CN108823640A - 一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用，包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库。将上述试剂盒用于淋巴瘤基因的高通量测序方法，包括以下步骤：利用所述试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；其中，所述测序分析的具体操作为：将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。与现有技术相比，本发明方案在高通量测序过程中具有低起始量、检测广泛、灵敏度高、准确性高、适用范围广、实用性强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用。
背景技术
淋巴瘤(lymphoma)是一类起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)两大类，根据2016年版世界卫生组织(World Health Organization，WHO)定义的淋巴瘤亚型超过40种，每一种淋巴瘤都有独特的分子遗传学背景，并可对应不同的治疗方案及预后分层，即使为同一亚型，其治疗方案也不尽相同。因此，相对于其它实体瘤而言，淋巴瘤的诊断和治疗更为复杂。淋巴瘤的精确诊断需要依赖形态病理学(Morphology)、免疫表型(Immunology)、细胞遗传学(Cytogenetics)和分子遗传学(Molecular genetics)等技术综合判断；而其中，分子遗传学尤为重要。
目前传统的检测方法，均基于聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)所衍生的技术，如荧光探针定量法(Taqman-Real Time-PCR，Taqman探针法)、桑格毛细管电泳法(Sanger法)等等方法，虽然能在一定程度上辅助临床对淋巴瘤进行分型及预后判断，但存在着一次性检测位点少、不能涵盖所有检测位点的缺陷，同时，Sanger法检测单核苷酸碱基突变(Single nucleotide variants，SNV)、微小插入/缺失突变(Insertion-deletion，Indel)等突变类型还存在着检测灵敏度差等问题(灵敏度约10％-20％)。而近年来兴起的数字聚合酶链式反应法(Digital Polymerase Chain Reaction，DDPCR)，虽然有极高的检测灵敏度(0.01％)，但同样不能一次性检测大量的基因位点。这些方法均不能很好的满足临床上对淋巴瘤这类亚型种类繁多、所涉大量基因突变位点的疾病的诊疗需求。
高通量测序，又称二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)，其以单次检测通量高、覆盖面广、检测灵敏度高等优点迅速被各大科研和临床机构所采用。目前随着该系列平台配套技术的完善及成熟，各大公司及医院已经开展包括遗传病、癌症、生育健康、胚胎移植前遗传学筛查诊断(Preimplantation Genetic Screening and PreimplantationGenetic Diagnosis，PGS/PGD)在内的多种检测服务。此外，随着国家对高通量测序监管的加强，高通量测序室间质量评价、高通量测序实验室建设规范等质量监管系统也日渐完善。因此，高通量测序应用于临床的意义不言而喻。
目前，NGS在淋巴瘤中的应用主要可概括为以下三个方面：
1.诊断分型:不同亚型的淋巴瘤有着不同的分子突变图谱，基因突变对于淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有着重要意义。例如：1)有MYD88L265P突变的DLBCL多为ABC亚型，MYD88其他位点突变在ABC和GCB型中分布无差异；2)原发中枢神经系统的大B细胞淋巴瘤中，最常见的突变为MYD88和CD79B突变MYD88和CD79B突变比例高于50％，突变热点分别为MYD88L265P和CD79B Y196突变，MYD88/CD79B突变在继发性中枢淋巴瘤中少见，可作为鉴别指标；3)Burkitt淋巴瘤常有MYC的重排、体细胞高频突变及ID3的功能失活性突变；4)BRAFV600E突变几乎见于所有HCL。
2.靶向治疗：NGS发现的基因突变异常为靶向药的使用提供依据。例如：1)CREBBP/EP300突变在DLBCL和FL中常见，CFDA在2014年批准HADC抑制剂西达本胺的上市；2)EZH2Y641突变见于22％的GCB DLBCL和7.2％的FL，EZH2Y641突变使其三甲基化活性增强，单甲基化活性减弱，为功能获得性突变EZH2抑制剂tazemetostat在伴EZH2突变的复发难治性B细胞淋巴瘤的Ⅱ期临床试验正在开展；3)根据NGS结果，BTK抑制剂伊布替尼，BCL-2抑制剂ABT199等的相继上市等等。
3.预后评估：不同淋巴瘤亚型的遗传学特点提示不同的预后。例如：1)MYD88L265P是DLBCL独立不良预后因素；2)TP53突变是多种淋巴瘤的不良预后因素；3)DDX3X突变提示NK/T细胞淋巴瘤预后不良。
然而，目前在诊疗淋巴瘤方面，传统的分子生物学方法主要有毛细管电泳、Taqman探针法，而近年来兴起的还有数字PCR法，这些方法均有诸多限制和缺陷。而目前各大医院及公司虽有一些相关的NGS检测试剂盒，但是普遍存在试剂盒检测范围涵盖面不够、检测结果解读不清晰、对临床提示不详尽等缺陷。导致目前淋巴瘤突变高通量检测不能有效的普及到各大医院当中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够通过高通量测序检测出与淋巴瘤相关的157个基因2300个位点，从而为淋巴瘤的疾病诊断、分型、治疗、预后监控进行全面展示，进而为临床诊疗提供有效的临床指导的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SETD2、SF3B1、SGK1、SH2B3、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STAT3、STAT5B、STAT6、TBL1XR1、TCF3、TET1、TET2、TMSB4X、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF1B、TP53、TRAF3、TRRAP、U2AF1、USP7、VAV1、VMA21、WHSC1、WT1和XPO1。
本发明的有益效果在于：本发明的构建方法针对157个目的基因组合(2300个位点)建立引物库，利用本发明引物库中的引物获取目标DNA片段，在降低了超始DNA量的前提下，可快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需6小时。采用本发明Panel中的基因组合进行检测，对于淋巴瘤诊断、分型、治疗、用药及预后等等各个方面均具备显著的临床指导意义；本发明所涉及的基因全面，靶向位点精准，降低了后续的实验成本，同时避免了市面上大多数此类基因组合均只能涵盖如用药或者分型等1～2项内容，又或因检测位点不够，导致临床指导性欠佳等缺陷。与目前国内同种技术产品相比，本发明方案的引物组合不仅覆盖了目前全球最新的淋巴瘤相关基因异常，而且包含了基于国内人群检测数据库中所获得的国人敏感基因，在国内检测更具有意义。
