CN118516448A - 一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，针对cfDNA jagged序列，本发明方法通过先对双链cfDNA进行加热变性成单链DNA，再对cfDNA单链直接进行3'端接头连接，之后将单链DNA进行延伸成完整双链，再将延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头，并进行PCR扩增，最后进行常规测序。本发明方法有效避免了现有技术构建cfDNA文库时，对cfDNA进行末端修复，补齐双链缺口和剪掉多余，造成了DNA链两端序列的丢失的问题。
Description
本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种能够完整保留jagged 信息的cfDNA文库构建方法。
背景技术
cfDNA是癌细胞凋亡过程中脱落的细胞外核酸片段；坏死或分泌，是早期发现的最有希望的方法。cfDNA表现出癌症相关遗传和表观遗传的改变，通过第二代测序，可以获悉包括突变，拷贝数改变，染色体重排、高甲基化和低甲基化等信息。与传统的癌症筛查相比，cfDNA检测显示出几个优势，使其成为早期发现癌症的理想方法。首先，从理论上讲，血液中是否存在异常的cfDNA可以通过检测来确定超早期癌症，在常规临床测量的阈值之前，扩大了早期干预的时间窗口。第二，cfDNA通过提供有关起源组织的信息，检测可以同时检测多种癌症。最后，cfDNA有潜力描述整个分子和表观遗传景观，不考虑肿瘤内异质性，帮助精确治疗和监测复发后早期检测。
cfDNA两端并非平末端，而是不对称的锯齿状，故称jagged序列。常规的建库方法会先对DNA进行末端修复，补齐双链缺口和剪掉多余，造成了jagged序列信息的丢失。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法。针对cfDNA jagged序列，本发明通过先对双链cfDNA加热变性成单链DNA，再对cfDNA单链直接进行接头连接，后续对连接了接头的单链进行补齐互补链，PCR扩增，最后进行常规测序。本发明方法有效避免了末端修复时，DNA链两端序列的丢失。
本发明的技术方案为：
一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，包括如下步骤：
（1）对双链cfDNA进行加热变性成为单链DNA；
（2）对步骤（1）所得单链DNA进行3'端接头连接；
（3）将单链DNA通过延伸引物延伸成完整双链；
（4）在经步骤（3）延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头；
（5）对纯化后的5'接头连接产物进行PCR扩增；
（6）文库质检，合格后进行混样和送测序。
步骤（1）中，对双链cfDNA进行加热变性成为单链DNA的具体操作为：
a1）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
b1）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
c1）反应结束后，迅速将PCR管置于冰上2分钟。
对步骤（1）所得单链DNA进行3'端接头连接的具体操作为：
a2）将3'接头连接缓冲液、3'连接酶、3'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述3'接头连接缓冲液的组成为：100 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM DTT，2mM ATP；
所述3'连接酶为T4 RNA连接酶1；
所述3'接头的序列为：5’-NNNNNNNNGTAACTGGTTCCAGTAC-3’；
b2）在PCR管中，按如下体积加入试剂得到预混液，并在冰上进行操作；
c2）将20 μL的预混液与步骤（1）所得变性后的单链，用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d2）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
e2）反应结束后，将PCR管取出并短暂离心，反应液收集至管底，放置冰上。
将单链DNA通过延伸引物延伸成完整双链的具体操作如下：
a3）将延伸引物和延伸酶解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述延伸引物的序列为5’-GTACTGGAACC-3’；
所述延伸酶为高保真DNA聚合酶；
b3）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
c3）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
d3）反应完成后，使用磁珠对反应产物进行纯化。
步骤d3）中，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
S1）吸取96 μL磁珠至上一步80 μL接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
S2）室温孵育5分钟；
S3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
S5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
S6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
S7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取20 μL上清至新EP管中。
步骤（4）中，在所述延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头，具体操作如下：
a4）将5'连接酶、5'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述5'连接酶为T4 DNA连接酶；
所述5'接头的序列为：5’-GACGTACCGTTAACCGT-3’；
b4）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
c4）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d4）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
e4）反应结束后，使用磁珠对反应产物进行纯化。
步骤e4）中，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
SS1）吸取40 μL磁珠至上一步40 μL 5'接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SS2）室温孵育5分钟；
SS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
SS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取20 μL上清至新EP管中。
步骤（5）中，对纯化后的5' 接头连接产物进行PCR扩增，具体操作如下：
a5）将PCR引物、 PCR扩增酶解冻后颠倒混匀，在PCR管中按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
所述PCR引物的序列为：
i5引物：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]CTGCATGGCAATTGGCA-3’；
i7引物：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTACTGGAACCAGTTAC-3'；
所述PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶；
b5）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
c5）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
d5）反应结束后，将样本取出并短暂离心，将反应液收集至管底；
