마이크로세틀라이트를 사용하는 경우, 현재 마이크로세틀라이트에 대한 연구가 대부분 외래품종을 대상으로 진행되었다는 점을 착안하여 최근 외래품종에서 규명되어진 마이크로세틀라이트를 한우에 적용한 결과, 한우는 외래품종의 소의 경우와 마이크로세틀라이트에서 차이를 보인다는 것이 확인되었다(Yeo, J. S. et al., Identification and analysis of functional quantitative trait loci and single nucleotide polymorphisms affecting economic traits in Hanwoo. Ministry of Agriculture and Forestry. 1-289(2005)).
구체적으로, 국내에서 통상적으로 개체 유전자 검사에 사용되는 도구는 세계동물유전학회(ISAG)에서 소 비교동정 시험용으로 제시한 마이크로세틀라이트 마커(microsatellite marker)를 바탕으로 Applied Biosystems사에서 제조하여 판매하는 StockMarker for Cattle® Bovine Genotyping kit으로, 상기 제품을 사용하는 경 우 비용이 비싸다는 문제점뿐만 아니라, 외국품종을 대상으로 선택된 마이크로세틀라이트를 사용하기 때문에 국내현실에서 적용하기에는 어렵다는 문제점이 있다는 것이 확인되었다.
따라서, 한우의 이력체계에서 개체식별에 유용한 DNA 마커 특히, 마이크로세틀라이트의 개발이 요구되고 있다.
또한, 한우의 생산이력체계를 위한 시스템을 구축하기 위해서 하나의 마이크로세틀라이트만을 사용하기 위해서는 검정력이 낮을 수 있다는 문제점이 있으므로, 기존의 외국품종에 대하여 연구된 마이크로세틀라이트와 한우 특유의 마이크로세틀라이트 중에 검정력, 검사의 용이성 및 Multiplex-PCR 수행 효율이란 측면에서 모두 우수한 마이크로세틀라이트 조합을 찾아내고, 이를 이용하여 한우 개체식별을 위한 한우 식별 키트 및 한우 식별 방법을 제공하여 최종적으로 한우의 생산이력체계를 가능하게 할 수 있는 검출법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 한우 생산이력체계를 구축하기 위하여, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 이용한 한우 개체 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트 및 중합효소를 포함하는 한우 개체 판별용 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한우 생산이력체계를 구축하기 위하여, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍을 포함하고, 추가로 서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 1 이상을 더욱 포함하는 프라이머 세트일 수 있으며, 바람직하게는 제1 프라이머쌍 내지 제8 프라이머쌍으로 이루어진 프라이머세트일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 이용한 한우 판별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트, 반응완충액 및 중합효소를 포함하는 한우 판별용 검출키트를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 한우 생산이력체계를 구축하기 위하여, 개체식별에 유용한 DNA 마커, 구체적으로는 마이크로세틀라이트의 이형접합체(Heterozygote; H)와 다형성 정보량(Polymorphism Information content; PIC)를 분석하고, 상기 마이크로세틀라이트의 정보를 이용하여 여러 가지 마이크로세틀라이트의 조합들의 검정력을 MP(Match Probability)와 R(Relatedness)계수를 통해 검토한 후, 현실 데이터에서 선택된 조합을 적용한 결과분석을 고려하여 최종적으로 개체식별에 유용한 마이크로세틀라이트 및 이를 이용하여 개체를 식별할 수 있는 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머세트를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 한우(Hanwoo)란 한국 고유의 소품종으로 수 천년동안 한국 풍토에 적응하여 그에 적합한 체질로 고정되었으며 역용(일소) 또는 육용으로 사육되는 가축을 말한다.
본 발명의 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 한우 고유의 유전적 다형성(Polymorphism)을 고려하여 한우 개체를 비교 동정할 수 있는 여러 종류의 프라이머 쌍을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 Multiplex-PCR용 프라이머 세트일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 한우의 마이크로세틀라이트를 탐지할 수 있는 2 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 Multiplex-PCR용 프라이머 세트일 수 있다. 상 기 마이크로세틀라이트는 다형성이 높기 때문에, 한우 개체를 비교동정하기 위한 시험에 사용하는 DNA 마커(DNA marker)로 사용될 경우 그 유용성이 높을 수 있다.
상기 Multiplex-PCR은 동시에 2개 이상의 프라이머를 이용하여 한번의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함으로써, 여러 종류의 프라이머에 의한 검색결과를 확인하는 PCR 방법이다. 따라서, Multiplex-PCR을 수행하여 다수의 마이크로세틀라이트에 의한 한우 개체를 비교동정하기 위해서는, 상기 프라이머는 하기와 같은 조건을 만족하여야 한다.
첫 번째, 상기 마이크로세틀라이트는 각 마이크로세틀라이트 마다의 고유한 크기가 존재하기 때문에, 본 발명의 마이크로세틀라이트는 여러 개의 마이크로세틀라이트 간의 고유한 영역을 침범하지 않는 범위 내에서 구성되도록 작성하여야 하며, 본 발명의 프라이머는 상기 마이크로세틀라이트의 고유한 크기를 확인할 수 있도록 작성하여야 한다. 구체적으로는, 상기 선택된 마이크로세틀라이트를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 목표 DNA(target DNA) 단편의 양 쪽 끝에서 안쪽으로 20 bp 내외의 염기서열에 대응하여야 하고, 여러 개의 마이크로세틀라이트의 고유한 영역을 침범하지 않도록 프라이머를 제작하여야 한다.