本发明还包括一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库。
本发明的有益效果在于：本方案Panel所涉及的基因全面，靶向位点精准，降低了后续的实验成本，同时避免了市面上大多数此类基因组合均只能涵盖如用药或者分型等1～2项内容，又或因检测位点不够，导致临床指导性欠佳等缺陷；本发明试剂盒可以兼容多种Illumina测序仪，包括从Miseq、Hiseq到Novaseq等等机型均在本发明方案的适用机型范围内。
本发明还包括一种用于淋巴瘤基因检测的高通量测序方法，包括以下步骤：利用上述试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；
其中，所述测序分析的具体操作为：
将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。
本发明的有益效果在于：本发明方案灵敏度高，采用中等深度测序(1000x)，保证灵敏度能达到1％的前提下，避免了过多的成本浪费，同时，1％的检测下限LOD也能够满足目前的FFPE样本DNA分析需求。
本发明还包括将一种或多种引物在制备用于构建如权利要求1-7任一项所述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂中的应用，所述引物选自所述引物库。
本发明的有益效果在于：本发明方案的引物可广泛应用于各种基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂中，具有准确性高、适用范围广及实用性强等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测方法的原理示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库；
其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SETD2、SF3B1、SGK1、SH2B3、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STAT3、STAT5B、STAT6、TBL1XR1、TCF3、TET1、TET2、TMSB4X、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF1B、TP53、TRAF3、TRRAP、U2AF1、USP7、VAV1、VMA21、WHSC1、WT1和XPO1。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明的构建方法针对157个目的基因组合(2300个位点)建立引物库，利用本发明引物库中的引物获取目标DNA片段，在降低了超始DNA量的前提下，可快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需6小时。采用本发明Panel中的基因组合进行检测，对于淋巴瘤诊断、分型、治疗、用药及预后等等各个方面均具备显著的临床指导意义；本发明所涉及的基因全面，靶向位点精准，降低了后续的实验成本，同时避免了市面上大多数此类基因组合均只能涵盖如用药或者分型等1～2项内容，又或因检测位点不够，导致临床指导性欠佳等缺陷。与目前国内同种技术产品相比，本发明方案的引物组合不仅覆盖了目前全球最新的淋巴瘤相关基因异常，而且包含了基于国内人群检测数据库中所获得的国人敏感基因，在国内检测更具有意义。上述Panel中的目的基因，均为人体基因，其核苷酸序列本领域普通技术人员可根据基因名称查知确定。
进一步地，所述引物库是选取所述目的基因的外显子区域或热点区域，进行多重PCR引物设计，根据设计好的引物进行引物合成并混合后构建而成的。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明通过精简引物库，去掉原始候选基因中不具备临床意义的区域及临床意义模糊、不明确的区域，使得Panel整体大小大大缩小，降低了后续的测序所需数据量，最终使得整体检测成本降低，实用性更强。
进一步地，所述引物库包括多对引物对，所述多对引物对中至少一对引物对的正向引物与反向引物中的特异性序列分别包含核苷酸序列如SEQ ID No.m与SEQ ID No.(m+93)所示的特异性序列，其中，m为从1到93的任意一个自然数。
进一步地，所述获取目标DNA片段的操作是通过多重PCR扩增法或杂交捕获法得到目标DNA片段。
进一步地，所述多重PCR扩增法的具体操作为：在每个多重PCR反应后的装置中，添加不同的NGS测序标签，然后再在两端连接含有测序所需的接头，并利用磁珠进行纯化，最终得到带测序接头的目标DNA片段混合体，即构建形成所述高通量测序文库。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明基于两步法多重PCR结合NGS测序，能正确检测99.99％以上的碱基序列，远远高于传统的Taqman-RT-PCR法等分子生物学检测方法；本发明采用多重PCR法构建文库，可实现低起始量的同时能检测广泛位点的效果，相比于传统的Taqman-qPCR法检测突变，多重PCR法能一次性检测几百甚至上千个片段及相关位点，具有传统PCR及微滴式数字DDPCR无法达到的通量，多重PCR法构建DNA文库，仅需要最低1ng的DNA起始量，与杂交捕获法构建DNA文库相比，该方法大大降低了DNA量的需求，尤其适用于现有的SNV和Indel检测中。
优选地，所述测序标签采用Illumina的测序标签序列，其最终文库结构为：测序接头I-XX-AA-测序接头II，其中，测序接头I和测序接头II为Illumina测序所需的两端接头核苷酸序列，所述测序接头I的核苷酸序列如SEQ ID No:187所示，所述测序接头II的核苷酸序列如SEQ ID No:188所示；所述XX为不同序列的index；所述AA为PCR产物。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案优选采用Illmina测序，但接头序列包括但并不仅限于上述序列，也可以采用其它Illmina对应接头序列。
进一步地，所述引物库中平均每条引物PCR扩增后对应的产物长度在100～200bp之间。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明涉及到的引物库，采用较短的产物片段设计，具有样本适用范围广等优点，本发明的引物库不仅能适用于标准的新鲜或低温冻存的组织/血液样本，而且还能良好的适用于福尔马林固定后石蜡包埋的组织(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE样本)中的DNA，基于该引物库的检测方法，FFPE样本依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