e5）使用磁珠对反应产物进行纯化。
步骤e5）中，使用0.85×磁珠对反应产物进行纯化，具体操作为：
SSS1）吸取42.5 μL磁珠，至上一步PCR 扩增产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SSS2）室温孵育5分钟；
SSS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
SSS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SSS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SSS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SSS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱， 加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取50 μL上清至新EP管中。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种能够完整保留jagged 信息的cfDNA文库构建方法，针对cfDNAjagged序列，本发明通过先对双链cfDNA进行加热变性成单链DNA，再对cfDNA单链直接进行3’端接头连接，之后将单链DNA进行延伸成完整双链，再将延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头，并进行PCR扩增，最后进行常规测序。本发明方法有效避免了末端修复时，DNA链两端序列的丢失。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示本发明cfDNA文库构建方法的操作流程示意图；
图2A显示利用本发明实施例1方法所得文库片段的质检结果；
图2B显示利用对比例1方法所得文库片段的质检结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，如图1所示，包括如下步骤：
（1）对双链cfDNA进行加热变性成为单链DNA，具体操作为：
a1）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
b1）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
c1）反应结束后，迅速将PCR管置于冰上2分钟；
（2）对步骤（1）所得单链DNA进行3'端接头连接，具体操作为：
a2）将3'接头连接缓冲液、3'连接酶、3'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述3'接头连接缓冲液的组成为：100 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM DTT，2mM ATP；
所述3'连接酶为T4 RNA连接酶1；
所述3'接头的序列具体为：5’-NNNNNNNNGTAACTGGTTCCAGTAC-3’；
b2）在PCR管中，按如下体积加入试剂得到预混液，并在冰上进行操作；
c2）将20 μL的预混液与步骤（1）所得变性后的单链，用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d2）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
e2）反应结束后，将PCR管取出并短暂离心，反应液收集至管底，放置冰上；
（3）将单链DNA通过延伸引物延伸成完整双链，具体操作如下：
a3）将延伸引物和延伸酶解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述延伸引物的序列为5’-GTACTGGAACC-3’；
所述延伸酶为高保真DNA聚合酶；
b3）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
c3）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
d3）反应完成后，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
S1）吸取96 μL磁珠至上一步80 μL接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
S2）室温孵育5分钟；
S3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清；
S4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
S5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
S6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
S7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，小心移取20 μL上清至新EP管中，切勿触碰磁珠；
（4）在经步骤（3）延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头，具体操作如下：
a4）将5'连接酶、5'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述5'连接酶为T4 DNA连接酶；
所述5'接头的序列为：5’-GACGTACCGTTAACCGT-3’；
b4）在PCR管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
c4）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d4）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
e4）反应结束后，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
SS1）吸取40 μL磁珠至上一步40 μL 5'接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SS2）室温孵育5分钟；
SS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清；
SS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
SS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
SS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，小心移取20 μL上清至新EP管中，切勿触碰磁珠；
（5）对纯化后的5'接头连接产物进行PCR扩增，具体操作如下：
a5）将PCR引物、 PCR扩增酶解冻后颠倒混匀，在PCR管中按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作；
所述PCR引物的具体序列为：
i5引物: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]CTGCATGGCAATTGGCA-3’；
i7引物: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTACTGGAACCAGTTAC-3'；
所述PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶；
b5）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
c5）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
d5）反应结束后，将样本取出并短暂离心，将反应液收集至管底；
e5）使用0.85×磁珠对反应产物进行纯化，具体操作为：
SSS1）吸取42.5 μL磁珠，至上一步PCR扩增产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SSS2）室温孵育5分钟；
