JP2023550141A - 制限酵素及びハイスループット配列決定を用いたｄｎａ試料におけるメチル化変化の検出 - Google Patents

制限酵素及びハイスループット配列決定を用いたｄｎａ試料におけるメチル化変化の検出 Download PDF

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Abstract

メチル化感受性制限酵素によるＤＮＡの消化、それに続くハイスループット配列決定及び配列読み取りの分析を含む、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイリング並びにＤＮＡ試料における遺伝的及び後成的変化の検出のための方法及びシステムが提供される。有利なことに、本発明の方法及びシステムは、高感度であるが正確であり、非常に少量のＤＮＡで作業することを可能にし、１回の実行からの配列決定データに基づいて、メチル化データ、変異データなどを含む膨大な量の情報を受け取る。

Description

本発明は、ＤＮＡ試料の、そして特に体液から得られた無細胞ＤＮＡ試料（例えば血漿及び尿）の、遺伝的及び後成的特性のプロファイリングを行うための方法及びシステムに関する。本発明の方法及びシステムは、メチル化感受性又はメチル化依存性制限酵素によるＤＮＡの消化、配列決定ライブラリの調製、ハイスループット配列決定（例えば、次世代配列決定）、及び配列読み取りの分析を含む。有利なことに、本発明の方法及びシステムは、高感度であるが正確であり、非常に少量のＤＮＡで作業することを可能にし、１回の実行からの配列決定データに基づいて、メチル化データ、変異データなどを含む膨大な量の情報を受け取る。本発明の方法及びシステムは、例えば、新しいメチル化マーカーの発見、及び診療所での診断用途の両方に有用である。
変異、ＤＮＡメチル化変化（例えば、単離されたＣｐＧの低メチル化及び主にＣｐＧアイランドで生じる高メチル化）、コピー数変動などを含む遺伝的及び後成的変化は、多くのタイプのがんで生じることが知られている。例えば、遺伝子サイレンシングにつながる、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域にあるＣｐＧアイランドの高メチル化は、広く研究されており、様々な種類のがんで実証されている。
腫瘍はＤＮＡ断片又は「無細胞ＤＮＡ」を生体液に放出するため、結果として、血漿や尿などの生体液から得られる「液体生検」において、腫瘍由来のＤＮＡ分子の遺伝的及び後成的変化が検出できる。従来の生検とは対照的に、液体生検は非侵襲的であり、腫瘍サブクローンの完全な遺伝的スペクトルをより適切に表す可能性がある。その結果、液体生検におけるがんに関連する遺伝的及び後成的変化の検出は、早期発見、予後、及び治療的監視に大きな期待を抱くものである。ただし、液体生検で腫瘍由来のＤＮＡを検出するには、生体液中の無細胞ＤＮＡの濃度が低い場合があり、更に正常なＤＮＡのバックグラウンドが大きいのに関連して、腫瘍ＤＮＡが非常に少量しか存在しない可能性があるため、超高感度の生化学的手法が必要である。
非メチル化シトシンをウラシルに変換するためのＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理、それに続くメチル化変化を検出するための変換されたＤＮＡの定量的ＰＣＲ又は配列決定に基づく、液体生検中のメチル化ＤＮＡ分子の検出のためのいくつかの技術が開発されている。変換された塩基は、配列決定データにおいてチミンとして同定され（ＰＣＲ後）、読み取りカウントを使用して、メチル化シトシンのパーセンテージ（％）を決定することができる。バイサルファイト変換配列決定は、標的化された方法又は全ゲノムバイサルファイト配列決定を用いて行われ得る。次世代配列決定（next-generation sequencing、ＮＧＳ）などのハイスループット配列決定の進歩は、単一ヌクレオチドレベルでメチル化パターンを同定及び分析するためのゲノムワイド分析及び標的化アプローチの両方を可能にする。
その人気にもかかわらず、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの変換は厄介なアッセイであり、鋳型ＤＮＡの分解、アッセイにノイズを導入する非特異的又は不完全な変換、並びにＰＣＲの特異性の低下、ＤＮＡ増幅におけるバイアスの増加、及びＤＮＡの配列決定におけるノイズレベルの増加を引き起こす４塩基ゲノムからおよそ３塩基ゲノムへのゲノムの複雑性の低下を含む欠点を有する。更に、バイサルファイト処理はＤＮＡの配列を変化させ、トランジション事象が配列の変化によってＤＮＡ鎖の１つで不明瞭になるため、変異分析が妨げられる。
Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７（４）：３６１－３６８は、次世代配列決定技術を利用するシトシンメチル化プロファイリングのための２つの技術：バイサルファイトパドロックプローブ（bisulfite padlock probe、ＢＳＰＰ）及びメチル感受性切断計数（methyl sensitive cut counting、ＭＳＣＣ）を報告している。
Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９（６）：１０４４－１０５６は、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑを報告しており、これはゲノム全体にわたって９０，０００を超える領域でのＤＮＡメチル化をアッセイする方法である。Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑは、メチル感受性酵素によるＤＮＡ消化を次世代（ｎｅｘｔ－ｇｅｎ）ＤＮＡ配列決定技術と組み合わせるものである。
Ｊｅｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１２，１３６８－１３７８は、メチル化のデジタル制限酵素分析（Digital Restriction Enzyme Analysis of Methylation、ＤＲＥＡＭ）と題された方法を報告しており、これは、同じ配列を認識する一対のネオシゾマー（neoschizomeric）制限酵素である、Ｓｍａ（メチル化感受性酵素）、及びＸｍａＩ（メチル化非感受性酵素）によるゲノムＤＮＡの連続的消化によって作成されたメチル化特異的シグネーチャの次世代配列決定分析に基づく。
Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｏｎｅ（２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，５：１７３は、ＭｃＭｕｒｄｏ Ｓｏｕｎｄ、Ａｎｔａｒｃｔｉｃａからの海洋多毛類Ｓｐｉｏｐｈａｎｅｓ ｔｃｈｅｒｎｉａｉにおけるメチル－シトシン組成のパターンの特徴付けを報告している。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ消化と、それに続く次世代配列決定を用いて、メチル化パターンが特徴付けられた。
Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．，７：１９１は、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ（methyl-sensitive restriction endonucleases、ＭＳＲＥ）を用いて次世代配列決定（ＮＧＳ）データから部位特異的ＣｐＧメチル化状態をコンピュータで再構築するための定量化方法論を報告している。
Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７（１９）：ｅ１２２は、同じ試料中の非メチル化ＤＮＡ及びメチル化ＤＮＡの両方の定量分析を可能にする、単一チューブ酵素法、制限酵素によるＤＮＡ分析（DNA Analysis by Restriction Enzymes、ＤＡＲＥ）を報告している。両方のメチル化状態の情報は、メチル化感受性及び非感受性制限酵素の対によって連続的に消化されるＤＮＡ断片のディファレンシャルアダプタのタギングによって捕捉される。
Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１５（６）：ｅ０２３３８００は、ゲノムの二重消化、それに続く特別なアダプタ連結及び次世代配列決定の組み合わせに基づく、メチル感受性（Ｍｅｔｈｙｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＤＡｒＴ－ｓｅｑ（ＭＳ－ＤＡｒＴ－ｓｅｑ）と名付けられた技術を報告している。ＣＣＧＧ部位を標的とし、対照的なメチル化感受性を示す制限酵素（ＭｓｐＩ、メチル化非感受性、及び内部シトシンが５’－メチル化されている場合に切断しないＨｐａＩＩ）を使用して、２つのライブラリを並行して構築する。
Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０９：１１３９７７は、絨毛膜絨毛（chorionic villi、ＣＶ）と母体血液細胞（ＭＢＣ）との間で差次的にメチル化された領域を同定するために、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）と次世代配列決定（ＮＧＳ）とを組み合わせるアプローチを報告している。
米国特許第１０，３９２，６６６号は、ＤＮＡのメチル化パターン（メチローム）の決定、より具体的には、少数ゲノムのメチル化パターン（メチローム）を決定するための、異なるゲノム由来（例えば、胎児及び母親由来、又は腫瘍及び正常細胞由来）のＤＮＡの混合物を含む生体試料（例えば、血漿）の分析を開示している。
国際公開第２０１６／０６１６２４号は、メチル化の分析に適した遺伝子又はゲノム内の部位及び領域を同定するための方法を開示している。本方法は、その後の分析のための標的を提供する標的制限部位及び断片のゲノムワイドスケールでの効率的な同定を可能にする。
国際公開第２０１８／１９５２１１号は、循環腫瘍ＤＮＡを含む、対象の体内の循環ポリヌクレオチド断片などの限定されたＤＮＡインプットに対するゲノムバリアント及びＤＮＡメチル化状態の同時検出のためのライブラリを構築するための組成物、キット、及び方法を開示している。
本発明の出願人に譲渡された国際公開第２０１１／０７０４４１号、同第２０１７／００６３１７号、同第２０１９／１４２１９３及び同第２０２０／１８８５６１号は、ＤＮＡ試料中のメチル化変化を検出する方法を開示している。
対象からの単一のサンプリングから得られた無細胞ＤＮＡから、及び一回のランからの配列決定データを使用して、様々なタイプの遺伝的及び後成的データを生成することができる方法及びシステムを有することは、非常に有益であろう。
本発明は、ＤＮＡ試料の、そして特に体液から得られた無細胞ＤＮＡ試料（例えば血漿及び尿）の、遺伝的及び後成的特性のプロファイリングを行うための方法及びシステムに関する。本発明の方法及びシステムは、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素、好ましくは同時に適用される複数のメチル化感受性制限酵素による消化、試料中のＤＮＡ分子の末端における配列情報を保存するライブラリ調製方法を用いた配列決定ライブラリの調製、ハイスループット配列決定及び配列読み取りの分析、を含む。
本発明は、これまでに記載された方法と比較してより単純かつ正確なアッセイを提供し、バイサルファイト配列決定と比較して高品質の配列決定データをもたらし、がん関連変化の高感度検出を可能にする。メチル化データ、変異データなどを含む、同じ配列決定データに基づく１回の実行からの膨大な量の情報を得ることができ、したがって、包括的な遺伝子及び後成的情報を得るための並行アッセイの必要性が回避される。重要なことには、驚くべきことに、非常に少量のＤＮＡからであっても、ライブラリ調製前に増幅する必要なく、高品質の配列決定データを得ることができることが見出された。以下に例示されるように、本明細書に開示される方法は、単一の標準血液試験管から得られる無細胞ＤＮＡの量に基づいて、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡの量が非常に低い場合でも早期のがんの遺伝的及び後成的変化を検出することができる。
本発明の方法及びシステムは、バイサルファイト変換を含まず、又は必要としない。本発明の方法及びシステムは、ＤＮＡの配列を変化させることを必要とせず、同じ配列決定データに基づいて、例えば、メチル化、変異、コピー数及びヌクレオソームポジショニングの同時分析を可能にする。
以下に例示されるように、メチル化感受性酵素消化に続いてハイスループット配列決定に供された無細胞ＤＮＡ試料について得られた配列決定データと、バイサルファイト変換及びハイスループット配列決定後に得られた配列決定データとの比較は、バイサルファイト処理ＤＮＡと比較し酵素処理ＤＮＡについて、顕著に良好な配列決定測定基準（読み取り数、マッピング率など）、コピー数完全性及びヌクレオソームポジショニング完全性を示した。個々の試料と比較したプールされた無細胞ＤＮＡ試料の分析は、少量のＤＮＡが使用される場合、情報の損失が存在することを示した。しかしながら、酵素処理されたＤＮＡ試料の配列決定データの質は高いままであり、信頼できる分析を可能にした一方で、バイサルファイト配列決定は、顕著に減少した読み取り数及びマッピング率を示し、事実上、全てのコピー数及びヌクレオソームポジショニング情報を喪失した。更に、配列決定ノイズは、バイサルファイト処理されたＤＮＡ試料について高く、その結果、変異は、配列決定ノイズと区別できなかった。メチル化検出に関して、酵素処理されたＤＮＡ試料におけるメチル化分析は、バイサルファイト処理されたＤＮＡ試料と比較して、血漿中で顕著により多くのメチル化変化を検出した。
以下に更に例示されるように、バイサルファイト処理されたＤＮＡ試料は、酵素処理された試料と比較して、配列決定深さ（ｄｅｐｔｈ）の下端においてより広いＣＧ範囲をもたらしたが、深さが増加するにつれて、バイサルファイト処理されたＤＮＡ試料においてカバーされたＣＧの数において、連続的かつ鋭い減少が見られた。対照的に、酵素処理された試料は、２５０～３００を超える深さでさえ実質的に一定のカバレッジを示した。高深度では、メチル化感受性消化は、バイサルファイトと比較して有意に良好なＣＧ適用範囲を提供した。メチル化感受性の消化は、非常に高い深さで数百万のＣＧの適用範囲を提供し、したがって、希少なメチル化シグナル、例えば、血漿中に非常に低い量、すなわち総無細胞ＤＮＡの１％又は更に少ない量、で存在し得る、腫瘍の初期段階における血漿中の腫瘍由来のメチル化ＤＮＡ分子の検出を可能にした。データは、稀なシグナルの同定に必要とされる深さにおいて、バイサルファイトは十分なカバレッジを提供せず、かかる稀なシグナルは、少量のＤＮＡに対してバイサルファイト配列決定を使用する場合に見逃される可能性が高いことを示した。
本発明は更に、目的のゲノム遺伝子座のメチル化値を決定するための改善された方法を開示する。本発明によるメチル化分析は、制限遺伝子座、すなわち、アッセイにおいて使用される制限酵素の制限部位について実施される。本明細書に開示されるメチル化分析は、目的の制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さ、好ましくは少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーするアラインメントを分析すること、及び所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの読み取りカウントを決定することに基づく。かかるアラインメントは、少なくとも５０ｂｐの長さ（好ましくは少なくとも１００ｂｐの長さ）のＤＮＡ分子を表し、ここで、分析された制限遺伝子座、並びにＤＮＡ分子内の任意の追加の制限遺伝子座は、ＤＮＡ試料において全てメチル化され、したがって、このＤＮＡ分子は、このアッセイにおいて使用される酵素での消化後に無傷なままであった。長さが少なくとも５０又は少なくとも１００ｂｐであり、ＤＮＡ試料中で全てメチル化された複数の制限遺伝子座を含むアラインメントを分析することは、がん関連過剰メチル化シグナルの特異性を増加させ、正常試料とがん性試料との間の差異の改善された、より正確な検出を可能にする。加えて、かかるアラインメントのコピー数はヌクレオソーム境界を反映するため、かかるアラインメントの分析は、メチル化に加えて無細胞ＤＮＡにおけるヌクレオソーム配置を評価するのに有利であり、ここで、高いコピー数はヌクレオソームの中央に典型的であり、低いコピー数はヌクレオソーム間の境界に典型的である。
本発明は更に、ＤＮＡ試料のメチル化感受性／非依存性制限後に生成された配列決定データに基づいて、ＤＮＡのメチル化レベル及び非メチル化レベルの両方を直接計算する方法を開示する。有利なことに、本発明の方法及びシステムは、単一のアッセイにおいて、同じ配列決定データに基づいて、ＤＮＡのメチル化レベル及び非メチル化レベルを独立して決定することを可能にし、したがって、メチル化変化の改善された同定を提供する。より詳細には、本明細書に開示される方法及びシステムは、いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化と、それに続く複数の配列読み取りを生成するハイスループット配列決定を含む。配列読み取りを参照ゲノムに対してアラインメントさせることができ、制限遺伝子座、すなわち、ゲノム内の制限部位を選択し、分析する。選択された制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルは、各制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいて決定され、読み取りカウントは、制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷のままであった試料中のＤＮＡ分子の数を表す。選択された制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルは、各制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する読み取りの数を決定することによって、配列読み取りの末端の特有の分析によって決定される。この読み取り数は、制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断された試料中のＤＮＡ分子の数を表す。かかる非メチル化ＤＮＡ分子の直接分析は、既存の方法によって実施されるようなメチル化ＤＮＡのレベルに基づく間接的評価よりも有利である。同じ配列決定データを使用するメチル化に加えて非メチル化の直接決定は、ゲノム領域の相補的なメチル化情報を提供し、したがって、メチル化プロファイリングの改善、潜在的なＤＮＡメチル化マーカーのより正確かつ有効な評価、及び試料間のメチル化の差異のより良好な検出を提供する。それはまた、メチル化分析の増加した感度を提供し、特に、非常に高い又は非常に低いメチル化レベルを有するゲノム領域に有益である。
一態様によれば、本発明は、対象由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
（ａ）無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、非メチル化制限部位が切断されている制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、配列決定ライブラリを調製することが、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを提供することと、
（ｄ）配列決定データから、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値、並びに任意選択で、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することと、を含み、
３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が当該方法に十分であり、無細胞ＤＮＡ試料がライブラリ調製の前に増幅に供されず、無細胞ＤＮＡ試料のメチル化値及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することが、同じ配列決定データに基づいて実施される。
別の態様によれば、本発明は、無細胞ＤＮＡ試料を処理して、遺伝的分析及び後成的分析のための配列決定データを得るための方法を提供し、方法は、
（ａ）無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、非メチル化制限部位が切断されている制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、配列決定ライブラリを調製することが、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを得ることと、を含み、
３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、少なくとも８５％のユニークマッピング率、未消化試料と比較して少なくとも０．６５のピアソン相関によって特徴付けられるコピー数完全性、及び未消化試料と比較して少なくとも０．５５のピアソン相関によって特徴付けられるヌクレオソームポジショニング完全性、のうちの少なくとも１つを達成するのに十分であり、
遺伝的及び後成的分析が、同じ配列決定データに基づいて実施される。
いくつかの実施形態では、６，０００の半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量は、本明細書に開示される方法に十分である。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは血漿無細胞ＤＮＡであり、無細胞ＤＮＡの量は９～１０ｍＬの血液から得られる量である。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡの量は、１０～２００ｎｇである。追加の実施形態では、無細胞ＤＮＡの量は、２０～１００ｎｇである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、非平滑末端を生成し、方法は、配列決定のライゲーションの前に、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを末端修復に供して、平滑末端を有するＤＮＡ分子を得ることを更に含む。
いくつかの実施形態では、ハイスループット配列決定は、全ゲノムハイスループット配列決定である。
いくつかの実施形態では、ハイスループット配列決定は、標的のみを対象にしたハイスループット配列決定である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を決定することは、
（ｉ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を計算することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、制限遺伝子座を含有する少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、複数の制限遺伝子座である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであり、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化は、同時の消化である。
いくつかの実施形態では、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉを含む。追加の実施形態では、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩを含む。追加の実施形態では、消化は、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩを使用して実施される。いくつかの実施形態では、消化は、１：１～５：１（酵素単位）（Ｈｉｎｐ：ＡｃｉＩ）の比でＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃＩＩを使用して実施される。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供することは、消化効力を決定することと、消化効力が所定の閾値を上回る場合に配列決定ライブラリの調製に進むことと、を更に含む。
別の態様によれば、本発明は、対象由来の無細胞ＤＮＡ試料（ｃｆＤＮＡ）におけるがん関連の遺伝的及び後成的変化を検出するための方法を提供し、方法は、本明細書に開示されるｃｆＤＮＡ試料のメチル化及び任意選択で少なくとも１つの追加の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングして、ｃｆＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイルを得ることと、ｃｆＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイルを、がんプロファイル及び非がんプロファイルから選択される１つ以上の参照遺伝的及び後成的プロファイルと比較して、ｃｆＤＮＡ試料におけるがん関連の遺伝的及び後成的変化を検出することと、を含む。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ試料は、がんを有することが疑われる、又はがんを有するリスクがある対象からのものであり、方法は、がん関連変化が検出された場合に、能動的ながん監視及び追跡検査を対象に施すことを更に含み、がん監視及び追跡検査は、血液検査、尿検査、細胞診、撮像、内視鏡検査、及び生検のうちの１つ以上を含む。
追加の態様によれば、本発明は、対象におけるがんの存在又は非存在を評価するための方法を提供し、方法は、
（ａ）対象の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、非メチル化制限部位が切断されている制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡをハイスループット配列決定法によって配列決定することと、
（ｃ）互いに１５０ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む少なくとも１つのマルチオミクスゲノム領域を選択することと、
（ｄ）少なくとも１つのマルチオミクス領域をカバーする配列読み取りの分析に基づいて、対象ががんを有する可能性を決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマルチオミクス領域は、互いに１００ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマルチオミクス領域をカバーする配列読み取りの分析は、
－各マルチオミクス領域について、
（ｉ）制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーするメチル化変異配列読み取りの数、
（ｉｉ）制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーするメチル化野生型配列読み取りの数、
（ｉｉｉ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーする非メチル化変異配列読み取りの数、及び
（ｉｖ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーする非メチル化野生型配列読み取りの数、のうちの少なくとも１つを決定することと、
－対象ががんを有する可能性を評価するために、（ｉ）～（ｉｖ）において決定された読み取りの数をがん患者及び／又は健康な個体の基準値と比較することと、を含む。