本发明还包括一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本方案Panel所涉及的基因全面，靶向位点精准，降低了后续的实验成本，同时避免了市面上大多数此类基因组合均只能涵盖如用药或者分型等1～2项内容，又或因检测位点不够，导致临床指导性欠佳等缺陷；本发明试剂盒可以兼容多种Illumina测序仪，包括从Miseq、Hiseq到Novaseq等等机型均在本发明方案的适用机型范围内。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR预混液。
进一步地，所述试剂盒还可以包括其他用于PCR扩增或杂交捕获过程中的多种其他常规试剂。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：其他常规试剂可根据构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库选用的方法进行组合。
本发明还包括一种用于淋巴瘤基因检测的高通量测序方法，包括以下步骤：利用上述试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；
其中，所述测序分析的具体操作为：
其中，所述测序分析的具体操作为：
将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。
本发明的有益效果在于：本发明方案灵敏度高，采用中等深度测序(1000x)，保证灵敏度能达到1％的前提下，避免了过多的成本浪费，同时，1％的检测下限LOD也能够满足目前的FFPE样本DNA分析需求。
优选地，所述数据文件分析处理方法具体包括以下步骤：
a)原始数据经过index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用BWA软件对数据进行比对分析，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据；
b)利用软件，对上述步骤a)处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的SNP及indel信息；
c)利用上述获得目标片段中的SNV及indel数据，通过软件及数据库进行突变的解读。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案的数据分析包括但不限于不同样本数据拆分、数据质量控制(Q30)、SNP call、Coverage analysis等部分，还可以使用其他商业化的软件或自主研发的相关软件进行分析。
本发明还包括将一种或多种引物在制备用于构建如权利要求1-7任一项所述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂中的应用，所述引物选自所述引物库。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案的引物可广泛应用于各种基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂中，具有准确性高、适用范围广及实用性强等优点。
本发明的实施例一为：一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，所述引物库是选取所述目的基因的外显子区域或热点区域，进行多重PCR引物设计，根据设计好的引物进行引物合成并混合后构建而成的。所述目的基因的外显子区域或热点区域以及其唯一国际NCBI机构编号如下表所示：
一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库，将该试剂盒用于淋巴瘤基因的高通量测序方法，利用所述试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；其中，所述测序分析的操作为：将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。
更具体地，所述文库构建采用两步法多重PCR法，其原理如图1所示，目标基因(gDNA)经过由多对PCR引物组合而成的Panel的扩增后，得到含有大量目的DNA碱基片段的初始文库，通过将测序仪所需识别的测序接头1、2连接到单个片段的两端后，进一步通过PCR进行目标DNA文库的富集，最终形成最后的文库后，即可进行测序。具体而言，操作流程如下：1)从FFPE或其他样本中，提取含有目的基因的DNA样本；2)将提取后的DNA样本进行多重PCR反应，扩增出目的DNA片段；3)向每个多重PCR反应后的管中，添加不同的NGS测序标签，然后两端连接含有测序所需的接头，并利用磁珠进行纯化，最终得到带测序接头的目标DNA片段混合体，即NGS测序文库(Library)。所述步骤1)中，DNA样本提取可采用商用的试剂盒，优选凯杰公司(Qiagen)中用于提取引物库目标基因DNA的提取试剂盒，并结合Nanodrop、Qubit等仪器进行提取后的DNA浓度及质量监控；所述步骤2)中的接头可以是测序通用接头，也可以是Life tech的测序接头，如采用Life tech的接头，后续测序及分析流程则与Life tech相应的流程一致即可，采用的PCR试剂优选采用商业试剂，如Life tech公司的《Amliseq Library kit》，针对步骤3)中的index，采用Illumina通用index序列，其最终文库结构为TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-XX-AA-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCAC GAGAC。其中，第一部分以及最后一部分碱基序列为Illumina测序所需的两端接头碱基序列，“XX”为不同序列的index，用以区分不同样本的DNA数据，“AA”为PCR产物，其长度在150bp左右。另外，接头序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它Illumina对应接头序列。
所述测序分析的具体操作流程为：I)、采用Illumina平台配套仪器，测序过程中将对各个DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成fastq/BAM等数据文件，测序深度平均在1000x左右，保证低比例突变能被有效地检测到；II)、对上述测序仪得到的数据进行分析，具体为：a)原始数据经index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用BWA软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据；b)利用Samtools及GATK等软件，对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的SNP及indel信息；c)利用上述获得目标片段中的基因突变(SNV)及微小插入/缺失突变(indel)数据，通过Annovar、Clinvar、dbSNP、Cosmic等软件及数据库进行突变的解读。所述步骤I)中的仪器，本发明涉及到的试剂盒可以兼容多种Illumina测序仪，包括从Miseq、Hiseq到Novaseq等机型均在本发明的适用机型范围内；所述步骤II)中，数据分析包括但不仅限于不同样本数据拆分、数据质量控制(Q30)、SNP call、Coverage analysis等等部分，使用可以是任意商业化的软件或自主开发的相关软件进行分析均不影响本发明目的的实现。