SSS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清；
SSS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
SSS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；
SSS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SSS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱， 加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，小心移取50 μL上清至新EP管中，切勿触碰磁珠；
（6）文库质检，合格后进行混样和送测序。
对比例1
本对比例提供一种现有方案，具体操作为：
S1、基因组DNA的酶切、末端修复和加A。
S11、利用两种常见的限制性内切酶对基因组DNA进行双酶切消化，得到限制性酶切片段；其中，两种常见的限制性内切酶分别为VVN和T7；
S12、利用聚合酶对酶切片段进行末端修复和DNA的3’端接头加A(腺嘌呤)，得到限制性片段产物；其中，聚合酶为Taq DNA聚合酶；该聚合酶的作用就是先将DNA的5’端突出部分补平，再DNA的3’端接头加A(腺嘌呤)。反应体系和条件如表：
其中，基因组DNA的酶切反应温度为37℃，反应时间为20-30min；加A反应温度为65℃，反应时间为20-30min。
S2、DNA片段接头连接。
该步骤中，使用连接酶，如T4DNA连接酶将步骤S1中得到的DNA加A产物与DNA的5’端带有突出T的接头连接在一起，得到含“ 接头-DNA插入片段-接头”形式的DNA片段，DNA片段接头连接过程的反应体系和条件如表：
其中，接头连接的反应温度为20℃，反应时间为20-30min。
S3、第一次纯化DNA片段。
该步骤中，通过进行第一次纯化处理，将DNA片段回收，得到目标DNA片段。具体工艺步骤如下：
S31、所述DNA的5’端的A接头连接反应结束后，将所述DNA片段置于离心管，如PCR管中，加入72μL DNA磁珠(0 .9X)，吹打混匀或震荡低速混匀所述DNA片段，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹离心管管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底。
S32、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述DNA片段且溶液变澄清之后，用中枪头吸去离心管中的溶液；注意不要吸到磁珠，EP管留在磁力架上。
S33、吸取200μL 80v/v％的乙醇于EP管，期间轻轻旋动EP管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠。
S34、重复上一步骤S33。
S35、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全所述DNA片段后，用枪吸取溶液。
S36、室温晾3min，让残留乙醇蒸发。该步骤，注意项：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作。
S37、吸取22μL DNA洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀所述DNA片段，室温反应5min；等待的同时，准备好下面步骤需要的PCR反应混合溶液，标记为Mix3，并吸取50μL于各新的0.2mL的PCR管中。
S38、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述DNA片段且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μL溶液至新的PCR管中。注意不能吸到磁珠；获得纯化后的目标DNA片段。
S4、PCR扩增并富集DNA片段。
该步骤中，以回收的所述DNA片段作为模板进行PCR扩增，以富集所述目标DNA片段，构建并获得DNA二代测序文库。具体工艺步骤中，PCR扩增处理包括如下步骤：
S41、往PCR管中加入PCR酶混合液、PCR引物混合液，进行DNA片段的PCR扩增反应，以富集所述目标DNA片段；该步骤中，反应体系如表：
其中，反应时，将PCR管放入PCR仪上，按以下条件进行反应：
1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s
5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
6)保存阶段：反应温度为4℃；
其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10－14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。
S42、待PCR扩增反应结束后，回收PCR扩增产物，对PCR扩增产物的DNA片段进行选择和第二次纯化处理后，得到DNA二代测序文库。
该步骤中，具体工艺操作如下：
S421、反应结束后补水至100μL，再加入80μL DNA磁珠(0 .8X)，吹打混匀或震荡低速混匀PCR扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；期间可轻弹管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底。
S422、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物且溶液变澄清之后，用中枪头转移溶液至含有40μL DNA磁珠(0 .4X)的低吸附管，吹打混匀或震荡低速混匀PCR扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；期间可轻弹管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于管底；注意不要吸到磁珠，EP管留在磁力架上。
S423、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物溶液变澄清之后，弃上清，并加入200μL 80v/v％的乙醇于EP管，期间轻轻旋动EP管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠。
S424、重复上一步骤S423。
S425、快速离心数s，让管壁液体甩到离心管管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全后PCR扩增产物后，用枪吸取溶液。
S426、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；该步骤中，注意：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作。
S427、吸取22μL DNA洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀PCR扩增产物，室温反应5min。
S428、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μL于新的EP管中(注意不能吸到磁珠)，得到DNA二代测序文库。
对本发明实施例1和对比例1方法所得文库片段的质检结果进行分析，分别如图2A和图2B所示，从图中可以看出，本发明的文库片段主峰为306 bp，而对比例1方法对同一核酸样本建库，文库片段主峰为300 bp。缺少的6 bp为末端修复时丢失的jagged序列。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对双链cfDNA进行加热变性成为单链DNA；
（2）对步骤（1）所得单链DNA进行3'端接头连接；
（3）将单链DNA通过延伸引物延伸成完整双链；
（4）在经步骤（3）延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头；
（5）对纯化后的5'接头连接产物进行PCR扩增；
（6）文库质检，合格后进行混样和送测序。
