CN105506125A - 一种dna的测序方法及一种二代测序文库 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA的测序方法及一种二代测序文库。本发明的测序方法经过待测DNA片段和随机引物Read2-NB混合进行延伸反应，将所得延伸产物的3’端与双链接头Read1-Adapter中含测序平台特异序列的b链连接，取特定引物T1和T2扩增连接产物，从而完成二代测序文库的构建，随后进行测序。本发明可以对双链DNA和/或单链DNA进行文库构建和测序，所需起始DNA量降低，针对模板DNA有限的样品的适用型强，并且从测序结果可直接区分出目标单链DNA原始模板序列。

Description

一种DNA的测序方法及一种二代测序文库
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种DNA测序方法以及一种二代测序文库。
背景技术
生命的遗传物质主要以DNA双螺旋结构存在，少量的以单链DNA、单链RNA、双链RNA的结构存在。为了揭开生命的遗传信息，需要对各种形式的遗传物质进行测序，即对单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA进行基因测序。
双链形式的DNA在复制、损伤修复、变性或其他特定处理时会短暂的保持在单链DNA的形式，相关研究人员需要对此特定序列进行测序研究。另外，遗传物质为单链DNA的生物以病毒为主。截止至2015年9月6日，已发表的单链DNA病毒基因组为827个，其中733株经鉴定分属于7个科，94株未分类到现有病毒科属中。要想对上述这些DNA进行研究，关键在于如何进行单链DNA的测序。
目前研究者开发出各种二代测序平台的建库方法，其研究对象主要为双链DNA与单链RNA。在二代测序平台上进行单链DNA的基因组测序时，方法较少，目前主要采用随机引物扩增法与单链DNA连接法进行文库构建。
采用随机引物扩增法与单链DNA连接法，研究者已完成一些遗传物质为单链DNA的生物的测序。
随机引物扩增法是通过随机引物的扩增，将单链DNA扩增成为双链DNA，后续进行常规的二代双链DNA测序的文库构建：先进行末端补平，使得目的片段的末端变为平末端，再在3’末端加dATP，形成3’末端的一个A碱基突出，再通过T4连接酶进行连接，将二代测序接头连接至目的片段的两端，最后通过特定引物的扩增，扩大和富集目标序列，完成二代测序文库的构建。该方法得到的测序结果在进行拼接时，需要有参考序列以确定目标单链DNA的正义链与反义链。在进行无参考序列的基因组拼接时，无法通过测序结果直接区分目标单链DNA的正义链与反义链。
单链DNA链接法是先进行单链DNA连接，对连接接头的5’端进行腺苷酸修饰，3’端进行锁核苷酸修饰，单链连接酶将接头的5’端与目标单链DNA的3’端连接，使得目标单链DNA的3’端带有特异序列。接着，用与3’端特异序列互补序列作为引物，将目标单链DNA合成为双链DNA，合成结果为目标序列变为双链DNA。接着用T4连接酶在目标序列的5’端连接上接头，使得目标序列的3’端和5’端都带有特异序列。最后，通过特定引物的扩增，扩大和富集目标序列，完成二代测序文库构建。3’末端进行单链DNA连接的效率很低，使得该方法的建库效率低，因此该方法对起始DNA量要求较高，不适用模板量有限的样本。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的单链DNA测序中无法通过测序结果直接区分目标单链DNA的正义链与反义链以及对起始DNA模板量要求高的缺陷，提供一种DNA的测序方法，该方法不仅能通过测序结果直接区分出目标单链DNA原始模板序列，而且对起始DNA模板量要求较低。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是，一种DNA的测序方法，包括以下步骤：
(1)将长度为200bp-700bp的待测DNA片段和随机引物Read2-NB混合进行延伸反应，获得待测DNA片段的互补延伸产物，即5’端延伸了随机引物序列的待测DNA片段的互补链；
(2)将步骤(1)所述的待测DNA片段的互补延伸产物和双链接头Read1-Adapter混合，变性，加入DNA连接酶进行连接反应，获得在步骤(1)所述的待测DNA片段的互补链的3’端连接了双链接头Read1-Adapter中含测序平台特异序列的b链的3’连接产物；
(3)取特定引物T1和T2，对步骤(2)所述的3’连接产物进行扩增，得到扩增产物，即测序文库；
(4)将步骤(3)所述的测序文库进行上机测序。
步骤(1)中，所述的随机引物Read2-NB的核苷酸序列如5’-D1-(m)x-D2-(n)y-3’，或者5’-D2-(n)y-3’所示，D1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’)的第1位～第24位中的任一位至第24位；(m)x是本领域常规的标记序列即index，用以标记不同的被检样本，m选自A、T、G或C，x为m的个数，x为6、8、10或者12，(m)x中每个m可以同时或者不同时选自A、T、G或C；D2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’)；(n)y为随机序列，n选自A、T、G或C，y为n的个数，y为6～12的整数。所述的随机引物Read2-NB的核苷酸序列较佳地如5’-D2-(n)y-3’所示，y为6～12的整数，更佳地其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，即核苷酸序列如5’-D2-(n)y-3’所示，y为6时所得的随机引物。
步骤(2)中，所述双链接头Read1-Adapter由a链和b链组成，所述a链的核苷酸序列如5’-Ta-(n)z-3’所示，Ta的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)的第1位～第26位中的任一位至第58位；(n)z为随机序列，其中，n选自A、T、G或C，z为n的个数，z为6～12的整数，较佳的所述a链核苷酸序列的z为6，更佳的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示即如5’-Ta-(n)z-3’所示的核苷酸序列，Ta的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第26位至第58位，z为6。所述b链的核苷酸序列与Ta的核苷酸序列反向互补配对。所述双链接头Read1-Adapter由上述a链和b链组成，较佳的其a链的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，b链的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
