CN108166067A

CN108166067A - 一种新型dna建库方法及其应用

Info

Publication number: CN108166067A
Application number: CN201810000898.0A
Authority: CN
Inventors: 李静; 陈昌岳; 王芳; 王雨倩; 赵慧茹; 胡秋萍; 张祥林
Original assignee: SHANGHAI MAJORBIO PHARM TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI MAJORBIO PHARM TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-01-02
Filing date: 2018-01-02
Publication date: 2018-06-15

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种新型DNA建库方法及其应用。本发明的DNA建库方法，直接通过普通的连接酶介导黏性末端接头连接到样本基因组DNA变性成的单链DNA上，能应用于低起始量的样品，和之前的方法相比，样品的连接效率大大提高，更大限度的保留样品的多样性，而且稳定性好，缩小由于人为原因造成的文库偏向性。

Description

一种新型DNA建库方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种新型DNA建库方法及其应用。

背景技术

DNA分子的功能是贮存决定物种性状的几乎所有蛋白质和RNA分子的全部遗传信息，对DNA信息的解读，对于我们研究生命的奥秘、疾病的机理等有着重要的意义。DNA分子通常以双链的形式存在以样本中，但是绝大多数珍贵的医学样本都以福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的形式存在。

FFPE样本珍贵，但是在分子生物学实验中却存在扩增困难的难题。通常FFPE都质量差，被片段化且在DNA上存在较多的断点，这对相应样品的扩增存在一定的困难，因为通常聚合酶不能跳过这些断点，而使样本不能扩增成功。

相应的存在另一类样本--cfDNA(cell-free circulating DNA)一般指存在于血浆、尿液等体液中的DNA碎片，也同样是一种片段化的样品，通常140bp～170bp左右。

为了解决这类小片段的样本的扩增问题，本领域技术人员提出了以下解决方案：

专利“一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法”，采用TS2126RNA连接酶(也称为Circligase ssDNA ligase)进行单链DNA分子和单链接头连接，可以将单链DNA接头连接至单链的DNA分子上，实现了对片段化基因组DNA的富集，提高了对片段化样本基因组的覆盖率。但是该方案中所需酶(circligase)价格昂贵、对连接片段的序列具有一定的选择性、暂无同等连接效率的替代用酶。

受以上限制因素的影响，目前对于这类片段化样本通常采用pcr的方式检测其中的个别位点；或者多重PCR的方式同时检测较多的位点；或者通过双链连接的方式对FFPE样本或cfDNA进行连接后扩增及二代测序文库的构建。但PCR扩增方式对片段有偏向性，一般只能覆盖到质量较好的区域，对于有断裂点的样本扩增情况则非常不理想，无法有效利用样本中的全部DNA信息；而在双链连接的方案中，受文库片段化影响较大的区域接头连接效率普遍较差，也会导致DNA信息的丢失。

针对以上问题，急需一种新型DNA建库方法，以满足对此类小片段样本的研究需求。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新型DNA建库方法及其应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供了一种DNA建库方法，包括如下步骤：

(1)对样本基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA；

(2)将步骤(1)中获得的单链DNA与黏性末端接头进行连接，获得一端带有接头的单链DNA；

(3)对步骤(2)中获得的一端带有接头的单链DNA进行延伸，形成一端带有接头的双链DNA；

(4)采用双链接头连接到步骤(3)所得一端带有接头的双链DNA的另一端，形成双端带有接头的双链DNA；

(5)对步骤(4)获得的双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得文库。

进一步地，所述样本基因组DNA来自单细胞样本或多细胞样本。

进一步地，所述样本基因组DNA由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得。

此外，可以是在进行步骤(1)之前，先对单细胞样本裂解或对多细胞样本抽提，从而获得所述样本基因组DNA。也可以采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。

进一步地，当样本的细胞数目在十万个以下时，可直接裂解获得样本基因组DNA，而无需进行抽提。

所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。所述真核细胞可以是植物细胞或动物细胞及微生物。所述动物细胞具体选自组织消化的细胞、培养所得的细胞、胚胎发育早期的细胞、癌症早期的细胞、未经富集培养的微生物细胞、微流控分选获得的细胞、流式分选获得的细胞、有限稀释获得的细胞、激光捕获等方法获得的细胞中的任一种。

进一步地，所述样本基因组DNA的质量可以大于等于6pg。

进一步地，所述步骤(1)中，本领域技术人员可采用公知的技术，例如高温变性后猝冷、NaOH溶液碱变性等方案使样本基因组DNA变性成单链DNA。所述高温一般是指60℃-98℃。优选地为80℃-98℃。更优选地为90℃-98℃。处理时间一般为30s-10min。所述NaOH溶液为0.2～0.6M NaOH，1～1.5MNaCl。优选地为0.3～0.5M NaOH，1～1.5MNaCl。更优选地为0.4M NaOH，1.5MNaCl。

进一步地，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端至少包括随机序列。

进一步地，所述随机序列的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。

需要说明的是，所述随机序列用于与样本基因组DNA变性成的单链DNA通过互补配对进行连接。所述黏性末端接头中的双链部分的序列可以适用于相应的测序平台，如illumina测序平台。

进一步地，所述黏性末端接头的另一端可以是平末端，也可以是第二黏性末端。当所述黏性末端接头的另一端为第二黏性末端时，所述第二黏性末端优选为A或T或C或G的重复序列，长度优选为2-10nt，更优选为2-5nt。当所述黏性末端接头的另一端为第二黏性末端时，所述第二黏性末端也可以为其他DNA序列，如illumina测序平台接头序列的全长或部分序列，防止接头自连，长度优选为2-10nt，更优选为2-5nt。

进一步地，所述第一黏性末端包括随机序列及特殊序列。

进一步地，所述特殊序列为序列确定的序列。

进一步地，所述第一黏性末端的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。

进一步地，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

进一步地，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

进一步地，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行磷酸化修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述带有第一黏性末端的单链的5’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的5’端进行氨基修饰。