追加の態様によれば、本発明は、がんを有することが疑われるか又はがんを有するリスクがある対象の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を特徴付けるための方法を提供し、方法は、
（ａ）無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡをハイスループット配列決定法によって配列決定することと、
（ｃ）互いに１５０ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む少なくとも１つのマルチオミクスゲノム領域を選択することと、
（ｄ）各マルチオミクス領域について、
（ｉ）制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーするメチル化変異配列読み取りの数、
（ｉｉ）制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーするメチル化野生型配列読み取りの数、
（ｉｉｉ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーする非メチル化変異配列読み取りの数、及び
（ｉｖ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーする非メチル化野生型配列読み取りの数、のうちの少なくとも１つを決定することと、を含み、
それにより、無細胞ＤＮＡ試料を特徴付ける。
別の態様によれば、本発明は、対象からのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
（ａ）ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、配列決定ライブラリを調製することが、配列決定アダプタを制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ断片にライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列読み取りを得ることと、
（ｄ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を計算することと、を含み、
それにより、無細胞ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングする。
いくつかの実施形態では、制限遺伝子座をカバーする所定の領域は、制限遺伝子座内の切断部位の少なくとも２５ｂｐ上流で始まり、制限遺伝子座内の切断部位の少なくとも２５ｂｐ下流で終了する。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、制限遺伝子座を含有する少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することを含む。いくつかの実施形態では、制限遺伝子座をカバーする所定の領域は、制限遺伝子座内の切断部位の少なくとも５０ｂｐ上流で始まり、制限遺伝子座内の切断部位の少なくとも５０ｂｐ下流で終了する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、ＣＧアイランド内に位置する。
いくつかの実施形態では、参照読み取りカウントは、未消化対照ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域について決定された読み取りカウントであり、任意選択的に、配列決定深度差について補正される。
いくつかの実施形態では、参照読み取りカウントは、制限エンドヌクレアーゼによって切断されない参照遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの参照領域を使用して決定された読み取りカウントである。
いくつかの実施形態では、参照読み取りカウントは、制限エンドヌクレアーゼによって切断されない参照遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの複数の参照領域を使用して決定された平均読み取りカウントである。
いくつかの実施形態では、メチル化値を計算することは、ステップ（ｄ）において決定された読み取りカウントを、ＤＮＡ試料の読み取りカウント中央値に対して正規化して、正規化読み取りカウントを得ることと、正規化読み取りカウントの正規化参照読み取りカウントに対する比を計算することとを含む。
別の態様によれば、本発明は、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイリングのための方法であって、本明細書に開示される少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を決定することと、配列決定データから、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択されるＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を更に決定することと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、生体液試料から抽出された無細胞ＤＮＡである。追加の実施形態では、ＤＮＡは、腫瘍試料から抽出されたＤＮＡである。
追加の態様によれば、本発明は、ＤＮＡの第１の給源と第２の給源との間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定するための方法を提供し、方法は、
本明細書に開示される第１の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第１のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
本明細書に開示される第２の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第２のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
第１及び第２のＤＮＡメチル化プロファイルを比較して、第１及び第２のＤＮＡの給源の間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡの給源は、がんＤＮＡであり、第２のＤＮＡの給源は、非がんＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡの給源は、がん患者の血漿無細胞ＤＮＡであり、第２のＤＮＡの給源は、１人以上の健康な個体の血漿無細胞ＤＮＡである。追加の実施形態では、ＤＮＡの第１及び第２の給源は、がんの異なる段階のものである。
更なる態様によれば、本発明は、対象からのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
（ａ）対象由来のＤＮＡ試料を提供することと、
（ｂ）ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供し、それによって、制限エンドヌクレアーゼにより生成されたＤＮＡ断片を含む制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡのハイスループット配列決定を実施して、配列読み取りを得ることと、
（ｄ）配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷なままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｅ）配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｆ）ステップ（ｄ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいて少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算し、ステップ（ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算して、
それにより、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）～（ｅ）は、
複数の制限エンドヌクレアーゼ生成ＤＮＡ断片にライゲーションされた配列決定アダプタを使用して、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製し、配列決定ライブラリをハイスループット配列決定に供して、配列読み取りを得ることと、
複数の配列読み取りを参照ゲノムに対してマッピングして、マッピングされた配列読み取りを生成し、参照ゲノム内の少なくとも１つの制限遺伝子座を選択することと、
マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷のままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ハイスループット配列決定は、全ゲノムハイスループット配列決定である。他の実施形態では、ハイスループット配列決定は、標的のみを対象にしたハイスループット配列決定である。
いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、完全ヒトゲノムである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、生体液試料から抽出された無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、生体液試料は、血漿、血清、又は尿である。生物学的試料の各可能性は、本発明の別個の実施形態である。
いくつかの態様では、ＤＮＡは、腫瘍試料から抽出されたＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算することは、ステップ（ｄ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントの、少なくとも１つの制限遺伝子座の予想読み取りカウントに対する比を計算することを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することは、ステップ（ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントと、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列の予想読み取りカウントと、の間の差を計算することと、その後、差を少なくとも１つの制限遺伝子座の予想読み取りカウントで割ることとを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算することは、
ステップ（ｄ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントと、ステップ（ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントとを合計することと、次に、合計から、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列の予想読み取りカウントを減算することと、によって総断片数を決定することと、
ステップ（ｄ）において決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを、総断片数によって除算することと、を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することは、
本明細書に記載される総断片数を決定することと、
ステップ（ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントと、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列の予想読み取りカウントと、の間の差を計算することと、
差を総断片数で割ることと、を含む。
いくつかの実施形態では、予想読み取りカウントは、制限エンドヌクレアーゼによって切断されない、少なくとも１つの制限遺伝子座と同じ長さの参照遺伝子座を使用して決定される読み取りカウントである。
いくつかの実施形態では、予想読み取りカウントは、制限エンドヌクレアーゼによって切断されない、少なくとも１つの制限遺伝子座と同じ長さの複数の参照遺伝子座を使用して決定された平均読み取りカウントである。
いくつかの実施形態では、予想読み取りカウントは、未消化対照ＤＮＡ試料中の少なくとも１つの制限遺伝子座について決定された読み取りカウントであり、任意選択的に、配列決定深度差について補正される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、複数の制限遺伝子座である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼである。
いくつかの態様では、メチル化をプロファイリングするための方法は、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを、１つ以上の参照メチル化プロファイルと比較することによって、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルに基づいて対象における疾患の存在又は非存在を同定するステップを更に含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、メチル化プロファイルに基づいて紙又は電子形式でレポートを作成することと、そのレポートを対象及び／又は対象の医療提供者に伝達することと、を更に含む。
別の態様によれば、本発明は、ＤＮＡ試料におけるメチル化変化を検出するための方法を提供し、方法は、本明細書に開示されるようにＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを得ることと、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを１つ以上の参照メチル化プロファイルと比較して、ＤＮＡ試料におけるメチル化変化を検出することと、を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の参照メチル化プロファイルは、健康なＤＮＡメチル化プロファイルを含む。追加の実施形態では、１つ以上の参照メチル化プロファイルは、疾患ＤＮＡメチル化プロファイルを含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ試料は、疾患を有することが疑われる対象及び／又は疾患を発症するリスクがある対象に由来し、メチル化変化を検出するステップは、ＤＮＡ試料が健康なＤＮＡ試料であるか又は疾患ＤＮＡ試料であるかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。
追加の態様によれば、本発明は、ＤＮＡの第１の給源と第２の給源との間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定するための方法を提供し、方法は、
本明細書に開示される方法に従って第１の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第１のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
本明細書に開示される方法に従って第２の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第２のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
第１及び第２のＤＮＡメチル化プロファイルを比較して、第１のＤＮＡの給源と第２のＤＮＡの給源との間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡの給源は、疾患ＤＮＡであり、第２のＤＮＡの給源は、非疾患ＤＮＡである。追加の実施形態では、ＤＮＡの第１及び第２の給源は、疾患の異なる段階のものである。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。
追加の態様によれば、本発明は、ＤＮＡ試料中の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
本明細書に開示されるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、
ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することであって、少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性が、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される、決定することであって、
メチル化のプロファイリング及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性の決定が、同じ配列決定データを用いて行われ、
それにより、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングする、決定することと、を含む。
本発明のこれら及び追加の態様及び特徴は明らかになるであろう。
以下の詳細な説明、実施例及び特許請求の範囲から得られる。
配列決定の前にメチル化感受性消化、バイサルファイト変換に供した、又は処理しなかった、プールされた血漿無細胞ＤＮＡ試料のコピー数データ。データは、ゲノム位置当たりのヒット数（カウント）として提示する。 試験（処理）プール血漿無細胞ＤＮＡ試料と対照（未処理）プール血漿無細胞ＤＮＡ試料との間のヒットの相関。 配列決定の前にメチル化感受性消化、バイサルファイト変換に供した、又は処理しなかった、プールされた血漿無細胞ＤＮＡ試料のヌクレオソームポジショニング。データは、「ヒットスパン１００」（＝分析されたゲノム位置の＞５０ｂｐ上流で開始し、＞５０ｂｐ下流で終了する読み取りの数）として提示する。 試験（処理）プール血漿無細胞ＤＮＡ試料と対照（未処理）プール血漿無細胞ＤＮＡ試料との間の「ヒットスパン１００」の相関。 配列決定前にメチル化感受性消化又はバイサルファイト変換に供した患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（３Ａ）及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６（３Ｂ）の血漿無細胞ＤＮＡのコピー数完全性。 配列決定前にメチル化感受性消化又はバイサルファイト変換に供された患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（４Ａ）及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６（４Ｂ）の血漿無細胞ＤＮＡのヌクレオソームポジショニング完全性。データは、「ヒットスパン１００」（＝分析されたゲノム位置の＞５０ｂｐ上流で開始し、＞５０ｂｐ下流で終了する読み取りの数）として提示する。 配列決定前にメチル化感受性消化又はバイサルファイト変換に供された患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（５Ａ）及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６（５Ｂ）の血漿無細胞ＤＮＡのＣＧ深さ。 ＤＮＡのメチル化感受性消化又はバイサルファイト変換を用いた、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６の血漿無細胞ＤＮＡにおける高メチル化マーカー遺伝子座の検出。 ＤＮＡのメチル化感受性消化又はバイサルファイト変換を使用した、対照と比較した患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５の血漿無細胞ＤＮＡ（７Ａ）、及び対照と比較した患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６の血漿無細胞ＤＮＡ（７Ｂ）における腫瘍変異の検出。 遺伝的及び後成的プロファイリングのための試料調製。（８Ａ）肺がん試料；（８Ｂ）対照試料。 患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（９Ａ）及びＢＭＤ ＬＮＧ１６６（９Ｂ）の臨床データ及びメチル化データ。 患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（１０Ａ）及びＢＭＤ ＬＮＧ１６６（１０Ｂ）のメチル化シグナルを有するメチル化遺伝子座。 患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（１１Ａ）及びＢＭＤ ＬＮＧ１６６（１１Ｂ）の変異データ。 患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５内のマルチオミクス領域。 マルチオミクスアラインメントのタイプ。 メチル化感受性ＨｉｎＰ１Ｉ部位の消化の前後及び末端修復の説明図。 切断部位でメチル化又は非メチル化されている、ＨｉｎＰ１Ｉ制限部位にわたるＤＮＡ分子の消化及び末端修復後に得られたＤＮＡ断片の図。 本発明の実施形態による配列読み取りの分析。（１６Ａ）制限遺伝子座の読み取りカウント、（１６Ｂ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始する配列読み取りの読み取りカウント、（１６Ｃ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで終了する配列読み取りの読み取りカウント。 例示的な遺伝子座ＣＧ＃１（図１７Ａ）、例示的な遺伝子座ＣＧ＃４（図１７Ｂ）及び例示的な遺伝子座ＣＧ＃５（図１７Ｃ）の、本発明の実施形態による配列読み取りの分析。 本発明の実施形態による肺がん関連ゲノム領域におけるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための例示的な方法を説明するフローチャート。 本発明の実施形態による肺がん関連ゲノム領域におけるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための追加の例示的な方法を説明するフローチャート。 本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料が肺がんに対して陽性であるか陰性であるかを決定するための例示的な方法を説明するフローチャート。 本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料が肺がんに対して陽性であるか陰性であるかを決定するための追加の例示的な方法を説明するフローチャート。
本発明は、メチル化感受性／メチル化依存性制限酵素によるＤＮＡの消化、それに続くハイスループット配列決定及び配列読み取りの分析を使用して、ＤＮＡ試料、特に無細胞ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法及びシステムに関する。有利なことに、本発明の方法及びシステムは、高感度であるが正確であり、非常に少量のＤＮＡで作業することを可能にし、一回のランからの配列決定データに基づいて、メチル化データ、変異データなどを含む膨大な量の情報を受け取る。
注目すべきことに、非常に少量のＤＮＡが使用され得る場合であっても、配列決定データの質、したがって、それから導き出され得る遺伝的及び後成的情報は非常に高く、がん関連変化の高感度かつ包括的な同定を可能にする。
本明細書に開示される方法は、いくつかの実施形態によれば、天然末端（例えば、無細胞ＤＮＡのヌクレオソームポジショニング評価のため）及び本明細書に開示される制限酵素による消化後に生成される末端（例えば、ＤＮＡ試料においてメチル化されていなかったＤＮＡ分子の分析のため）を含む、ＤＮＡ分子の５’末端及び／又は３’末端における配列情報を保存することを必要とする。本発明によれば、ＤＮＡ分子の末端における配列情報の保存、又は「末端保存」は、目的のゲノム領域を濃縮するための、及び／又は配列決定アダプタを導入するための、ＰＣＲを回避することを包含する。いくつかの特定の実施形態では、本発明による末端保存は、ＤＮＡ分子のメチル化状態に関するＤＮＡ分子の末端における配列情報を保存することである。
いくつかの実施形態では、本発明によるライブラリ調製は、末端保存様式で実施され、このことは、ライブラリ調製プロセスが、目的のゲノム領域を富化するため、及び／又は配列決定アダプタを導入するためのＰＣＲを含まないことを示す。これらの実施形態によれば、ライブラリ調製は、ライゲーション（例えば、酵素的ライゲーション）を介して配列決定アダプタを付加することを含む。特定のゲノム領域の濃縮が所望される場合、これらの実施形態によるライブラリ調製は、捕捉剤を使用して目的のゲノム領域を濃縮することを含む。
本発明の方法は、制限酵素アイソシゾマーの使用を必要とせず（ここで、酵素の一方は、制限部位のメチル化形態及び非メチル化形態の両方を認識するが、他方は、非メチル化形態のみを認識する）、又はメチル化感受性制限酵素及びメチル化非感受性制限酵素の組み合わせ使用を必要とする。
また、本発明の方法は、消化後の特定のサイズ範囲のＤＮＡ断片のサイズ選択、又は配列決定後の特定のサイズ範囲を有する読み取りカウントのフィルタリングを必要とせず、又は使用しない。
いくつかの実施形態では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座のメチル化値を決定するための改善された方法を提供する。改善された方法は、目的の制限遺伝子座を含む、少なくとも５０ｂｐの長さ、好ましくは少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの読み取りカウントを決定することに基づく。
いくつかの実施形態では、本発明は、高分解能ＤＮＡメチル化プロファイリングのためのシステム及び方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡメチル化の分析におけるメチル化感受性／メチル化依存性制限酵素及びハイスループット配列決定の使用を提供する。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、メチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルを直接計算するための、メチル化感受性／メチル化依存性制限酵素及びハイスループット配列決定の使用を提供する。
ヒトゲノムのメチル化は、５－メチルシトシンの形で発生し、ＣｐＧジヌクレオチドとも呼ばれるＣＧ配列の一部であるシトシン残基に限定される（他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されていない）。ヒトゲノムのＣＧジヌクレオチドにはメチル化されているものとそうでないものがある。更に、メチル化は細胞と組織に特異的であるため、特定のＣＧジヌクレオチドは、特定の細胞でメチル化され、同時に別の細胞ではメチル化されないか、特定の組織でメチル化され、同時に別の組織でメチル化されないことがあり得る。ＤＮＡメチル化は、遺伝子転写の重要な調節因子である。
がんＤＮＡのメチル化パターンは、正常なＤＮＡのメチル化パターンとは異なり、一部の遺伝子座は高メチル化されているが、他の遺伝子座は低メチル化されている。いくつかの実施形態では、本発明は、がんに関連する差次的にメチル化された（例えば、過剰メチル化された）ゲノム遺伝子座の高感度検出のための方法及びシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
