CN109988820A

CN109988820A - 一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒

Info

Publication number: CN109988820A
Application number: CN201910317012.XA
Authority: CN
Inventors: 童云广; 王瓯晨; 徐鹭芹
Original assignee: Oing (hangzhou) Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Oing (hangzhou) Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明公开了一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒，包括(1)样品采集与提取；(2)末端修复/磷酸化/加A；(3)添加含标签的接头序列；(4)捕获前扩增；(5)目的基因杂交捕获；(6)富集；(7)捕获后扩增。本发明基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因检测的技术领域。

Description

一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒。

背景技术

乳腺癌号称“女性癌症第一杀手”，99％发生在女性。全球肿瘤流行病统计数据显示乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，而乳腺癌的发病率，居女性所有癌种发病率之首，且近几年一直居高不下，中国的发病率每年以3％的速度增长，高出发达国家1-2个百分点，发病率的增速是全球平均增速的两倍，在全世界排第一，每年新增病例超过50万，死亡人数超过4万。ctDNA作为乳腺癌患者的特异性肿瘤分子标志物，已在多篇文献中报道，不但可以用于肿瘤进化动态监测，疗效评估，还可以用于靶向治疗和个性化复发风险、预后评估。

目前市场上主要只针对基因的编码区(coding-region)进行检测，并且所检测基因种类不齐全。在中国，乳腺癌的合成致死疗法还未开始被运用，什么是合成致死？当细胞的基因A功能异常的时候，细胞还可以存活，当细胞的基因B功能异常的时候，细胞也可以存活，但这两个基因同时功能异常的时候，就会发生致死效应。HRD相关基因检测是PARP抑制剂利用合成致死治疗癌症的生物标记物，PRAP抑制剂是特别设计出来治疗携带BRCA基因突变肿瘤的疗法。PARP和BRCA都是DNA修复的机制，大约有1～5％的乳腺癌患者携带BRCA1或BRCA2种系基因突变(Germline Mutation)。由于BRCA基因在细胞通过同源重组(Homologous Recombination,HR)修复DNA损伤方面起到重要作用，因此BRCA基因突变会导致细胞修复DNA损伤。PRAP抑制剂的作用是抑制肿瘤PARP基因，进一步破坏细胞的其它DNA损伤修复机制，导致肿瘤细胞因为DNA损伤得不到修复而死亡。这种药物对因BRCA基因突变而导致同源重组功能缺失的癌细胞尤其有效。

如何建立供乳腺癌合成致死疗法相关基因检测的方法，从而有效指导靶向用药及对疗效评估成为急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，能对DNA分子的两条链都进行分析，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，同时减少数据量的需求，降低后续检测成本。

本发明所需的样本量少，可以同时检测到五大类突变，包括了临床信息中最相关(伴随诊断和指南)的基因以及其它靶向治疗证据相关的基因，如单点突变，小片段插入或者缺失，拷贝数，可变剪切以及融合基因，不但能检测已知位点，还能检测未知的突变信息。

本发明的第二目的在于提供一种用于乳腺癌多基因检测的试剂盒，缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获游离核酸中乳腺癌基因的产品的问题，特别是对拷贝数及融合基因的检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，包括如下步骤：

(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；

(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；

(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混合，PCR反应，纯化后得标签-靶标DNA；

(4)捕获前扩增：对标签-靶标DNA进行PCR扩增，然后进行纯化，获得基因组DNA文库；

(5)目的基因杂交捕获：使用Hyb Block将基因组DNA文库进行杂交前的封闭，然后使用捕获探针与基因组DNA文库进行杂交捕获；

(6)富集：对步骤(5)捕获到的靶序列采用磁珠富集法进行富集；

(7)捕获后扩增：对步骤(6)富集后的靶序列进行PCR扩增，纯化后获得目的基因文库。

本发明的文库构建方法对ctDNA检测panel除了常规的基因编码区(coding-region)的检测外，还具有二大创新性：

包含基因非编码区(Noncoding-region)的检测人类基因组中只有1-2％的序列是编码区序列，98％的序列属于非编码区序列，这些非编码区主要起到转录调控作用，非编码区如启动子区域主要与转录因子相结合调控基因的表达，当启动子区域发生突变后，会影响转录因子的结合，从而影响基因的表达导致癌症发生。这些发生在基因非编码区的临床意义未明的热点突变具有重大的，潜在的临床价值。