두 번째, 상기 프라이머의 증폭온도가 서로 동일하여야 한다. Multiplex-PCR은 한번의 PCR을 통하여 원하는 결과를 확인하여야 하기 때문에, 증폭온도가 서로 동일하여야만 한다.
세 번째, 상기 프라이머는 마이크로세틀라이트간의 간섭현상(Dimer) 또는 간섭효과가 없어야 한다. 간섭현상은 DNA 마커, 구체적으로는 복수의 마이크로세 틀라이트들간에 증폭합성되는 마이크로세틀라이트의 크기(size)나 프라이머의 증폭온도가 비슷하더라도, 마이크로세틀라이트를 2 이상 사용하는 경우 각 마이크로세틀라이트가 가지는 고유한 검출결과(peak)가 생성되지 못하게 방해하는 현상이다. 따라서, 복수의 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머를 사용하는 Multiplex-PCR의 경우에는 간섭효과를 방지하기 위해서 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머를 선택 또는 제작하여야 한다.
또한, 연관불균형(Linkage disequilibrium)에 의한 효과를 얻기 위하여 가능한 서로 다른 염색체에 존재하는 마이크로세틀라이트를 이용하는 것이 바람직하다. 즉, 같은 염색체 상에 존재하는 마이크로세틀라이트를 이용하는 경우 후대에 상기한 마이크로세틀라이트가 전달되게 되어 적절하지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명에서는 285개의 마이크로세틀라이트 집합에서 상기와 같은 조건을 만족하는 마이크로세틀라이트 즉, 프라이머의 증폭온도가 서로 동일하고, 마이크로세틀라이트 간의 고유한 영역을 침범하지 않는 범위 내이며, 마이크로세틀라이트의 크기가 90 bp 내지 270 bp에 존재하고, 대립유전자가 5개 이상이며, 이상접합체빈도(Heterozygosity; H)와 다양성정보상수(Poylmorphism Information Content; PIC) 값이 모두 높은 값을 가지는 마이크로세틀라이트를 선택하였다.
상기 285개의 마이크로세틀라이트 집합은 USDA-MARC에서 발표된 마이크로세틀라이트, 특히 상기 USDA-MARC에서 발표된 마이크로세틀라이트 중에서 한우에서 확인된 염색체 2번, 6번, 17번 및 27번의 마이크로세틀라이트 DNA, 한우 BAC clone library에서 확인된 마이크로세틀라이트 DNA 및 ISAG에서 소비교동정시험용으로 제 공되는 마이크로세틀라이트로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 본 발명의 프라이머 쌍은 상기 285개의 마이크로세틀라이트 DNA를 기초로 하여 작성된 것 중에서 상기 조건을 만족하는 마이크로세틀라이트 DNA를 기초로 하여 합성된 것일 수 있다.
상기 이상접합체빈도 및 다양성정보상수는 DNA 마커 바람직하게는 마이크로세틀라이트의 다양성을 나타내는 값을 의미한다. 보다 상세하게는 이상접합체빈도는 특정 DNA 마커에 대하여, 무작위로 선발된 개체가 상기 DNA 마커의 이형접합자일 경우의 확률을 의미하는 값으로, 상기 이상접합체빈도값은 0 내지 1 사이의 값일 수 있다. 상기 이상접합체빈도값은 개체별 DNA 유전형(DNA genotyping)에 대한 정보를 하기 계산식 1의 통계분석 모델에 의해 분석될 수 있다.
[계산식 1]
Figure 112007044912269-pat00001
상기 DNA 유전형의 분석과정은 일반적인 DNA 유전자형 분석과정(DNA genotyping)에 의해 수행될 수 있고, 바람직하게는 PAGE(Polyacrylamid Gel Electrophoresis)를 이용하거나, 자동염기서열분석장치를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 DNA 유전형의 분석과정을 포함한 Multiplex-PCR 프라이머 세트의 제작과정을 도 1에 개략적으로 나타내었다.
보다 상세하게는, 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, DNA 유전형의 분석과정 중, 상기 PAGE(Polyacrylamid Gel Electrophoresis)를 이용하는 방법은 시료(sample) 조직(Tissue) 또는 혈액으로부터 게놈 DNA(Genomic DNA)를 추출한 다음, 각각의 DNA에 대해 PCR을 수행하고, 상기 PCR의 결과물을 1 % 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동(electophoresis)를 수행하여 PCR 반응 여부를 확인한 후에, 6% denaturing polyacrylamid gel(40% acrylamide solution, urea, 5X TBE buffer) 및 서열분석기(Sequencer), 구체적으로는 SQ3 sequencer(Hoefer Pharmacia Biotech Inc., USA) Electrophoresis를 이용하여 전기영동 하는 단계로 수행할 수 있다.