随机引物Read2-NB中的D1和D2为Illumina测序平台特定序列，双链接头Read1-Adapter中的b链也是适用于Illumina测序平台的特异序列，因此，本发明的测序方法适用于Illumina测序平台。
本发明的测序方法还可以适用于其他测序平台，分别为454测序平台、Itron测序平台、华大的CG测序平台，只需要将所需的测序平台特定序列替换为不同的常规测序平台所使用的与之对应的常规序列即可。
步骤(3)中，所述的T1的核苷酸序列如5’-Tc-3’所示，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第17位～第58位中的任一位。所述T1的3’端与所述Read1-Adapter的a链的5’端存在一段核苷酸序列相同的片段，长度为17～58bp，较佳地为15～33bp，更佳地为18～27bp，最佳的为20bp。较佳的，所述的T1的核苷酸序列如5’-Tc-3’所示，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第25位～第58位中的任一位；更佳的，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第42位～第58位中的任一位；最佳的，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第45位即P1，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。
步骤(3)中，所述的T2的核苷酸序列如5’-TD1-(m)x-TD2-3’或5’-TD1-3’所示；TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第17位～第24位中的任一位；(m)x是本领域常规的标记序列(index)，用以标记不同的被检样本，m选自A、T、G或C，x为m的个数，x为6、8、10或者12，(m)x中每个m可以同时或者不同时选自A、T、G或C；TD2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第34位中的任一位。所述T2的3’端与所述Read2-NB的5’端存在一段核苷酸序列相同的片段，长度为17～70bp，较佳地为15～30bp，更佳地为18～27bp，最佳的为21bp。所述的T2的核苷酸序列较佳的如5’-TD1-(m)x-TD2-3’所示；TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第24位；x为6、8、10或者12，D2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第17位中的任一位。所述的T2的核苷酸序列更佳的如5’-TD1-(m)x-TD2-3’所示，TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第24位组成；x取值为6，TD2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第17位中的任一位。所述的T2核苷酸序列最佳的为P2，其核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。
本发明中，步骤(1)为：将长度为200bp-700bp的待测DNA片段和随机引物Read2-NB混合进行延伸反应，获得待测DNA片段的互补链，所述互补链的5’端包括随机引物序列。
步骤(1)中，所述待测DNA片段为常规的，可以是单链DNA片段，也可以是双链DNA片段，也可以同时包括单链DNA片段和双链DNA片段，较佳的为单链DNA片段。较佳地，所述待测DNA片段的长度为200bp-700bp，较佳的为400bp。所述待测DNA片段的制备为常规的，较佳的为大于700bp的起始DNA模板随机打断得到或实验所得短链DNA片段，更佳地为染色质免疫共沉淀技术(ChIP)捕获到的短链DNA片段。所述起始DNA模板随机打断使用的是常规方法，较佳为使用CovarisM220进行打断。所述随机打断得到的片段大小为200bp-700bp。
步骤(1)中，所述的混合是常规的，较佳的混合均匀即可。所述的延伸反应是常规的，较佳的在反应体系中加入DNA聚合酶和dNTP在PCR仪上进行即可。
步骤(1)中，较佳的，在步骤(1)中所述的混合之后进行延伸反应之前还包括变性的步骤，所述变性是常规的，较佳的为95℃孵育1-5分钟。当待测DNA是双链DNA时，变性步骤使之变性为单链DNA。
步骤(1)将含有测序平台特异序列的随机引物加入到待测DNA片段的互补链的5’端。
本发明中，步骤(2)为：将步骤(1)所述的待测DNA片段的互补链和双链接头Read1-Adapter混合，变性，加入DNA连接酶进行连接反应，获得在步骤(1)所述的待测DNA片段的互补链的3’端连接了双链接头Read1-Adapter中含测序平台特异序列的b链的3’连接产物。
步骤(2)中，所述混合是常规的，较佳的混合均匀即可。所述变性是常规的，较佳为95℃孵育1-5分钟，最佳地为在PCR仪中95℃孵育1-5分钟。所述的连接反应是常规的，较佳的是16℃，1h。所述的DNA连接酶是常规的，较佳的是T4DNA连接酶。较佳的，在步骤(1)所述扩增的扩增体系中加入双链接头Read1-Adapter混合即可进行所述的变性。
本发明步骤(2)中，较佳的，所述的连接反应完成后，还包括将连接产物分离纯化的步骤。所述的纯化的方法是常规的，较佳的是磁珠纯化。
步骤(2)将双链接头Read1-Adapter中含测序平台特异序列的b链连接到待测DNA片段的互补链的3’端。
本发明中，步骤(3)为：取特定引物T1和T2，对步骤(2)所述的3’连接产物进行扩增，得到扩增产物，即测序文库。
步骤(3)中所述的扩增为常规方法，较佳为PCR，较佳的循环数是10-20个。
较佳地，所述的扩增完成后，还包括将所述扩增所得的扩增产物进行富集的步骤，所述的富集为常规方法，较佳为使用磁珠纯化或者凝胶回收，最佳地使用AgencourtAmpureXPbeads(BeckmanCoulter,cat.no.A63881)进行回收，或者使用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN，cat.no.28104)进行回收。
步骤(3)所述的扩增，富集了步骤(2)获得的3’连接产物，所得的扩增产物，即测序文库。
本发明中，步骤(4)为：将步骤(3)所述的测序文库进行上机测序。