如DMS(O)MT-Amino-Modifier-C6、Amino-Modifier-C3-TFA、Amino-Modifier-C12、Amino-Modifier-C6-TFA(trifluoroacetic acid protecting group on amine)、Amino-dT、Amino-Modifier-5、Amino-Modifier-C2-dT、Amino-Modifier-C6-dT，氨基修饰可以随意组合。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的5’端既进行间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰，间臂(spacer)修饰和氨基修饰可以随意组合。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列与C3Spacer或C6Spacer或Spacer 12或Spacer 12或Spacer C18的修饰的组合。优选地，采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列个数为2-8个为佳。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行氨基修饰。如DMS(O)MT-Amino-Modifier-C6、Amino-Modifier-C3-TFA、Amino-Modifier-C12、Amino-Modifier-C6-TFA(trifluoroacetic acid protecting group on amine)、Amino-dT、Amino-Modifier-5、Amino-Modifier-C2-dT、Amino-Modifier-C6-dT，氨基修饰可以随意组合。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端既进行间臂(spacer)又进行氨基修饰，间臂(spacer)和氨基修饰可以随意组合。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰和生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰位于所述第一引物序列的3’末端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰与生物素之间用TEG进行连接。

进一步地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端的随机序列之后还可以采用AmC3或AmC6或AmC7的氨基修饰或spacer修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，不带有第一黏性末端的那条单链称为另一条单链。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行磷酸化修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，采用C3Spacer或C6Spacer或Spacer C12或Spacer 12或Spacer C18或C3Spacer-CPG的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。再优选地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端采用1-10个Spacer C12或1-10个C18Spacer或1-10个C3Spacer或1-10个C6Spacer或1-10个C3Spacer-CPG的修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行氨基修饰。

如DMS(O)MT-Amino-Modifier-C6、Amino-Modifier-C3-TFA、Amino-Modifier-C12、Amino-Modifier-C6-TFA(trifluoroacetic acid protecting group on amine)、Amino-dT、Amino-Modifier-5、Amino-Modifier-C2-dT、Amino-Modifier-C6-dT。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的的3’端进行氨基修饰。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端既进行间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰，间臂(spacer)修饰和氨基修饰可以随意组合。

进一步地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰又有生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰位于所述第二引物序列的3’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)和氨基修饰与生物素之间用TEG进行连接。

进一步地，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头通过连接酶连接到所述单链DNA上。

进一步地，所述连接酶选自HiFi Taq DNA连接酶、T4RNA连接酶2、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4DNA连接酶、Circligase ssDNA ligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶中的任一种或多种。

进一步地，所述步骤(3)中，延伸时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、延伸引物。

进一步地，所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、、T4DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、SulfolobusDNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶等一种或几种酶的组合。

进一步地，所述dNTPs可以是2.5mM的也可以是10mM的也可以是其他浓度的。所述DNA聚合酶缓冲液为对应所选聚合酶而选用的最佳匹配缓冲液。

进一步地，所述延伸引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

进一步地，所述步骤(4)中，所述双链接头的末端为平末端或黏性末端。

所述双链接头的序列可以是适用于illumina测序平台的接头序列，也可以是其他双链结构的DNA。

进一步地，所述黏性末端的长度为2-10nt，优选为2-5nt。

进一步地，所述黏性末端可以是带有一个T的黏性末端、Y型末端或为A或T或C或G的重复序列或其他DNA序列。

例如，所述双链接头的一端可以是平末端或带有一个T的黏性末端。所述双链接头的另一端为平末端或Y型或黏性末端，所述黏性末端为A或T或C或G的重复序列或其他DNA序列。

进一步地，所述双链接头包括第一条链和第二条链。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的5’端进行磷酸化修饰。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的3’端进行间臂(spacer)修饰。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的的3’端既有间臂(spacer)修饰又有生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰位于所述第一条链的3’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰与生物素之间用TEG进行连接。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的3’端进行磷酸化修饰。

进一步地，所述双链接头中，第一条单链的的3’端进行硫代修饰。

进一步地，所述双链接头中，第二条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

进一步地，所述双链接头中，第二条单链的的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

进一步地，所述双链接头中，第二条单链的的5’端进行磷酸化修饰。

进一步地，所述双链接头中，第二条单链的的3’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，采用C3Spacer或C6Spacer或Spacer C12或Spacer 12或Spacer C18的修饰。再优选地，所述第二条单链的5’端采用1-10个Spacer C12或1-10个C18Spacer或1-10个C3Spacer或1-10个C6Spacer的修饰。

进一步地，所述第二条单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

进一步地，所述二条单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又有生物素化(bioten)修饰。

优选地，所述间臂(spacer)修饰可位于所述第二条单链的5’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰与生物素之间用TEG进行连接。

进一步地，所述第二条单链的3’端进行硫代修饰。

进一步地，所述第二条单链的3’端进行磷酸化修饰。

进一步地，步骤(5)中，扩增时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、扩增引物。

进一步地，所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、SulfolobusDNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶等中一种或几种酶的组合。

进一步地，所述扩增引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

本发明的第二方面，提供了前述DNA建库方法用于样本基因组DNA测序中的用途。

本发明的第三方面，提供一种样本基因组DNA测序方法，包括如下步骤：采用前述方法建立文库后，对所获得的文库进行测序。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供一种新型的DNA建库方法，可适用于对样本基因组DNA进行单链连接、扩增或文库构建。该方案适用于单细胞、cfDNA、ctDNA、ChIp DNA、提取的线粒体DNA、提取的基因组DNA，其中提取的基因组DNA可以是活细胞或组织提取的，也可以是FFPE样本等提取的质量较差的基因组DNA。另外该方案对样品的起始量要求为6pg。

(2)相比于双链连接的方案，采用本发明的DNA建库方法能应用于低起始量的样品(低至6pg)。

(3)相比于随机引物扩增法，采用本发明的DNA建库方法，可直接通过连接酶引入带有黏性末端的双链DNA接头，因此能确保一条DNA的分子链来源于模板链的同一区域，从而实现后续比对到参考基因组时能采用更精确的双端比对的模式，增加数据的准确性。