本发明实施例二为：一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，包含所述引物库中的全部引物，将述试剂盒应用于淋巴瘤检测的操作流程如下：1、样本DNA的提取：采用商业化的FFPE样本DNA提取试剂盒(Qiagen《GeneRead DNA FFPEKIT》)，将切片上的FFPE提取成DNA溶液，采用Nonodrop测定DNA 260/280质量，利用Qubit仪器检测DNA浓度。2、将上述得到的DNA样本利用本发明试剂盒进行建库，具体流程如下：a)将上述操作提取得到的DNA按照如下表1所示比例成分配置：
表1DNA反应液组分表
| 组分 | Hotspot反应体系(10μL) |
| 高保真PCR缓冲液 | 2 |
| 5X引物库 | 2 |
| 基因组DNA，10ng | Y |
| 去离子水 | (6-Y) |
| 总体积 | 10 |
备注：Y为10ng DNA所需加入的液体体积。
b)将上述加入DNA的反应液加入到热循环仪中按照如下表2所示的参数进行PCR反应：
表2反应参数表
c)将1μLfuPa溶液加入到上述操作得到的PCR反应液，混匀后放置于热循环仪中进行如下表3的时间梯度进行反应：
表3时间梯度表
| 温度 | 时间 |
| 50℃ | 10min |
| 55℃ | 10min |
| 60℃ | 20min |
| 10℃ | 保持(最多1小时) |
d)上述反应结束后，按照如下表4进行下一步反应液配置：
表4成分表
| 组分 | 体积 |
| Switch溶液 | 2μL |
| 稀释特异性标签混合液 | 1μL |
| DNA连接酶 | 1μL |
| 总体积(包含11μL消化的扩增子) | 14μL |
e)将上述反应液放置于热循环仪中按如下表5所示时间梯度进行如下反应：
表5
| 温度 | 时间 |
| 22℃ | 30min |
| 72℃ | 10min |
| 10℃ | 保持(最多1小时) |
f)上述反应结束后，按如下步骤进行纯化：i、打开PCR管或96孔板薄膜，每孔加22.5μL(1.5X样本体积)AMPure XP磁珠，移液器上下吹打5次，将DNA和磁珠充分混匀；ii、混合液室温孵育5min；iii、将混合液放到磁力架上，静置2min，直到混合液变清澈，去除上清液，上清液去除操作过程中应当注意不要扰动磁珠；iv、每管加150μL新配置70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清液，避免扰动磁珠；v、重复操作iv一次；vi、确保所有乙醇被除尽，PCR管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5min；g)待乙醇完全干燥后，打开PCR管或96孔板薄膜，每孔加入25μL高保真Platinum PCR超级混合液，取1μL试剂盒中的扩增引物，高保真Platinum PCR超级混合液和文库扩增引物可提前混匀；h)将混合液放置于热循环仪上，按下表6所示的条件进行反应：
表6
i)每管加入12.5μL(0.5X样本体积)AMPure XP磁珠，每管大约25μL样本，盖上PCR管或96孔板薄膜，涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀；j)室温孵育5min；k)将PCR管或96孔板放到磁力架上，至少5min，直到溶液澄清；l)小心转移上清液至新离心管中，每管加入30μL(1.2X样本体积)AMPure XP磁珠，每管大约25μL样本，盖上PCR管或96孔板薄膜，涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀；m)混合液室温孵育5min；n)将混合液放到磁力架上，静置2min，直到混合液变得清澈，去除上清液，操作时注意避免扰动磁珠；o)每管加入150μL新配置70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，避免扰动磁珠；p)重复上述步骤o)一次；q)确保所有的乙醇被除尽，PCR管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5min；r)各PCR管或96孔板每孔加入25μL去核酸水溶液AMPure XP磁珠，盖上PCR管或96孔板薄膜，涡旋混匀或移器上下吹打5次混匀；s)将PCR管或96孔板放在磁力架上，至少2min，直到溶液澄清，吸取上清20μL，上清即文库，做好标记；t)将上述文库进行Qubit仪器质控检测，并记录浓度，浓度低于0.2ng/μL的文库视为不合格文库。
3、文库测序：将上述文库按Illumina测序准备流程操作并进行测序。
4、数据分析：a)原始总数据经过机器拆分后，得到不同样本的原始测序数据；b)利用BWA软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据；c)利用Samtools对上述处理完毕后的数据进行进下分析得到所需的SNP及indel信息；通过Annovar软件进行上述SNP及indel进行注释，并结合Clinvar、Cosmic、PubMed等数据库整理突变意义信息；e)去掉对临床指导没有帮助的突变结果，保留具备明确临床指导的突变位点及注释信息。
本发明所采用的引物库包含了157个基因的引物片段，所选引物90％以上具备明确的临床意义，旨在降低无效数据及模糊测序结果对疾病检测结果造成的干扰，同时节约整体实验成本。
上述实施例中的文库构建均采用多重PCR方法进行文库构建，但本发明方案并不仅限于该方法，例如杂交捕获等其它方法进行文库构建同样适用于本发明方案，其区别在于将利用引物库中的引物杂交捕获目标DNA片段，其具体操作步骤及所需试剂可根据本领域常规的操作流程。本发明所采用的引物库包括但不限于本发明内容中所列举的157种基因，还可以包括其他基因及其他引物。
综上所述，本发明提供的一种高通量测序试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒在检测过程中具有低起始量检测广泛、灵敏度高、准确性高、适用范围广、实用性强等优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 珠海铂华生物工程有限公司
<120> 一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用
<160> 188
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ctggctggac caagcccatc accat 25
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
cttgaactta gggctgcttg tggct 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
agccgccagc ggaactgctt tttcg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