包含利用乳腺癌合成致死疗法的同源重组缺陷(HRD：Homologous RecombinationDeficiency)相关基因检测。

本发明率先提供乳腺癌合成致死疗法相关基因检测的文库构建方法，从而有效指导靶向用药及对疗效评估。

作为优选，含标签的接头序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；

其中，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T；负链中的标签序列与正链中的标签序列反向互补。

作为优选，正链中的标签序列具体包括SEQ ID No.1—SEQ ID No.25所示的核苷酸序列。

作为优选，步骤(4)捕获前扩增的PCR扩增引物序列如下：

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。

作为优选，所述Hyb Block的序列为：SEQ ID No.26和SEQ ID No.27。

作为优选，步骤(5)中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量。本发明用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液可有效缩短杂交时间。

作为优选，步骤(5)的捕获探针经生物素标记，步骤(6)中磁珠富集法的磁珠为链霉亲和素偶联的磁珠，磁珠富集法采用的清洗液包括清洗液I和清洗液II，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水余量；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水余量。本发明的清洗液配方能配合掺入的长片段探针，有效提高局部GC区域和整体捕获效率。

作为优选，步骤(7)捕获后扩增的PCR扩增引物如下：

通用引物P1：A A T G A T A C G G C G A C C A C C G A G和

Index引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T。

作为优选，乳腺癌多基因检测的被检测基因包括：

第一组、乳腺癌基因非编码区相关基因：CTNNB1、TERT、ZNF143、LEPROTL1、RMRP、NEAT1、TBC1D12、FOXA1、ALDOA；

第二组、乳腺癌基因编码区与同源重组修复缺陷相关基因:BRCA1、BRCA2、EMSY、PTEN、RAD51C、RAD51D、RAD50、ATM、ATR、FANC、BARD1、BLM、BRIP1、CHEK1、CHEK2、FAM175A、NBN、PALB2、MRE11A、MMR、TP53；

第三组、除第二组外的乳腺癌基因编码区相关基因：

MTOR、RHOA、CDK6、FGFR2、IDH2、GNAS、BAG1，

ARID1A、PIK3CA、MET、HRAS、TSC2、RUNX1、CTSL2，

NRAS、FGFR3、SMO、CCND1、PALB2、U2AF1、Survivin，

NOTCH2、PDGFRA、BRAF、CCND2、NF1、MAPK1、RPLPO，

RIT1、KIT、EZH2、ETV6、BRCA1、CRLF2、GSTM1，

NTRK1、KDR、RHEB、KRAS、RNF43、BCOR、KI67，

DDR2、TET2、FGFR1、CDK4、SRSF2、ARAF、ESR1，

DNMT3A、FBXW7、MYC、PTPN11、SMAD4、AR、GUS，

ALK、RICTOR、JAK2、HNF1A、STK11、STAG2、HER2，

MSH2、PIK3R1、CDKN2A、FLT3、GNA11、ACTB、STK15，

NFE2L2、APC、GNAQ、BRCA2、MAP2K2、CD68、PGR，

SF3B1、PDGFRB、TSCI、RB1、KEAP1、MMP11、TFRC，

IDH1、CCND3、NOTCH1、AKT1、CCNE1、MYBL2、GRB7，

VHL、PMS2、GATA3、MAP2K1、AKT2、SCUBE2、CCNB1，

RAF1、EGFR、RET、NTRK3、ERCC2、GAPDH、BCL2。

一种用于乳腺癌多基因检测的试剂盒，包括：

A、用于杂交捕获的含标签的接头序列，该接头序列为T突出端，所述含标签的接头序列为：正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；