步骤(4)中，所述上机测序是常规的，较佳为在二代测序平台上机测序，如在Illumina测序平台、454测序平台、Itron测序平台或华大的CG测序平台进行测序，最佳地为在Illumina测序平台上机测序。当使用的随机引物是含有某测序平台的特有接头序列(特定序列)时，上机测序即在该测序平台进行。本发明所述的测序方法，较佳的还包括将测序结果进行组装和/或拼接的步骤。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二是：一种二代测序文库，所述测序文库是由包括前述步骤(1)、(2)和(3)的方法制备而得。
本发明中，所述测序文库其他特征同前文所述。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明可以对双链DNA和/或单链DNA进行文库构建和测序。本发明可以用于进行宏病毒基因组研究，可以在一次建库中同时完成双链DNA和单链DNA病毒的文库构建，一次性覆盖全部DNA病毒。本发明可以对ChIP捕获的单链DNA和双链DNA进行建库测序。
(2)本发明的单链DNA文库构建是链特异的，当目标为单链DNA时，能在测序结果直接区分出目标单链DNA原始模板序列，在进行单链DNA如病毒基因组测序时，可以在无参考基因组辅助的拼接时直接明确病毒的正义链。
(3)本发明随机引物Read2-NB包括多个n构成的随机序列，通过退火后延伸的方式在待测DNA片段互补链的5’端加入了测序平台特异序列。由于随机引物Read2-NB含有多个n构成的随机序列，其与单链DNA互补，因此，退火后，同一条单链DNA可以结合多条随机引物Read2-NB，经过延伸得到的产物相当于目标单链DNA进行了1次线性扩增，因此，运用该方法进行文库构建，在使用相同的起始DNA量时，最后一步PCR时所需要的循环数将比常规方法低2-3个循环，运用本方法进行文库构建时，起始DNA量可以降低到10ng，针对模板DNA有限的样品的适用型强。
(4)本发明双链接头Read1-Adapter为3’末端带有多个n的粘性末端的双链DNA，可以与延伸产物的单链DNA的3’末端通过互补形成双链后，进行连接，与单链DNA的连接相比，其连接效率显著提高。同时，双链接头Read1-Adapter的最后一个n为锁核苷酸修饰，提高了Read1-Adapter的退火温度，增强了Read1-Adapter与目标单链DNA的3’末端的结合能力，进一步增加连接效率。另外，双链接头Read1-Adapter最后一个n为锁核苷酸修饰，使得DNA聚合酶无法延其3’末端方向进行延伸，因此，即使连接纯化后存在Read1-Adapter的残留，也无法在后续PCR反应中参与扩增，提高后续PCR的扩增效率。因此，本发明测序文库构建的成功率高。
(5)本发明操作步骤更加简洁，其使用的试剂更少、时间更短，其试剂成本和人力成本更具优势。
附图说明
图1为本发明测序方法的原理图示。
图2为目的片段扩增产物电泳结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中所述的“室温”是指常规的室内温度，一般为15-30℃。
实施例1DNA样本制备
待制备样本为病毒单链DNA，使用QIAampUltraSensVirusKit(QIAGEN)进行DNA抽提。步骤如下：
1)在5％牛胎血清中用NL-DK1细胞培养单链DNA病毒(Canineparvovirus犬细小病毒)，取培养液1ml至2mlEP管中，再加入0.8mlBufferAC，加入5.6μlcarrierRNA，混匀；
2)混匀的样本室温放置10分钟；
3)1200×g离心3分钟，丢弃上清液；
4)加入300μl60℃预热好的BufferAR和20μl蛋白酶K，混匀至沉淀完全悬浮在液体中；
5)40℃孵育10分钟，其中，每隔5分钟混匀一次样本；
6)加入300μlBufferAB，混匀；
7)将混合液体加入到吸附柱中，3000-5000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱转移至新的2mlEP管中；
8)向吸附柱中加入500μlBufferAW1，6000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱转移至新的2mlEP管中；
9)向吸附柱中加入500μlBufferAW2，20000×g离心3分钟，弃废液，将吸附柱转移至新的1.5mlEP管中；
10)向吸附柱中加入30μlBufferAVE，6000×g离心1分钟，将离心得到的液体再次加入到吸附柱中，6000×g离心1分钟，得到的液体即病毒单链DNA。
使用CovarisM220进行打断，取100ng样品DNA进行打断，目标300bp，入射功率50W，负载周期20％，循环200次，运行时间65s，温度20℃，体积130μl。打断结果进行磁珠纯化，向打断后体系中加入1倍体积即130μl纯化磁珠AgencourtAmpureXPbeads(BeckmanCoulter,cat.no.A63881)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入30μlddH2O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的随机打断产物。
实施例2二代测序文库的构建及测序
测序方法的原理示意见图1。
1)互补延伸：
在反应管中加入如下反应体系：
进行如下反应程序：95℃1-5min；25℃10min；37℃暂停，加入以下试剂后继续反应；
在反应管中加入Klenow(NEB)0.5μl；
进行如下反应程序为：37℃30min；70℃10min；10℃保存，即得含连接了特定序列的病毒单链DNA互补链的反应产物。
上述加入反应管中的DNA为实施例1中制备的病毒单链DNA，上述Read2-NB-1(SEQIDNO:4)为与病毒单链DNA互补的随机引物，核苷酸序列如下：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnn-3’。
经过上述步骤，将随机引物Read2-NB-1和病毒单链DNA互补链的5’端连接。
2)连接双链接头：
在反应管中加入如下反应体系：
步骤1)反应产物20μl
Read1-Adapter-1(5-20P)2μl
进行如下反应程序：95℃5min；16℃暂停，加入以下试剂后继续反应：
10×T4LigationBuffer(NEB)3μl
T4Ligation0.5μl
ddH2O4.5μl
进行如下反应程序：16℃1h；10℃保存。