（ａ）無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、配列決定ライブラリを調製することが、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを提供することと、
（ｄ）配列決定データから、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値、並びに任意選択で、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することと、を含み、
３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が当該方法に十分であり、無細胞ＤＮＡ試料がライブラリ調製の前に増幅に供されず、無細胞ＤＮＡ試料のメチル化値及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することが、同じ配列決定データに基づいて実施される。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ試料を処理して、遺伝的及び後成的分析のための配列決定データを得るための方法であって
（ａ）無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、配列決定ライブラリを調製することが、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを得ることと、を含み、
３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、少なくとも８５％のユニークマッピング率、未消化試料と比較して少なくとも０．６５のピアソン相関によって特徴付けられるコピー数完全性、及び未消化試料と比較して少なくとも０．５５のピアソン相関によって特徴付けられるヌクレオソームポジショニング完全性、のうちの少なくとも１つを達成するのに十分であり、
遺伝的及び後成的分析が、同じ配列決定データに基づいて実施される。
本明細書中で使用される場合、３．３ｐｇのＤＮＡが、１半数体当量に対応する。
いくつかの実施形態では、１０ｎｇのＤＮＡが、本明細書に開示される方法に十分である。追加の実施形態では、２０ｎｇのＤＮＡが、本明細書に開示される方法に十分である。追加の実施形態では、本明細書に開示される方法は、１０～２００ｎｇ、例えば、２０～２００ｎｇ、２０～１００ｎｇの範囲（範囲内の各値を含む）のＤＮＡの初期量を使用して実施される。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、３，０００半数体当量が、本明細書に開示される方法に十分である。追加の実施形態では、６，０００半数体当量が、本明細書に開示される方法に十分である。追加の実施形態では、本明細書に開示される方法は、３，０００～６０，０００個の一倍体当量、例えば、６，０００～６０，０００個の間の一倍体当量、６，０００～３０，０００個の間の一倍体当量（範囲内の各値を含む）を含む初期量のＤＮＡを使用して実施される。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される無細胞ＤＮＡの量は、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％の固有のマッピング率を達成するのに十分である。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される無細胞ＤＮＡの量は、未消化試料と比較して少なくとも０．６、例えば、未消化試料と比較して少なくとも０．６５、少なくとも０．６６、少なくとも０．６７、少なくとも０．６８、少なくとも０．６９のピアソン相関によって特徴付けられるコピー数完全性を達成するのに十分である。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの態様では、本明細書に開示される無細胞ＤＮＡの量は、未消化試料と比較して少なくとも０．５５、例えば、未消化試料と比較して少なくとも０．５６、少なくとも０．５７、少なくとも０．５８、少なくとも０．５９のピアソン相関によって特徴付けられるヌクレオソームポジショニング完全性を達成するのに十分である。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法を提供し、方法は、
（ａ）ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化制限部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することと、
（ｃ）ハイスループット配列決定法によって、配列決定ライブラリを配列決定して、配列読み取りを得ることと、
（ｄ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を決定することと、を含み、
それにより、無細胞ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングする。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料のメチル化のプロファイリングは、制限遺伝子座を含有する少なくとも６０ｂｐの長さの所定のゲノム領域、例えば、制限遺伝子座を含有する少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、５０～１５０ｂｐ、５０～１２０ｂｐ、５０～１００ｂｐの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することを含む。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、ＣＧアイランド内に位置する。「ＣＧアイランド」（又はＣｐＧアイランド）は、目的の生物の全ゲノムに対して高いＧ／Ｃ含量及び高い頻度のＣＧジヌクレオチドを有するＤＮＡの領域である。ＣＧアイランドは典型的には２００～３，０００ｂｐの長さであり、典型的には５０％を超えるＧＣ含量及び以下の観察されたものによって特徴付けられる：０．６より大きい予想ＣＧ比。より低いＣＧ密度のゲノム領域は、「ＣＧオーシャン」と呼ばれ、ゲノムの大部分を含む。
いくつかの実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法が提供され、方法は、（ｉ）対象由来のＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性／依存性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供することと、（ｉｉ）消化されたＤＮＡをハイスループット配列決定法によって配列決定することと、を含み、方法は、単一のアッセイにおいて、同じ配列決定データに基づいて、ＤＮＡのメチル化レベル及び非メチル化レベルを独立して決定することができる。
いくつかの実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法が提供され、方法は、
（ａ）対象由来のＤＮＡ試料を提供することと、
（ｂ）ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供し、それによって、制限エンドヌクレアーゼにより生成されたＤＮＡ断片を含む制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡのハイスループット配列決定を実施して、複数の配列読み取りを得ることと、
（ｄ）配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷なままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｅ）配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｆ）ステップ（ｄ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算し、ステップ（ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算し、それによってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。
追加の実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法が提供され、方法は、
（Ａ）対象由来のＤＮＡ試料を提供することと、
（Ｂ）ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供し、それによって、複数の制限エンドヌクレアーゼ生成ＤＮＡ断片を含む制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（Ｃ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製し、配列決定ライブラリをハイスループット配列決定に供して配列読み取りを得ることと、
（Ｄ）複数の配列読み取りを参照ゲノムに対してマッピングして、マッピングされた配列読み取りを生成し、参照ゲノム内の少なくとも１つの制限遺伝子座を選択することと、
（Ｅ）マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷のままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（Ｆ）マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（Ｇ）ステップ（Ｅ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算し、ステップ（Ｆ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算し、それによってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法であって、ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供することと、消化された試料のハイスループット配列決定を行うことと、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することと、読み取りカウントに基づいて少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算することとを含む方法において、改善は、
少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントは、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、
少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡのレベルを使用して、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。
本明細書で使用される「複数」という用語は、「少なくとも２つ」又は「２つ以上」を指す。
いくつかの実施形態では、対象における疾患の存在又は非存在を同定するための方法が提供され、方法は、本明細書に開示される対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを１つ以上の参照メチル化プロファイルと比較することと、比較に基づいて、対象における疾患の存在又は非存在を決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるメチル化をプロファイリングすることを含む、ＤＮＡ試料の給源を示すＤＮＡメチル化マーカーを同定するための方法が提供される。追加の実施形態では、本明細書に開示されるようなメチル化をプロファイリングすることを含む、ＤＮＡメチル化マーカーの品質を評価するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、疾患、例えばがんのタイプの存在又は非存在を示すマーカーである。追加の実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、疾患の病期、例えばがんの病期を示すマーカーである。追加の実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、組織のタイプ（例えば、肺組織、乳房組織、結腸組織など）を示すマーカーである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルを直接決定するための、（ｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素及び／又は少なくとも１つのメチル化依存性制限酵素、並びに（ｉｉ）ハイスループット配列決定の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルの直接決定によってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための、（ｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素及び／又は少なくとも１つのメチル化依存性制限酵素、並びに（ｉｉ）ハイスループット配列決定、の使用であって、メチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルの決定が同じ配列決定データに基づく、使用が提供される。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡ試料中の少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルの直接決定によってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素及び／又は少なくとも１つのメチル化依存性制限酵素によるＤＮＡ試料の消化、並びにハイスループット配列決定の後に生成される配列読み取り、の使用であって、メチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルの決定が同じ配列決定データに基づく、使用が提供される。
一般に、メチル化感受性制限酵素を用いて実施することができる実施形態は、代わりにメチル化依存性制限酵素を用いて行うことができ、それに応じて下流のステップが調整される。例えば、いくつかの実施形態では、ハイスループット配列決定及び配列読み取りの生成に続いて、本発明によるメチル化をプロファイリングするための方法は、少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、所定のゲノム領域の読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいてメチル化値を計算することと、を含み、計算されたメチル化値は、ＤＮＡ試料中でメチル化されておらず、したがってメチル化依存性制限酵素による消化後に無傷のままであった分子の数を反映する。
別の例として、いくつかの実施形態では、制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベルを計算するために、ハイスループット配列決定及び配列読み取りの生成に続いて、方法は、配列読み取りから、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、制限遺伝子座がメチル化された、すなわち制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの決定された読み取りカウントに基づいて、制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、を含む。制限遺伝子座の非メチル化ＤＮＡのレベルを計算するために、いくつかの実施形態では、本方法は、配列読み取りから制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントは、制限遺伝子座が非メチル化され、したがって無傷のままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、制限遺伝子座の決定された読み取りカウントに基づいて制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、を含む。
ＤＮＡ試料
本発明による使用のためのＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、精液、糞便、痰及び羊水などの生物学的流体試料を含む、核酸を得ることができる対象の任意の生物学的試料から得ることができる。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。生物学的試料はまた、組織及び器官試料を含む。
本発明による対象は、典型的には、ヒト対象である。対象は、特定の疾患を疑われている可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、目的の疾患を有すると診断される。他の実施形態では、対象は、目的の疾患を有さない健康な対象である。対象はまた、例えば、疾患の既往歴、遺伝的素因、及び／若しくは家族歴に基づいて疾患を発症するリスクがあってもよく、並びに／又は疾患の疑わしい臨床徴候を示す対象及び／若しくは他の以前のアッセイに基づいて、例えば、他のバイオマーカーの試験に基づいて疾患を有することが疑われる対象であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の再発のリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の少なくとも１つの症状又は特徴を示す。他の実施形態では、対象は無症候性である。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、生体液試料から抽出された無細胞ＤＮＡである。「無細胞ＤＮＡ」（「ｃｆＤＮＡ」と略される）という用語は、体液中を自由に循環し、無傷な細胞内に含有されないＤＮＡ分子を指す。ｃｆＤＮＡの起源は完全には理解されていないが、アポトーシス、壊死及び細胞からの能動的放出に関連すると考えられている。ｃｆＤＮＡは、正常細胞及び腫瘍細胞の両方によって放出される。ｃｆＤＮＡは高度に断片化されており、断片は典型的には長さが１２０～２２０ｂｐの範囲であり、大部分は長さが１５０～１８０ｂｐの範囲である。本明細書で使用される用語「無細胞ＤＮＡ」は、対象の体内ですでに無細胞であるＤＮＡを指すものと理解されるべきである。無細胞ＤＮＡ試料について、「制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ」は、消化の結果として生成された断片、及び天然の無細胞ＤＮＡ断片、例えば、アッセイで使用される酵素の認識配列を含まない無細胞ＤＮＡ断片、及び全てメチル化され、したがって酵素によって切断されない酵素の１つ以上の認識配列を含む無細胞ＤＮＡ断片を含むことを理解されたい。
あるいは、ＤＮＡ試料は、細胞から抽出されたＤＮＡ、例えば、組織若しくは臓器試料又は血液細胞から抽出されたＤＮＡであってもよい。典型的には、ＤＮＡを抽出するために細胞溶解が必要とされる。ＤＮＡは、腫瘍試料又は健常組織から得られ得る。本明細書で使用される「腫瘍試料」は、手術によって切除された腫瘍全体又はその一部を包含する。「腫瘍試料」はまた、生検によって腫瘍から採取された試料、及びがん性であると疑われる病変又は組織から採取された試料を包含する。本発明による使用のための腫瘍試料には、新鮮な腫瘍試料並びに凍結／保存腫瘍試料が含まれる。
細胞から抽出されたＤＮＡについて、ＤＮＡをハイスループット配列決定に適した断片に断片化することは、本発明による少なくとも１つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによる消化の前、後、又は間に実施して、下流の処理及び配列決定ライブラリの調製を単純化することができる。かかる断片化は、例えば、超音波処理を使用して、又はメチル化に対して非感受性である制限エンドヌクレアーゼ、すなわちメチル化状態にかかわらずその認識配列を切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して行うことができる。ＣＧジヌクレオチドを含まない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼを用いて実施することもできる。
本発明は、全ゲノム配列決定並びに標的のみを対象にした配列決定（例えば、ＣｐＧアイランド、エクソン又は目的の特定の遺伝子座の配列決定）を包含する。標的のみを対象にした配列決定のために、目的のゲノム領域は、例えば、ビーズに付着した配列特異的プローブなどの捕捉剤を使用して濃縮される。典型的には、目的のゲノム領域の富化は、以下により詳細に記載されるように、本発明に従うメチル化感受性／非メチル化依存性消化の後、及び配列決定ライブラリ調製の後に実施される。いくつかの実施形態では、濃縮は、消化及びライブラリ調製の前に実施され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明によるメチル化感受性又はメチル化依存性消化に供されるＤＮＡ試料は、未処理のＤＮＡ試料、すなわち、生物学的試料から抽出されたＤＮＡ試料である。他の実施形態では、ＤＮＡ試料は、処理されたＤＮＡ試料であり、例えば、本発明による少なくとも１つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによる消化の前に、対象となる特定の領域について濃縮され、かつ／又は断片化されてサイズが縮小されている。
好ましくは、メチル化分析が実施されるＤＮＡ試料は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的にｓｓＤＮＡを含まない」又は「実質的にｓｓＤＮＡを欠く」は、７％未満のＤＮＡがｓｓＤＮＡであり、好ましくは５％未満のＤＮＡがｓｓＤＮＡであり、より好ましくは１％未満のＤＮＡがｓｓＤＮＡである（つまり、ＤＮＡの少なくとも９９％は二本鎖である）、ＤＮＡ試料を示す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、０．１％未満のｓｓＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、０．０１％未満のｓｓＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、ｓｓＤＮＡを全く含まない（ｓｓＤＮＡを含まない）。ｓｓＤＮＡを実質的に含まないＤＮＡ試料を得るためのＤＮＡの抽出は、例えば、本発明の出願人に譲渡された国際公開第２０２０／１８８５６１号に記載されている。本発明の方法での使用に適した無細胞ＤＮＡを抽出するための例示的なキットは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。細胞からＤＮＡを抽出するための例示的なキットは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔである。
ＤＮＡ消化
本発明によれば、抽出（及び任意選択で目的の領域の濃縮及び／又はサイズを減少させるための断片化）に続いて、ＤＮＡは、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及び／又は少なくとも１つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは同時に適用される複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（又は複数のメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ）による消化に供される。本明細書中で使用される場合、「同時に適用される制限エンドヌクレアーゼ」又は「同時消化」は、酵素が、別の酵素の適用の前に１つの酵素を不活性化することなく、活性形態で反応混合物中に一緒に存在することを意味する。
例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。アッセイにおいて使用されるエンドヌクレアーゼのそれぞれの数は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、抽出されたＤＮＡ全体が消化ステップで使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、消化を受ける前に定量されない。他の実施形態では、ＤＮＡは、その消化の前に定量化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、消化に供される第１のアリコートと、未消化対照として維持される第２のアリコートとに等分される。
本明細書で「制限酵素」と互いに置換可能に使用される「制限エンドヌクレアーゼ」は、制限部位としても知られる、特定の認識配列又はその近くでＤＮＡを切断する酵素を指す。制限部位は、通常４～８ヌクレオチド長であり、典型的にはパリンドロームである（すなわち、ＤＮＡ配列は両方向で同じである）。
「メチル化感受性」の制限エンドヌクレアーゼは、メチル化されていない場合にのみ、その認識配列を切断する制限エンドヌクレアーゼである（メチル化された部位は無傷のままである）。したがって、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化の程度は、メチル化レベルに依存し、メチル化レベルが高いほど、切断から保護され、したがって消化が少なくなる。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理されたＤＮＡ試料は、無傷なメチル化部位及び切断された非メチル化部位によって特徴付けられる。１００％の消化効率を必要とせず、したがって、いくつかの非メチル化部位が無傷なままであり得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、消化効率を決定することと、消化効率が所定の閾値／レベルを上回る場合に配列決定ライブラリの調製に進むこととを含む。
「メチル化依存性」の制限エンドヌクレアーゼは、メチル化されている場合にのみ、その認識配列を切断する制限エンドヌクレアーゼである（非メチル化部位は無傷のままである）。したがって、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化の程度は、メチル化レベルに依存し、メチル化レベルが高いほど、より広範な消化がもたらされる。
本発明による使用のためのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、Ａｖａｌ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺｌ７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ－ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰｌＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙｌ６６ｉｉ、Ｈｐｙｌ８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ－ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ－ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａｌｌ、ＳａｌＩ－ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩ及びＺｒａＩからなる群から選択され得る。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉを含む。追加の特定の実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｈａＩを含む。更に追加の特定の実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩを含む。
メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡ、及びＭｒｒＡからなる群から選択され得る。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡ試料は、単一のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受ける。いくつかの特定の実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉである。追加の特定の実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｈａＩである。追加の実施形態では、ＤＮＡ試料は、２つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受ける。
いくつかの特定の実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩが使用される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法であって、ＤＮＡ試料をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供することと、ＨｉｎＰ１Ｉの少なくとも１つの制限遺伝子座及び／又はＡｃｉＩの少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化を分析し、それによってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む方法が提供される。いくつかの態様では、本方法は、ＤＮＡ試料をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供することと、ＨｉｎＰ１Ｉの少なくとも１つの制限遺伝子座及び／又はＡｃｉＩの少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベル及び任意で非メチル化ＤＮＡのレベルを決定し、それによってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、生体液から抽出された無細胞ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩは、１：１～５：１（酵素単位）（ＨＩｎＰ：ＡｃｉＩ）の比、例えば、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１及び４．５：１（酵素単位）（Ｈｉｎｐ：ＡｃｉＩ）の比で、本発明の方法及びシステムとともに使用される。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩは、２：１～４．５：１（酵素単位）（ＨＩｎＰ：ＡｃｉＩ）の比で、本発明の方法に使用される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料におけるメチル化変化を検出するための方法であって、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩ消化を使用してＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、メチル化プロファイルを１つ以上の参照メチル化プロファイルと比較することとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、生体液から抽出された無細胞ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法が提供され、方法は、ＤＮＡ試料をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供し、それによって、制限エンドヌクレアーゼによって生成されたＤＮＡ断片を含む制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡのハイスループット配列決定を実施して、複数の配列読み取りを得ることと、配列読み取りから、ＨｉｎＰ１Ｉの少なくとも１つの制限遺伝子座及び／又はＡｃｉＩの少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベル及び任意選択的に非メチル化ＤＮＡのレベルを決定し、それによってＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、生体液から抽出された無細胞ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、生体液から抽出されたヒト無細胞ＤＮＡと、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩと、を含む反応混合物が提供される。反応混合物は更に、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩの活性に適した緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩは、１：１～５：１（酵素単位）（Ｈｉｎｐ：ＡｃｉＩ）の比で、例えば、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１及び４．５：１（酵素単位）（Ｈｉｎｐ：ＡｃｉＩ）の比で、反応混合物中に存在する。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩを２：１～４．５：１（酵素単位）（Ｈｉｎｐ：ＡｃｉＩ）の比で含む。
いくつかの実施形態では、遺伝的及び後成的分析のために無細胞ＤＮＡ試料を処理する方法が提供され、方法は、本明細書に開示される反応混合物を提供することと、反応混合物をインキュベートして、メチル化制限部位が無傷であり、非メチル化制限部位が切断されている制限エンドヌクレアーゼ処理無細胞ＤＮＡを得ることと、制限エンドヌクレアーゼ処理無細胞ＤＮＡをハイスループット配列決定に供することと、を含む。
消化効率は、試験試料に対して内部的に、又は外部的に評価することができる。内部評価は、遍在的にメチル化されていないことが知られているゲノム位置の無傷な切断部位を測定することによって行うことができる。かかる遺伝子座の例は、ミトコンドリアＤＮＡ上の任意の部位であり得る。消化効率の外部評価は、非メチル化試料を消化ステップに含め、両方の試料を並行して消化し、次いで非メチル化試料が実際に消化されたことを検証する（無傷な切断部位の数を測定することによって）ことによって行うことができる。かかる非メチル化試料は、例えば、ＰＣＲアンプリコン、プラスミドＤＮＡ、市販の非メチル化ＤＮＡ種、又は特定のゲノム位置において非メチル化されていることが知られている細胞株ＤＮＡであり得る。あるいは、消化効率の外部評価は、非メチル化試料を調査試料に添加し、調査試料と同じステップで非メチル化ＤＮＡ試料の消化を測定することによって、単一ステップで実施することができる。この目的のために、上記の全てのタイプの非メチル化ＤＮＡ種を使用することが可能である。いくつかの実施形態では、小さな標的（例えば、ＰＣＲアンプリコン又はプラスミドＤＮＡ）の使用が好ましい。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ消化は、完全に消化するまで実施され得る。いくつかの実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰ１Ｉ及び／又はＡｃｉＩであり得、完全な消化は３７℃での酵素との１～２時間のインキュベーション後に達成され得る。
ライブラリの調製及び配列決定
「ハイスループット配列決定」（「次世代配列決定」とも呼ばれる）は、多数（典型的には数千から数十億）の核酸配列を並行して決定する方法を使用する配列決定を含む。ハイスループット配列決定は、一般に、３つの基本的なステップ、すなわちライブラリ調製、配列決定及びデータ分析、を含む。ハイスループット配列決定技術の例としては、合成による配列決定及びライゲーションによる配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅによって採用される）、ナノポア配列決定法、及びＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）などの電子検出に基づく方法が挙げられる。
主要なハイスループット配列決定プラットフォームのためのライブラリ調製は、配列決定されるＤＮＡの断片への特異的アダプタオリゴヌクレオチドのライゲーションを必要とする。本明細書中に開示されるように、制限消化は、好ましくは、酵素によるアダプタの可能な消化を回避するために、アダプタライゲーションの前に実施される。本明細書に開示されるメチル化感受性／依存性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化は、典型的には、均一な平滑末端断片をもたらさない。したがって、末端修復は、各ＤＮＡ分子がオーバーハングを含まず、５’リン酸基及び３’ヒドロキシル基を含有することを確実にするために必要である。典型的な平滑化酵素混合物は、ポリメラーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（polynucleotide kinase、ＰＮＫ）を含む。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰの存在下）は、５’オーバーハングを充填し、３’オーバーハングをｄｓＤＮＡ界面までトリミングして平滑末端を生成することができる。次いで、Ｔ４ ＰＮＫは、５’末端ヌクレオチドをリン酸化することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリについては、平滑化されたＤＮＡ断片の３’末端への非テンプレート化デオキシアデノシン５’－一リン酸（ｄＡＭＰ）の組み込み（ｄＡテーリングとして公知のプロセス）もまた、ライブラリ調製のために必要とされる。ｄＡテールは、下流のライゲーションステップ中のコンカテマー形成を防止し、ＤＮＡ断片が相補的ｄＴオーバーハングを有するアダプタオリゴヌクレオチドにライゲーションされることを可能にする。
本明細書に開示されるように、「配列決定アダプタ」とも呼ばれるアダプタオリゴヌクレオチドは、リガーゼ酵素が配列決定アダプタをＤＮＡ断片に共有結合させて完全なライブラリ分子を作製する酵素的ライゲーションなどの末端保存法を使用してＤＮＡ断片にライゲーションされる。配列アダプタは、配列決定ライブラリの各ＤＮＡ断片の５’及び３’末端にライゲーションされる。配列決定アダプタには通常、特定のシーケンサーによる断片認識のためのプラットフォーム固有の配列、例えば、ライブラリ断片をＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのフローセルに結合可能にする配列が含まれる。各解列決定機器のプロバイダーは通常、この目的のために特定の配列セットを使用する。
配列決定アダプタはまた、試料インデックスを含み得る。「試料インデックス」、またの名を「試料バーコード」は、複数の試料を同じ機器フローセル又はチップ上で一緒にシーケンス（つまり多重化）できるようにする配列である。各試料インデックス（通常は６～１０塩基）は、特定の試料ライブラリに固有であり、データ分析中に逆多重化して個々の配列読み取りを正確な試料に割り当てるために使用される。配列決定アダプタには、組み合わせるライブラリの数と所望の精度のレベルに応じて、シングル又はデュアルの試料インデックスが含まれ得る。
配列決定アダプタは、固有の分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を含み得る。ＵＭＩは、配列決定中に分子追跡、エラー修正及び精度の向上を提供する分子バーコードの一種である。ＵＭＩは、典型的には５～２０塩基長の短い配列であり、試料ライブラリ中の各分子をユニークにタグ付けするために使用される。出発材料中の各核酸は固有の分子バーコードでタグ付けされているため、バイオインフォマティクスソフトウェアは、高レベルの精度で重複読み取り及びＰＣＲエラーをフィルタリングして除去し、固有の読み取りを報告し、最終的なデータ分析の前に同定されたエラーを除去することができる。
いくつかの実施形態では、試料バーコード配列及びＵＭＩの両方が、核酸標的分子に組み込まれる。
本明細書に開示される方法は、消化されたＤＮＡ分子対未消化ＤＮＡ分子の示差的アダプタのタグ付け（すなわち、メチル化ＤＮＡ分子対非メチル化ＤＮＡ分子の示差的アダプタタグ付け）を必要とせず、混合物中の任意のアダプタが消化されたＤＮＡ及び未消化ＤＮＡの両方にライゲーションすることができるように、同じアダプタ集団が試料全体に使用される。
本発明によるハイスループット配列決定は、Ｎｏｖａｓｅｑ（商標）、Ｎｅｘｔｓｅｑ（商標）及びＭｉＳｅｑ（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、４５４ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＳｅｑｕｅｌ ＩＩ（商標）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むがこれらに限定されない、様々なハイスループット配列決定機器及びプラットフォームを使用して実施することができる。適切なプラットフォーム設計の配列決定アダプタが、配列決定ライブラリを調製するために使用される。
いくつかの実施形態では、全ゲノム配列決定は、エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから調製されたライブラリに対して実施される。ライブラリは、使用される配列決定プラットフォームに適した配列決定アダプタを使用して調製される。
他の実施形態では、エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中の目的の領域は、例えば、溶液相又は固相ハイブリダイゼーションに基づくプロセスを使用して捕捉され、続いてハイスループット配列決定され得る。目的の領域の濃縮とそれに続くハイスループット配列決定は、本明細書において「標的のみを対象にしたハイスループット配列決定」と称される。標的のみを対象にしたハイスループット配列決定は、例えば、ＣｐＧアイランド配列決定及びエクソーム配列決定を含む。標的のみを対象にしたハイスループット配列決定はまた、特定の有益なゲノム領域、例えば、がん組織と非がん組織との間で差次的にメチル化されることが知られている領域の配列決定を含む。標的のみを対象にした配列決定のためのゲノム領域の捕捉は、典型的には、ライブラリ調製後に実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、目的のゲノム領域を濃縮することを含む。ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の末端を保存するために（例えば、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終結する配列の分析を可能にするために）、本発明による富化は、典型的には、目的のゲノム領域のＰＣＲ増幅を使用して行われない。
いくつかの実施形態では、本発明によるＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイリングのための方法は、
生物学的試料からＤＮＡを抽出することと、
抽出されたＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供し、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡにおいてＤＮＡ断片にライゲーションされた配列決定アダプタを使用して、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することと、
捕捉剤を用いて配列決定ライブラリから少なくとも１つ（好ましくは複数）の目的のゲノム領域を濃縮して、少なくとも１つ（好ましくは複数）の目的のゲノム領域が濃縮された配列決定ライブラリを得ることと、
少なくとも１つの（好ましくは複数の）目的のゲノム領域が濃縮された配列決定ライブラリをハイスループット配列決定に供することと、
配列決定データから、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値、並びに任意選択で、本明細書に開示されるＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるメチル化をプロファイリングするための方法は、
生物学的試料からＤＮＡを抽出することと、
抽出されたＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供し、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
制限エンドヌクレアーゼにより生成したＤＮＡにおいてＤＮＡ断片にライゲーションされた配列決定アダプタを使用して、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することと、
捕捉剤を用いて配列決定ライブラリから少なくとも１つ（好ましくは複数）の目的のゲノム領域を濃縮して、少なくとも１つ（好ましくは複数）の目的のゲノム領域が濃縮された配列決定ライブラリを得ることと、
少なくとも１つ（好ましくは複数）の目的のゲノム領域で富化された配列決定ライブラリをハイスループット配列決定に供して、配列読み取りを得ることと、
本明細書に開示されるように、目的のゲノム領域内の少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベル及び非メチル化ＤＮＡのレベルを決定することと、を含む。
配列読み取りの分析
いくつかの実施形態では、「配列読み取り」（又は単に「読み取り」）、すなわち、配列決定プロセスによって生成されたヌクレオチド配列は、参照ゲノムに対してマッピングされる。本明細書で使用される「参照ゲノム」は、種又は対象の代表例として組み立てられた、部分的であるか完全であるかにかかわらず、以前に同定されたゲノム配列を指す。参照ゲノムは典型的には一倍体であり、典型的には種の単一個体のゲノムを表さず、むしろいくつかの個体のゲノムのモザイクである。本発明の方法のための参照ゲノムは、典型的にはヒト参照ゲノムである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）又はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）ゲノムブラウザのウェブサイトで入手可能なヒトゲノムアセンブリなどの完全ヒトゲノムである。ヒト研究のための適切な参照ゲノムの例は、「ｈｇ１８」ゲノムアセンブリである。代替案として、より最近のＧＲＣｈ３８主要アセンブリを使用することができる（パッチｐ１３まで）。
読み取りマッピングは、参照ゲノム内の読み取りの位置を同定するために、参照ゲノム上で読み取りをアラインメントさせるプロセスである。アラインメントする配列読み取りは、「マッピング」されていると指定される。アラインメントプロセスは、アラインメント中の様々な配列にわたって配列同一性の領域を得る可能性を最大化し、読み取りの２つの末端上のいくつかの短い断片のミスマッチ、インデル及び／又はクリッピングを可能にすることを目的とする。目的の特定のゲノム遺伝子座にマッピングされた読み取りの数は、本明細書において、このゲノム遺伝子座の「読み取りカウント」又は「コピー数」と称される。コンピュータソフトウェアを使用して、配列読み取りを分析し、参照ゲノムに対して配列読み取りをマッピングし、読み取りの数を定量化することができる。
本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」という用語は互いに置換可能であり、染色体上の特定の位置にあるＤＮＡ配列を指す。「遺伝子座」は、単一の位置（ゲノム中の規定された位置における単一のヌクレオチド）、又はゲノム中の規定された位置で開始及び終了するヌクレオチドのストレッチを含み得る。特定の位置は、分子の位置によって、つまり染色体上の開始及び終了塩基対の数によって同定できる。所与のゲノム位置にあるＤＮＡ配列のバリアントは、対立遺伝子と呼ばれる。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体の同一部位に位置する。ゲノムの遺伝子座には、遺伝子配列並びに他の遺伝的要素（遺伝子間配列など）が含まれる。
「制限遺伝子座」は、本明細書において、本発明による消化ステップにおいて適用されるメチル化感受性／非依存性制限エンドヌクレアーゼの制限部位であるゲノム遺伝子座を説明するために使用される。本発明による制限遺伝子座は、正常なＤＮＡ及び疾患ＤＮＡの間で差次的にメチル化され得るが、これは、分析が実施される所与の疾患、例えば、特定のタイプのがんについて、制限遺伝子座が、正常なＤＮＡ及びがん細胞由来のＤＮＡの間でメチル化レベルが異なることを意味する。例えば、がん細胞からのＤＮＡは、正常な非がん性ＤＮＡと比較して、制限遺伝子座でのメチル化レベルが増加している可能性がある。より具体的には、制限遺伝子座は、正常な非がん性ＤＮＡと比較してがんのＤＮＡでよりメチル化されているＣＧジヌクレオチドを含有する。本発明によれば、異なってメチル化されたＣＧジヌクレオチドは、消化ステップで適用される少なくとも１つの制限酵素の認識部位内に位置する。
いくつかの実施形態では、本発明による制限遺伝子座は、健康な対象の無細胞ＤＮＡよりも特定のタイプのがんを有する対象の無細胞ＤＮＡ、例えば血漿ＤＮＡにおいてよりメチル化されているＣＧジヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、がん患者の血漿試料は、健常対象の血漿試料と比較して、制限遺伝子座においてメチル化されているＤＮＡ分子をより高い割合で含有する。
追加の実施形態では、本発明に従う制限遺伝子座は、非がん性組織由来のＤＮＡよりもがん性組織（例えば、腫瘍試料）由来のＤＮＡにおいてよりメチル化されているＣＧジヌクレオチドを含み、これは、がん性組織において、非がん性組織と比較してより大きな割合のＤＮＡ分子がこの位置でメチル化されていることを意味する。
メチル化感受性制限酵素は、メチル化されていない場合にのみ、その認識配列を切断する。メチル化依存性制限酵素は、メチル化されている場合にのみ、その認識配列を切断する。したがって、試料間のメチル化レベルの差は、消化の程度の差をもたらし、その後、後続の配列決定及び定量化ステップにおける配列読み取りの量が異なる。かかる差異は、異なる試料由来のＤＮＡ間、例えば、がんを有する被験体由来のＤＮＡ試料と健康な被験体由来のＤＮＡ試料との間の区別を可能にする。
制限遺伝子座の「メチル化ＤＮＡのレベル」、「メチル化レベル」又は「メチル化値」という用語は、試料中の制限遺伝子座を含むＤＮＡ分子の総数のうち、この制限遺伝子座でメチル化されている（すなわち、制限遺伝子座内のＣＧジヌクレオチドでメチル化されている）ＤＮＡ分子の数を表す数値である。いくつかの実施形態では、制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベルは、本明細書において、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化後の制限遺伝子座の読み取りカウントから計算される。追加の実施形態では、制限遺伝子座のメチル化ＤＮＡのレベルは、本明細書において、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの所定のゲノム領域の読み取りカウントから計算される。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列がメチル化されていない場合にのみ認識配列を切断するため、制限遺伝子座の読み取りカウントは、制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷のままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す。
いくつかの実施形態は、制限遺伝子座のメチル化レベルは、制限遺伝子座の読み取りカウント、又は制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの所定のゲノム領域の読み取りカウントを、制限遺伝子座又は制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの所定のゲノム領域の予想読み取りカウントで割ることによって計算される。制限遺伝子座／所定のゲノム領域の予想される読み取りカウントは、例えば、（ｉ）制限エンドヌクレアーゼによって切断されない、制限遺伝子座／ゲノム領域と同じ長さの参照遺伝子座／ゲノム領域の読み取りカウント、（ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼによって切断されない、制限遺伝子座／ゲノム領域と同じ長さの複数の参照遺伝子座／ゲノム領域の平均読み取りカウント、又は（ｉｉｉ）未消化対照ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座／所定のゲノム領域の読み取りカウントであって、任意選択的に、配列決定深度差について補正された読み取りカウント、を使用して決定され得る。例示的な計算は、本明細書の以下の実施例のセクションに記載されている。
追加の実施形態では、メチル化レベルは、制限遺伝子座の読み取りカウント及び制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントから決定される総断片数を決定することによって計算される。例示的な計算は、本明細書の以下の実施例のセクションに記載されている。
いくつかの実施形態は、メチル化レベルは、メチル化のパーセンテージ（％）として表され、試料中の制限遺伝子座を含有するＤＮＡ分子の総数のうち、制限遺伝子座においてメチル化されているＤＮＡ分子のパーセンテージを表す。
制限遺伝子座の「非メチル化ＤＮＡのレベル」又は「非メチル化レベル」という用語は、試料中の制限遺伝子座を含むＤＮＡ分子の総数のうち、この制限遺伝子座においてメチル化されていない（すなわち、制限遺伝子座内のＣＧジヌクレオチドにおいてメチル化されていない）ＤＮＡ分子の数を表す数値である。本明細書に開示されるように、制限遺伝子座の非メチル化ＤＮＡのレベルは、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化及び任意のその後の末端修復後の、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する読み取りの数から計算される。配列読み取りが開始又は終了する制限遺伝子座内の正確なヌクレオチドは、消化ステップで使用される制限エンドヌクレアーゼのタイプ及びその認識配列の長さに依存する。例えば、５’オーバーハングを有する非平滑末端を生成する制限エンドヌクレアーゼについて、消化及び末端修復は、認識配列の２番目のヌクレオチドで始まる断片及び認識配列の最後から２番目のヌクレオチドで終了する断片を生じる。例えば、５’オーバーハングを有する非平滑末端を生成する４塩基カッターについて、消化及び末端修復は、認識配列の第２のヌクレオチドで開始する断片及び認識配列の第３のヌクレオチドで終了する断片を生じる（図１５）。したがって、５’オーバーハングを有する非平滑末端を生成する制限エンドヌクレアーゼについて、その制限遺伝子座の「開始」分析は、制限遺伝子座の２番目のヌクレオチド（認識配列の２番目のヌクレオチド）で開始する配列読み取りに対して行われ、「終了」分析は、制限遺伝子座の最後から２番目のヌクレオチド（認識配列の最後から２番目のヌクレオチド）で終了する配列読み取りに対して実施される。