其中，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T；负链中的标签序列与正链中的标签序列反向互补；

B、用于捕获前扩增标签-靶标DNA的PCR扩增引物，所述PCR扩增引物序列如下：

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC；

C、用于文库杂交前封闭的Hyb Block，所述Hyb Block序列为：SEQ ID No.26和SEQ IDNo.27；

D、用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液，所述缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量；

E、用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液，清洗液包括清洗液I和清洗液II，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水余量；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水余量；

F、用于捕获后扩增靶序列的PCR扩增引物，所述PCR扩增引物序列如下：

通用引物P1：A A T G A T A C G G C G AC C A C C G A G和

Index引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T；

G、生物素标记的捕获探针和链霉亲和素偶联的磁珠。NNNNNNNNNNNN具体为SEQ IDNo.1-SEQ ID No.25所示的核苷酸序列中选择。

本发明的有益效果是：

1、筛选并设计了涵盖134个基因、超灵敏检测自主创新型panel，基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因检测的技术领域。

2、本发明所需的样本量少，可以同时检测到五大类突变，包括了临床信息中最相关(伴随诊断和指南)的基因以及其它靶向治疗证据相关的基因，如单点突变，小片段插入或者缺失，拷贝数，可变剪切以及融合基因，不但能检测已知位点，还能检测未知的突变信息。

附图说明

图1为本发明提供的分子标签接头示意图；

图2为本发明提供的基于DMI数字分子标识符文库结构示意图；

图3为本发明加完分子标签的文库峰图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例

1、乳腺癌相关基因的捕获探针组

捕获探针组(液相捕获探针)可捕获的基因包括：

第一组：(Noncoding-region)基因非编码区(启动子区域)相关基因：

CTNNB1	TERT	ZNF143
			LEPROTL1	RMRP	NEAT1
TBC1D12	FOXA1	ALDOA

第二组：(HRD：Homologous Recombination Deficiency)同源重组修复缺陷相关基因:

BRCA1	BRCA2	EMSY	PTEN	RAD51C	RAD51D
						RAD50	ATM/ATR	FANC	BARD1	BLM	BRIP1
CHEK1	CHEK2	FAM175A	NBN	PALB2	MRE11A
						MMR	TP53

第三组：除第一、第二组外编码区相关基因：

MTOR

RHOA

CDK6

FGFR2

IDH2

GNAS

BAG1

ARID1A

PIK3CA

MET

HRAS

TSC2

RUNX1

CTSL2

NRAS

FGFR3

SMO

CCND1

PALB2

U2AF1

Survivin

NOTCH2

PDGFRA

BRAF

CCND2

NF1

MAPK1

RPLPO

RIT1

KIT

EZH2

ETV6

BRCA1

CRLF2

GSTM1

NTRK1

KDR

RHEB

KRAS

RNF43

BCOR

KI67

DDR2

TET2

FGFR1

CDK4

SRSF2

ARAF

ESR1

DNMT3A

FBXW7

MYC

PTPN11

SMAD4

AR

GUS

ALK

RICTOR

JAK2

HNF1A

STK11

STAG2

HER2

MSH2

PIK3R1

CDKN2A

FLT3

GNA11

ACTB

STK15

NFE2L2

APC

GNAQ

BRCA2

MAP2K2

CD68

PGR

SF3B1

PDGFRB

TSCI

RB1

KEAP1

MMP11

TFRC

IDH1

CCND3

NOTCH1

AKT1

CCNE1

MYBL2

GRB7

VHL

PMS2

GATA3

MAP2K1

AKT2

SCUBE2

CCNB1

RAF1

EGFR

RET

NTRK3

ERCC2

GAPDH

BCL2

。

所述捕获探针组的设计按照如下规则：

(a)探针长度为121nt；

(b)探针设计合并相邻区域；

(c)探针位置优先覆盖于检测位点的中间位置；

(d)探针设计区间为目标区间向两翼扩展40bp；

(e)探针参考为基因组正义链；

(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性；

(g)探针GC含量以40％-60％为标准，GC含量变化幅度偏离标准含量每增加10％，探针在该区域探针数量增加50％；

(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针，每有一个近似序列，则该区域探针数量增加100％；所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95％的序列。