上述反应管中加入的反应结果为步骤1)所得含连接了特定序列的病毒单链DNA互补链的反应产物，Read1-Adapter-1(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)为与含有特定序列的病毒单链DNA互补链的3’端互补的双链接头，核苷酸序列如下：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnn-3’；
5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’。
双链接头Read1-Adapter-1通过其中一条链上(Read1-Adapter-1a链)的随机序列nnnnnn与病毒单链DNA互补链的3’端互补配对，在T4连接酶的作用下将双链接头的不带有n的链Read1-Adapter-1的b链5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’连接到含有特定序列的病毒单链DNA互补链的3’端。
经过上述操作，将双链接头携带的特异序列连接到病毒单链DNA互补链的3’端。因为双链DNA的连接效率远高于单链DNA的连接效率，所以，本发明提高了建库效率，增大了成功机率，同时降低了所需的起始DNA需求量。
3)连接产物纯化
步骤2)所得连接产物进行磁珠纯化，向连接后体系中加入1倍体积即30μl纯化磁珠AgencourtAmpureXPbeads(BeckmanCoulter,cat.no.A63881)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入30μlddH2O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的连接产物。
4)目的片段的扩增
在反应管中加入如下反应体系：
反应程序如下：
98℃30s；
15cycles：
98℃10s，
65℃30s，
72℃30s；
72℃5min；
10℃∞。
上述纯化的连接产物为步骤3)中纯化的连接产物，上述引物P1(SEQIDNO:7)和P2(SEQIDNO:8)，核苷酸序列如下：
P1:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；
P2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’。
其中，引物P1与病毒单链DNA互补链的3’端连接的双链接头Read1-Adapter不带有n的链(即b链)的特异序列的部分核苷酸序列互补配对；
而引物P2与病毒单链DNA互补链的5’端连接的随机引物Read2-NB中的特定序列的部分核苷酸序列相同。
所得到的目的片段扩增样品经过电泳检验，其中，样品3μl，MarkerI(DSBIO)3μl，结果如图2，得到了目的片段的扩增产物。
5)扩增的目的片段的富集
富集方法同步骤3)中的连接产物纯化方法。
6)链特异的单链DNA测序文库构建完毕，进行Illumina上机测序。
实施例3测序结果分析
1)实施例2构建的单链DNA测序文库使用Illumina测序平台上机测序，251个循环；
2)使用以上方法，得到以下结果：共得到7073对序列，去掉重复序列和质量较低序列后，共有6893对高质量序列(即去掉重复测到的序列和质量未达到Q20序列后所得到的具有唯一特征的序列)；
3)将得到的高质量序列使用软件SOAPdenovov2.04(http://soap.genomics.org.cn/)进行组装，得到1条contig，contigN50为5323(基因组大小为5323bp)，测序所得序列覆盖全部基因组。
实施例4二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-2(SEQIDNO:9)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-2，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:10所示，为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnnn-3’；b链核苷酸序列如SEQIDNO:11所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’。
所用的引物P1替换为T1-1(SEQIDNO:12)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCAC-3’；所用的引物P2替换为T2-1(SEQIDNO:13)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCAT-3’。
实施例5二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-3(SEQIDNO:14)核苷酸序列如下：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-3，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:15所示，为5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnnnnnnn-3’；b链核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’。
所用的引物P1替换为T1-2(SEQIDNO:16)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC-3’；所用的引物P2替换为T2-2(SEQIDNO:17)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGAC-3’。
实施例6二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-4(SEQIDNO:18)核苷酸序列如下：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-4，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，为5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnnnn-3’；b链核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’。