(4)相比于利用circligas(即TS2126RNA连接酶)进行单链连接的扩增方式，采用本发明的DNA建库方法可通过更经济实用的诸如T4DNA连接酶进行接头连接。该酶价格便宜，利用circligas进行连接每个反应的酶成本约为200元而T4DNA连接酶仅需3元左右。另外circligas对于500nt以上的片段没有连接活性，同时其更适用于分子内的环化反应，另外该酶对于DNA分子的5端的连接活性G>A>>>T>>>C，对于DNA分子的3端的连接活性T>A>G>，对于C基本没有连接活性(其中>表示优于，>>>表示远远优于)。而T4DNA连接酶没有上述的选择性，因此能更大限度的保留样品的多样性，缩小由于人为原因造成的文库偏向性。

附图说明

图1：本发明的DNA建库方法中使用的黏性末端接头的结构示意图，NNNN为随机引物序列，图上的4个N只是展示结构，而并非对随机引物部分长度的限定。

图2：展示采用本发明的DNA建库方法对基因组DNA进行建库的大致过程，其中采用黏性末端接头连接单链DNA的步骤中，黏性末端接头中的随机引物序列NNNN，只作为结构示意，不作为限定；黏性末端接头上还可以连接生物素等修饰，后续可以与链霉亲和素等磁珠相连，进行纯化；若在连接黏性末端接头后或延伸成双链DNA后或平末端接头连接后已能满足应用，则可相应的停止后续实验，而非一定进行到指数扩增。

图3：采用3％琼脂糖凝胶电泳检测单链DNA与本发明DNA建库方法中的黏性末端接头的连接率。

图4：本发明实施例1中采用本发明DNA建库方法进行建库时，出库芯片检测结果图。

图5：平行样本分别采用常规双链建库的方案和本发明的方案构建文成的文库，利用完全相同的实验条件，利用相对定量的方式鉴定文库分子的含量的结果图，如图所示经过3次重复试验，单链DNA的连接方式比双链DNA连接方式约提高2倍的分子数量。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明具体提供了一种DNA建库方法，包括如下步骤：

(1)对样本基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA；

在一个示例中，所述样本基因组DNA来自单细胞样本或多细胞样本。

在一个示例中，所述样本基因组DNA由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得。

可以是在进行步骤(1)之前，先对单细胞样本裂解或对多细胞样本抽提，从而获得所述样本基因组DNA。也可以采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。

可采用细胞裂解液对单细胞样本裂解或采用基因组DNA抽提试剂对多细胞样本抽提，从而获得所述样本基因组DNA。也可以采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。单个细胞的起始量一般为6pg。

本发明提供的新型DNA建库方法的样本起始量为单细胞。对于细胞异质性的探索、珍惜样本的研究具有极其重要的意义。

在一个示例中，所述样本的基因组DNA的质量大于等于6pg。

在一个示例中，所述细胞具体为原核细胞或真核细胞。

在一个示例中，所述真核细胞具体为植物细胞或动物细胞。

在一个示例中，所述动物细胞具体选自组织消化的细胞、培养所得的细胞、胚胎发育早期的细胞、癌症早期的细胞、未经富集培养的微生物细胞、微流控分选的细胞、流式分选获得的细胞、有限稀释获得的细胞、激光捕获等方法获得的细胞中的任一种。

在一个示例中，本领域技术人员可采用公知的技术，例如高温变性后猝冷、NaOH溶液碱变性等方案使样本基因组DNA变性成单链DNA。所述高温一般是指60℃-98℃。优选地为80℃-98℃。更优选地为90℃-98℃。处理时间一般为30s-10min。所述NaOH溶液为0.2～0.6MNaOH，1～1.5MNaCl。优选地为0.3～0.5M NaOH，1～1.5MNaCl。更优选地为0.4M NaOH，1.5MNaCl。具体地，本领域技术人员可根据实际需要来选择适合的方法使样本基因组DNA变性成单链DNA，只要不限制本发明的目的即可。

在一个示例中，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端至少包括随机序列。其中，所述随机序列用于与样本基因组DNA变性成的单链DNA通过互补配对进行连接。而所述黏性末端接头中的双链部分的序列可以适用于相应的测序平台，如illumina测序平台。如果无测序要求，则对双链部分的序列无特殊要求，只要符合双链结构即可。

所述随机序列的长度可根据目标样本的多样性进行调整，若目标样本的多样性高则随机序列的长度可相对增加，若目标样本的多样性低则随机引物的长度可相对减少。通常所述随机序列的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。

在一个示例中，所述黏性末端接头的另一端可以是平末端，也可以是第二黏性末端。当所述黏性末端接头的另一端为第二黏性末端时，所述第二黏性末端优选为A或T或C或G的重复序列，长度优选为2-10nt，更优选为2-5nt，也可以是其他DNA序列。具体地，本发明的技术人员可根据实际需要来选择适合的第二黏性末端的序列及长度，只要不限制本发明的目的即可。

在一个示例中，所述第一黏性末端包括随机序列及特殊序列。一般地，所述特殊序列为序列确定的序列。

例如：当需要连接的单链DNA是通过酶切获得的带有一定末端序列的单链DNA，所述酶切可以是限制性内切酶酶切，所述限制性内切酶可以是MSPI、EcoB、EcoK、EcoRI、HindⅢ、HinfⅢ、XspI、BfaI、MaeI、TaqI、TthHB8I、HpaⅡ、HapⅡ、ApaⅠ、BamHⅠ、BanⅡ、HgiJⅡ、EcoRⅡ、MvaⅠ、BstOⅠ、BglⅠ、BglⅡ、AsuⅠ、Cfr13Ⅰ、Sau96Ⅰ、AvaⅠ、BseJⅠ、AsuⅡ、NspⅤ、BstBⅠ、Csp45Ⅰ、HgiCⅠ、BanⅠ、BstPⅠ、BstEⅡ、DraⅠ、AhaⅢ、DraⅡ等，以MSPI酶切为例，使得单链DNA带有的一定末端序列是CGG或C，那么此时，所述第一黏性末端中所包括的特殊序列是与所述一定末端序列互补的序列，亦即GCC或G。