한편, 상기 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법은 시료(sample) 조직(Tissue) 또는 혈액으로부터 게놈 DNA(Genomic DNA)를 추출한 다음, 각각의 DNA에 대해 PCR을 수행하고, 상기 PCR의 결과물을 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 자동염기서열분석장치는 구체적으로는 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)일 수 있으며, 상기 분석장치에 의한 결과를 ABI PRISM GeneMapper v4.0 software(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 도출할 수 있다. 상기 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer를 사용하는 경우에는 상기 PCR을 수행하기 위한 각각의 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질(fluorescein)을 결합하여야 하며, 상기 형광물질은 형광물질이 결합된 상기 프라이머의 PCR 수행에 영향을 미치지 아니하고, 최대 흡광도가 상이하며, 형광물질의 가격이 경제적이라는 측면 을 고려하여 결정될 수 있으며, 현재 시판되는 다양한 형광물질 중에서 보편적으로 사용되는 형광물질을 사용하는 것이 바람직하다. 일 예로 상기 형광물질은 5'-FAM 및/또는 5'-HEX일 수 있다
또한, 다양성정보상수는 보다 상세하게는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률을 주어진 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하는 값을 의미한다. 상기 다양성정보상수값은 개체별 DNA 유전형(DNA genotyping)에 대한 정보를 하기 계산식 2의 통계분석 모델에 의해 분석될 수 있다.
[계산식 2]
Figure 112007044912269-pat00002
구체적으로, 상기 조건을 만족하고, Multiplex-PCR을 수행할 수 있는 프라이머를 선택하기 위하여, 상기 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머 세트의 증폭온도가 58 ℃로 동일하고, 마이크로세틀라이트의 크기가 90 bp 내지 270 bp이며, 대립유전자가 5개 이상이고, 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값이 상대적으로 높은 마이크로세틀라이트를 선택하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112007044912269-pat00003
a ; H(heterozygosity), b ; PIC(polymorphism information content), c; Tm(Annealing temperature)
상기 표 1에 나타낸 마이크로세틀라이트 중에서, 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium) 검정을 만족하는 마이크로세틀라이트를 본 발명에 적합한 마이크로세틀라이트로 선택하였다.
상기 하디-와인버그 평형이란 외적인 요인이 작용하지 않는다면, 유전자와 유전자형 빈도 모두가 변하지 않고 평형을 이루게 된다는 것으로 이것을 만족하는 집단은 대립유전형질의 독립성이 성립하게 된다. 따라서, 유전자 내에서 독립성 검정은 X 2 통계량을 이용한 적합도 검정으로 각 유전자형 범주에 대한 실제 관측빈도와 기대빈도를 이용하여 하기 계산식 3으로 구할 수 있다.
[계산식 3]
Figure 112007044912269-pat00004
상기 계산식 3에 의해 선택된 DNA 마커 즉, 상기 하디-와인버그 평형 검정을 만족한 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍; 및 서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 도 2에 개략적으로 나타낸 방법에 의해 제조될 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 제1 프라이머 쌍 내지 상기 제 5 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 쌍 및 이상접합체 값 및 다양성 정보량 값이 높은 마이크로세틀라이트, 바람직하게는 상기 표 1에 기재된 17개의 마이크로세틀라이트를 선택하고, 상기 선택된 프라이머 쌍 및 상기 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머 쌍으로 프라이머 세트를 조합하였다. 상기 조합된 프라이머 세트을 이용하여 Multiplex-PCR을 수행한 결과를 바탕으로 Match Probability(MP) 값을 측정하였으며, 상대적으로 MP 값이 우수한 프라이머 쌍을 선택하여 최종적으로 프라이머 세트를 제조할 수 있다.
상기 최종적으로 제조된 프라이머 세트는 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 상기한 MP 값이 우수한 마이크로세틀라이트로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 바람직하게는
서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍;
서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍;
서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍; 및
서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍을 포함하고,
추가로 서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍;
서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍 및
서열번호 15의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 프라이머 세트일 수 있으며,
더욱 바람직하게는 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는
서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍;
서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍;
서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍;
서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍;
서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍;
서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍 및
서열번호 15의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 구성하는 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머를 하기 표 2에 나타낸다.
마이크로세틀라이트 방향 서열(Primer sequence, 5' → 3') 서열번호 TmC(℃) PCR product size(bp)
제1 프라이머쌍 (BMS 1866) 정방향 CAGGGACTGAAAAATAATGCC 1 58 ℃ 134 - 158
역방향 TTCCATGTTGATTGTTTCTTCC 2
제2 프라이머쌍 (BMS 1242) 정방향 AGTGTGATCAACAACGGCAG 3 58 ℃ 98 - 130
역방향 AGTGACTGGTGCAGTGCTTG 4
제3 프라이머쌍 (HUJ 223) 정방향 CTGATGGAAGCAGGGAAAAC 5 58 ℃ 150 - 180
역방향 ATTGTGCAGGAGAACAGAAGC 6
제4 프라이머쌍 (BMS 3507) 정방향 GCCCAAAGAAAGAAGTATGTGC 7 58 ℃ 164 - 189
역방향 TAGTGCGGAGTCAGTCATGTG 8
제5 프라이머쌍 (HW-YU-MS#3) 정방향 CTGCTTCATTTGACGGAATG 9 58 ℃ 198 - 212
역방향 TGGAAGGAAACAGCTGGACT 10
제6 프라이머쌍 (ETH 104) 정방향 GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA 11 58 ℃ 212 - 224
역방향 CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC 12
제7 프라이머쌍 (BM 1818) 정방향 AGCTGGGAATATAACCAAAGG 13 58 ℃ 258 - 272
역방향 AGTGCTTTCAAGGTCCATGC 14
제8 프라이머쌍 (HW-YU2CA-53) 정방향 TGTGGTCATGCTCTTCTCCA 15 58 ℃ 104 - 126
역방향 ACACGAGTCGGCAGAGTTTT 16
상기 표 2에 기재된 바와 같이, 상기 제1 프라이머 쌍 내지 제8 프라이머 쌍은 증폭온도의 값이 동일하고,
서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 134 bp 내지 158 bp이고,
서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 98 bp 내지 130 bp이고,
서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 150 bp 내지 180 bp이고,
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 164 bp 내지 189 bp이고,
서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 198 bp 내지 212 bp이고,
서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 212 bp 내지 224 bp이고,
서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 258 bp 내지 272 bp이고,
서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍을 이용하여 소의 게놈 DNA를 증폭시키는 경우에 증폭 산물의 크기는 104 bp 내지 126 bp이다.