所用的引物P1替换为T1-3(SEQIDNO:20)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；所用的引物P2替换为T2-3(SEQIDNO:21)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
实施例7二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-5(SEQIDNO:22)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-5，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:23所示，为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’；b链核苷酸序列如SEQIDNO:11所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’。
所用的引物P1替换为T1-4(SEQIDNO:24)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3’；所用的引物P2替换为T2-4(SEQIDNO:25)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’。
实施例8二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-6(SEQIDNO:26)核苷酸序列为5’-AAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-6，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:27所示，为5’-TACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’；其b链核苷酸序列如SEQIDNO:28所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTA-3’。
所用的引物P1替换为T1-4(SEQIDNO:24)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3’；所用的引物P2替换为T2-6(SEQIDNO:29)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmmmGTG-3’。
实施例9二代测序文库的构建
按照实施例2中的方法进行二代测序文库的构建。
操作步骤不变，进行如下有关序列的替换：
所用的随机引物Read2-NB-1替换为Read2-NB-7(SEQIDNO:30)核苷酸序列为5’-CGGCATACGAGATmmmmmmmmmmmmGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’。
所用的双连接头Read1-Adapter-1替换为Read1-Adapter-7，其a链核苷酸序列如SEQIDNO:31所示，为5’-ACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnnn-3’；其b链核苷酸序列如SEQIDNO:32所示，为5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGT-3’。
所用的引物P1替换为T1-5(SEQIDNO:33)核苷酸序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCT-3’；所用的引物P2替换为T2-7(SEQIDNO:34)核苷酸序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATmmmmmmmmmmmmGTGACT-3’。
实施例10二代测序文库的构建及测序
1)样本制备
取双链λDNA100ng(ThermoScientific，SD0011)，使用CovarisM220进行打断，目标300bp，入射功率50W，负载周期20％，循环200次，运行时间65s，温度20℃，体积130μl。打断结果进行磁珠纯化，向打断后体系中加入1倍体积即130μl纯化磁珠AgencourtAmpureXPbeads(BeckmanCoulter,cat.no.A63881)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入30μlddH2O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的随机打断产物。
2)互补延伸
在反应管中加入如下反应体系：
进行如下反应程序：95℃1-5min；25℃10min；37℃暂停，加入以下试剂后继续反应；
在反应管中加入Klenow(NEB)0.5μl；
进行如下反应程序为：37℃30min；70℃10min；10℃保存，即得含连接了特定序列的单链λDNA反应产物。
上述加入反应管中的DNA为以上制备的纯化的随机打断产物，上述Read2-NB-1(SEQIDNO:4)为与λDNA互补的随机引物，核苷酸序列如下：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnn-3’。
经过上述步骤，将随机引物Read2-NB-1和经变性后得到的单链λDNA互补链的5’端连接。
3)连接双链接头
在反应管中加入如下反应体系：
步骤1)反应产物20μl
Read1-Adapter-1(5-20P)2μl
进行如下反应程序：95℃5min；16℃暂停，加入以下试剂后继续反应：
10×T4LigationBuffer(NEB)3μl
T4Ligation0.5μl
ddH2O4.5μl
进行如下反应程序：16℃1h；10℃保存。
上述反应管中加入的反应结果为步骤1)所得含连接了特定序列的单链λDNA反应产物，Read1-Adapter-1(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)为与含有特定序列的单链λDNA互补链的3’端互补的双链接头，核苷酸序列如下：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnn-3’；
5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’。
双链接头Read1-Adapter-1通过其中一条链上的随机序列nnnnnn与单链λDNA互补链的3’端互补配对，在T4连接酶的作用下将双链接头的不带有n的链Read1-Adapter-1的b链5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’连接到含有特定序列的单链λDNA互补链的3’端。