在Agilent SureDesign在线设计软件设计，Agilent公司合成。

2、用于乳腺癌多基因检测的试剂盒试剂盒包括如下试剂：

①第1节提供的乳腺癌相关基因的捕获探针组，并且该探针组经过生物素标记；和用于捕获杂交靶序列的经链霉亲和素标记的磁珠。

②用于连接的含有不同barcode(标签)序列的接头序列(图1)，所述barcode序列为双链DNA分子，含有不同barcode序列的接头序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT(SEQ ID No.28)；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID No.29)；

其中，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的barcode序列，所述不同barcode序列共24对，制备方法为：等摩尔量混合两条标签核苷酸，使每条链的终浓度为50μM，95℃，孵育5min，使两条标签核苷酸退火，NNNNNNNNNNNN序列分别为：

TCCCTTGTCTCC(SEQ ID No.1),ACGAGACTGATT(SEQ ID No.2),GCTGTACGGATT(SEQ IDNo.3),ATCACCAGGTGT,(SEQ ID No.4)TGGTCAACGATA(SEQ ID No.5),ATCGCACAGTAA(SEQ IDNo.6),GTCGTGTAGCCT(SEQ ID No.7),AGCGGAGGTTAG(SEQ ID No.8),ATCCTTTGGTTC(SEQ IDNo.9),TACAGCGCATAC(SEQ ID No.10),ACCGGTATGTAC(SEQ ID No.11),AATTGTGTCGGA(SEQID No.12),TGCATACACTGG(SEQ ID No.13),AGTCGAACGAGG(SEQ ID No.14),ACCAGTGACTCA(SEQ ID No.15),GAATACCAAGTC(SEQ ID No.16),GTAGATCGTGTA(SEQ ID No.17),TAACGTGTGTGC(SEQ ID No.18),CATTATGGCGTG(SEQ ID No.19),CCAATACGCCTG(SEQ IDNo.20),GATCTGCGATCC(SEQ ID No.21),CAGCTCATCAGC(SEQ ID No.22),CAAACAACAGCT(SEQID No.23),GCAACACCATCC(SEQ ID No.24),GCGATATATCGC(SEQ ID No.25)。

③用于文库杂交前封闭的Hyb Block，所述Hyb Block序列为：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID No.26)和AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC IIII IIII IIII ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID No.27)。

④用于富集杂交捕获前的靶序列的PCR扩增引物：所述PCR扩增引物序列为：

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG(SEQ ID No.30)

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC(SEQ ID No.31)。

⑤用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液，可有效缩短杂交时间，其组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水。

⑥用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液，有效提高高比例GC区域和整体靶向区域捕获效率，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水。

⑦用于富集杂交捕获后的靶序列的PCR扩增引物：所述PCR扩增引物为：通用引物P1：A A T G A T A C G G C G A C C A C C G A G(SEQ ID No.32)和Index引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC(SEQ ID No.33)，NNNNNNNNNNNN是指固定的多重Barcode序列(SEQ ID No.1—SEQ ID No.25)的位置。

3、一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法本实施例提供了一种文库构建方法，该文库中共包含119个不同患者的血液游离核酸样本(来自浙江省各级医院)，该文库用于基于Illumina平台的双端测序。

使用乳腺癌相关基因的捕获探针组，并且基于液相杂交的序列捕获技术对靶序列进行富集。液相杂交技术路线是：1)制备杂交探针库，2)使用探针对目标基因进行富集，3)将富集后的DNA序列用高通量测序仪进行测序。使用液相杂交技术能对目标基因进行有效富集，除了能分析基因的SNP(单核苷酸突变)，Indel(碱基的插入缺失)外，还能对捕获基因的CNV(拷贝数变异)和Fusion(基因融合)进行分析，用于乳腺癌患者靶向治疗的用药指导及相关患病机理的研究。