상기 제1 프라이머 쌍 내지 제8 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있고, 바람직하게는 Multiplex-PCR에 사용될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 각 프라이머의 PCR을 수행한 결과 얻어지는 고유한 DNA 증폭 산물의 크기를 확인하기 위한 물질을 추가로 결합한 것일 수 있다. 상기 증폭 산물을 확인하기 위한 물질은 바람직하게는 형광물질(fluorescein)일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 프라이머는 각 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질(fluorescein)을 결합한 것일 수 있다. 상기 형광물질은 형광물질의 상기 프라이머의 PCR 수행에 영향을 미치지 아니하고, 최대 흡광도가 상이하며, 형광물질의 가격이 경제적이라는 측면을 고려하여 결정될 수 있으며, 바람직하게는 5'-FAM 및/또는 5'-HEX일 수 있다. 상기 형광물질인 5'-FAM는 최대 흡광도가 496 nm이고, 5'-HEX는 최대 흡광도가 538 mm이므로, 상기 형광물질인 5'-FAM와 5'-HEX를 함께 사용하는 경우에는 마이크로세틀라이트가 가지는 고유한 크기를 확인할 수 있어 서로 마이크로세틀라이트의 크기가 중복되는 마이크로세틀라이트의 경우, 각각의 프라이머에 서로 다른 형광물질을 결합시켜(modification) 중복을 회피시킬 수 있는 유리한 효과가 있다.
바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 18의 염기서열은 염기서열을 확인하기 위하여 첫 번째 염기에 형광물질(fluorescein)을 결합한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5'-FAM 및/또는 5'-HEX를 결합한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 11의 프라이머는 첫 번째 염기에 5'-FAM를 결합한 것이고, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13 및 서열번호 15의 프라이머는 첫 번째 염기에 5'-HEX를 결합한 것일 수 있다 .
또한, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 이용한 한우 개체 판별방법을 제공하며, 구체적으로 상기 한우 개체 판별방법은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 한우 판별방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체에에서, 본 발명은 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 한우 판별용 검출키트를 제공한다.
본 발명의 한우 개체 판별방법 및 판별용 검출키트는 상기 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 판별 대상이 되는 한우 개체를 동정하거나, 상기 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상을 이용하여 Multiplex-PCR을 수행함으로써, 판별 대상이 되는 한우 개체를 판별할 수 있다.
구체적으로, 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 상기 본 발명의 프라이머 세트일 수 있으며, 바람직하게는 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는
서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍;
서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍;
서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍;
서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍;
서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍;
서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍 및
서열번호 15의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 바람직하게는 첫 번째 염기에 5'-FAM를 결합한 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 11의 프라이머와 첫 번째 염기에 5'-HEX를 결합한 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13 및 서열번호 15의 프라이머와 형광물질을 결합하지 않은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 16의 프라이머를 갖는 것일 수 있다.
상기 한우 개체 판별방법은 바람직하게
a) 소의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 DNA, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응용액을 제조하는 단계;
c) 상기 제조된 PCR 반응용액에 대해 PCR을 수행하는 단계 및
d) 상기 PCR 수행 결과를 분석하는 단계
를 포함하는 한우 개체 판별방법일 수 있다.
상기 a) 단계의 소의 게놈 DNA는 바람직하게는 소의 조직 또는 혈액으로부터 채취한 게놈 DNA, 더욱 바람직하게는 소의 혈액으로부터 채취한 게놈 DNA 일 수 있다. 상기 a) 단계의 게놈 DNA를 추출하는 단계는 일 예로 판별대상이 되는 소에서 채취한 혈액을 원심분리하여 백혈구를 제거하고, 상기 백혈구가 제거된 혈액을 용혈시킨 후에, DNA를 용출시킨 후에, 단백질을 제거하고 DNA만을 추출하는 방법으로 수행하거나, 게놈 DNA 추출 키트를 이용하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 b) 단계의 PCR 반응용액을 제조하는 단계는 상기 a) 단계에서 추출된 DNA, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 PCR 반응용액은 상기 추출된 DNA, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트, 중합효소연쇄반응을 이용한 통상적인 구성성분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적인 구성성분은 반응완충액, Taq DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다.
상기 추출된 DNA와 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트의 함량은 1 : 3 내지 3: 1(추출된 DNA : 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트)일 수 있고, 바람직하게는 1 : 2 내지 2 : 1 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 1일 수 있다.
삭제
상기 PCR 반응용액은 중합효소연쇄반응용 기기 또는 프라이머 쌍의 종류에 따라 적절한 조성으로 제조될 수 있다. 일 예로, 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 쌍을 함께 사용하는 경우, 상기 프라이머의 함량비는 하기 표 3과 같을 수 있고, 상기 PCR 반응용액의 함량은 하기 표 4와 같을 수 있다.