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列がメチル化されていない場合にのみ認識配列を切断するため、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する読み取りの数は、制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す。
本明細書中に開示されるような制限エンドヌクレアーゼによって切断される各ＤＮＡ分子は、２つの断片（一方は、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始し、他方は、制限遺伝子座内のヌクレオチドで終結する）を生じる。したがって、所与のＤＮＡ分子について、２つの異なる配列読み取りを得ることが可能であり得る。試料中に存在した非メチル化ＤＮＡ分子の数の正確な分析のために、非メチル化のレベルは、制限遺伝子座で開始する配列読み取りの数、制限遺伝子座で終了する配列読み取りの数に基づいて、又は２つの値の間の平均によって計算され得るが、値の合計には基づいていない。本明細書に開示されるように、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することは、２つの値の間の平均を使用して非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することを包含する。
いくつかのライブラリ調製方法は、続いて配列決定されない小さな断片の枯渇を生じ得ることが更に注目される。かかる枯渇は、非メチル化レベルの過小評価及びメチル化レベルの過大評価をもたらし得る。加えて、制限遺伝子座で開始する配列読み取りの数は、制限遺伝子座で終了する配列読み取りの数と異なり得る。本発明は、かかるライブラリ調製バイアスに有利に対処する。このバイアスを低減し、より正確な結果を達成するために、制限遺伝子座で開始する読み取りの数及び制限遺伝子座で終了する読み取りの数の両方を決定し、その後、追加の分析及び計算のためにより多くの読み取り数を提供する配向を選択するか、又は２つの値の間の平均を計算し、追加の分析及び計算のために平均を使用することが好ましい。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、制限遺伝子座内のヌクレオチドから始まる配列読み取りの数を決定することと、制限遺伝子座内のヌクレオチドで終了する配列読み取りの数を決定することと、より多数の配列読み取りを提供する配向を使用して、制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、を含む。追加の実施形態では、本発明の方法は、制限遺伝子座内のヌクレオチドから始まる配列読み取りの数を決定することと、制限遺伝子座内のヌクレオチドで終了する配列読み取りの数を決定することと、２つの値の間の平均を計算することと、平均を使用して、制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、を含む。
制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの数は、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの予想数を減算することによって正規化され得る。制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの予想数は、例えば、以下を使用して決定され得る：（ｉ）制限エンドヌクレアーゼによって切断されない、制限遺伝子座と同じサイズの参照遺伝子座で開始又は終了する配列読み取りの数、（ｉｉ）酵素によって切断されない、制限遺伝子座と同じサイズの複数の参照遺伝子座で開始又は終了する配列読み取りの平均数、（ｉｉｉ）未消化対照ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの数であって、任意選択で配列決定深度差について補正された読み取りの数。例示的な計算は、本明細書の以下の実施例のセクションに記載されている。正規化された値を使用して、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの正規化された数と制限遺伝子座の予想される読み取りカウントとの間の比を作成することによって、非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することができる。
いくつかの実施形態では、非メチル化ＤＮＡのレベルは、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する読み取りの数と、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する読み取りの予想数との間の差を計算し、その後、差を制限遺伝子座の予想読み取りカウントで割ることによって得られる。
追加の実施形態では、非メチル化ＤＮＡのレベルは、制限遺伝子座の読み取りカウント及び制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントから決定される総断片数を決定することによって計算される。例示的な計算は、本明細書の以下の実施例のセクションに記載されている。
いくつかの実施形態は、非メチル化ＤＮＡのレベルは、非メチル化のパーセンテージ（％）として表され、試料中の制限遺伝子座を含有するＤＮＡ分子の総数のうち、制限遺伝子座において非メチル化されているＤＮＡ分子のパーセンテージを表す。
メチル化レベル（又は非メチル化ＤＮＡのレベル）はまた、複数の制限遺伝子座に及ぶゲノム中の領域（すなわち、複数の制限部位を含有するゲノム領域）について計算され得る。複数の制限遺伝子座にまたがるゲノム領域は、遺伝子、遺伝子間領域、プロモーター領域、染色体の一部（例えば、染色体アーム）、染色体全体などであり得る。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
メチル化変化の検出
本明細書で使用される場合、「メチル化変化の検出」は、試験されたＤＮＡ試料が１つ以上の基準ＤＮＡ試料と比較してメチル化変化を含むかどうかを検出することと、ＤＮＡ試料が選択されたゲノム遺伝子座での異なるメチル化プロファイルによって特徴付けられるかどうかを検出することと、及び／又はＤＮＡ試料のメチル化プロファイルが正常であるか、又は疾患の存在の指標となるメチル化変化を含むかどうかを決定することと、を指す。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。メチル化変化の検出はまた、ＤＮＡメチル化マーカーとして使用され得る、試料間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定するために、本明細書に開示されるように得られたメチル化データを試料間で比較することを包含する。例えば、本明細書に開示されるように得られたメチル化データを分析して、異なるタイプの組織間で、がんＤＮＡと非がんＤＮＡとの間で、異なるタイプのがん間で、又は特定のタイプのがんの異なるステージ間で示差的にメチル化されたゲノム領域を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ゲノムワイドのメチル化分析を提供する。他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、標的のみを対象にしたメチル化分析を提供する。配列決定及びメチル化データの分析において、コンピュータソフトウェアを使用することができる。
本発明の方法は、汎がん診断マーカー、すなわちがんタイプの群を示すＤＮＡメチル化マーカーとして使用され得るＤＮＡメチル化マーカー領域を同定及び分析するために適用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明による汎がんマーカーは、肺がん、結腸直腸がん、肝臓がん、乳がん、膵臓がん、子宮がん、卵巣がん、頭部及び頸部がん、胃がん、食道がん、血液がん（例えば、リンパ種）及び肉腫から選択される複数のがん型を示す。本方法はまた、異なるタイプのがん間の差次的メチル化を同定するために、例えば、異なるタイプのがん間を区別することができる、異なるタイプのがんに特徴的なメチル化プロファイルを決定するために適用され得る。本明細書に開示される方法は、肺がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、神経系に影響を及ぼすがん、骨がん、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝細胞がん）、血液悪性腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、子宮頸がんを含むがこれらに限定されない任意のタイプのがんに適用可能である。各がんのタイプは、本発明の個別の実施形態を表す。本発明の方法はまた、組織特異的メチル化マーカーを同定するために適用され得る。例えば、肺、膀胱、乳房、結腸直腸、前立腺、胃、卵巣、膵臓、腎臓、子宮頸部組織に特異的なメチル化マーカーを同定するためである。各組織のタイプは、本発明の個別の実施形態を表す。かかるマーカーは、例えば、循環無細胞ＤＮＡの組織給源を同定するために使用され得る。
本発明の方法はまた、被験体における疾患（例えば、がん）を同定するために適用され得る。本明細書で使用される同定するという用語は、対象において、疾患についてのスクリーニングを行うこと、疾患の存在又は不存在を検出すること、疾患の再発を検出すること、疾患に対する感受性を検出すること、治療に対する応答を検出すること、治療の有効性を決定すること、疾患の病期（重症度）を決定すること、疾患の予後及び早期診断を決定すること、のいずれか１つ以上を包含する。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
本明細書で使用される「がんを評価する」又は「がんの存在を評価する」又は「がんの存在又は非存在を評価する」は、対象ががんを有する可能性を決定することを指す。これらの用語は、がんの存在を確認する（又は除外する）ために、対象が、確証的な血液検査、尿検査、細胞診、撮像、内視鏡検査及び／又は生検などの確証的ながん検査を受けるべきかどうかを決定することを包含する。これらの用語は更に、対象におけるがんの診断を補助することを包含する。この用語は更に、がんの存在を示す無細胞ＤＮＡ試料におけるがん関連変化を定量化することを包含する。本発明によるがんの存在の評価は、対象におけるがんのスクリーニング、がんの再発の評価、がんに対する感受性又はリスクの評価、治療に対する応答の評価及び／又はモニタリング、治療の有効性の評価、がんの重症度（病期）の評価並びにがんの予後の評価のうちの１つ又は複数を含む。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。本明細書に開示されるアッセイにおける陰性結果は、依然として、本発明によるがんの存在についての評価とみなされることを理解されたい。
本発明の方法は、腫瘍画分又は腫瘍ＤＮＡの画分濃度を決定するステップを更に含み得る。腫瘍画分は、ｃｆＤＮＡ試料中の腫瘍分子の割合である。
本明細書に開示される「メチル化プロファイル」（又は「ＤＮＡメチル化プロファイル」若しくは「ＤＮＡ試料のメチル化プロファイル」）を決定することは、１つ以上の制限遺伝子座、好ましくは複数の制限遺伝子座におけるメチル化値を決定することを指す。いくつかの実施形態では、メチル化プロファイルを決定することは、１つ以上の制限遺伝子座、好ましくは複数の制限遺伝子座におけるメチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルを決定することを含む。
本明細書に開示される「参照メチル化プロファイル」は、既知の給源からのＤＮＡにおいて決定されたメチル化プロファイルを指す。「参照ＤＮＡ試料」は、既知の給源からのＤＮＡ試料である。いくつかの実施形態では、参照メチル化プロファイルは、複数の参照ＤＮＡ試料において決定されたプロファイルである。加えて、本発明の方法は、異なる時点で単一の対象から採取された、例えば、疾患の異なる段階で採取された、又は疾患の治療の前後に採取されたＤＮＡ試料間のメチル化変化を分析（例えば、測定）するために使用され得る。第１の時点で採取されたＤＮＡ試料のメチル化プロファイルは、第２の（後の）時点で採取されたＤＮＡ試料のメチル化プロファイルの参照として使用することができる。
特定の制限遺伝子座又は複数の制限遺伝子座にわたる特定のゲノム領域についての「参照メチル化レベル」は、既知の給源由来のＤＮＡにおける特定の制限遺伝子座／ゲノム領域について測定されたメチル化のレベルである。特定の制限遺伝子座又は複数の制限遺伝子座にわたる特定のゲノム領域についての「参照メチル化値」は、既知の給源由来のＤＮＡにおける特定の制限遺伝子座／ゲノム領域のメチル化のレベルを表す数値である。
特定の制限遺伝子座又は複数の制限遺伝子座にわたる特定のゲノム領域についての「非メチル化ＤＮＡの参照レベル」は、既知の給源由来のＤＮＡ中の特定の制限遺伝子座／ゲノム領域について測定された非メチル化ＤＮＡのレベルである。
参照メチル化／非メチル化レベル／値は、既知の給源からのＤＮＡ試料の大きなセットにおける特定の制限遺伝子座又は特定のゲノム領域について決定されたメチル化／非メチル化レベル／値の分布であり得る。いくつかの実施形態では、メチル化／非メチル化レベル／値は基準スケールであり得る。
特定の制限遺伝子座／ゲノム領域についての基準スケールは、同じ参照源からの複数のＤＮＡ試料中のこの制限遺伝子座について測定されたメチル化／非メチル化レベル／値を含み得る。例えば、基準がん患者の基準スケール又は基準健常者の基準スケール。あるいは、所与の制限遺伝子座についての基準スケールは、健康な個体及び罹患した個体の両方からのメチル化／非メチル化レベル／値、すなわち、両方の給源からの参照メチル化値を組み合わせた単一スケールを含み得る。一般に、単一のスケールが使用される場合、健常者からの値がスケールの一方の端に、例えばカットオフ値より下になるように、患者からの値はスケールのもう一方の端に、例えばカットオフ値より上になるように、値は分布される。いくつかの実施形態では、未知の給源の検査ＤＮＡ試料について計算されたメチル化／非メチル化レベル／値は、健康及び／又は疾患の基準値の基準スケールと比較することができ、スコアは、スケール内の相対位置に基づいて計算されたメチル化／非メチル化レベル／値に割り当てることができる。
「疾患参照メチル化」（例えば：「がん参照メチル化」）、「疾患参照非メチル化」又は「疾患ＤＮＡにおける参照メチル化（又は非メチル化）」（例えば：「がんＤＮＡにおける参照メチル化」）という用語は、互換的に、分析が実施される疾患を有する対象、例えば、ある種のがんを有する対象のＤＮＡ試料中の特定の制限遺伝子座又は特定のゲノム領域について測定されたメチル化値及び／又は非メチル化値を指す。疾患参照メチル化及び／又は非メチル化は、疾患ＤＮＡ、すなわち、疾患を有する対象の試料からのＤＮＡにおけるメチル化／非メチル化値を表す。疾患基準メチル化／非メチル化レベル／値は、上で詳述したように、単一の値、又は複数の値（例えば、分布）であり得る。
「疾患ＤＮＡメチル化プロファイル」（例えば、「がんＤＮＡメチル化プロファイル」）という用語は、分析が実施される疾患を有する対象、例えば、分析されている特定の種類のがんを有する対象の試料（例えば、血漿試料）から決定された、複数の制限遺伝子座におけるメチル化値及び／又は非メチル化値を指す。
「健常参照メチル化」、「正常参照メチル化」又は健常／正常ＤＮＡにおける参照メチル化」という用語は、互換的に、正常個体由来のＤＮＡ試料中の特定の制限遺伝子座／ゲノム領域について測定されたメチル化値を指す。同様に、「健常参照非メチル化」、「正常参照非メチル化」又は健常／正常ＤＮＡにおける参照非メチル化」は、正常個体由来のＤＮＡ試料中の特定の制限遺伝子座／ゲノム領域について測定された非メチル化値を互換的に指す。「正常」又は「健康」は、分析が実施される特定の疾患に関して定義される。「健康な」又は「正常な」個人は、本明細書では、従来の診断方法によって決定される、検出可能な症状、及び／又は疾患の病理学的知見のない個人として定義される。健康基準メチル化／非メチル化レベル／値は、上で詳述したように、単一の比率、統計値、又は複数の比率（例えば、分布）であり得る。
「健康なＤＮＡメチル化プロファイル」又は「正常なＤＮＡメチル化プロファイル」という用語は、上記で定義されるように、正常な個体のＤＮＡ試料から決定される、複数の制限遺伝子座におけるメチル化値及び／又は非メチル化値を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される診断方法は、疾患ＤＮＡからの基準メチル化／非メチル化レベル／値の事前決定を含む。いくつかの実施形態では、本発明の診断方法は、本明細書で開示されるように、正常なＤＮＡからの基準メチル化／非メチル化レベル／値の事前決定を含む。
組織特異的メチル化プロファイルはまた、組織の正常な非がんＤＮＡメチル化プロファイルを確立するために、本明細書中に開示される方法を使用して特徴付けられ得る。あるいは、又は更に、循環無細胞ＤＮＡの組織給源を同定するために、組織特異的メチル化プロファイルを特徴付けることができる。
いくつかの実施形態では、本発明によるメチル化変化の検出は、対象由来のＤＮＡ試料のメチル化プロファイルに基づいて、対象における特定の疾患の有無を同定することを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料の細胞給源又は組織給源を同定するための方法が提供される（例えば、ＤＮＡが由来する組織の種類を同定する、及び／又はＤＮＡが正常な若しくは疾患の細胞／組織に由来するかどうかを同定する）。
当業者は、対応する基準値について計算されたＤＮＡメチル化／非メチル化レベル／値と、１つ以上の対応する基準値との比較が、様々な統計的手段を使用して、いくつかの方法で実行され得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、特定の制限遺伝子座／ゲノム領域について計算された試験メチル化／非メチル化値を基準値と比較することは、試験値を単一の基準値と比較することを含む。単一の基準値は、健常者又は分析が実施される疾患を有する対象の大集団から基準メチル化／非メチル化レベル／値について得られた平均値に対応し得る。他の実施形態では、試験値を基準値と比較することは、試験値を複数の基準値の分布又はスケールと比較することを含む。試験試料について計算された値が疾患基準値又は正常基準値に対応するかどうかを決定するために、既知の統計的手段を使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明による診断は、検査ＤＮＡ試料のメチル化／非メチル化レベル／値が疾患値であるかどうか、すなわち、問題となっている疾患を示すかどうかの分析に基づく。いくつかの実施形態では、本方法は、計算値をその対応する健常基準値と比較して、計算値が疾患値である可能性を反映するスコアを得るステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、計算値をその対応する疾患基準値と比較して、計算値が疾患値である可能性を反映するスコアを得ることを含む。いくつかの実施形態では、スコアが高いほど、計算された値が疾患値である可能性が高い。いくつかの実施形態では、スコアは、疾患値の分布内での計算された値の相対的位置に基づく。
いくつかの実施形態では、本方法は、それらの対応する健常な及び／又は疾患参照値に対して、複数の制限遺伝子座のために算出される複数の値を比較することを含む。いくつかの実施形態では、値のパターンは、統計的手段及びコンピュータ化されたアルゴリズムを使用して分析され、それが問題となっている疾患のパターン又は正常で健康なパターンを表すかどうかを決定し得る。例示的なアルゴリズムとしては、機械学習及びパターン認識アルゴリズムが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの例示的な実施形態では、試験された試料について計算された値は、がん試料、非がん試料、又はその両方の大きなセットから生成された基準値のスケールに対して比較され得る。スケールは、閾値を示してもよく、以下「カットオフ」又は「事前に定義された閾値」とも呼ばれ、それを超えるとがんに対応する基準値であり、それ以下は健常者に対応する基準値であり、又はその逆順である。いくつかの実施形態では、スケールの下部及び／又はカットオフより下のより低い値は、正常人（健康、すなわち、問題となっているがんに罹患していない）の試料からのものであり得、スケールの上部及び／又は所定のカットオフを超えるより高い値は、がん患者からのものであり得る。複数の制限遺伝子座の分析に基づく診断では、各遺伝子座について計算された値に、スケール内のその相対位置に基づくスコアを与えることができ、（各遺伝子座についての）個々のスコアを組み合わせて単一のスコアを与える。いくつかの実施形態では、個々のスコアを合計して単一のスコアを与えることができる。他の実施形態では、個々のスコアを平均して単一のスコアを与えることができる。いくつかの実施形態では、単一のスコアは、対象が問題となっているがんを有しているかどうかを決定するために使用することができ、所定の閾値を超えるスコアは、がんを示す。
追加の例示的な実施形態では、複数の制限遺伝子座の分析に基づく診断のために、各計算値について、それががんＤＮＡを表す確率が、対応するがん基準値及び／又は正常基準値との比較に基づいて決定され得る。スコアを各遺伝子座に割り当てることができ、その後、各遺伝子座について計算された個々のスコアを組み合わせて（例えば、合計又は平均して）、組み合わせスコアを得る。複合スコアは、対象ががんに対して陽性若しくは陰性であるかどうかを決定するために使用することができ、所定の閾値を超える複合スコアは、がんを示す。したがって、いくつかの実施形態では、閾値又はカットオフスコアが決定され、それを上回る（又は下回る）対象は、問題となっている疾患、例えば、問題となっているがんに対して陽性であるとして同定される。閾値スコアは、健常者の母集団と非健常者の母集団を区別する。
いくつかの実施形態では、本発明の診断方法は、閾値スコアを提供することを含む。
多くの場合、統計的有意性は、２つ以上の母集団を比較し、信頼区間（ＣＩ）及び／又はｐ値を決定することによって決定される。いくつかの実施形態では、統計的に有意な値は、約９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％及び９９．９９％の信頼区間（ＣＩ）を指し、好ましいｐ値は約０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１未満又は０．０００１未満である。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、閾値スコアのｐ値は最大で０．０５である。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示され診断る方法の診断感度は、少なくとも７５％である。いくつかの実施形態では、診断感度は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、診断感度は、少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、方法の診断感度は、少なくとも約９０％である。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される診断アッセイの「診断感度」は、陽性であると診断された病人のパーセンテージ（「真の陽性」のパーセント）を指す。したがって、アッセイによって検出されない病人は「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイにおいて陰性である被験体は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を引いたものであり、ここで、「偽陽性」率は、試験結果が陽性である疾患を有さない者の割合として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を提供できないが、この方法が診断に役立つ陽性の指標を提供する場合はそれで十分である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される診断方法の診断特異度は、少なくとも約６５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の診断特異度は少なくとも約７０％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の診断特異度は少なくとも約７５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の診断特異度は少なくとも約８０％であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明による診断方法は、メチル化プロファイルに基づいてレポート（紙又は電子で）を作成することを含む。報告は、対象及び／又は対象の医療提供者に通信されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明による診断方法は、被験体を追跡検査及びスクリーニングに照会することを含む。
追加の遺伝的及び後成的特性付け
ＤＮＡメチル化／非メチル化値に加えて、本明細書に開示される同じ配列決定データから、ＤＮＡ変異、コピー数変化、及び無細胞ＤＮＡのヌクレオソームポジショニングに関する情報を得ることが可能である。一般に、無細胞ＤＮＡは、１２０～２２０ｂｐの間の範囲の断片で循環する。このパターンは、単一ヌクレオソームの周りに巻き付いたＤＮＡの長さに加えて、ヒストンに結合した約２０ｂｐの短いストレッチ（リンカーＤＮＡ）と一致する。ヌクレオソームのポジショニングは、異なる組織間で、及び悪性細胞において変動するため、断片化のパターンは、ｃｆＤＮＡプールに寄与する起源の優勢な細胞型を決定するのに役立つことが示されている。
有利には、本明細書に開示されるＤＮＡメチル化プロファイルの決定及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性の決定は、同じ配列決定データに基づいて行われ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列決定ベースのアッセイは、メチル化変化の検出を、変異検出及び追加の後成的特性の分析と、全て１つの単一アッセイにおいて組み合わせる。このアッセイは、単一のアッセイで少量のＤＮＡの組み合わせ分析を有利に可能にする。
メチル化並びに追加の遺伝的及び後成的特性の組み合わせ分析は、がん（又は任意の他の状態／組織源）の検出を増強するのに有用である。
いくつかの例示的な実施形態では、対象におけるがんの存在又は非存在を検出するための方法は、
（Ａ）本明細書に開示されるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、１つ以上のがん関連ゲノム領域における過剰メチル化の存在又は非存在を検出すること、及び
（Ｂ）以下の１つ以上：
１つ以上のがん関連変異の存在又は非存在（例えば、がん遺伝子／腫瘍抑制因子におけるがん関連変異）を決定すること、
がん関連コピー数多型の存在又は非存在を決定すること、及び