再例如，如果研究者或实验人员，对于某些目标序列具有有偏向性的富集意愿，以目标序列为CG二核苷酸序列为例，具体如CGCGCGCG，则此时，所述第一黏性末端中所包括的特殊序列是与所述目标序列互补的序列，亦即GCGCGCGC。此外，所述CG二核苷酸序列的个数可以为1-10，优选地为2-8，更优选地为2-6。

在一个示例中，所述第一黏性末端的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

在一个示例中，所述第一条链的长度为10-70nt。进一步可以是10-30nt。再进一步可以是10-25nt。

在一个示例中，所述第一条链的退火温度为10-100℃。进一步可以是20-80℃。再进一步可以是30-60℃。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链可进行适当的修饰，以减少引物的非特异性扩增。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述带有第一黏性末端的单链的5’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的5’端进行氨基修饰。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的5’端既进行间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰，间臂(spacer)修饰和氨基修饰可以随意组合。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列与C3Spacer或C6Spacer或Spacer 12或Spacer 12或Spacer C18的修饰的组合。优选地，采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列个数为2-8个为佳；更优选地，随机引物之后还可以采用AmC3或AmC6或AmC7的修饰或硫代修饰。更优选地，随机引物之后还可以采用AmC3或AmC6或AmC7的修饰或硫代修饰。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述带有第一黏性末端的单链的3’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端进行氨基修饰。如DMS(O)MT-Amino-Modifier-C6、Amino-Modifier-C3-TFA、Amino-Modifier-C12、Amino-Modifier-C6-TFA(trifluoroacetic acid protecting group on amine)、Amino-dT、Amino-Modifier-5、Amino-Modifier-C2-dT、Amino-Modifier-C6-dT，氨基修饰可以随意组合。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端既进行间臂(spacer)又进行氨基修饰，间臂(spacer)和氨基修饰可以随意组合。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰和生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰位于所述第一引物序列的3’末端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰与生物素之间用TEG进行连接。

在一个示例中，所述带有第一黏性末端的单链的3’端的随机序列之后还可以采用AmC3或AmC6或AmC7的氨基修饰或spacer修饰。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，不带有第一黏性末端的那条单链称为另一条单链。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行磷酸化修饰。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，采用C3Spacer或C6Spacer或Spacer C12或Spacer 12或Spacer C18或C3Spacer-CPG的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。再优选地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端采用1-10个Spacer C12或1-10个C18Spacer或1-10个C3Spacer或1-10个C6Spacer或1-10个C3Spacer-CPG的修饰。再优选地，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列与C3Spacer或C6Spacer或Spacer 12或Spacer 12或SpacerC18的修饰的组合。优选地，采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列个数为2-8个为佳。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行氨基修饰。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端可采用连续的Spacer C12或C18Spacer或C3Spacer-CPG或C3Spacer或C9Spacer的修饰，Spacer可随意组合以增长碳链长度。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的的3’端进行氨基修饰。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端既进行间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰，间臂(spacer)修饰和氨基修饰可以随意组合。

在一个示例中，所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又进行氨基修饰又有生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰和氨基修饰位于所述第二引物序列的3’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)和氨基修饰与生物素之间用TEG进行连接。

本发明一些实施例中所列举的是适用于illumina测序平台的接头序列，仅用于示意，并不局限于这些具体的序列。实施例中所列举的修饰方式也仅用于示意。可根据实际需要进行其他修饰。

在一个示例中，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头通过连接酶连接到所述单链DNA上。

在一个示例中，所述连接酶选自HiFi Taq DNA连接酶、T4RNA连接酶2、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、Circligase ssDNAligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶中的任一种或多种。

在一个示例中，所述步骤(3)中，延伸时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、延伸引物。

在一个示例中，所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、、T4DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动FlexDNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶等一种或几种酶的组合。

在一个示例中，所述DNA聚合酶缓冲液为对应选用的最佳匹配缓冲液。

在一个示例中，所述延伸引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

在一个示例中，所述步骤(4)中，所述双链接头的末端为平末端或黏性末端。

在一个示例中，所述黏性末端的长度为2-10nt，优选为2-5nt。

在一个示例中，所述黏性末端可以是带有一个T的黏性末端、Y型末端或为A或T或C或G的重复序列或其他DNA序列。

例如，所述双链接头的一端可以是平末端或带有一个T的黏性末端。所述双链接头的另一端为平末端或Y型末端或黏性末端，所述黏性末端为A或T或C或G的重复序列或其他DNA序列，优选地为A或T或C或G的重复序列，长度为2-10nt，更优选为2-5nt。

在一个示例中，所述双链接头包括第一条链和第二条链。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的5’端进行磷酸化修饰。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的的5’端进行生物素化(bioten)修饰。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的的5’端既有间臂(spacer)修饰又有生物素化(bioten)修饰。优选地，所述间臂(spacer)修饰位于所述第一条链的3’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰与生物素之间用TEG进行连接。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的的3’端进行磷酸化修饰。

在一个示例中，所述双链接头中，第一条单链的3’端进行硫代修饰。

在一个示例中，所述双链接头中，第二条单链的长度为10-70nt。优选为10-30nt。再优选为10-25nt。

在一个示例中，所述双链接头中，第二条单链的的退火温度为10-100℃。优选为20-80℃。再优选为30-60℃。

在一个示例中，所述双链接头中，第二条单链的的5’端进行间臂(spacer)修饰。优选地，采用C3Spacer或C6Spacer或Spacer C12或Spacer 12或Spacer C18的修饰。再优选地，所述第二条单链的5’端采用1-10个Spacer C12或1-10个C18Spacer或1-10个C3Spacer或1-10个C6Spacer的修饰。再优选地，所述第二条单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列与C3Spacer或C6Spacer或Spacer 12或Spacer 12或Spacer C18的修饰的组合。优选地，采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列个数为2-8个为佳。

在一个示例中，所述第二条单链的3’端进行生物素化(bioten)修饰。

在一个示例中，所述二条单链的3’端既有间臂(spacer)修饰又有生物素化(bioten)修饰。

在一个示例中，所述间臂(spacer)修饰可位于所述第二条单链的5’末端端序列与生物素化(bioten)修饰之间。再优选地，所述间臂(spacer)修饰与生物素之间用TEG进行连接。