tccccacttt tcctcttgca gcagc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ggcgtgtgta catttcttat ctgga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
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<400> 6
gtgacaggta agacccagat ccagt 25
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<211> 25
<212> DNA
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<400> 7
cgcgcgctgg gaatccgacc tctcc 25
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<211> 25
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ctcgagtgat gattgggaga ttcct 25
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<211> 25
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<400> 9
cgaactttaa tctcatacat tgctg 25
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<211> 25
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atttggtctg gaagtcacat tcctt 25
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<211> 25
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<400> 11
tttgcattct tggtcatctg cattc 25
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<400> 12
cttctggcag aatgctggag ccttt 25
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<211> 25
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<400> 13
ttcctggaac attgtttcaa aggct 25
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<211> 25
<212> DNA
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<400> 14
ctgtaggaat ctttcccatg agaag 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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<211> 25
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agttaagaac taggtgctta tttat 25
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atactgaaga tcacacccaa gcttt 25
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ctctgtcctc atgacctcgc ccttg 25
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<211> 25
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aaaggacaag tacaggaagc agatc 25
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<400> 20
cctgatacag atgctacttg actta 25
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<211> 25
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<400> 21
gcctggcggt gcacactatt ctgcc 25
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ggccagaacc ttcctcctct tcctc 25
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<211> 25
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ggccagaacc ttcctcctct tcctc 25
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ccgggcctgg ctcaccatcg aagtc 25
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gctgctcatc aagctctagc tcctc 25
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<211> 25
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tgtcagcttt aataagccat taaat 25
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cggaagatgc tcttctcctc gttct 25
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caaatattac tgataccatg aagtt 25
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cttgatgtct ctggctagac caaaa 25
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tcgctgtaga acgcaccata gaagc 25
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tttccattta tctcctcaac aacct 25
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cttcctcacc ctcgccagag acaag 25