经过上述操作，将双链接头携带的特异序列连接到单链λDNA互补链的3’端。因为双链DNA的连接效率远高于单链DNA的连接效率，所以，本发明提高了建库效率，增大了成功机率，同时降低了所需的起始DNA需求量。
4)连接产物纯化
步骤2)所得连接产物进行磁珠纯化，向连接后体系中加入1倍体积即30μl纯化磁珠AgencourtAmpureXPbeads(BeckmanCoulter,cat.no.A63881)，混匀，室温放置5min后，放置在磁力架上，至液体澄清，弃掉上清；加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；再次加入1ml80％乙醇，放置在磁力架上，至液体澄清，弃上清；加入30μlddH2O，混匀，室温放置2min后，放置在磁力架上，取上清，即得到纯化的连接产物。
5)目的片段的扩增
在反应管中加入如下反应体系：
反应程序如下：
98℃30s；
15cycles：
98℃10s，
65℃30s，
72℃30s；
72℃5min；
10℃∞。
上述纯化的连接产物为步骤4)中纯化的连接产物，上述引物P1(SEQIDNO:7)和P2(SEQIDNO:8)，核苷酸序列如下：
P1：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’
P2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATnnnnnnGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
其中，引物P1与单链λDNA互补链的3’端连接的双链接头Read1-Adapter-1不带有n的链的部分核苷酸序列互补配对；
而引物P2与单链λDNA互补链的5’端连接的随机引物Read2-NB中的部分核苷酸序列相同。
所得到的目的片段扩增样品经过电泳检验，其中，样品3μl，MarkerI(DSBIO)3μl，得到了目的片段的扩增产物。
6)扩增的目的片段的富集。
富集方法同步骤3)中的连接产物纯化方法。
7)双链λDNA测序文库构建完毕，进行Illumina上机测序。
实施例11测序结果分析
1)将实施例10构建的双链λDNA测序文库在Illumina测序平台进行上机测序，251个循环。
2)使用以上方法，得到以下结果：共得到69521对序列，去掉重复序列和质量较低序列后，共有68896对高质量序列(即去掉重复测到的序列和质量未达到Q20序列后所得到的具有唯一特征的序列)；
3)将得到的高质量序列使用软件SOAPdenovov2.04(http://soap.genomics.org.cn/)进行组装，得到2条contig，contigN50为44389。该商购的λDNA是双链DNA，其基因组大小为48502bp，可见，本发明测序所得序列覆盖全部基因组。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种DNA的测序方法，其特征在于，所述测序方法包括以下步骤：
(1)将长度为200bp-700bp的待测DNA片段和随机引物Read2-NB混合进行延伸反应，获得待测DNA片段的互补延伸产物，即5’端延伸了随机引物序列的待测DNA片段的互补链；
(2)将步骤(1)所述的待测DNA片段的互补延伸产物和双链接头Read1-Adapter混合，变性，加入DNA连接酶进行连接反应，获得在步骤(1)所述的待测DNA片段的互补链的3’端连接了双链接头Read1-Adapter中含测序平台特异序列的b链的3’连接产物；
(3)取特定引物T1和T2，对步骤(2)所述的3’连接产物进行扩增，得到扩增产物，即测序文库；
(4)将步骤(3)所述的测序文库进行上机测序；
其中，步骤(1)所述的随机引物Read2-NB的核苷酸序列如5’-D1-(m)x-D2-(n)y-3’，或者5’-D2-(n)y-3’所示；D1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位～第24位中的任一位至第24位；(m)x是本领域常规的标记序列即index，m选自A、T、G或C，x为m的个数，x为6、8、10或者12，(m)x中每个m同时或者不同时选自A、T、G或C；D2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；(n)y为随机序列，n选自A、T、G或C，y为n的个数，y为6～12的整数；
步骤(2)所述双链接头Read1-Adapter由a链和b链组成，所述a链的核苷酸序列如5’-Ta-(n)z-3’所示，Ta的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位～第26位中的任一位至第58位；(n)z为随机序列，z为n的个数，z为6～12的整数；b链的核苷酸序列与Ta的核苷酸序列反向互补；
步骤(3)所述的T1的核苷酸序列如5’-Tc-3’所示，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第17位～第58位中的任一位；
步骤(3)所述的T2的核苷酸序列如5’-TD1-(m)x-TD2-3’或5’-TD1-3’所示；TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第17位～第24位中的任一位；所述TD2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第34位中的任一位。
2.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(1)所述待测DNA片段为单链DNA片段，或者双链DNA片段，或者同时包括单链DNA片段和双链DNA片段；较佳地为单链DNA片段。
3.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(1)所述待测DNA片段由大于700bp的起始DNA模板随机打断得到。
4.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(1)所述随机引物Read2-NB的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，或者，步骤(2)所述双链接头Read1-Adapter的a链的核苷酸序列的z为6。