在一个示例中，所述第二条单链的3’端进行硫代修饰。

在一个示例中，所述第二条单链的3’端进行磷酸化修饰。

在一个示例中，所述步骤(5)中，扩增时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、扩增引物。

在一个示例中，所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶等中一种或几种酶的组合。所述dNTPs可以是2.5mM的也可以是10mM的也可以是其他浓度的。本领域技术人员可根据实际需要来选择适合的浓度，只要不限制本发明的目的即可。

在一个示例中，所述DNA聚合酶缓冲液为对应所选聚合酶而选用的最佳匹配缓冲液。

在一个示例中，所述扩增引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

本领域技术人员所知晓的是，前述DNA建库方法用于样本基因组DNA测序。

因此，本发明还提供一种样本基因组DNA测序方法，包括如下步骤：采用前述方法建立文库后，对所获得的文库进行测序。

在一个示例中，所述测序可以是一代测序、二代测序或三代测序。

在一个示例中，所述测序的平台可以是illumina测序平台。

相比于现有技术中的随机引物扩增法，采用本发明的新型DNA建库方法进行DNA建库，可直接采用连接酶引入黏性末端接头序列，因此，能确保一条DNA的分子链来源于模板链的同一区域，从而实现后续比对到参考基因组时能采用更精确的双端比对的模式，增加数据的准确性。

相比于现有技术中利用circligase进行单链连接的扩增方式，采用本发明的新型DNA建库方法进行DNA建库，可采用更经济实用的普通连接酶例如T4DNA连接酶进行接头连接。这些普通的连接酶价格便宜，且对目的DNA片段没有选择性，能更大限度的保留样品的多样性，缩小由于人为原因造成的文库偏向性。

采用本发明的新型DNA建库方法进行DNA建库，操作灵活，可根据需要采用特异性黏性末端接头直接连接单链DNA，经过扩增得到的扩增子适用于后续的一系列应用，如可以用于构建一代测序文库，也可以用于构建二代测序文库，也可以构建三代测序文库，也可以用于qPCR模板的建立、还可以用于短片段DNA的克隆等。使用者可以根据构建的测序文库的类别，采用相应的PCR进行扩增，以构建不同的测序文库。

需要说明的是，采用本发明的新型DNA建库方法进行DNA建库的起始样本可以为一个细胞的基因组，仅用于说明而非限定。容易理解的是，所述起始样本也可以是多个细胞的基因组。

采用本发明的新型DNA建库方法进行DNA建库可覆盖全基因组，包括高GC区域或GC含量平衡的区域以及高AT含量区域；除了基因组启动子区域还包括增强子、转录起始位点、非编码区(UTR)、外显子、基因间区段(intergenic)、基因体(gene body)等，对全基因组进行检测。

下文以具体实施例1对本发明实施例的技术方案进行更具体地说明。

实施例1

一、试验准备

(一)、黏性末端接头合成：

所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端至少包括随机序列。

1、作为示例，采用Primer1和Primer2合成黏性末端接头，

Primer1：5’-AGATCGGAAG-3’-bioten(SEQ ID NO.1)；

Primer2：5’-CTTCCGATCTNNNNNN-3’(SEQ ID NO.2)；其中，NNNNNN表示随机序列，通常所述随机序列的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。

2、按下表1加入配置反应液：

表1

试剂	体积(ul)
		Primer1(10μM)	1
Primer2(10μM)	1
		TE buffer	7
5M NaCl	1
		总体积	10

其中反应中采用的TE buffer也可以被水、Tris-Hcl(0.05mM，PH7.0-8.0)等具有相似功能的缓冲液所替代。

3、按下表2进行反应：

表2

温度	时间	循环数
			95℃	60s	1
95℃-16℃	0.5℃/s	1
			16℃	forever	1

获得黏性末端接头：

5’-CTTCCGATCT-NNNNNN-3’

bioten-3’-GAAGGCTAGA-5’。可转存于-20℃保存。

亦即，示例性地，Primer2和Primer1一起形成了黏性末端接头，所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端包括随机序列NNNNNN，通常所述随机序列NNNNNN的长度为2-30nt，优选的为4-20nt，更优选的为5-10nt。若将带有第一黏性末端的单链称为第一条链，不带有第一黏性末端的单链称为第二条链，则第二条链的3’进行了bioten修饰。在此示例中，所述黏性末端接头的另一端为平末端。

表2中的反应条件只是作为示例，也可以采用类似的方案进行，总体原则为先高温变性后缓慢退火形成互补的DNA双链。

(二)、双链接头的准备

所述双链接头的末端为平末端或黏性末端。

1、作为示例，双链接头由Primer3和Primer4制备而成，为一黏性末端。

Primer3：5’-CTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.3)；

Primer4：5’-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG-3’(SEQ ID NO.4)；

Primer3在3’端优选地采用磷酸化修饰的C，更优选地可以采用双脱氧核糖核酸的C进行引物的合成；Primer4可以选择进行硫代修饰或不进行硫代修饰，优选的为进行硫代修饰，更优选的为硫代修饰3’端的3个碱基；primer4的5’端优选地采用磷酸化修饰。

2、按下表3加入配置反应液：

表3

试剂	体积(ul)
		Primer3(10μM)	5
Primer4(10μM)	5
		TE buffer	9
5M NaCl	1
		总体积	20

3、按下表4进行反应：

表4

温度	时间	循环数
			95℃	60s	1
95℃-16℃	0.5℃/s	1
			16℃	forever	1

获得双链接头可转存于-20℃保存。

上表5中的反应条件只是作为示例，也可以采用类似的方案进行，总体原则为先高温变性后缓慢退火是互补的DNA双链结构。

(三)所用到的连接酶、DNA延伸试剂、DNA扩增试剂可通过商业购买途径获得。

具体地，所述DNA延伸试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、延伸引物。

所述延伸引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

作为示例，所述延伸引物使用：

Primer5：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.5)。

所述DNA扩增试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、扩增引物。

所述扩增引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。所述非黏性部分是指黏性末端接头的双链部分。

作为示例，所述扩增引物使用：

Primer6：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQID NO.6)；

Primer7：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATtgccgaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.7)。