该文库构建方法包括如下步骤：

游离核酸抽提

使用DNAcfDNA Kit(M3298-01)提取119个不同外周血样本中的游离核酸DNA。

末端修复/磷酸化/加A

取5～30ng游离核酸DNA，体积浓缩或补水至16.7μL，样本置于0.2mL PCR反应管中；

预先从-20℃保存的试剂盒(市售，NEB Ultra II End Repair/dA-Tailing Module)中取出NEB Ultra II End Repair Rxn Buffer和End Repair Enzyme Mix，将Buffer置于冰上融化，酶置于置于-20℃冰盒上，按照下表配制末端补平预混液，混匀离心，将预混液分装至反应管中(3.3μL/管)；

吹吸混匀，于PCR仪中运行以下程序(总体系为20μL)：

20℃	30min
		65℃	30min
4℃	Hold
		105℃	Lid

。

分子标签序列连接

预先从-20℃保存的试剂盒(市售,NEB Ultra II Ligation Module)中取出Ultra IIBlunt/TA Ligase Master mix置于冰盒上，按照下表配制Adaptor Ligation Master mix：

试剂	1×(μL)	7.7(7个样品1.1X)
			Ultra II Blunt/TA Ligase Master mix	10	77
Ligation Enhancer	0.3	2.31
			subTotal	10.3	79.31

将Mix涡旋混匀后瞬时离心，吸取10.3μL Adapter Ligation Mastermix加入至EndRepair产物中，涡旋混匀；

吸取2μL Adapter Mix3(4μM)加至End Repair产物中，涡旋混匀；

于PCR仪中运行以下程序(总体系为32.8μL)，切记无需热盖，PCR仪的盖子需打开：

20℃	60min
		4℃	Hold
No	Lid

反应后产物用2倍体积的Omi-Nano磁珠纯化，溶解于30μL Nuclease-Free Water，取28uL上清，进入下一步反应。

PCR富集

预先从-20℃保存的试剂盒(GeneRead DNA I Amp kit with Illumina platforms，180455，Qiagen)中取出2×扩增酶混合液，置于冰上融化，按如下表格加入反应成分，混匀后瞬时离心：

于PCR仪中运行以下程序(总体系为60μL)：

反应后产物使用2倍体积的Omi-Nano磁珠进行纯化，溶解于30μl Nuclease-FreeWater中，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，使用Agilent2100检测核酸片段分布，文库主峰要在300-400bp左右。

杂交(RNase Block购自Agilent，货号300152；Human Cot-1 DNA购自ThermoFisher货号15279011)

每个样本取文库900ng，使用Thermo SpeedVac DNA120浓缩仪浓缩样本至6.0ul；

打开温浴仪，调节温度至65℃；

吸取18uL杂交缓冲液置于1.5mL低吸附离心管内，65℃预热；

在1.5mL低吸附离心管内配制12％RNase Block solution，涡旋混匀，冰上保存：

。

取3.1μL Omi-Nano Block Mix(购自IDT公司)加入到6.0μL DNA library中，吹吸混匀(Cot-1 DNA，货号15279011，购自Thermo Fisher)：

样品	vol(uL)
		Pool DNA+Cot1DNA	6.0
Omi-Nano Block Mix	3.1
		subTotal	9.1

将9.0μL混合物加入96孔板的指定孔内，做好标记，放入PCR仪，运行如下程序：PCR仪运行至65℃时，配制如下Capture Library Hybridization Mix，65℃预热至少2min：

吸取20uL预热后的Capture Library Hybridization Mix到样品孔，吹吸混匀10次，盖上8连管盖，parafilm膜，96孔板膜，65℃杂交捕获4h。

捕获

73℃预热清洗液II，1.6mL/样；

准备用于捕获的链霉亲和素磁珠：

将Dynabeads T1链霉亲和素磁珠(购自Thermo Fisher，型号65602)取出，黑暗平衡30min，涡旋15s使磁珠充分混匀；

取50uL的磁珠置于新的1.5mL低吸附管中；

将反应管置于磁力架上，液体澄清后(约5min)，小心将液体移弃，不要触碰到管内磁珠；加入200μL磁珠结合缓冲液(购自Agilent公司)，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，液体澄清后(约5min)，小心将液体移弃，不要触碰到管内磁珠；