5.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(1)所述的混合之后进行延伸反应之前还包括变性的步骤，所述变性较佳的为95℃孵育1-5分钟，或者，步骤(3)所述的扩增完成后，还包括将所述扩增所得的扩增产物进行富集的步骤。
6.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(2)所述双链接头Read1-Adapter的a链的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，b链的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
7.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)所述的T1的核苷酸序列如5’-Tc-3’所示，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第25位～第58位中的任一位。
8.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)所述的T1的核苷酸序列如5’-Tc-3’所示，Tc的核苷酸序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的第1位至第42位～第58位中的任一位；较佳的，Tc的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
9.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)所述的T2核苷酸序列如5’-TD1-(m)x-TD2-3’所示，TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第24位，x为6、8、10或者12，TD2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第17位中的任一位；
较佳的，步骤(3)所述的T2核苷酸序列如5’-TD1-(m)x-TD2-3’所示，所述TD1的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的第1位至第24位，x为6，TD2的核苷酸序列为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的第1位至第1位～第17位中的任一位；
更佳的，步骤(3)所述的T2为P2，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。
10.一种二代测序文库，所述测序文库是由包括如权利要求1-9任一项权利要求所述的步骤(1)、(2)和(3)的方法制备而得。
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Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867995A (zh) * 2017-03-01 2017-06-20 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN107217310A (zh) * 2017-08-01 2017-09-29 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒
CN107904668A (zh) * 2018-01-02 2018-04-13 上海美吉生物医药科技有限公司 一种微生物多样性文库构建方法及其应用
CN107937986A (zh) * 2017-11-10 2018-04-20 深圳裕策生物科技有限公司 一种ffpe dna建库用试剂盒、其用途及建库方法
CN108166067A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库方法及其应用
CN108166068A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库试剂盒及其应用
CN108166069A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型甲基化建库方法及其应用
CN108300716A (zh) * 2018-01-05 2018-07-20 武汉康测科技有限公司 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法
CN108559743A (zh) * 2017-08-21 2018-09-21 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种新型gbs的建库接头结构
CN108588197A (zh) * 2018-06-14 2018-09-28 珠海市人民医院 一种检测痕量单链dna片段的方法
CN108866155A (zh) * 2018-06-11 2018-11-23 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 一种下一代测序文库的制备方法
CN109486924A (zh) * 2018-11-23 2019-03-19 上海海洋大学 基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法
CN109988820A (zh) * 2019-04-19 2019-07-09 奥明（杭州）基因科技有限公司 一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒
CN110607353A (zh) * 2019-08-29 2019-12-24 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN110904512A (zh) * 2018-09-14 2020-03-24 广州华大基因医学检验所有限公司 一种适用于单链dna的高通量测序文库构建方法
CN111479923A (zh) * 2017-12-19 2020-07-31 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用于生产寡核苷酸的新型方法
CN112176420A (zh) * 2020-09-15 2021-01-05 上海英基生物科技有限公司 一种dna和rna共建库的方法及试剂盒
CN112410331A (zh) * 2020-10-28 2021-02-26 深圳市睿法生物科技有限公司 带分子标签和样本标签的接头及其单链建库方法