마이크로세틀라이트 방향 서열(Primer sequence, 5' → 3') 서열번호 volume mixture ratio
제1 프라이머쌍 (BMS1866) 정방향 FAM-CAGGGACTGAAAAATAATGCC 1 8 0.084
역방향 TTCCATGTTGATTGTTTCTTCC 2 8 0.084
제2 프라이머쌍 (BMS1242) 정방향 FAM-AGTGTGATCAACAACGGCAG 3 3 0.032
역방향 AGTGACTGGTGCAGTGCTTG 4 3 0.032
제3 프라이머쌍 (HUJ223) 정방향 HEX-CTGATGGAAGCAGGGAAAAC 5 7.5 0.079
역방향 ATTGTGCAGGAGAACAGAAGC 6 7.5 0.079
제4 프라이머쌍 (BM3507) 정방향 FAM-GCCCAAAGAAAGAAGTATGTGC 7 4 0.042
역방향 TAGTGCGGAGTCAGTCATGTG 8 4 0.042
제5 프라이머쌍 (HW-YU-MS#3) 정방향 HEX-CTGCTTCATTTGACGGAATG 9 8 0.084
역방향 TGGAAGGAAACAGCTGGACT 10 8 0.084
제6 프라이머쌍 (ETH104) 정방향 FAM-GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA 11 5 0.053
역방향 CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC 12 5 0.053
제7 프라이머쌍 (BM1818) 정방향 HEX-AGCTGGGAATATAACCAAAGG 13 7.5 0.079
역방향 AGTGCTTTCAAGGTCCATGC 14 7.5 0.079
제8 프라이머쌍 (HWYU2CA-53) 정방향 HEX-TGTGGTCATGCTCTTCTCCA 15 4.5 0.047
역방향 ACACGAGTCGGCAGAGTTTT 16 4.5 0.047
Total 95 1
1 Sample
Template 20ng 1
Primer Mix each 10pM/ul 1
dNTP each 0.05mM 0.3
MgCl2 1mM 0.6
10 x buffer 1.5
f-Taq 5U/㎕ 0.1
ddH2O 10.25
DMSO 0.25
Total 15
상기 표 3에 기재된 DNA의 부피의 기준은 ul이고, 상기 각 DNA의 농도는 10 pM/ul이다. 상기 PCR 반응용액에 포함되는 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트는 각각의 프라이머를 상기 표 3의 함량에 따라 혼합될 수 있고, 상기 PCR 프라이머 혼합액은 상기 표 3의 함량으로 첨가된 프라이머와 증류수(ddH2O)를 부피비를 기준으로 1 : 9로 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 c) 단계의 PCR은 바람직하게는 Multiplex-PCR일 수 있다.
상기 Multiplex-PCR의 반응조건은 Multiplex-PCR용 기기 또는 프라이머 쌍의 종류에 따라 적절한 조건으로 수행될 수 있다. 일 예로, 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 쌍을 함께 사용하는 경우, Multiplex-PCR의 반응조건은 하기 표 5와 같을 수 있다.
time
1 95 ℃ 20 min
2 95 ℃ 15 sec
3 58 ℃ 60 sec
4 72 ℃ 60 sec go to 2 step 34 time
5 72 ℃ 30 min
6 4 ℃ pause
상기 d) PCR 수행 결과를 분석하는 단계는 상기 PCR을 수행하여 증폭된 DNA를 이용하여 한우 개체를 판별하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 증폭된 DNA를 이용하여 한우 개체를 판별하는 방법은 상기 DNA의 크기 및 형광정도를 이용하여 분석하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 PAGE(Polyacrylamid Gel Electrophoresis)를 이용하는 방법이나, 상기 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법은 구체적으로는 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer를 사용하는 경우에는 상기 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질(fluorescein)의 최대 흡광도 범위에서의 형광정도 및 DNA의 크기를 이용하여 분석할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 제1 프라이머 쌍과 제2 프라이머 쌍을 이용할 경우, 독립인 두 동물 사이에 동일한 대립유전자(allele)를 가질 확률, 즉 MP 값이 1,000분의 2.5로 나타났고, 제1 프라이머 쌍, 제2 프라이머 쌍 및 제3 프라이머 쌍을 이용할 경우, MP 값이 10,000분의 1로 나타난 반면, 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 상을 모두 이용한 경우에는 1,000,000,000분의 2로 나타나는 것을 확인하였다.
상기한 결과로부터 제1 프라이머 쌍 내지 제 8 프라이머 쌍을 모두 이용하여 Multiplex-PCR을 수행하는 경우에는 판별대상이 사람이 아닌 동물 즉, 소라는 사실에 의해 R(Relatedness) 계수 또는 동물 오분류 확률(Percentage of animal incorrectly identified)을 고려하더라도, 생산이력추적체계를 구축할 수 있는 유효성을 가지는 것을 확인되었다.
상기 검출키트는 상기 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트, 및 중합효소연쇄반응을 이용한 소 개체 검출키트의 통상적인 구성성분을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적인 구성성분은 반응완충액 및/또는 DNA 중합효소 등일 수 있으며, 더욱 상세하게는 반응완충액, Taq DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다. 또한, 상기 검출키트는 추가로 PCR을 수행하기 위한 온도 조절 기능이 있는 통상적인 PCR용 기기를 포함할 수 있다.