重复d)2次，一共使用磁珠结合缓冲液洗涤3次；

用200μL磁珠结合缓冲液重悬磁珠；

DNA与捕获磁珠的结合及洗涤

将杂交捕获的样本用移液器转移到制备好的捕获磁珠中；

涡旋混匀，置于旋转混匀仪上(10的旋转速度)室温孵育Hybrid-capture/bead 30min；

瞬离，放入磁力架上，待液体澄清后，弃上清；

从磁力架上取下离心管，用500μL清洗液I重悬磁珠(涡旋混匀)；

在旋转混匀仪上(10的旋转速度)室温孵育Hybrid-capture/bead 15min；

瞬离，转入新的1.5mL离心管，放入磁力架上，待液体澄清后，弃上清；

从磁力架上取下离心管，用500μL 73℃预热的清洗液II重悬磁珠(涡旋混匀)；

73℃孵育10min(1200rpm振动)，瞬离，放入磁力架，待液体澄清后，弃上清；

重复步骤g-h漂洗磁珠2次，共用500μL73℃预热的清洗液II漂洗磁珠3次；

注：使用清洗液II洗涤磁珠时操作速度要快，不能让温度降到47℃；

弃尽上清残液，从磁力架上取下离心管，加入35μL无核酸酶水重悬磁珠。

PCR富集(Post-Capture amp mix试剂购自Herculase II Fusion DNAPlymerase,200rxn，600677，Agilent)

按照如下表格配制Post-Capture amp mix

试剂名称	体积(uL)	2.2个(1.1X，2个样本)
			5x扩增酶缓冲液	10	22
高保真扩增酶	1	2.2
			25mM dNTP mix	2	4.4
通用引物P1(10μM)	1	单加
			Index引物(10μM)	1	单加
subTotal	15	33

吸取15μL Post-Capture amp mix加入到上一步骤的磁珠混合体中，混匀离心；

放入PCR仪，运行如下程序(50μL 体系)：

反应后产物使用1.8倍体积的Omi-Nano磁珠进行纯化，溶解于25μl无核酸酶水中，文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，使用Agilent 2100进行文库片段长度测定，文库长度约在300-400bp之间，文库图如图2、图3。

文库上机制备得到的文库等摩尔浓度混合，于Illumina测序平台中进行双末端测序，同时对样品上的标签序列也进行测序。NextSeq500测序时使用1.8pM DNA。

数据分析

有完整标签核苷酸的reads含有已知12bp的分子标签序列，这些reads是通过过滤掉缺少预期特定的分子标签序列来识别的。通过取reads上分子标签序列的正向和反向序列和靶标核苷酸序列的5～17位的序列来计算出每条read的DMI。将DMI序列添加到reads前端，并去除标签核苷酸序列。由于连接和末端修复错误的倾向，使接近DNA片段末端的错误率升高，所以位于标签核苷酸序列之后的前4个核苷酸也会被去除。具有相同的DMI序列的reads被分在一组，产生一条共有read。如果覆盖某测序位点的reads数少于3条并且reads中的某位点少于90％具有相同碱基，则该测序位点被去除。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将reads比对到人类基因组上，然后通过将read1中的AabB形式的每条24个核苷酸的标签序列与其相应的read2中的BbaA形式的相应标签序列配对。仅当来自两条DNA链的信息完全一致时才考虑所得的序列位置。

数据分析如下：

表1

染色体	起始位置	终止位置	基因名称	突变类型	拷贝数
						CHR	START	Stop	GENE	ABBERATION	COPY
10	1.23E+08	1.23E+08	FGFR2	DUP	3.114795959
						17	41275965	41276220	BRCA1	DEL	0.38625453

表1表示CNV拷贝数变异的结果展示，说明本发明的方法可以用于拷贝数检测。

表2：

表2说明50ng游离核苷酸起始量，SNV检测最低限能到0.04％。

表3：

表3说明此文库构建方法能适用于乳腺癌基因检测，捕获效率高。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 奥明（杭州）基因科技有限公司

<120> 一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒

<130> 2019.4.18

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tcccttgtct cc 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

acgagactga tt 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gctgtacgga tt 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atcaccaggt gt 12