2.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，步骤（1）中，对双链cfDNA进行加热变性成为单链DNA的具体操作为：
a1）在PCR管中，按如下体积加入试剂：5μL的cfDNA和15μL的水，并在冰上进行操作；
b1）将PCR管置于PCR仪中，设定热盖温度为105℃，95℃进行反应2分钟；
c1）反应结束后，迅速将PCR管置于冰上2分钟。
3.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，对步骤（1）所得单链DNA进行3'端接头连接的具体操作为：
a2）将3'接头连接缓冲液、3'连接酶、3'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述3'接头连接缓冲液的组成为：100 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM DTT，2 mMATP；
所述3'连接酶为T4 RNA连接酶1；
所述3'接头的序列为：5’-NNNNNNNNGTAACTGGTTCCAGTAC-3’；
b2）在PCR管中，按如下体积加入试剂得到预混液：10μL的3'连接缓冲液、5μL的3'连接酶和5μL的3'接头，并在冰上进行操作；
c2）将20 μL的预混液与步骤（1）所得变性后的单链，用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d2）将PCR管置于PCR仪中，设定热盖温度为105℃，37℃进行反应15分钟，95℃进行反应2分钟后，4℃保持；
e2）反应结束后，将PCR管取出并短暂离心，反应液收集至管底，放置冰上。
4.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，将单链DNA通过延伸引物延伸成完整双链的具体操作如下：
a3）将延伸引物和延伸酶解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述延伸引物的序列为5’-GTACTGGAACC-3’；
所述延伸酶为高保真DNA聚合酶；
b3）在PCR管中，按如下体积加入试剂：40μL的上一步的反应液、5μL的延伸引物和35μL的延伸酶，并在冰上进行操作；
c3）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将PCR管置于PCR仪中，设定热盖温度为105℃，98℃进行反应30秒；
d3）反应完成后，使用磁珠对反应产物进行纯化。
5.根据权利要求4所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，步骤d3）中，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
S1）吸取96 μL磁珠至上一步80 μL接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
S2）室温孵育5分钟；
S3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
S5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
S6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
S7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取20 μL上清至新EP管中。
6.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，步骤（4）中，在所述延伸完成的双链DNA的原模板链5'末端连接接头，具体操作如下：
a4）将5'连接酶、5'接头解冻，颠倒混匀，短暂离心后将试剂置于冰上备用；
所述5'连接酶为T4 DNA连接酶；
所述5'接头的序列为：5’-GACGTACCGTTAACCGT-3’；
b4）在PCR管中，按如下体积加入试剂：20μL的上一步的纯化产物、10μL的5'连接酶和10μL的5'接头，并在冰上进行操作；
c4）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
d4）将PCR管置于PCR仪中，设定热盖温度为105℃，25℃进行反应15分钟，4℃保持；
e4）反应结束后，使用磁珠对反应产物进行纯化。
7.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，其特征在于，步骤e4）中，使用诺唯赞磁珠N411对反应产物进行纯化，具体操作为：
SS1）吸取40 μL磁珠至上一步40 μL 5'接头连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SS2）室温孵育5分钟；
SS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
SS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱，加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取20 μL上清至新EP管中。
8.根据权利要求1所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法，步骤（5）中，对纯化后的5' 接头连接产物进行PCR扩增，具体操作如下：
a5）将PCR引物、 PCR扩增酶解冻后颠倒混匀，在PCR管中按如下体积加入试剂：20μL的上一步的纯化产物、5μL的PCR引物和25μL的PCR扩增酶，并在冰上进行操作；
所述PCR引物的序列为：
i5引物：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]CTGCATGGCAATTGGCA-3’；
i7引物：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTACTGGAACCAGTTAC-3'；
所述PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶；
b5）用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底；
c5）将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：先98℃45秒；之后依次98℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，共15个循环；72℃1分钟后，4℃保持；
d5）反应结束后，将样本取出并短暂离心，将反应液收集至管底；
e5）使用磁珠对反应产物进行纯化。
9.根据权利要求8所述的能够完整保留jagged信息的cfDNA文库构建方法， 步骤e5）中，使用0.85×磁珠对反应产物进行纯化，具体操作为：
SSS1）吸取42.5 μL磁珠，至上一步PCR 扩增产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
SSS2）室温孵育5分钟；
SSS3）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
SSS4）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SSS5）重复上一步骤，再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清；
SSS6）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟至无乙醇残留；
SSS7）将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱， 加入22.5 μL NF H2O洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置5分钟，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，移取50 μL上清至新EP管中。
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