본 발명의 한우 판별용 검출키트의 바람직한 일예로, 본 발명의 검출키트는 (i) 상기 표 3의 프라이머를 갖는 프라이머 세트; (ii) Taq DNA 중합효소(polymerase); (iii) dNTP; (iv) MgCl2; (v) 10 x 반응완충액; (vi) ddH2O; 및 (vii) DMSO를 포함하는 것일 수 있으며, 추가로 대상 시료인 판별 대상 한우 DNA를 포함하는 것일 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 판별 대상 한우 DNA의 추출
본 발명의 판별 대상 한우는 농협 중앙회 가축개량 사업소로부터 한우 집단의 혈연정보가 정확히 기재된 26차 내지 28차 국가 후대검정우 중, 동일한 아비로부터 생산된 자손의 수가 5두 이상인 36 가계 305두 중에서 조부와 부가 각각 서로 다른 개체 33두를 선택하여 이용하였다.
상기 33두의 한우로부터 항응고제(0.5M EDTA)가 처리된 진공주사기(Becton dickinson, USA)를 이용하여 5 cc 내지 10 cc의 혈액을 채취하였다. 상기 채취된 혈액은 50 ml falcon tube에 옮겨서 0.2 % NaCl 용액을 40 ml 정도 첨가하여 용혈(hemolysis)을 시킨 후에, 2,000 rpm에서 10 분간 원심분리를 수행하여 상등액을 수거하고 침전물을 제거함으로써, 백혈구층을 분리하였다. 상기 백혈구층이 분리된 혈액에 0.16 M NaCl이 포함된 1mM EDTA와 계면활성제 용액(0.5 % N-lauroylsarcosine sodium salt, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA)를 첨가하여 핵막 내 DNA를 용출시킨 후에, Proteinase K(10 ㎎/㎖, Promega Co. USA)를 150 μl를 첨가하고 65 ℃에서 12시간동안 처리하여 DNA 용출시켰다. 상기 용출된 DNA는 동일량의 dephenol용액과 dephenol : chloroform : isoamylalcohol(25:24:1)을 사용해서 단백질을 제거시킨 후, OD 측정값이 1.5 내지 1.8의 농도로 DNA를 추출하여 4 ℃에 보관하였다.
실시예 2 : 마이크로세틀라이트의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값 측정
한우 생산이력체계를 구축하기 위한, 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트에 포함될 마이크로세틀라이트를 선택하기 위하여, 후보군이 되는 285개의 마이크로세틀라이트 집합에서 프라이머의 증폭온도가 서로 동일하고, 마이크로세틀라이트 간의 고유한 영역을 침범하지 않는 범위 내이며, 마이크로세틀라이트의 크기가 90 bp 내지 270 bp에 존재하고, 대립유전자가 5개 이상이며, 이상접합체빈도(Heterozygosity; H)와 다양성정보상수(Poylmorphism Information Content; PIC) 값이 모두 높은 값을 가지는 마이크로세틀라이트를 선택하였다.
상기 285개의 마이크로세틀라이트 집합은 USDA-MARC에서 발표된 마이크로세틀라이트 중에서 한우에서 확인된 염색체 2번, 6번, 17번 및 27번의 마이크로세틀라이트 DNA, 한우 BAC clone library(Hanwoo BAC clone library)에서 확인된 마이크로세틀라이트 DNA 및 세계동물유전학회(ISAG)에서 소비교 동정시험용으로 제공되는 마이크로세틀라이트로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 실시예 1에서 추출한 게놈 DNA(genomic DNA)에 대하여 상기 285개의 마이크로세틀라이트의 각각의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값의 측정은 각각의 DNA에 대해 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행한 후에, 6 % PAGE gel을 이용하여 genotyping을 수행한 후에, 상기 genotyping 결과를 통계분석하여 수행하였다.
보다 상세하게는, 상기 PCR은 각각의 마이크로세틀라이트의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값을 측정하기 위하여, 상기 마이크로세틀라이트 부위를 확인할 수 있는 프라이머를 이용하여 하기 표 6 및 표 7과 같은 방법으로 수행하였으며, 상기 각각의 마이크로세틀라이트의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값을 측정하기 위하여 실시예 1의 소의 게놈 DNA를 Template으로 사용하였다.
Template 20 ng
Primer each 10 pM/ul
dNTP each 0.2mM
MgCl2 1 mM
1 x PCR buffer
Taq Polymerase 1 U/㎕
ddH2O
DMSO
Total
time
1 95 ℃ 20 min
2 95 ℃ 15 sec
3 58 ℃ 60 sec
4 72 ℃ 60 sec go to 2 step 34 time
5 72 ℃ 30 min
6 4 ℃ pause
상기 PCR을 수행하여 얻은 결과를 1 % 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 반응의 유무를 확인하였다. 상기 반응을 확인한 PCR 산물을 6 % dentaturing polyacrylamide gel(40% acrylamide solution, Urea, 5 X TBE buffer)를 사용하여 SQ3 sequencer(Hoefer Pharmacia Biotech Inc, USA)에서 전기영동을 수행하여 PCR 산물의 서열을 분석한 후에, 상기 분석한 결과를 기초로 상기 285개의 마이크로세틀라이트의 각각의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값을 측정하였으며, 그 중 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값이 상대적으로 높은 것으로 확인된 마이크로세틀라이트를 선택하였고, 그 결과를 표 8에 기재하였다.
Figure 112007044912269-pat00005
상기 표 8에 기재된 바와 같이, 하디-와인버그 평형 검정의 결과로 선택된 BMS 1886, BMS 1242, HUJ 223, BMS 3507 및 HW-YU-MS#3와 HW-YU2CA-53등을 포함한 17개의 마이크로세틀라이트가 선택되었다.