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tctggatctc ttcatgcacc ggaaa 25
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tcttgccact cgtacttgcc ctcta 25
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ccccaaatct cggaccgtcc cttcg 25
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attgacaacc ggcagtgtgt gcagg 25
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ttcaatataa tgctggaccg ccata 25
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ccaggaatgg tcctcacctg tcttc 25
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cggagcatgt acccgagagg ctggc 25
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ggcctccagc acctgccaga agaag 25
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agaagccatt atctgcaaaa atatc 25
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cccagagatt ttcactgagt ttttc 25
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aaatcagtct tccttctacc ctggt 25
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ggctgctggt ctggctacta tgatc 25
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catcactatg gcttagcgtc tccaa 25
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tgtaaacgta actcaaccag tatat 25
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<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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tctgcagccc agatttactg cattt 25
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tttttagatt ttgtggtgga tgcaa 25
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cctgatccca ctttcattcc ctcag 25
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atcacctttc cttgcctctt tccta 25
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cccccattgt gactttccag ctcat 25
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aaacggcaag ggtggcgaac ttttt 25
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ctagaatttt attacccaga actgt 25
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acttacttct aatgtgcatt tgttt 25
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tctatggttg ggaaagggtc attac 25
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ctgcagcttc tttcaagaac tcttc 25
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cctacacatt ccctcattct cttgc 25
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<211> 25
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gactgctctt ttcacccatc tacag 25
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tagcactttt cgaagaactt cagag 25
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ctagcatcta ttgctggcac catct 25
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cggcccgagg aataacaaga cggta 25
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tcttctcctc ctagacaaag atcat 25
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aagcaatgtg cctttaaaag aggtc 25
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ccgaggctag accttctctg tccat 25
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gaccactatt atctctgtcc tcaca 25
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agccccaggg cttcatcaca cccat 25
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ctggcctctt acctgggtca cacat 25