CN112941073A (zh) * 2021-03-29 2021-06-11 武汉伯远生物科技有限公司 一种单链dna接头及其制备和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081225A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
CN102409045A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna接头连接的标签文库构建方法及其所使用标签和标签接头
CN102628079A (zh) * 2012-03-31 2012-08-08 盛司潼 一种通过环化方式构建测序文库的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081225A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
CN102409045A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna接头连接的标签文库构建方法及其所使用标签和标签接头
CN102628079A (zh) * 2012-03-31 2012-08-08 盛司潼 一种通过环化方式构建测序文库的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾晓松 主编: "《分子生物学理论与技术》", 31 March 2002 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867995A (zh) * 2017-03-01 2017-06-20 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN107217310A (zh) * 2017-08-01 2017-09-29 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒
CN108559743A (zh) * 2017-08-21 2018-09-21 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种新型gbs的建库接头结构
CN107937986A (zh) * 2017-11-10 2018-04-20 深圳裕策生物科技有限公司 一种ffpe dna建库用试剂盒、其用途及建库方法
CN111479923A (zh) * 2017-12-19 2020-07-31 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用于生产寡核苷酸的新型方法
CN107904668A (zh) * 2018-01-02 2018-04-13 上海美吉生物医药科技有限公司 一种微生物多样性文库构建方法及其应用
CN108166067A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库方法及其应用
CN108166068A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库试剂盒及其应用
CN108166069A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型甲基化建库方法及其应用
CN108300716B (zh) * 2018-01-05 2020-06-30 武汉康测科技有限公司 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法
CN108300716A (zh) * 2018-01-05 2018-07-20 武汉康测科技有限公司 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法
CN108866155A (zh) * 2018-06-11 2018-11-23 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 一种下一代测序文库的制备方法
CN108588197A (zh) * 2018-06-14 2018-09-28 珠海市人民医院 一种检测痕量单链dna片段的方法
CN110904512A (zh) * 2018-09-14 2020-03-24 广州华大基因医学检验所有限公司 一种适用于单链dna的高通量测序文库构建方法
CN109486924B (zh) * 2018-11-23 2022-03-01 上海海洋大学 基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法
CN109486924A (zh) * 2018-11-23 2019-03-19 上海海洋大学 基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法
CN109988820A (zh) * 2019-04-19 2019-07-09 奥明（杭州）基因科技有限公司 一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒
CN110607353A (zh) * 2019-08-29 2019-12-24 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN110607353B (zh) * 2019-08-29 2022-11-22 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN112176420A (zh) * 2020-09-15 2021-01-05 上海英基生物科技有限公司 一种dna和rna共建库的方法及试剂盒
CN112410331A (zh) * 2020-10-28 2021-02-26 深圳市睿法生物科技有限公司 带分子标签和样本标签的接头及其单链建库方法
CN112941073A (zh) * 2021-03-29 2021-06-11 武汉伯远生物科技有限公司 一种单链dna接头及其制备和应用
CN112941073B (zh) * 2021-03-29 2023-03-14 武汉伯远生物科技有限公司 一种单链dna接头及其制备和应用

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