실시예 3 : Multiplex-PCR용 프라이머 세트의 선택 및 MP 값의 측정
상기 실시예 2에서 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값이 상대적으로 높은 것으로 확인된 표 1에 기재된 마이크로세틀라이트를 이용하여 도 3에 나타낸 바와 같이, 50개의 Multiplex-PCR용 프라이머 세트를 위한 프라이머 세트 조합을 작성하였다.
상기 작성된 프라이머 세트 조합을 이용하여 한우 개체를 동정하기 위해 가장 적합한 조합을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트 조합을 이용하여 시료 DNA에 대해 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하고, ABI PRISM 3130 XL Genetic analyer(Applied Biosystems, CA)를 이용하여 전기영동을 수행하였, ABI PRISM GeneMapper v4.0 software(Applied Biosystems, CA)와 파장이 각기 다른 두 형광물질인 5'-FAM 및 5'-HEX를 이용하여 실험을 수행하였다.
보다 상세하게는, 상기 PCR은 각각의 마이크로세틀라이트의 이상접합체빈도 값 및 다양성정보상수 값을 측정하기 위하여, 상기 마이크로세틀라이트 부위를 확인할 수 있는 프라이머를 이용하였으며, 상기 프라이머는 동일한 결합온도, 즉 58 ℃에서 결합할 수 있도록 제작되었다. 또한, 동일한 PCT 산물의 크기로 인하여 중복된 결과를 구분하기 위하여, 각각의 마이크로세틀라이트 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질인 5'-FAM 또는 5'-HEX를 결합하여 사용하였다.
상기와 같이 결합하여 사용한 50개의 Multiplex-PCR용 프라이머 세트를 위한 프라이머 세트 조합을 이용하여 실험한 결과를 바탕으로 Multiplex-PCR 조건을 충족하고, DNA 분석 시 가장 정확한 peak를 타나내며, 각 마이크로세틀라이트가 가지는 대립유전자의 크기가 서로 겹치지 않고, PCR 수행시 프라이머의 결합온도가 동일하며, dimer 현상이 일어나지 않는 프라이머 조합을 선택하여 최종적으로 프라이머 세트를 제조하여 하기 표 9에 나타내었다.
마이크로세틀라이트 방향 서열(Primer sequence, 5' → 3') 서열번호 volume mixture ratio
제1 프라이머쌍 (BMS1866) 정방향 FAM-CAGGGACTGAAAAATAATGCC 1 8 0.084
역방향 TTCCATGTTGATTGTTTCTTCC 2 8 0.084
제2 프라이머쌍 (BMS1242) 정방향 FAM-AGTGTGATCAACAACGGCAG 3 3 0.032
역방향 AGTGACTGGTGCAGTGCTTG 4 3 0.032
제3 프라이머쌍 (HUJ223) 정방향 HEX-CTGATGGAAGCAGGGAAAAC 5 7.5 0.079
역방향 ATTGTGCAGGAGAACAGAAGC 6 7.5 0.079
제4 프라이머쌍 (BM3507) 정방향 FAM-GCCCAAAGAAAGAAGTATGTGC 7 4 0.042
역방향 TAGTGCGGAGTCAGTCATGTG 8 4 0.042
제5 프라이머쌍 (HW-YU-MS#3) 정방향 HEX-CTGCTTCATTTGACGGAATG 9 8 0.084
역방향 TGGAAGGAAACAGCTGGACT 10 8 0.084
제6 프라이머쌍 (ETH104) 정방향 FAM-GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA 11 5 0.053
역방향 CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC 12 5 0.053
제7 프라이머쌍 (BM1818) 정방향 HEX-AGCTGGGAATATAACCAAAGG 13 7.5 0.079
역방향 AGTGCTTTCAAGGTCCATGC 14 7.5 0.079
제8 프라이머쌍 (HWYU2CA-53) 정방향 HEX-TGTGGTCATGCTCTTCTCCA 15 4.5 0.047
역방향 ACACGAGTCGGCAGAGTTTT 16 4.5 0.047
Total 95 1
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 구성된 프라이머이고, 상기 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질이 결합되어 있으며, 상기 형광물질의 결합은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 11의 프라이머는 첫 번째 염기에 5'-FAM를 결합하고, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13 및 서열번호 15의 프라이머는 첫 번째 염기에 5'-HEX를 결합하여 수행하였다.
상기와 같이 결합하여 사용한 50개의 Multiplex-PCR용 프라이머 세트를 위한 프라이머 세트 조합을 이용하여 실험한 결과를 바탕으로 Match Probability(MP) 값을 측정하였다. 상기 Match Probability(MP)는 독립인 두 동물 사이에 동일한 대립유전자를 가질 확률 값으로, 유전자형의 도수들은 독립성이 보장되어야 함을 전제조건으로 하고, 비교하려는 개체와 우연히 동일한 유전자형을 가진 개체가 존재할 확률을 나타내는 것이므로, 유전자 검사 및 비교 동정에서 확률은 주로 MP 값으로 그 유효성을 나타낸다.
상기와 같이 결합하여 사용한 50개의 Multiplex-PCR용 프라이머 세트를 위한 프라이머 세트 조합을 이용하여 실험한 결과 상기 표 9에 나타낸 프라이머 세트를 이용한 결과가 다른 조합에 비하여 가장 우수한 것으로 나타났다.