がん関連ヌクレオソームポジショニングの存在又は非存在を決定すること、を行うことを含み、
（Ａ）及び（Ｂ）は、同じ配列決定データを用いて行われ、
１つ以上のがん関連ゲノム領域における過剰メチル化の存在、並びに１つ以上のがん関連変異、がん関連コピー数多型及びがん関連ヌクレオソームポジショニングのうちの少なくとも１つを決定することが、対象におけるがんの存在を示す。
非メチル化がん関連変化は、がん関連変化が同じＤＮＡ断片上に見出されるか否かに応じて、依存的又は非依存的にメチル化情報と組み合わせることができ、同じ断片上に見出される変化は、がんの存在のより強い指標を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法が提供され、方法は、本明細書に開示されるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することとを含み、少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性は、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択され、メチル化のプロファイリング及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性の決定は、同じ配列決定データを使用して行われ、それによってＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングする。
いくつかの実施形態では、対象における疾患の存在又は非存在を検出するための方法が提供され、方法は、本明細書に開示されるＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングすることと、ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することであって、少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性は、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択され、メチル化のプロファイリング及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性の決定は、同じ配列決定データを使用して実施されて、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性を得ることと、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性を１つ以上の参照遺伝的及び後成的特性と比較することと、比較に基づいて疾患の存在又は非存在を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。
システム及びキット
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料におけるメチル化変化を検出するためのシステムが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料における遺伝的及び後成的変化を検出するためのシステム及び方法が本明細書に提供される。追加の実施形態では、ＤＮＡ試料におけるメチル化変化を検出するためのキットが本明細書に提供される。追加の実施形態では、ＤＮＡ試料における遺伝的及び後成的変化を検出するためのキットが本明細書に提供される。
本発明によるシステムは、アッセイを実行するため及び／又は結果を処理するための、例えば計算を実行するためのコンピュータプロセッサを含む。いくつかの実施形態では、コンピュータ実装方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、システム及びキットは、本明細書に開示される方法に従って、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするためのものである。いくつかの実施形態では、システム及びキットは、本明細書に開示される方法に従って、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするためのものである。追加の実施形態では、システム及びキットは本明細書に開示される方法に従って、ＤＮＡ試料のメチル化変化を検出するためのものである。追加の実施形態では、システム及びキットは、本明細書に開示される方法に従って、ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的変化を検出するためのものである。
いくつかの実施形態では、本発明によるシステムは、
ＤＮＡ試料と、
ＤＮＡ試料を消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及び／又は少なくとも１つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼと、
複数の制限エンドヌクレアーゼにより生成されたＤＮＡ断片を含む配列決定ライブラリを調製するための成分と、
配列決定ライブラリを配列決定し、配列読み取りを生成するためのハイスループットシーケンサーと、
非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアであって、本明細書に開示される方法に従って、複数の配列読み取りに基づいてＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするようにコンピュータプロセッサに指示する、コンピュータソフトウェアと、を含む。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、本明細書に開示される方法に従って、複数の配列読み取りに基づいてＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするようにコンピュータプロセッサに指示する。
いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体上に記憶されたコンピュータソフトウェアは、コンピュータプロセッサに、本明細書に開示される方法に従って、複数の配列読み取りに基づいて、ＤＮＡ試料における遺伝的及び後成的変化を決定するように指示する。いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアは、コンピュータプロセッサに、本明細書に開示される方法に従って複数の配列読み取りに基づいてＤＮＡ試料中のメチル化変化を決定するように指示する。
本明細書中で使用される場合、配列決定ライブラリを調製するための「成分」は、生化学的成分（例えば、酵素、ヌクレオチド）、化学的成分（例えば、緩衝液）、及び技術的成分（例えば、チューブ、バイアル、ピペットなどの装置）を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明によるキット又はシステムは、制限酵素に加えて、１つ以上の緩衝液などの、ＤＮＡ消化に必要な成分を含む。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするためのシステムが提供され、システムは、無細胞ＤＮＡ試料と、非一時的コンピュータ可読媒体上に記憶されたコンピュータソフトウェアであって、実行されると、コンピュータプロセッサに以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる無細胞ＤＮＡ試料の消化後に得られたＤＮＡ分子のライブラリの配列決定データを受け取り、配列決定アダプタを制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子にライゲーションすることを含む配列決定ライブラリを調製することであって、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び未消化のＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、受け取り、調製することと、
（ｉｉ）配列決定データから、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値、並びに任意選択で、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することと、
を実行させるよう構成され若しくは指示された指令を含む、コンピュータソフトウェアと、を含み、
３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、当該方法に十分であり、無細胞ＤＮＡ試料が、ライブラリ調製の前に増幅に供されておらず、無細胞ＤＮＡ試料のメチル化値及び少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することが、同じ配列決定データに基づいて実施される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするためのシステムが本明細書で提供され、システムは、非一時的コンピュータ可読媒体上に記憶されたコンピュータソフトウェアを含み、このコンピュータソフトウェアは、実行されると、コンピュータプロセッサに以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化後に得られたＤＮＡ分子のライブラリの配列読み取りを受け取ることと、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を計算することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするためのシステムが本明細書で提供され、システムは、非一時的コンピュータ可読媒体上に記憶されたコンピュータソフトウェアを含み、このコンピュータソフトウェアは、実行されると、コンピュータプロセッサに以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化後に得られたＤＮＡ断片のライブラリの配列読み取りを受け取ることと、
（ｉｉ）複数の配列読み取りを参照ゲノムに対してマッピングして、マッピングされた配列読み取りを生成し、参照ゲノム内の少なくとも１つの制限遺伝子座を選択することと、
（ｉｉｉ）マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化され、したがって無傷のままであったＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｉｖ）マッピングされた配列読み取りから、少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定することであって、読み取りカウントが、少なくとも１つの制限遺伝子座がメチル化されておらず、したがって制限エンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数を表す、決定することと、
（ｖ）ステップ（ｉｉｉ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいて少なくとも１つの制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルを計算し、ステップ（ｉｖ）で決定された少なくとも１つの制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて少なくとも１つの制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルを計算することと、を実行させるよう構成され若しくは指示された指令を含む。
いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは更に、コンピュータプロセッサに、試験されたＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイルを１つ以上の参照遺伝的及び後成的プロファイルと比較し、比較に基づいて、ＤＮＡ試料が正常ＤＮＡ試料であるか疾患ＤＮＡ試料であるかを出力するように指示する。
いくつかの態様では、コンピュータソフトウェアは更に、コンピュータプロセッサに、試験されたＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを１つ以上の参照メチル化プロファイルと比較し、比較に基づいて、ＤＮＡ試料が正常ＤＮＡ試料であるか疾患ＤＮＡ試料であるかを出力するように指示する。
いくつかの実施形態では、本発明によるコンピュータソフトウェアは、ハイスループット配列決定の実行の入力生データを受け取る。いくつかの態様では、コンピュータソフトウェアは、本明細書に開示されるような遺伝的及び後成的プロファイルを決定するために配列決定データを分析するようにコンピュータプロセッサに指示する。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、本明細書に開示されるように、配列決定データを分析してＤＮＡメチル化値及び／又はＤＮＡ非メチル化値を決定するようにコンピュータプロセッサに指示する。
コンピュータソフトウェアは、非一時的なコンピュータ可読媒体に格納されるプロセッサ実行可能命令を含む。コンピュータソフトウェアはまた、格納データを含み得る。コンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（compact disc、ＣＤ）、磁気記憶装置、光学記憶装置、ランダムアクセスメモリ（random access memory、ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（read only memory、ＲＯＭ）、又は任意の他の有形的表現媒体などの有形的コンピュータ可読媒体である。
本明細書に記載のコンピュータ関連の方法、ステップ、プロセスは、実行されたときに、指示を実行するように構成されているか、又はそれをコンピュータプロセッサ若しくはコンピュータに指示する不揮発性又は非一時的コンピュータ可読命令に格納されたソフトウェアを使用して実施されることが理解される。
本明細書に記載のシステム、サーバー、コンピュータデバイス、及びコンピュータのそれぞれは、１つ以上のコンピュータシステムに実装でき、ネットワークを介して通信するように構成できる。それらは全て、単一のコンピュータシステムに実装することもできる。一実施形態では、コンピュータシステムは、情報を通信するためのバス又は他の通信メカニズム、及び情報を処理するためのバスと結合されたハードウェアプロセッサを含む。
コンピュータシステムはまた、プロセッサによって実行される情報及び命令を記憶するためにバスに結合された、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的記憶装置などのメインメモリを含む。メインメモリは、プロセッサによって実行される命令の実行中に一時変数又は他の中間情報を格納するために使用することもできる。このような命令は、プロセッサがアクセスできる非一時的な記憶媒体に格納されると、コンピュータシステムを、命令で指定された操作を実行するようにカスタマイズされた専用の機器にレンダリングする。
コンピュータシステムは更に、静的情報及びプロセッサへの命令を格納するためにバスに結合された読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）又は他の静的記憶装置を含む。磁気ディスク又は光ディスクなどの記憶装置が提供され、情報及び命令を記憶するためにバスに結合される。
コンピュータシステムは、コンピュータユーザーに情報を表示するために、バスを介してディスプレイに結合することができる。
英数字及びその他のキーを含む入力デバイスは、情報及びコマンド選択をプロセッサに通信するためにバスに結合される。別のタイプのユーザー入力デバイスは、方向情報及びコマンド選択をプロセッサに伝達し、ディスプレイ上のカーソルの動きを制御するための、マウス、トラックボール、又はカーソル方向キーなどのカーソル制御である。
一実施形態によれば、本明細書の技術は、メインメモリに含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するプロセッサに応答して、コンピュータシステムによって実行される。そのような命令は、記憶装置などの別の記憶媒体からメインメモリに読み込むことができる。メインメモリに含まれる一連の命令を実行すると、プロセッサは、本明細書に記載のプロセスステップを実行する。代替の実施形態では、ハードワイヤー回路を、ソフトウェア命令の代わりに、又はソフトウェア命令と組み合わせて使用することができる。
本明細書で使用される記憶媒体という用語は、機械を特定の方法で動作させるデータ及び／又は命令を記憶する任意の非一時的な媒体を指す。記憶媒体の一般的な形式には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、ソリッドステートドライブ、磁気テープ、又は任意の他の磁気データ記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、任意の他の光データ記憶媒体、穴パターンを伴う任意の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、ＮＶＲＡＭ、任意の他のメモリチップ、又はカートリッジが含まれる。
記憶媒体は、伝送媒体とは異なるが、伝送媒体と組み合わせて使用できる。伝送媒体は、記憶媒体との間の情報転送に関与する。例えば、伝送媒体には、バスを構成する線を含む、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバーが含まれる。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形及び改変を容易に考案することができる。
実施例１－メチル化感受性ＤＮＡ消化とそれに続く次世代配列決定（ＮＧＳ）対 バイサルファイト処理＋ＮＧＳ
以下の実施例では、メチル化感受性酵素消化、続いてＮＧＳに供された無細胞ＤＮＡ試料について得られた配列決定データを、バイサルファイト変換及びＮＧＳ後に得られた配列決定データと比較した。まず、プールされた血漿ＤＮＡ試料の配列決定データを試験した。次に、それぞれが約１０～２００ｎｇのＤＮＡ（ＤＮＡの約３，０００～６０，０００一倍体当量に対応する）を含有する個々の血漿ＤＮＡ試料の配列決定データを試験した。
Ａ．健康な個体のプールされた血漿試料
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５６～６０人の健常対照対象の血漿試料からＤＮＡを抽出し、プールした。５００ｎｇのアリコートを未処理対照ＤＮＡとして保持し、１７００ｎｇのアリコートをＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してバイサルファイト変換に供し、残りのＤＮＡ（７７０ｎｇ）をメチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供した。メチル化感受性消化は、試料を１０単位のＨｉｎＰ１Ｉ及び５単位のＡｃｉＩとともに３７℃で２時間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間不活性化することによって行った。
次に、各試料（酵素処理、バイサルファイト処理及び未処理対照試料）から、酵素処理及び未処理対照試料については、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを、バイサルファイト処理試料については、ＡＣＣＥＬ－ＮＧＳ（登録商標）ＭＥＴＨＹＬ－ＳＥＱ ＤＮＡ ＬＩＢＲＡＲＹ ｋｉｔ（ｓｗｉｆｔ）を、使用することによって、配列決定ライブラリを調製した。配列決定ライブラリは、酵素ライゲーションを使用してＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム配列決定アダプタを付加することによって、ＤＮＡ分子の末端の情報を保存しながら調製した。Ｓ４フローセルを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００配列決定プラットフォームを使用して、ライブラリを全ゲノム次世代配列決定に供した。各試料からの配列読み取りを、完全ヒトゲノム（ｈｇ１８ゲノム構築）に対してマッピングした。
配列決定メトリック
表１及び図１Ａ～図１Ｂ、図２Ａ～図２Ｂは、プールされた血漿ＤＮＡ試料について得られた配列決定測定基準、コピー数完全性データ及びヌクレオソームポジショニング完全性データを要約する。コピー数の完全性の分析のために、メチル化感受性消化アリコート中の制限遺伝子座から＞１００ｂｐに位置する各ゲノム位置でのヒット数を、未処理アリコートから得られた対応するヒット数と比較した。バイサルファイト処理アリコートに対しても同じ分析を行った（未処理アリコートと比較して）。ピアソン相関を、各実験設定（メチル化感受性消化ＤＮＡ及びバイサルファイト処理）における全てのデータ点について計算した。ピアソン相関は、－１から１の間の数をもたらし、１に近い数は、より良好な相関を表す。
ヌクレオソームポジショニング完全性分析のために、「ヒットスパン１００」（＝分析されたゲノム位置の＞５０ｂｐ上流で開始し、＞５０ｂｐ下流で終了する読み取りの数）をヒットの代わりに使用したことを除いて、コピー数分析と同じタイプの手順に従った。
データから分かるように、メチル化感受性消化は、未処理対照試料について得られたものと実質的に同じマッピング率及びユニークマッピング率をもたらし、９２％を超えるユニークマッピング率に達した。対照的に、バイサルファイト処理した試料は、わずか約８０％の固有のマッピング率で、情報の有意な損失を示した。
バイサルファイト処理試料における情報の喪失は、コピー数及びヌクレオソームポジショニング完全性データによって更に実証された：すなわち、図１Ａ及び図２Ａに見られるように、コピー数及びヌクレオソームポジショニングの同様のパターンが、メチル化感受性消化試料及び未処理試料について観察された。パターンはバイサルファイト処理試料では維持されなかった。ピアソン相関分析は、メチル化感受性消化試料と未処理対照試料との間で、コピー数において０．９、ヌクレオソームポジショニングにおいて０．８８の相関を示した。対照的に、バイサルファイト処理試料と未処理対照試料との間で、０．６７（コピー数）及び０．５８（ヌクレオソームポジショニング）の相関が得られた（図１Ｂ、図２Ｂ）。
Ｂ．肺がん患者の血漿試料
上記セクションＡは、比較的多量のＤＮＡを含有するプールされた血漿試料を使用した結果を提供する。分析のために、はるかに少ない量のＤＮＡを含有する個々の血漿試料を使用して、メチル化感受性消化とバイサルファイト変換との間の差異をチェックすることは興味深い。
この目的のために、治療未経験の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者の血漿試料からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを上記セクションＡに記載したように抽出し、バイサルファイト変換又はメチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供した。血漿試料から抽出されたＤＮＡの量は、試料当たり約１０～２００ｎｇのＤＮＡの範囲であった（ＤＮＡの約３，０００～６０，０００一倍体当量に対応する）。酵素消化又はバイサルファイト変換に続いて、試料を上記のようにライブラリ調製及び配列決定に供した。
ＢＭＤ ＬＮＧ１６５（２６ｎｇの無細胞ＤＮＡ）及びＢＭＤ ＬＮＧ１６６（９４ｎｇの無細胞ＤＮＡ）として同定された２人の患者の例示的な結果を以下に提供する。
配列決定メトリック
表２～３及び図３Ａ～図３Ｂ、図４Ａ～図４Ｂは、各血漿ＤＮＡ試料について得られた配列決定測定基準、コピー数完全性データ及びヌクレオソームポジショニング完全性データを要約する。
結果は、少量のＤＮＡについて、得られる読み取りの数は、バイサルファイト処理対メチル化感受性消化を使用した場合に有意に減少することを示す：すなわち、バイサルファイト処理ＤＮＡについて得られた読み取りの数、及び重要なことに、ユニークにマッピングされた読み取りの数は、メチル化感受性消化ＤＮＡについて得られた量の半分未満であった。更に、メチル化感受性消化ＤＮＡは約９０％のユニークマッピング率を示したが、バイサルファイト処理ＤＮＡのユニークマッピング率はわずか７７～７８％であった。
バイサルファイト処理試料における情報の有意な喪失は、コピー数及びヌクレオソームポジショニング完全性データによって更に実証された：すなわち、ピアソン相関分析は、メチル化感受性消化ＤＮＡと未処理対照試料との間で、コピー数において０．７３５及び０．６９３、並びにヌクレオソームポジショニングにおいて０．６４７及び０．５９５の相関を示した。対照的に、バイサルファイト処理したＤＮＡと未処理の対照試料との間で、０．１９６及び０．１６１の相関（コピー数）、並びに０．１９及び０．１７６の相関（ヌクレオソームポジショニング）が得られた（図３Ａ～図３Ｂ、図４Ａ～図４Ｂ）。バイサルファイト配列決定は、少量のＤＮＡがアッセイに使用された場合、事実上全てのコピー数及びヌクレオソームポジショニング情報を損失した。
ＣＧカバレッジ
図５Ａ～図５Ｂは、バイサルファイト処理ＤＮＡ及びメチル化感受性消化ＤＮＡにおけるＣＧ深さの分布を示す。より詳細には、グラフは、各方法によって各深さでカバーされたゲノム中のＣＧ部位の数を示す。図５Ａは、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５からの試料について得られたデータを示す。図５Ｂは、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６からの試料について得られたデータを示す。
メチル化感受性酵素消化を使用するゲノムワイドメチル化分析は、アッセイにおいて使用される酵素の認識部位内に位置するＣＧに限定されるが、バイサルファイト配列決定は、原則として、ゲノム中の全てのＣＧ部位を網羅する。ゲノム中のＣＧ部位の画分のみを調査する能力は、制限酵素に基づくメチル化分析の主な制限の１つと考えられてきた。しかしながら、本明細書に提示されるデータは、バイサルファイトが、メチル化感受性消化と比較して深さの下端でより広いＣＧ範囲を提供する一方で、深さが増加するにつれて、バイサルファイト処理されたＤＮＡにおいてカバーされるＣＧの数において、連続的かつ鋭い減少が見られることを示す。対照的に、メチル化感受性消化は、２５０～３００を超える深さでさえ実質的に一定のカバレッジを示す。高深度では、メチル化感受性消化は、バイサルファイトと比較して有意に良好なＣＧ適用範囲を提供する。
例えば、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５由来のＤＮＡ試料において（図５Ａ）、メチル化感受性消化は、１６５を超える深さでバイサルファイトよりも多くのゲノムＣＧをカバーした。３００の深さで、メチル化感受性消化試料は４．１６ＭのＣＧをカバーしたのに対して、バイサルファイト処理試料では４４ＫのＣＧ部位しかカバーされなかった。患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６由来のＤＮＡ試料において（図５Ｂ）、メチル化感受性消化は、２５５を超える深さでバイサルファイトよりも多くのゲノムＣＧをカバーした。４００の深さで、メチル化感受性消化試料は４．２４ＭのＣＧをカバーしたのに対して、バイサルファイト処理試料では６５ＫのＣＧ部位しかカバーされなかった。
したがって、メチル化感受性消化は、非常に高い深さで数百万のＣＧのカバレッジを提供し、稀なメチル化シグナル、例えば、血漿中に非常に低い量－１％以下で存在し得る腫瘍の初期段階での血漿中の腫瘍由来のメチル化ＤＮＡ分子の検出を可能にする。データは、稀なシグナルの同定に必要とされる深さにおいて、バイサルファイトは十分なカバレッジを提供せず、かかる稀なシグナルは、少量のＤＮＡに対してバイサルファイト配列決定を使用する場合に見逃される可能性が高いことを示した。