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ggggtgacag agctccaaga ggtga 25
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tgccctgggt acccatgtcc ttgct 25
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tgctggtaag gagactgagc ctgtg 25
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tgggaatagg cagtttgctg ggact 25
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cagcaaagtt ctcatgacac taacc 25
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aggatgcctg agacccaaat gaatc 25
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atcacctttc agaaggtgca gaaat 25
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gctggaaatc cctgatgtgc tcact 25
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aaggagactg agctggatta ctctg 25
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agtcaccttt ccctctccct aaagc 25
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acctcgatct tgggcaatgc ttgat 25
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cagctctcca aaagctactg catag 25
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<212> DNA
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tccggaaggc tgacgcggag ataag 25
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<212> DNA
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agctccccat ggagttctgc tggta 25
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<212> DNA
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tatctactcc taactgggta gtata 25
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gccaggctgt ccatgcattt gacct 25
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gttgcccatg gaggcgtgac tcatc 25
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agtttcttgg gttttccggt tcatg 25
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ctgttttgga tagagttggc agcaa 25
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ttgatcatgc cagccatact attaa 25
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aaatccctag tgagaatgac tagca 25
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<212> DNA
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taccttggat ttggattctg tcttg 25
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tcctatcact gaaaaagata ggaca 25
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 171
ccagataacg gtccacccac atctt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 172
aatccaccaa tctccttcac agaca 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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tgaagccagt gagtacctag aaagg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 174
ggatatactg ctttttcaag gagct 25
<210> 175
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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gctggatctt gggctgggac ttctt 25
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<211> 25
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ataagcctct tattcatatc ctgaa 25
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ggggatctga ctgtgtggtg tggat 25
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<213> 未知(Unknown)
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ttcccatgca cttatcttca gccat 25
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<212> DNA