보다 상세하게는, 상기 표 9에 나타낸 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1의 각각의 33두의 시료 게놈 DNA를 주형(template) DNA로 하여 Multiplex PCR을 수행한 결과를 바탕으로 Match Probability(MP) 값을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 한 개의 마이크로세틀라이트에 대한 프라이머 쌍(BMS 1242)을 사용할 경우에 MP 값은 100분의 4.8로 나타났고, 두 개의 프라이머 쌍(BMS 1242 및 BMS 1866)을 사용한 경우에는 MP 값이 1,000분의 2.5로 나타났으며, 세 개의 프라이머 쌍(BMS 1242, BMS 1866 및 HUJ 223)을 사용한 경우에는 10,000분의 1로 나타났고, 상기 표 9에 나타난 8개의 프라이머 쌍을 모두 사용한 경우에 십 억분의 2인 것으로 확인되었다.
상기 표 9에 기재된 8개의 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 Multiplex-PCR을 실제로 수행하면서, PCR 조성물의 조성비와 반응 조건을 수정하면서, 최적의 반응 결과를 얻을 수 있는 조성비와 조건을 선택하였고, 그 결과를 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.
1 Sample
Template 20ng 1
Primer Mix each 10pM/ul 1
dNTP each 0.05mM 0.3
MgCl2 1mM 0.6
10 x buffer 1.5
f-Taq 5U/㎕ 0.1
ddH2O 10.25
DMSO 0.25
Total 15
time
1 95 ℃ 20 min
2 95 ℃ 15 sec
3 58 ℃ 60 sec
4 72 ℃ 60 sec go to 2 step 34 time
5 72 ℃ 30 min
6 4 ℃ pause
상기 표 9의 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1에서 수득한 상기 33두의 한우에 대하여 상기 표 10 및 표 11의 조건으로 Multiplex-PCR을 수행한 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 상기 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 표 10 및 표 11의 조건으로 Multiplex-PCR을 수행한 경우, 각각의 peak가 선명하게 나타나, 8 종류의 peak가 모두 나타나는 것을 확인할 수 있어 상기 표 10 및 표 11의 조건이 상기 표 9의 프라이머 세트에 대한 최적의 조성물 및 Multiplex-PCR 조건임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 한우에 대한 개체 판별을 위한 Multiplex-PCR를 실시할 경우, 검사가 용이하고 효율적일 뿐만 아니라, 한우 특유 의 마이크로세틀라이트를 검정할 수 있는 것이므로 우수한 검정력이 있어 한우의 개체의 동정을 매우 높은 확률로 수행할 수 있어, 한우의 생산이력추적체계에 활용할 수 있으므로, 한우의 생산·도축·가공·유통과정의 각 단계별 정보를 기록·관리, 문제발생시 이동경로를 따라 추적 또는 소급할 수 있으므로, 안전하고 차별화되는 한우 쇠고기 생산 정보체계를 구출할 수 있어 산업 특히 축산업에 있어서 현저하게 유리한 효과가 있다.
<110> Industry-Academic Cooperation Yeungnam University <120> A PRIMER SETS FOR CONSTRUCTING TRACEABILITY IN HANWOO AND METHOD OF SELECTING HANWOO BY USING THE SAID PRIMER SET SAME S <130> DPP20071138KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st primer-BMS1866for <400> 1 cagggactga aaaataatgc c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd primer-BMS1866re <400> 2 ttccatgttg attgtttctt cc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd primer-BMS1242for <400> 3 agtgtgatca acaacggcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4th primer-BMS1242re <400> 4 agtgactggt gcagtgcttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5th primer-HUJ223for <400> 5 ctgatggaag cagggaaaac 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6th primer-HUJ223re <400> 6 attgtgcagg agaacagaag c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7th primer-BM3507for <400> 7 gcccaaagaa agaagtatgt gc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8th primer-BM3507re <400> 8 tagtgcggag tcagtcatgt g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9th primer-HW_YU_MS#3for <400> 9 ctgcttcatt tgacggaatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10th primer-HW_YU_MS#3re <400> 10 tggaaggaaa cagctggact 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11th primer-ETH10000for <400> 11 gttcaggact ggccctgcta aca 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12th primer-ETH10000re <400> 12 cctccagccc actttctctt ctc 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13th primer-BM1818for <400> 13 agctgggaat ataaccaaag g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14th primer-BM1818re <400> 14 agtgctttca aggtccatgc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15th primer-HWYU2CA_53for <400> 15 tgtggtcatg ctcttctcca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16th primer_HWYU2CA-53re <400> 16 acacgagtcg gcagagtttt 20

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 쌍;
    서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 쌍;
    서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제3 프라이머 쌍;
    서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제4 프라이머 쌍;
    서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제5 프라이머 쌍;
    서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제6 프라이머 쌍;
    서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제7 프라이머 쌍 및
    서열번호 15의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 제8 프라이머 쌍
    을 갖는 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트.
  3. a) 소의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    b) 상기 추출된 DNA 및 제2항에 따른 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응용액을 제조하는 단계;
    c) 상기 제조된 PCR 반응용액에 대해 PCR을 수행하는 단계 및
    d) 상기 PCR 수행 결과를 분석하는 단계
    를 포함하는 한우 개체 판별방법.
  4. 제2항에 따른 한우 DNA 다형성 분석용 프라이머 세트 및 DNA 중합효소(polymerase)를 포함하는 한우 판별용 검출키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 한우 판별용 검출키트.
  6. 제4항에 있어서,
    dNTP, MgCl2 및 반응완충액을 추가로 더 포함하는 한우 판별용 검출키트.
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