メチル化変化の検出
腫瘍対正常組織における高メチル化を示し、健康な個体の血漿中の低バックグラウンドメチル化によって特徴付けられる、低バックグラウンド高メチル化マーカー遺伝子座のセットを編集した。メチル化レベルを、以下の実施例２に記載されるように決定した。マーカー遺伝子座のこのセットは、２人の肺がん患者（ＢＭＤ ＬＮＧ１６５及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６）からの試料及び健康な個体のプールされた血漿試料に基づいて編集し、両方の検出方法、すなわち、メチル化感受性消化＋ＮＧＳ及びバイサルファイト変換＋ＮＧＳを使用して観察された低バックグラウンド高メチル化遺伝子座を含んだ。加えて、イソメチル化マーカー遺伝子座、すなわち、腫瘍組織と正常組織との間で異なるメチル化レベルを示さない遺伝子座のセットを編集した。
次に、患者の血漿中の低バックグラウンド高メチル化マーカー遺伝子座のメチル化レベルを決定するために、メチル化感受性消化＋ＮＧＳ又はバイサルファイト変換＋ＮＧＳを使用して、各患者からの血漿ＤＮＡを分析した。閾値メチル化レベルを設定し、それを超えるとマーカー遺伝子座が「検出された」とみなした。９５％の検出特異性を得るために、イソメチル化マーカー遺伝子座のセットに基づいて閾値を決定した。各患者由来のメチル化感受性消化ＤＮＡ及びバイサルファイト変換ＤＮＡにおいて閾値を超えた（すなわち、検出された）マーカー遺伝子座の数を比較した。結果を図６に要約する。メチル化感受性消化＋ＮＧＳを使用するメチル化分析は、両方の試料において、バイサルファイト＋ＮＧＳと比較して、血漿中で有意により多くのメチル化変化を検出した。
変異検出
腫瘍変異は、同じ患者からの対応する正常組織において最も優勢な遺伝子型とは異なる、腫瘍ＤＮＡにおいて見出される遺伝子型として定義した。腫瘍ＤＮＡ中の変異遺伝子型を有する読み取りの割合は、腫瘍変異レベルを表し、患者の血漿中の同じ変異遺伝子型を有する読み取りの割合は、血漿変異レベルを表した。各試料について、平均腫瘍及び血漿変異レベルを全ての変異にわたって計算し、腫瘍変異負荷を計算した（すなわち、平均血漿変異レベル／平均腫瘍変異レベル）。腫瘍変異負荷は、患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡの割合を表す。配列決定ノイズを制御するために、患者Ａの腫瘍変異負荷を、患者Ｂの腫瘍変異から計算された対照腫瘍変異負荷（すなわち、患者Ａの血漿中の患者Ｂの腫瘍変異の平均変異レベル／患者Ａの腫瘍変異レベル）と比較した。
結果を、図７Ａ～図７Ｂに要約する。腫瘍変異は、メチル化感受性消化＋ＮＧＳによって、配列決定ノイズを明らかに上回るレベルで血漿中に検出されたが、バイサルファイト＋ＮＧＳ変異では、高い配列決定ノイズと区別できなかった。
実施例２－肺がん患者の腫瘍及び血漿ＤＮＡの遺伝的及び後成的プロファイリング
メチル化及び変異分析を、ＢＭＤ ＬＮＧ１６５及びＢＭＤ ＬＮＧ１６６として同定された２人の肺がん患者からの試料に対して行った。各患者の臨床データを図９Ａ～図９Ｂに詳述する。
分析のための試料調製を図８Ａに示す。正常肺組織試料、腫瘍肺組織試料及び血液試料を各患者に提供した。血液試料をバフィーコート及び血漿試料に分離した。図に示すように、各試料からＤＮＡを抽出した。正常組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＤＮＡ及びバフィーコートＤＮＡを超音波処理によって断片化した。次に、実施例１と同様にメチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩでＤＮＡを消化し、精製した。各患者からの正常組織ＤＮＡのアリコートを未消化のままにし、対照として保存した。精製したＤＮＡ試料を、上記のようにライブラリ調製及び配列決定に供した。
図８Ｂは、１００人の健常対照対象から採取された対照試料の試料調製を示す。対照試料は、各対照対象からのバフィーコート試料及び血漿試料を含んでいた。図に示すように、各試料からＤＮＡを抽出した。バフィーコートＤＮＡを超音波処理により断片化し、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供し、続いて精製した。各対照被験者からのバフィーコートＤＮＡのアリコートを未消化のままにし、対照として保存した。血漿ＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩによる消化に供し、精製した。血漿ＤＮＡのアリコートを、品質管理（例えば、血漿分離の品質の評価）のために、及び血漿ＤＮＡの未消化対照プールを作製するために採取した。精製したＤＮＡ試料を、上記のようにライブラリ調製及び配列決定に供した。
各試料からの配列読み取りを、完全ヒトゲノム（ｈｇ１８ゲノム構築）に対してマッピングした。ＣＩＧＡＲ＆ＭＡＰＱ＞０＆ａｂｓ（ＴＬＥＮ）≦５００ｂｐを有するアラインメントを、腫瘍におけるメチル化変化及び変異並びに血漿におけるそれらの提示を同定するために、メチル化及び変異の追加の分析のために選択した。
各ゲノム位置について、「ヒットスパン１００」、すなわち、ゲノム位置の＞５０ｂｐ上流で開始し、＞５０ｂｐ下流で終了する読み取りの数を決定した。
「ヒットスパン１００」は、少なくとも１００ｂｐのアラインメントであり、メチル化感受性消化及びライブラリ調製後に残ったＤＮＡ試料中の少なくとも１００ｂｐの長さのＤＮＡ分子を表す。加えて、かかるアラインメントのコピー数はヌクレオソーム境界を反映するため、かかるアラインメントの分析は、メチル化に加えて無細胞ＤＮＡにおけるヌクレオソーム配置を評価するのに有利であり、ここで、高いコピー数はヌクレオソームの中央に典型的であり、低いコピー数はヌクレオソーム間の境界に典型的である。
また、多くのがん関連メチル化変化は、ＣＧアイランド内、すなわち、メチル化を受けるＣＧ部位に到達するゲノムの領域内で起こる。アッセイにおいて使用される酵素の制限遺伝子座内に位置する分析されたＣＧ部位の周囲の「ヒットスパン１００」領域は、典型的には、追加のＣＧ部位を含有する、酵素の追加の制限遺伝子座を含む。したがって、「ヒットスパン１００」アラインメントは、少なくとも１００ｂｐの長さのＤＮＡ分子を表し、ここで、分析された制限遺伝子座、並びにＤＮＡ分子内の任意の追加の制限遺伝子座は、ＤＮＡ試料において全てメチル化され、そしてアッセイにおいて使用される酵素での消化後に無傷なままであった。長さが少なくとも１００ｂｐであり、ＤＮＡ試料中で全てメチル化された複数の制限遺伝子座を含むアラインメントを分析することは、がん関連過剰メチル化シグナルの特異性を増加させ、正常試料とがん性試料との間の差異の改善された、より正確な検出を可能にする。かかるメチル化分析は、ＣＧアイランド内に位置するＣＧ部位について特に有利である。
「ヒットスパン１００」値を、同じ試料における中央値「ヒットスパン１００」値に対して正規化した。例えば：特定の遺伝子座における正規化された「範囲１００のヒット」＝その遺伝子座における「範囲１００のヒット」の数／試料中の「範囲１００のヒット」の中央値数、である。正規化は、染色体１～２２にわたる中央値に対するものとした。
全ゲノムメチル化解析
メチル化遺伝子座は、未消化正常組織プールにおける所定の閾値を超える正規化された「ヒットスパン１００」の数を有する制限遺伝子座として定義した。
メチル化遺伝子座のバックグラウンドメチル化レベルは、以下のように決定した：
消化された正常血漿プールにおける正規化「ヒットスパン１００」／未消化の正常血漿プールにおける正規化「ヒットスパン１００」。
未消化正常血漿プールにおける正規化された「ヒットスパン１００」＝０の場合、値１／中央値「ヒットスパン１００」を代わりに使用した。
メチル化遺伝子座の腫瘍メチル化レベルは、以下のように決定した：
腫瘍における正規化された「ヒットスパン１００」／未消化正常組織プールにおける正規化された「ヒットスパン１００」。
メチル化遺伝子座の正常メチル化レベルは、以下のように決定した：
正常組織における正規化「ヒットスパン１００」／未消化正常組織プールにおける正規化「ヒットスパン１００」。
メチル化遺伝子座の血漿メチル化レベルを以下のように決定した：
血漿における正規化された「ヒットスパン１００」／未消化正常血漿プールにおける正規化された「ヒットスパン１００」。
各患者について、バックグラウンドメチル化レベルが所定の閾値未満であるメチル化遺伝子座を選択することによって、低バックグラウンドメチル化遺伝子座のセットを編集した。
加えて、腫瘍対正常組織における高メチル化を示す高メチル化遺伝子座のセットを編集した。高メチル化遺伝子座の腫瘍－正常差次的メチル化レベル（＝腫瘍メチル化レベル－正常メチル化レベル）を決定し、所定の閾値を超える腫瘍－正常差次的メチル化レベルを有するメチル化遺伝子座を選択することによって、高メチル化遺伝子座のセットを編集した。
腫瘍対正常組織において低メチル化を示す低メチル化遺伝子座のセットを編集した。低メチル化遺伝子座の腫瘍－正常差次的メチル化レベル（＝腫瘍メチル化レベル－正常メチル化レベル）を決定し、所定の閾値を下回る腫瘍－正常差次的メチル化レベルを有するメチル化遺伝子座を選択することによって、高メチル化遺伝子座のセットを編集した。
腫瘍と正常組織との間で異なるメチル化レベルを示さないイソメチル化遺伝子座のセットを編集した。イソメチル化遺伝子座のセットは、メチル化遺伝子座の腫瘍正常差次的メチル化レベル（＝腫瘍メチル化レベル－正常メチル化レベル）を決定し、腫瘍正常高メチル化でも腫瘍正常低メチル化でもないメチル化遺伝子座を選択することによって編集した。
各患者についての分析結果を図９Ａ～図９Ｂに示す。何百万もの高メチル化及び低メチル化事象が、各患者の腫瘍において検出された。更に、各患者の血漿において、何千もの低バックグラウンド高メチル化事象が検出された。検出された事象は、推定メチル化マーカーを表す。
図１０Ａ～図１０Ｂは、血漿において特に強い過剰メチル化シグナルを有する何千ものメチル化遺伝子座を同定することができたことを示す。
全ゲノム変異分析
腫瘍変異は、同じ患者からの対応する正常組織において最も優勢な遺伝子型とは異なる、腫瘍ＤＮＡにおいて見出される遺伝子型として定義した。
腫瘍ＤＮＡ中の変異遺伝子型を有する読み取りの割合は、腫瘍変異レベルを表し、患者の血漿中の同じ変異遺伝子型を有する読み取りの割合は、血漿変異レベルを表した。各試料について、平均腫瘍及び血漿変異レベルを全ての変異にわたって計算し、腫瘍変異負荷を計算した（すなわち、平均血漿変異レベル／平均腫瘍変異レベル）。腫瘍変異負荷は、患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡの割合を表す。
各患者について、所定の閾値未満の血漿変異バックグラウンド（＝正常血漿プールにおける変異の割合）を有する変異を選択することによって、低バックグラウンド変異のセットを編集した。更に、血漿中の平均変異率を各患者について決定した。各患者についての分析結果を図１１Ａ～図１１Ｂに示す。
マルチオミクス領域
マルチオミクス領域は、本明細書において、腫瘍高メチル化部位（正常組織と比較して腫瘍において高メチル化されている）及び所定の距離内の腫瘍変異部位を有するゲノム領域として定義する。本発明の方法は、無細胞ＤＮＡ試料中のがん関連の遺伝的及び後成的変化を検出することを目的とする。したがって、同じ配列読み取り上の腫瘍高メチル化部位及び腫瘍変異部位の両方を含むＤＮＡを同定するためには、１５０ｂｐまでのマルチオミクス領域が好ましい。本実施例では、腫瘍過剰メチル化遺伝子座及び腫瘍変異が互いに１００ｂｐ以内にあるマルチオミクス領域を、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５及び患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６の腫瘍試料において検索した。
分析により、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６５において６，０６０個のマルチオミクス領域が同定され、患者ＢＭＤ ＬＮＧ１６６において９，４７１個のマルチオミクス領域が同定された。ＢＭＤ ＬＮＧ１６５におけるマルチオミクス領域の例を、図１２に記載する（ｃｈｒ．７ ｐｏｓ．１５０２２０８５６－１５０２２０９２１）。
マルチオミクスアラインメントは、マルチオミクス領域にわたるＣＩＧＡＲ＆ＭＡＰＱ＞０＆ＴＬＥＮ＞０＆ＴＬＥＮ≦５００ｂｐのアラインメントとして定義した。マルチオミクスアラインメントタイプの例は、図１３に記載するとおりであり、以下を含む：
がん表現型がメチル化位置（位置がメチル化されている）及び変異位置（変異体が存在する）の両方で見られる一致したメチル化アラインメント：アラインメントは、高メチル化制限部位の全てにわたり（アッセイで使用される制限酵素の認識配列の全ての文字がアラインメント中に存在し、例えば、ＨｉｎＰ１ＩについてはＧＣＧＣ）、読み取り中に変異遺伝子型を含有する。
がん表現型がメチル化位置で見られ（位置がメチル化されている）、正常表現型が変異位置で見られる（ＷＴバリアントが存在する）不一致メチル化アラインメント：アラインメントは、高メチル化制限部位の全てにわたり（例えば、ＧＣＧＣの全ての文字がアラインメント中に存在する）、読み取り中にＷＴ（参照）遺伝子型を含有する。
正常な表現型がメチル化位置（この位置はメチル化されていない）及び変異位置（ＷＴ変異体が存在する）の両方で見られる一致した非メチル化アラインメント：アラインメントは、正確な切断部位で開始又は終了し（制限部位のｎ位で開始するか、又はｎ＋１位で終了する）、読み取り中にＷＴ（参照）遺伝子型を含む。
正常表現型がメチル化位置で見られ（その位置は非メチル化である）、がん表現型が変異位置で見られる（変異バリアントが存在する）不一致非メチル化アラインメント：アラインメントは、正確な切断部位で開始又は終了し（制限部位のｎ位で開始するか、又はｎ＋１位で終了する）、読み取り中に変異遺伝子型を含有する。
上記は、メチル化感受性消化とそれに続く次世代配列決定を採用する本明細書に開示される方法が、少量のＤＮＡで機能し、メチル化データ、変異データなどを含む膨大な量の情報を受け取るのに十分に高感度であるが正確であることを示す。この方法は、例えば新たなメチル化マーカーの発見、及び診療所での診断用途、の両方に有利である。この方法は、バイサルファイトでは検出できないシグナルの検出を可能にする。
実施例３－メチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルの直接計算
以下の実施例において、メチル化／非メチル化の計算は、血漿試料由来の無細胞ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩで消化し、続いてライブラリ調製、次世代配列決定及び配列読み取りの分析を行うことによって行った。
図１４は、消化及び末端修復の前後のメチル化感受性ＨｉｎＰ１Ｉ部位を示す。ＨｉｎＰ１Ｉ部位でメチル化されていない無細胞ＤＮＡ分子は消化を受け、ＨｉｎＰ１Ｉ切断部位に対応する非平滑（粘着性）末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を生じる。具体的には、ＨｉｎＰ１Ｉは４塩基の切断部位を有するため、消化は、一方のＤＮＡ分子に２塩基の５’オーバーハングを有し、他方に相補的な５’オーバーハングを有する一対の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。非平滑末端を末端修復に供して（例えば、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して）、平滑末端ＤＮＡ分子を生成する。末端修復後、２種類のＤＮＡ断片が得られる：ＨｉｎＰ１Ｉ認識配列の３番目のヌクレオチド（Ｇヌクレオチド）で終了する断片（３’末端）、及びＨｉｎＰ１Ｉ認識配列の２番目のヌクレオチド（Ｃヌクレオチド）で始まる断片（５’末端）。
図１５は、切断部位でメチル化又は非メチル化されているＨｉｎＰ１Ｉ制限部位にわたる無細胞ＤＮＡ分子の消化及び末端修復後に得られたＤＮＡ断片の差異を示す。黒丸はメチル化を表す。切断部位でメチル化されたＤＮＡ分子は、消化後も無傷のままであり、切断部位にまたがるＤＮＡ断片が得られる。切断部位でメチル化されていないＤＮＡ分子は、酵素によって消化される。末端修復後、結果は、認識配列で開始又は終了するＤＮＡ断片（具体的には、認識配列の第３のヌクレオチドＧで終了する断片及び第２のヌクレオチドＣで開始する断片）である。
実験手順
血漿試料を５６人の健康な対照対象から収集した。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血漿試料からＤＮＡを抽出し、プールした。４５０ｎｇのアリコートを未消化対照ＤＮＡとして保持し、残りのＤＮＡ（８００ｎｇ）を消化に供した：試料を１０単位のＨｉｎＰ１Ｉ及び５単位のＡｃｉＩとともに３７℃で２時間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間不活化した。消化後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用することによって配列決定ライブラリを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００配列決定プラットフォームをＳ４フローセルとともに使用して、ライブラリを次世代配列決定に供した。消化及び未消化ＤＮＡ試料からの配列読み取りを、完全ヒトゲノム（ｈｇ１８ゲノム構築）に対してマッピングした。
メチル化ＤＮＡのレベルの計算
メチル化ＤＮＡのレベルを計算するために、配列読み取りを４ｂｐ遺伝子座当たりの読み取りカウントとしてプロットした。制限酵素（ＨｉｎＰ１Ｉ）の切断部位に対応する遺伝子座を分析し、完全無傷部位に及ぶ読み取りの数を記録した。図１６Ａは、消化されたＤＮＡ試料中のＨｉｎＰ１Ｉ部位に対応する４ｂｐ遺伝子座の例示的な分析を示す（長方形でマーク）。図から分かるように、読み取りカウントの減少がこのＨｉｎＰ１Ｉ部位で観察される。減少は、酵素による消化を示し、この位置での読み取りカウントは、遺伝子座が無傷のままであるＤＮＡ断片の数に対応する。上記のように、ＨｉｎＰ１Ｉはメチル化感受性であり、したがってメチル化ＤＮＡを切断しない。したがって、この制限遺伝子座の読み取りカウントは、制限遺伝子座がメチル化されたＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数に対応する。
制限遺伝子座でメチル化されたＤＮＡのレベルは、以下のように計算される。
（数１）
メチル化ＤＮＡのレベル＝制限遺伝子座の実際の読み取りカウント
制限遺伝子座の予測読み取りカウント
ここで、制限遺伝子座の予想読み取りカウントは、以下から計算され得る：
（ｉ）酵素によって切断されない４ｂｐ参照遺伝子座の読み取りカウント、
（ｉｉ）酵素によって切断されない複数の４ｂｐ参照遺伝子座（最適には、未消化試料中の制限遺伝子座と同じコピー数を有する遺伝子座からなる）の平均読み取りカウント、又は
（ｉｉｉ）未消化対照試料中の制限遺伝子座の読み取りカウント（深度差について補正可能）。
参照遺伝子座は、制限遺伝子座のすぐ上流若しくは下流に位置する４ｂｐストレッチ、又はゲノム中のより離れた位置に位置する４ｂｐ遺伝子座であり得る。
深度差の補正は、以下のように実施され得る：
制限遺伝子座の予測読み取りカウント＝
未消化試料中の制限遺伝子座の読み取りカウント／（未消化試料中の平均配列決定深度／消化試料中の平均配列決定深度）
平均配列決定深度＝
読み取り総数＊平均読み取り長／ゲノムサイズ
得られたメチル化ＤＮＡのレベルに１００を掛けて、元のＤＮＡ試料中の試験したＨｉｎＰ１Ｉ遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのパーセンテージ（％）を得ることができる。
非メチル化ＤＮＡのレベルの計算
非メチル化ＤＮＡのレベルを計算するために、配列読み取りを、ゲノム全体の各塩基で終了する読み取りカウントとしてプロットした。代替的又は追加的に、配列読み取りは、ゲノムにわたって各塩基で開始する読み取りカウントとしてプロットされ得る。制限酵素（ＨｉｎＰ１Ｉ）の切断部位に対応するゲノム遺伝子座を分析した。
図１６Ｂは、上記で分析したＨｉｎＰ１Ｉ部位及び隣接領域についての「開始」分析を示す。図から分かるように、切断部位の２番目のヌクレオチド（Ｃヌクレオチド）にピークが観察される。ピーク高さ、すなわち、切断部位の２番目のヌクレオチドで始まる配列読み取りの数は、酵素によって切断されたＤＮＡ断片の数に対応する。上記のように、ＨｉｎＰ１Ｉはメチル化感受性であり、したがって非メチル化ＤＮＡを切断する。したがって、ピーク高さは、制限遺伝子座がメチル化されていないＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数に対応する。
図１６Ｃは、上記及び隣接領域で分析されたＨｉｎＰ１Ｉ部位の「終了」分析を示す。図から分かるように、切断部位の３番目のヌクレオチド（Ｇヌクレオチド）にピークが観察される。ピーク高さ、すなわち、切断部位の３番目のヌクレオチドで終了する配列読み取りの数は、この切断部位で酵素によって切断されたＤＮＡ断片の数に対応する。上記のように、ＨｉｎＰ１Ｉはメチル化感受性であり、したがって非メチル化ＤＮＡを切断する。したがって、ピーク高さは、制限遺伝子座がメチル化されていないＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子の数に対応する。
制限遺伝子座でメチル化されたＤＮＡのレベルは、以下のように計算される：
非メチル化ＤＮＡのレベル＝
（制限遺伝子座で開始又は終了する実際の読み取り数－制限遺伝子座で開始又は終了する予想読み取り数）／制限遺伝子座の予想読み取り数
制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの予想数は、以下から計算することができる：
（ｉ）酵素によって切断されない４ｂｐの参照遺伝子座で開始又は終了する読み取りの数、
（ｉｉ）酵素によって切断されない４ｂｐ参照遺伝子座のファミリーで開始又は終了する読み取りの平均数、又は
（ｉｉｉ）未消化対照試料中の制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの数（深度差について補正可能）。
制限遺伝子座の予想読み取りカウントは、以下から計算することができる：
（ｉ）酵素によって切断されない４ｂｐ参照遺伝子座の読み取りカウント、
（ｉｉ）酵素によって切断されない複数の４ｂｐ参照遺伝子座（最適には、未消化試料中の制限遺伝子座と同じコピー数を有する遺伝子座からなる）の平均読み取りカウント、又は
（ｉｉｉ）未消化対照試料中の制限遺伝子座の読み取りカウント（深度差について補正可能）。
参照遺伝子座は、制限遺伝子座のすぐ上流若しくは下流に位置する４ｂｐストレッチ、又はゲノム中のより離れた位置に位置する４ｂｐ遺伝子座であり得る。
本明細書中に開示されるような制限エンドヌクレアーゼによって切断される各ＤＮＡ分子は、２つの断片を生じさせ、一方は、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始し、他方は、制限遺伝子座内のヌクレオチドで終結する。したがって、所与のＤＮＡ分子について、２つの異なる配列読み取りを得ることが可能であり得る。試料中に存在した非メチル化ＤＮＡ分子の数の正確な分析のために、非メチル化ＤＮＡレベルの計算は、制限遺伝子座で開始する配列読み取りの数、制限遺伝子座で終了する配列読み取りの数に基づいて、又は２つの値の間の平均によって行われてもよいが、値の合計に基づいて行われなくてもよい。小断片を枯渇させるライブラリ調製方法を使用する場合、小断片の枯渇による偏りを回避するために、より多数の配列読み取りを有する配向を使用して非メチル化ＤＮＡレベルを計算することが好ましい。
得られた非メチル化ＤＮＡのレベルに１００を掛けて、元のＤＮＡ試料中の試験したＨｉｎＰ１Ｉ遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのパーセンテージ（％）を得ることができる。
かかるメチル化／非メチル化分析は、低いＣＧ含量を有するゲノム領域に位置するＣＧ部位について特に有利である。
メチル化＋非メチル化ＤＮＡレベルの同時計算
メチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルを同時に計算するために、「総断片数」を最初に以下のように計算する：
総断片数＝
制限遺伝子座の読み取りカウント＋制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの数－制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの予想数
制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの予想数は、上記のように計算する。
メチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルは、以下のように総断片数を用いて計算される：
（数２）
メチル化ＤＮＡのレベル＝制限遺伝子座の読み取りカウント
総断片数
非メチル化ＤＮＡのレベル＝
（制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの数－制限遺伝子座で開始又は終了する読み取りの予想数）／総断片数
得られたメチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルに１００を掛けて、元のＤＮＡ試料中の試験したＨｉｎＰ１Ｉ遺伝子座におけるメチル化及び非メチル化ＤＮＡのパーセンテージ（％）を得ることができる。
実施例４－メチル化及び非メチル化ＤＮＡレベルを用いた制限遺伝子座の分析
メチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルを、実施例３に記載されるプールされた血漿ＤＮＡ試料において、ＣＧ＃１～８として同定されるＨｉｎＰ１Ｉの制限遺伝子座内に位置する８つのＣＧジヌクレオチドについて計算した（表４）。実施例３に詳述されるように、プールされたＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩで消化し、続いてライブラリ調製、次世代配列決定、及び完全ヒトゲノムに対する配列読み取りのアラインメントを行った。
ＣＧ＃１（高度にメチル化されている）、ＣＧ＃４（高度にメチル化されていない）及びＣＧ＃５についての例示的な生データを図１７Ａ～図１７Ｃに示す。各図の上パネルは、制限遺伝子座の読み取り数を決定するための、４ｂｐ遺伝子座当たりの読み取り数を示す。制限遺伝子座を長方形で示す。各図の下パネルは、制限遺伝子座で開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定するための、参照ゲノム中の各塩基で開始又は終了する読み取りカウントを示す。「終了」又は「開始」の提示は、より多数の読み取りを提供した方向に従う。
各制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのレベルは、制限遺伝子座の読み取りカウントを予想読み取りカウント（対照遺伝子座の読み取りカウント）で割り、１００を掛けて制限遺伝子座におけるメチル化ＤＮＡのパーセンテージを得ることによって計算した。
各制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのレベルは、制限遺伝子座で開始又は終了する予想読み取り数を減算し、続いて制限遺伝子座の予想読み取り数で除算し、１００を乗算して制限遺伝子座における非メチル化ＤＮＡのパーセンテージを得ることによって計算した。各制限遺伝子座について、制限遺伝子座で開始する読み取りの数及び制限遺伝子座で終了する読み取りの数を決定し、読み取りのより大きい数に基づいて更なる計算を行った。