二、采用本发明的DNA建库方法对样本基因组DNA进行文库建立

(一)对样本的基因组DNA进行去磷酸化，防止样本的基因组DNA之间的自连，这一步骤为可选步骤

具体地，按下表5加入配置反应液：

表5

试剂	体积(ul)
		10x T4DNA ligation buffer	4
1％Tween 20	1
		FastAP(1U/μl)	1
样本的基因组DNA(6pg-100ng)	14
		总体积	20

这里的样本的基因组可以是采用细胞裂解液对单细胞样本裂解或采用基因组DNA抽提试剂对多细胞样本抽提获得。也可以采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。

(二)对样本的基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA

具体地，将样品轻弹混匀后，按下表6进行反应：

表6

将样品立即转移到冰上。

(三)单链DNA通过连接酶与黏性末端接头进行连接，获得获得一端带有接头的单链DNA

具体地，按下表7加入配置反应液：

表7

试剂	体积(ul)
		50％PEG-4000	4
100mM ATP	0.1
		本实施例中获得的黏性末端接头	1
T4DNA连接酶	1
		无核酸水	13.9
总体积	20

轻弹混匀，总体积40ul。

然后，按下表8进行反应：

表8

温度	时间	循环数
			37℃	30min	1
95℃	5min	1
			4℃	forever	1

可将样品于-20℃保存，或直接进行下一步反应。

如图3所示，采用3％琼脂糖凝胶电泳检测单链DNA与带黏性的双链接头的连接率。其中，阴对：未加连接酶的阴性对照，10ng；1：表示1号样品，10ng；2：表示2号样品，50ng；3：表示3号样品，100ng。S+A：连接成功的样品加上接头，产物长度大于样品故在胶上显示跑的较慢；S：样品，未连接接头，分子量较小，故在胶上显示跑的较快；A：接头。从图3可以看出，在不同样品起始量时，都有较好的连接结果，在样品起始量低时基本可完全连接上接头。在样品量升高时，有部分样品没能连接成功，但是由于接头已被耗尽，故提高接头含量可提高量样品的连接率。

DNA样品在与带有黏性的双链接头连接时，可以不用FastAP进行处理，优选的为利用FastAP进行处理。反应中采用的1％Tween 20可以被同浓度的NP40、triton x-100所替代；T4DNA连接酶可以由其他具有双链或单链连接酶活性的酶所替代，优选地有HiFi TaqDNA连接酶、T4RNA连接酶2、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4RNA连接酶、Circligase ssDNA ligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶、T4RNALigase。优选地使用T4DNA连接酶。

(四)、磁珠捕获获得一端带有接头的单链DNA，此步骤可视具体情况选择，为可选步骤

1、将链霉亲和素修饰的磁珠，在室温至少平衡30分钟，涡旋混匀。

2、取20ul的beads到1.5ml的EP管中(20ul/样品)。

3、Beads用500μl的1xBinding buffer(1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mMEDTA(pH8.0),0.05％Tween-20，0.5％SDS)洗涤2次。

4、将beads重悬于100ul的1xBinding buffer。

5、将样品(40ul)在95℃加热1min，迅速转移到冰上，放置至少2-5min。

6、将样品与洗涤完成的beads混匀。

7、在室温孵育40min，并不断混匀。

8、瞬离，将EP管放置在磁力架上，去除上请。

9、加入200μl的wash bufferI(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)，涡旋8s使beads重悬。

10、瞬离，将EP管转移到磁力架上，去除上清。

其中链霉亲和素修饰的磁珠可以是Dynabeads^TM M-280Streptavidin、Dynabeads^TM MyOne^TM Streptavidin C1、Dynabeads^TM M-270Streptavidin等商业产品，也可以是自行偶联的链霉亲和素修饰的类似磁珠样品。

(五)、一端带有接头的单链DNA进行延伸，形成一端带有接头的双链DNA

具体地，按下表9加入配置反应液：

表9

试剂	体积(ul)
		10x Klenow reaction buffer	5
10mM dNTPs	0.4
		1％Tween-20	2.5
Primer5(10μM)	1
		水	39.1
总体积	48

Primer5：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.5)。

可选的，primer5可进行硫代修饰，也可不进行硫代修饰，优选的进行硫代修饰，更优选地为整条引物进行硫代修饰，更优选地为3端的10个碱基进行硫代修饰；更优选的为3端的5个碱基进行硫代修饰；更优选地为3端的个碱基进行硫代修饰。

1.将beads转移到磁力架上，去除上请。

2.加入上表9中的混合物，涡旋使beads充分混匀。

3.将样品转移到95℃，2min。

4.迅速转移到冰上，至少放置2-5min。

5.将样品在室温转移到EP管中。

6.加入2ul的Klenow fragment(10U/μl)，混匀，将beads重悬。

7.25℃孵育5min，每60s混匀2s，1500rpm。

8.35℃孵育25min，每60s混匀2s，1500rpm。

其中Klenow fragment也可以被其他的聚合酶所替代，如：vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶，大片段、T4DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，全长、Bst DNA聚合酶，DeepVentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶等一种或几种酶的组合。

上述反应体系只用于实例展示，而不用于限定。

(六)、扩增后清洗，为可选步骤

1.样品瞬离，转移到磁力架上，去除上清。

2.加入200μl的wash bufferI(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)，涡旋8s使beads重悬。

3.将样品混匀，瞬离，转移到磁力架上，去除上清。

4.加入100μl的wash buffer II(0.5xSSC,PH7.0)。

5.将样品室温孵育3min。

6.瞬离，转移到磁力架上，去除上请。

7.加入200μl的wash bufferI(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)，涡旋8s使beads重悬。

上述清洗方案只用与实例展示而不用于限定。

(七)、采用双链接头连接到一端带有接头的双链DNA的另一端，形成双端带有接头的双链DNA

按下表10加入配置反应液：

表10

试剂	体积(ul)
		10x T4DNA ligase buffer	5
50％PEG-4000	5
		双链接头(10uM)	2
1％Tween-20	2
		T4DNA ligase(5U/μl)	2
水	34
		总体积	50