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gctgataccc agggtttgga gtcat 25
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ctgccctgag gacatgaagg gatca 25
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<212> DNA
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ttacctcact ctgtcataag gacct 25
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aacaaaattg gagaggcaga ttgag 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 184
gggtagcggc taggagaata catcc 25
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<213> 未知(Unknown)
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gcagtggcga agcctgatcc atagc 25
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<211> 25
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<213> 未知(Unknown)
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tgctgttgat acattgtagt ctgct 25
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<400> 187
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
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<211> 34
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 188
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34
Claims (10)
1.一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：包括以下步骤：
针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SETD2、SF3B1、SGK1、SH2B3、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STAT3、STAT5B、STAT6、TBL1XR1、TCF3、TET1、TET2、TMSB4X、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF1B、TP53、TRAF3、TRRAP、U2AF1、USP7、VAV1、VMA21、WHSC1、WT1和XPO1。
2.根据权利要求1所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述引物库是选取所述目的基因的外显子区域或热点区域，进行多重PCR引物设计，根据设计好的引物进行引物合成并混合后构建而成的。
3.根据权利要求2所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述引物库包括多对引物对，所述多对引物对中至少一对引物对的正向引物与反向引物中的特异性序列分别包含核苷酸序列如SEQ ID No.m与SEQ ID No.(m+93)所示的特异性序列，其中，m为从1到93的任意一个自然数。
4.根据权利要求1所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述获取目标DNA片段的操作是通过多重PCR扩增法或杂交捕获法得到目标DNA片段。
5.根据权利要求4所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增法的具体操作为：在每个多重PCR反应后的装置中，添加不同的NGS测序标签，然后再在两端连接含有测序所需的接头，并利用磁珠进行纯化，最终得到带测序接头的目标DNA片段混合体，即构建形成所述高通量测序文库。
6.根据权利要求5所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述测序标签采用Illumina的测序标签序列，其最终文库结构为：测序接头I-XX-AA-测序接头II，其中，测序接头I和测序接头II为Illumina测序所需的两端接头核苷酸序列，所述测序接头I的核苷酸序列如SEQ ID No:187所示，所述测序接头II的核苷酸序列如SEQID No:188所示；所述XX为不同序列的index；所述AA为PCR产物。
7.一种用于构建如权利1-6任一项所述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，其特征在于：包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库。
8.一种用于淋巴瘤基因检测的高通量测序方法，其特征在于：包括以下步骤：
利用如权利要求7所述的试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；
其中，所述测序分析的具体操作为：
将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。
9.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于：对所述数据文件进行分析处理的操作具体包括以下步骤：
a)原始数据经过index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用BWA软件对数据进行比对分析，比对到人类基因组数据库Hg19参考序列上，同时筛除低于Q30质量的数据；
b)利用软件，对上述步骤a)处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的SNP及indel信息；
c）利用上述获得目标片段中的SNV及indel数据，通过软件及数据库进行突变的解读。
10.一种或多种引物在制备用于构建如权利要求1-6任一项所述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂中的应用，其特征在于：所述引物选自所述引物库。
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|---|---|---|---|---|
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