不一致レベル（％）は、本実施例で計算されたメチル化及び非メチル化パーセンテージの合計と、１００％の予想合計との間の差を決定することによって、各制限遺伝子座について計算した。
不一致％＝（メチル化％＋非メチル化％）－１００
結果を表４にまとめる。制限遺伝子座を不一致のレベルに従って昇順で表４に列挙する。不一致のレベルは、潜在的なＤＮＡメチル化マーカーを評価及び選択する際に使用することができ、不一致のレベルがより低い遺伝子座が好ましい場合がある。不一致のレベルはまた、すでに同定されたＤＮＡメチル化マーカーについての適切な試料処理及び分析の指標として使用され得、ここで、不一致の低いレベルは、適切な試料処理及び分析を示す。
結果は、同じ配列決定データを使用するメチル化に加えて非メチル化の直接決定が、ゲノム領域の相補的なメチル化情報を提供し、改善されたメチル化プロファイリング、潜在的なＤＮＡメチル化マーカーのより正確かつ有効な評価、及びその後の試料間のメチル化差異のより正確な分析を可能にすることを実証する。
実施例５－肺がんＤＮＡメチル化マーカーにおけるメチル化プロファイリング及び肺がんの診断
血漿試料から抽出したＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを、肺がんＤＮＡと正常な非肺がんＤＮＡとの間で差次的にメチル化されたＨｉｎＰ１Ｉの制限遺伝子座を含む６つのゲノム領域で決定する。本発明の出願人に譲渡された国際公開第２０１９／１４２１９３号において以前に開示されたゲノム領域は、配列番号１～６として同定され、それらを表５に詳述する。


＊開始位置。説明はｈｇ１８ゲノムビルド上の位置を指す
図１８は、本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための例示的な方法を説明するフローチャートである。例示的な方法は、以下のステップを含む。
１８０１－メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１ＩでＤＮＡ試料を消化する、
１８０２－複数のＤＮＡ断片にライゲーションされたアダプタを使用して、消化されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製する、
１８０３－配列読み取りを得るための配列決定ライブラリのハイスループット配列決定、
１８０４－完全ヒトゲノムに対するマッピング配列読み取り、
１８０５－肺がんＤＮＡと正常な非肺がんＤＮＡとの間で差次的にメチル化された制限遺伝子座を含むゲノム領域１～６を選択する、
１８０６－ゲノム領域１～６の各制限遺伝子座について、制限遺伝子座の読み取りカウントを決定する、
１８０７－ゲノム領域１～６の各制限遺伝子座について、制限遺伝子座の第２のヌクレオチドで開始する配列読み取りの読み取りカウント及び制限遺伝子座の最後から２番目のヌクレオチドで終了する配列読み取りの読み取りカウントを決定し、より大きい読み取りカウントを有する配向を選択する、
１８０８－ゲノム領域１～６の各制限遺伝子座について、制限遺伝子座の読み取りカウントに基づいてメチル化ＤＮＡのレベルを計算する、
１８０９－ゲノム領域１～６の各制限遺伝子座について、制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了する配列読み取りの読み取りカウントに基づいて、非メチル化ＤＮＡのレベルを計算する、
それにより、ゲノム領域１～６におけるＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを得る（ステップ１９１０）。
図１９は、本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための追加の例示的な方法を説明するフローチャートである。例示的な方法は、以下のステップを含む。
１９０１－メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１ＩでＤＮＡ試料を消化する、
１９０２－複数のＤＮＡ断片にライゲーションされたアダプタを使用して、消化されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製する、
１９０３－肺がんＤＮＡと正常な非肺がんＤＮＡとの間で差次的にメチル化された制限遺伝子座を含むゲノム領域１～６を富化する、
１９０４－配列読み取りを得るための富化された配列決定ライブラリのハイスループット配列決定、
１９０５－配列読み取りをゲノム領域１～６のうちの１つに割り当てる、
上記のステップ１９０６～１９１０に従って操作し、ゲノム領域１～６でのＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを得る。
図２０は、本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料が肺がんに対して陽性であるか陰性であるかを決定するための例示的な方法を説明するフローチャートである。例示的な方法は、以下のステップを含む。
２００１－上記のように、メチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルを組み合わせて、ゲノム領域１～６におけるＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを得る、
２００２－ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを、ゲノム領域１～６における少なくとも１つの参照ＤＮＡメチル化プロファイル（例えば、肺がん参照プロファイル及び／又は健常非肺がんメチル化プロファイル）と比較する、及び
２００３－比較に基づいて、ＤＮＡ試料を肺がんについて陽性又は陰性として同定する。
図２１は、本発明の実施形態による、ＤＮＡ試料が肺がんに対して陽性であるか陰性であるかを決定するための追加の例示的な方法を説明するフローチャートである。例示的な方法は、以下のステップを含む。
２１０１－上記のように、メチル化及び非メチル化ＤＮＡのレベルを組み合わせて、ゲノム領域１～６におけるＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを得る、
２１０２－ゲノム領域１～６におけるメチル化プロファイルに基づいてスコアを計算する、
２１０３－スコアをカットオフ値と比較する、及び
２１０４－比較に基づいて、ＤＮＡ試料を肺がんについて陽性又は陰性として同定する。
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするため、他の者は、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしに、及び一般的な概念から逸脱することなく、かかる特定の実施形態の様々な用途に容易に修正及び／又は適合でき、したがって、かかる適合及び変更は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現又は用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。開示された様々な化学構造及び機能を実施するための手段、材料、及びステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。

Claims (39)

  1. 対象由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングするための方法であって、
    （ａ）前記無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
    （ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、前記配列決定ライブラリを調製することが、前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
    （ｃ）ハイスループット配列決定法によって、前記配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを提供することと、
    （ｄ）前記配列決定データから、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値、並びに任意選択で、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択される前記無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することと、を含み、
    ３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、前記方法に十分であり、前記無細胞ＤＮＡ試料が、ライブラリ調製の前に増幅に供されず、前記メチル化値及び前記無細胞ＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を決定することが、同じ配列決定データに基づいて実施される、方法。
  2. 無細胞ＤＮＡ試料を処理して、遺伝的及び後成的分析のための配列決定データを得るための方法であって、
    （ａ）前記無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
    （ｂ）ＤＮＡ分子の末端の配列情報を保存しながら、前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、前記配列決定ライブラリを調製することが、前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ中のＤＮＡ分子に配列決定アダプタをライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
    （ｃ）ハイスループット配列決定法によって、前記配列決定ライブラリを配列決定して、配列決定データを得ることと、を含み、
    ３０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、少なくとも８５％のユニークマッピング率、未消化試料と比較して少なくとも０．６５のピアソン相関によって特徴付けられるコピー数完全性、及び未消化試料と比較して少なくとも０．５５のピアソン相関によって特徴付けられるヌクレオソームポジショニング完全性、のうちの少なくとも１つを達成するのに十分であり、
    遺伝的及び後成的分析が、同じ配列決定データに基づいて実施される、方法。
  3. ６，０００半数体当量を含む無細胞ＤＮＡの量が、前記方法に十分である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記無細胞ＤＮＡが、血漿無細胞ＤＮＡであり、前記無細胞ＤＮＡの量が、９～１０ｍＬの血液から得られる量である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記無細胞ＤＮＡの量が、１０～２００ｎｇである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記無細胞ＤＮＡの量が、２０～１００ｎｇである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、非平滑末端を生成し、前記方法が、配列決定アダプタの前記ライゲーションの前に前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを末端修復に供して、平滑末端を有するＤＮＡ分子を得ることを更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ハイスループット配列決定が、全ゲノムハイスループット配列決定である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ハイスループット配列決定が、標的のみを対象にしたハイスループット配列決定である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を決定することが、
    （ｉ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、前記制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、前記少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を計算することと、を含む、方法。
  11. ステップ（ｉ）が、前記制限遺伝子座を含有する少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの制限遺伝子座が、複数の制限遺伝子座である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであり、前記複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる前記消化が、同時の消化である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎＰ１Ｉを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記複数のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＡｃｉＩを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記消化が、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＡｃｉＩを使用して実施される、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供する前記ステップが、消化効力を決定することと、前記消化効力が所定の閾値を上回る場合に配列決定ライブラリの調製に進むことと、を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 対象由来の無細胞ＤＮＡ試料（ｃｆＤＮＡ）におけるがん関連の遺伝的及び後成的変化を検出するための方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｃｆＤＮＡ試料のメチル化及び任意選択で少なくとも１つの追加の遺伝的及び後成的特性をプロファイリングして、前記ｃｆＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイルを得ることと、前記ｃｆＤＮＡ試料の前記遺伝的及び後成的プロファイルを、がんプロファイル及び非がんプロファイルから選択される１つ以上の参照遺伝的及び後成的プロファイルと比較して、前記ｃｆＤＮＡ試料におけるがん関連の遺伝的及び後成的変化を検出することと、を含む、方法。
  19. 前記無細胞ＤＮＡ試料が、がんを有することが疑われる、又はがんを有するリスクがある対象からのものであり、前記方法が、がん関連変化が検出された場合に、能動的ながん監視及び追跡検査を前記対象に施すことを更に含み、前記がん監視及び追跡検査が、血液検査、尿検査、細胞診、撮像、内視鏡検査、及び生検のうちの１つ以上を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 対象におけるがんの存在又は非存在を評価するための方法であって、
    （ａ）前記対象の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
    （ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡをハイスループット配列決定法によって配列決定することと、
    （ｃ）互いに１５０ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む少なくとも１つのマルチオミクスゲノム領域を選択することと、
    （ｄ）前記少なくとも１つのマルチオミクス領域をカバーする配列読み取りの分析に基づいて、前記対象ががんを有する可能性を決定することと、を含む、方法。
  21. 前記少なくとも１つのマルチオミクス領域が、互いに１００ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つのマルチオミクス領域をカバーする配列読み取りの分析が、
    －各マルチオミクス領域について、
    （ｉ）前記制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、前記変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーするメチル化変異配列読み取りの数、
    （ｉｉ）前記制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、前記変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーするメチル化野生型配列読み取りの数、
    （ｉｉｉ）前記制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、前記変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーする非メチル化変異配列読み取りの数、及び
    （ｉｖ）前記制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、前記変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーする非メチル化野生型配列読み取りの数、のうちの少なくとも１つを決定することと、
    －前記対象ががんを有する可能性を評価するために、（ｉ）～（ｉｖ）において決定された前記読み取りの数をがん患者及び／又は健康な個体の基準値と比較することと、を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. がんを有することが疑われるか又はがんを有するリスクがある対象の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を特徴付けるための方法であって、
    （ａ）前記無細胞ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
    （ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡをハイスループット配列決定法によって配列決定することと、
    （ｃ）互いに１５０ｂｐ以内の腫瘍高メチル化制限遺伝子座及び腫瘍変異遺伝子座を含む少なくとも１つのマルチオミクスゲノム領域を選択することと、
    （ｄ）各マルチオミクス領域について、
    （ｉ）前記制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、前記変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーするメチル化変異配列読み取りの数、
    （ｉｉ）前記制限遺伝子座の全てのヌクレオチドを含み、前記変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーするメチル化野生型配列読み取りの数、
    （ｉｉｉ）前記制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、前記変異遺伝子座に変異遺伝子型を提示する、前記マルチオミクス領域をカバーする非メチル化変異配列読み取りの数、及び
    （ｉｖ）制限遺伝子座内のヌクレオチドで開始又は終了し、変異遺伝子座に野生型遺伝子型を提示する、マルチオミクス領域をカバーする非メチル化野生型配列読み取りの数、のうちの少なくとも１つを決定することと、を含み、
    それにより、前記無細胞ＤＮＡ試料を特徴付ける、方法。
  24. 対象由来のＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングするための方法であって、
    （ａ）前記ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、メチル化部位が無傷であり、かつ、非メチル化部位が切断されている、制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
    （ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから配列決定ライブラリを調製することであって、前記配列決定ライブラリを調製することが、配列決定アダプタを前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ断片にライゲーションすることを含み、各アダプタが、消化されたＤＮＡ分子及び消化されていないＤＮＡ分子の両方にライゲーションすることができる、調製することと、
    （ｃ）ハイスループット配列決定法によって、前記配列決定ライブラリを配列決定して、配列読み取りを得ることと、
    （ｄ）少なくとも１つの制限遺伝子座を選択し、前記制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）において決定された読み取りカウント及び参照読み取りカウントに基づいて、少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を計算することと、を含み、
    それにより、前記無細胞ＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングする、方法。
  25. 前記制限遺伝子座をカバーする前記所定の領域が、前記制限遺伝子座内の前記切断部位の少なくとも２５ｂｐ上流から始まり、前記制限遺伝子座内の前記切断部位の少なくとも２５ｂｐ下流で終了する、請求項２４に記載の方法。
  26. ステップ（ｄ）が、前記制限遺伝子座を含有する少なくとも１００ｂｐの長さの所定のゲノム領域をカバーする配列読み取りの数を決定することを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記制限遺伝子座をカバーする前記所定の領域が、前記制限遺伝子座内の前記切断部位の少なくとも５０ｂｐ上流から始まり、前記制限遺伝子座内の前記切断部位の少なくとも５０ｂｐ下流で終了する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記少なくとも１つの制限遺伝子座が、ＣＧアイランド内に位置する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記参照読み取りカウントが、未消化対照ＤＮＡ試料中の前記制限遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの前記所定のゲノム領域について決定された読み取りカウントであり、任意選択的に、配列決定深度差について補正される、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記参照読み取りカウントが、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されない参照遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの参照領域を使用して決定された読み取りカウントである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記参照読み取りカウントが、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されない参照遺伝子座を含有する少なくとも５０ｂｐの長さの複数の参照領域を使用して決定された平均読み取りカウントである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  32. メチル化値を計算することが、ステップ（ｄ）において決定された前記読み取りカウントを前記ＤＮＡ試料の読み取りカウント中央値に対して正規化して、正規化読み取りカウントを得ることと、前記正規化読み取りカウントの正規化参照読み取りカウントに対する比を計算することと、を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ＤＮＡ試料の遺伝的及び後成的プロファイリングのための方法であって、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの制限遺伝子座のメチル化値を決定することと、配列決定データから、ＤＮＡ変異、コピー数多型及びヌクレオソームポジショニングから選択されるＤＮＡ試料の少なくとも１つの追加の遺伝的又は後成的特性を更に決定することと、を含む、方法。
  34. 前記ＤＮＡが、生体液試料から抽出された無細胞ＤＮＡである、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＤＮＡが、腫瘍試料から抽出されたＤＮＡである、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 第１及び第２のＤＮＡの給源の間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定するための方法であって、
    請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法に従って、前記第１の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第１のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
    請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法に従って、前記第２の給源からの少なくとも１つのＤＮＡ試料のメチル化をプロファイリングして、第２のＤＮＡメチル化プロファイルを得ることと、
    前記第１及び前記第２のＤＮＡメチル化プロファイルを比較して、前記第１及び前記第２のＤＮＡの給源の間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定することと、を含む、方法。
  37. 前記第１のＤＮＡの給源が、がんＤＮＡであり、前記第２のＤＮＡの給源が、非がんＤＮＡである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１のＤＮＡの給源が、がん患者の血漿無細胞ＤＮＡであり、前記第２のＤＮＡの給源が、１人以上の健康な個体の血漿無細胞ＤＮＡである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記第１及び前記第２のＤＮＡの給源が、がんの異なる段階のものである、請求項３６に記載の方法。

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CA2902980A1 (en) * 2004-03-08 2005-09-29 Rubicon Genomics, Inc. Methods and compositions for generating and amplifying dna libraries for sensitive detection and analysis of dna methylation
US20200283840A1 (en) * 2016-08-15 2020-09-10 Ming-Che Shih Epigenetic discrimination of dna
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