1.将beads去上清，用上表10中的mix混匀。

2.将样品在25℃孵育1h，孵育时注意混匀。

T4DNA连接酶可以由其他具有双链或单链连接酶活性的酶所替代，优选地有HiFiTaq DNA连接酶、T4RNA连接酶2、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、Circligase ssDNA ligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶、T4RNA Ligase等一种或几种酶的组合。优选地使用T4DNA连接酶。

(八)、连接后洗涤及样品洗脱

1.将样品瞬离，转移到磁力架上，去除上请。

2.加入200μl的wash bufferI(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)。

3.将样品混匀。

4.瞬离，转移到磁力架上，去除上清。

5.加入100μl的Stringency wash buffer(0.1xSSC and 0.1％SDS)。

6.将样品在45℃，孵育3min。

7.瞬离，转移到磁力架上，去除上请。

8.加入200μl的wash bufferI(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)，涡旋8s使beads重悬。

9.将样品转移到混匀，转移到磁力架上，去除上请。

10.加入50μl的无核酸水。

11.将样品在室温孵育10min后，95℃加热2min。

12.将样品转移到磁力架上，将上清转移到干净的低吸付的EP管中。

上述双链接头连接方案只用于实例说明，而不用于限定。

(九)、双端带有接头的双链DNA进行扩增(可选步骤)

按下表11混合pcr扩增原料：

表11

样品	体积(ul)
		KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x)	25
Primer6(10μM)	1
		Primer7(10μM)	1
NF water	23
		总体积	50

将洗脱的样品或直接带着磁珠进行下列反应(每个样品可做2个或多个平行的PCR扩增反应，可增加样品的产量)。

混匀样品，按下表12进行扩增：

表12

Primer6：

Primer7：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATtgccgaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.7)；

其中下划线部分为index序列，可以替换为其他的index序列，具体可参考illumina测序仪器适用的index序列。

如果不需要进行文库测序，只是进行扩增，则可利用以下引物进行：

Primer8：5’-CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.8)；

Primer9：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.9)；

其中可选取Primer8或Primer9的全长引物进行扩增，也可以是选取其中的一部分作为PCR引物，优选的选用全长引物进行扩增。

其中KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x)也可以由其他聚合酶所替代，如ventDNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶，大片段、T4DNA聚合酶、Klenow)片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，全长、Bst DNA聚合酶，DeepVentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、KAPA HiFi Uracil+ReadyMix(2x)、PfuTurbo Cx热启动DNA聚合酶等一种或几种酶的组合。

上述反应只用于实例展示，而不用于限定。

(十)、Ampure XP beads纯化样品

1.将AMPure XP BeadsDNA纯化磁珠在室温平衡至少30min。

2.取40μlDNA纯化磁珠Agencourt AMPure XP Beads到50μl的样品中，涡旋混匀。若同一样品进行了平行的PCR反应，可将多个样品混合成一管。其中DNA纯化磁珠AgencourtAMPureXP Beads的用量可更具需要进行调整，优选的为40-50ul。

3.室温放置5min，使样品与DNA充分结合。

4.将样品转移到磁力架上，待样品澄清后弃去上清。

5.用新鲜的200ul 80％(vol/vol)的乙醇(现配现用)，清洗beads，可上下颠倒，转动EP管，使洗涤充分。

6.弃去上清。

7.用新鲜的200ul 80％(vol/vol)的乙醇(现配现用)，清洗beads，可上下颠倒，转动EP管，使洗涤充分。弃去上清。

8.瞬离一次，待样品澄清后弃去残留乙醇。

9.室温开盖等待，使乙醇充分挥发，至表面出现小裂痕。(不可过干或有乙醇残留)。

10.加入适量的无核酸水，与样品充分混匀。

11.在室温孵育至少2min。

12.将上清转移至干净的NF的EP管中，余2ul进行定量与质检。

其中DNA纯化磁珠可以是AMPure XP Beads可以由等其他具有相同功效的磁珠替代，除了可以用磁珠纯化样品，也可以采用具有相同功效的方法或方案替代。

本实施例文库出库芯片检测结果图如图4所示，安捷伦2100高灵敏芯片检测文库出库后的片段大小，X轴为片段大小，Y轴为荧光强度。该文库的大小为100bp-400bp，其中分布在220bp左右的片段达到峰值。

下机数据质控分析，如表13所示：

表13

样品名称	样品来源	数据量(G base)	测序模式	产量(ng)	Q20	Q30	map_rate
								Sample1	FFPE样本	1.05	PE150	356	79.59	75.91	21.18％
Sample2	FFPE样本	1.11	PE150	653	80.12	76.64	20.71％
								Sample3	FFPE样本	1.13	PE150	643	83.75	80.79	20.36％
Sample4	FFPE样本	1.06	PE150	581	93.74	87.66	62.83％
								Sample5	FFPE样本	1.23	PE150	573	93.75	87.68	62.88％
Sample6	FFPE样本	1.15	PE150	652	94.3	88.6	62.41％

如果某碱基质量值为20(Q20)，则表示该碱基测序出错的概率为0.01。如果某碱基质量值为30(Q30)，则表示该碱基测序出错的概率为0.001。Map_rate：能回帖到基因组的数据占下机数据的比例。Sample1、Sample2、Sample3、Sample4、Sample5、Sample6的样品来源为FFPE样本提取的DNA，平均分为6份，每份20ng。Sample1、Samp1e2、Sample3采用常规illumina双链连接的方案进行建库(具体采用试剂盒如：IlluminaSamplePreparation Kits；Custom Amplicon orAmplicon–Cancer Panel；Targeted RNA Expression；HT Sample Prep Kits；v1/v2/LTSample Prep Kits；Synthetic Long-Read DNA Library Prep Kits；Small RNA Sample Prep Kits；DNA Sample Prep Kit；Multiplexing SamplePrep Oligo Only Kit；v1and v1.5Small RNA Kits；Sample PreparationKits)，而Sample4、Sample5、Sample6采用本发明中的新型DNA建库方法通过单链DNA与黏性末端接头连接的方式进行建库。从表13中可知两种方案，产量相当，但是在数据质量上采用本发明中的新型DNA建库方法通过单链DNA与黏性末端接头连接的方式进行建库的方式明显优于常规illumina双链连接的方案。