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

tggtcaacga ta 12

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

atcgcacagt aa 12

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gtcgtgtagc ct 12

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

agcggaggtt ag 12

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

atcctttggt tc 12

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

tacagcgcat ac 12

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

accggtatgt ac 12

<210> 12

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

aattgtgtcg ga 12

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

tgcatacact gg 12

<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

agtcgaacga gg 12

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

accagtgact ca 12

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

gaataccaag tc 12

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

gtagatcgtg ta 12

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

taacgtgtgt gc 12

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

cattatggcg tg 12

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

ccaatacgcc tg 12

<210> 21

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

gatctgcgat cc 12

<210> 22

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

cagctcatca gc 12

<210> 23

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

caaacaacag ct 12

<210> 24

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

gcaacaccat cc 12

<210> 25

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 25

gcgatatatc gc 12

<210> 26

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 26

agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtagatctc ggtggtcgcc gtatcatt 58

<210> 27

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 27

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacatctcg tatgccgtct tctgcttg 58

<210> 28

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(65)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 28

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccnnnnnnn 60

nnnnngatct 70

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 29

gatcnnnnnn nnnnnnggaa gagcacacgt ctgaactcca gtcac 45

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 30

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 31

gtgactggag ttcagacgtg tgc 23

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 32

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(36)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 33

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnnnnngtga ctggagttca gacgtgtgc 59

Claims

1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：含标签的接头序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；

3.根据权利要求2所述的文库构建方法，其特征在于：正链中的标签序列具体包括SEQID No.1—SEQ ID No.25所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(4)捕获前扩增的PCR扩增引物序列如下：

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。

5.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：所述Hyb Block的序列为：SEQ IDNo.26和SEQ ID No.27。

6.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量。

7.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)的捕获探针经生物素标记，步骤(6)中磁珠富集法的磁珠为链霉亲和素偶联的磁珠，磁珠富集法采用的清洗液包括清洗液I和清洗液II，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水余量；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水余量。

8.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(7)捕获后扩增的PCR扩增引物如下：

通用引物P1：A A T G A T A C G G C G A C C A C C G A G和

Index引物：

9.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，乳腺癌多基因检测的被检测基因包括：

第三组、除第二组外的乳腺癌基因编码区相关基因：

MTOR、RHOA、CDK6、FGFR2、IDH2、GNAS、BAG1，

ARID1A、PIK3CA、MET、HRAS、TSC2、RUNX1、CTSL2，

NRAS、FGFR3、SMO、CCND1、PALB2、U2AF1、Survivin，

NOTCH2、PDGFRA、BRAF、CCND2、NF1、MAPK1、RPLPO，

RIT1、KIT、EZH2、ETV6、BRCA1、CRLF2、GSTM1，

NTRK1、KDR、RHEB、KRAS、RNF43、BCOR、KI67，

DDR2、TET2、FGFR1、CDK4、SRSF2、ARAF、ESR1，

DNMT3A、FBXW7、MYC、PTPN11、SMAD4、AR、GUS，

ALK、RICTOR、JAK2、HNF1A、STK11、STAG2、HER2，

MSH2、PIK3R1、CDKN2A、FLT3、GNA11、ACTB、STK15，

NFE2L2、APC、GNAQ、BRCA2、MAP2K2、CD68、PGR，

SF3B1、PDGFRB、TSCI、RB1、KEAP1、MMP11、TFRC，

IDH1、CCND3、NOTCH1、AKT1、CCNE1、MYBL2、GRB7，

VHL、PMS2、GATA3、MAP2K1、AKT2、SCUBE2、CCNB1，

RAF1、EGFR、RET、NTRK3、ERCC2、GAPDH、BCL2。

10.一种用于乳腺癌多基因检测的试剂盒，其特征在于，包括：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；

负链：

/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；

上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG

下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC；

D、用于提供杂交反应的离子环境的缓冲液，所述缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量；

通用引物P1：A A T G A T A C G G C G A C C A C C G A G和

Index引物：

G、生物素标记的捕获探针和链霉亲和素偶联的磁珠。