此外，平行样本分别采用常规双链建库的方案和本发明的方案构建文成的文库，利用完全相同的实验条件，利用相对定量的方式鉴定文库分子的含量的结果图，如图5所示经过3次重复试验，单链DNA的连接方式比双链DNA连接方式约提高2倍的分子数量。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 上海美吉生物医药科技有限公司

<120> 一种新型DNA建库方法及其应用

<130> 176212

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatcggaag 10

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttccgatct nnnnnn 16

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttccgatc 9

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcggaaga gcgtcgtgta gg 22

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agattgccga gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ct 32

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33

Claims

1.一种DNA建库方法，包括如下步骤：

(1)对样本基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA；

2.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述样本基因组DNA来自单细胞样本或多细胞样本。

3.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头为带有黏性末端的双链接头，所述黏性末端接头的一端为第一黏性末端，所述第一黏性末端至少包括随机序列。

4.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头的另一端为平末端或第二黏性末端。

5.根据权利要求4所述的DNA建库方法，其特征在于，当所述黏性末端接头的另一端为第二黏性末端时，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述第二黏性末端为A或T或C或G的重复序列；(2)所述第二黏性末端的长度为2-10nt，优选为2-5nt。

6.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述第一黏性末端包括随机序列及特殊序列。

7.根据权利要求6所述的DNA建库方法，其特征在于，所述特殊序列为序列确定的序列。

8.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述第一黏性末端的长度为2-30nt，优选为4-20nt，更优选为5-10nt。

9.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的长度为10-70nt，优选为10-30nt，更优选为10-25nt。

10.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的退火温度为10-100℃，优选为20-80℃，更优选为30-60℃。

11.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行磷酸化修饰；(2)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行间臂(spacer)修饰；(3)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端进行氨基修饰；(4)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的5’端采用甲基化修饰的重复A/T/C/G序列；(5)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行生物素化修饰；(6)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行间臂(spacer)修饰；(7)所述黏性末端接头中，带有第一黏性末端的单链的3’端进行氨基修饰。

12.根据权利要求3所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，不带有第一黏性末端的那条单链称为另一条单链。

13.根据权利要求12所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，另一条单链的长度为10-70nt，优选为10-30nt，更优选为10-25nt。

14.根据权利要求13所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端接头中，另一条单链的退火温度为10-100℃，优选为20-80℃，更优选为30-60℃。

15.根据权利要求12所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行磷酸化修饰；(2)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行间臂(spacer)修饰；(3)所述黏性末端接头中，另一条单链的5’端进行氨基修饰；(4)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行生物素化修饰；(5)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行间臂(spacer)修饰；(6)所述黏性末端接头中，另一条单链的3’端进行氨基修饰。

16.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述黏性末端接头通过连接酶连接到所述单链DNA上。

17.根据权利要求16所述的DNA建库方法，其特征在于，所述连接酶选自HiFi Taq DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、T4 RNA连接酶、连接酶、9°N^TM DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶预混液、瞬时黏性连接酶预混液、T4 DNA连接酶、Circligase ssDNA ligase、5′AppDNA/RNA热稳定连接酶中的任一种或多种。

18.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(3)中，延伸时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、延伸引物。

19.根据权利要求18所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29 DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶中一种或几种酶的组合；(2)所述dNTPs的浓度为2.5mM或10mM；(3)所述延伸引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。

20.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述双链接头的末端为平末端或黏性末端。

21.根据权利要求20所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端的长度为2-10nt，优选为2-5nt。

22.根据权利要求20所述的DNA建库方法，其特征在于，所述黏性末端可以是带有一个T的黏性末端、Y型末端或为A或T或C或G的重复序列。

23.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述双链接头包括第一条链和第二条链。

24.根据权利要求23所述的DNA建库方法，其特征在于，所述双链接头中，第一条单链的长度为10-70nt，优选为10-30nt，再优选为10-25nt。

25.根据权利要求23所述的DNA建库方法，其特征在于，所述双链接头中，第一条单链的退火温度为10-100℃，优选为20-80℃，再优选为30-60℃。

26.根据权利要求23所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述双链接头中，第一条单链的5’端进行磷酸化修饰；(2)所述双链接头中，第一条单链的5’端进行间臂(sapcer)修饰；(3)所述双链接头中，第一条单链的的5’端进行生物素化修饰；(4)所述双链接头中，第一条单链的3’端进行硫代修饰。

27.根据权利要求24所述的DNA建库方法，其特征在于，所述双链接头中，第二条单链的长度为10-70nt，优选为10-30nt，再优选为10-25nt。

28.根据权利要求23所述的DNA建库方法，其特征在于，所述双链接头中，所述双链接头中，第二条单链的的退火温度为10-100℃，优选为20-80℃，再优选为30-60℃。

29.根据权利要求23所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述双链接头中，第二条单链的的3’端进行间臂(spacer)修饰；(2)所述第二条单链的3’端进行生物素化修饰；(3)所述第二条单链的3’端进行硫代修饰；(4)所述第二条单链的3’端进行磷酸化修饰。

30.根据权利要求1所述的DNA建库方法，其特征在于，所述步骤(5)中，扩增时所用试剂选自DNA聚合酶、dNTPs、DNA聚合酶缓冲液、扩增引物。

31.根据权利要求30所述的DNA建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述DNA聚合酶选自vent DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Therminator^TM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29 DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentR^TM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶中一种或几种酶的组合；(2)所述dNTPs的浓度为2.5mM或10mM；(3)所述扩增引物的序列与黏性末端接头的任意一条链的非黏性部分的序列全部或部分互补。

32.如权利要求1-32任一项所述DNA建库方法用于样本基因组DNA测序中的用途。

33.一种样本基因组DNA测序方法，包括如下步骤：采用如权利要求1-32任一项所述DNA建库方法建立文库后，对所获得的文库进行测序。