CN112410424A - 一种nk/t细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及NK/T细胞淋巴瘤相关基因检测试剂盒及建库方法。本发明的NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒包括针对65个目的基因捕获探针。本发明试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短、覆盖率高、比对率高、均一性好、操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及NK/T细胞淋巴瘤相关基因检测试剂盒及建库方法。
背景技术
淋巴瘤是起源于淋巴结和淋巴组织的血液系统恶性肿瘤，病理类型复杂，发病率高。传统的淋巴瘤主要分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)两大类，后者又可分为B细胞NHL和T细胞NHL等不同类别。NK/T细胞淋巴瘤(Natural-killer/T-cell lymphoma，NK/TCL)是一类CD56阳性/CD3阳性的淋巴细胞恶性增殖性疾病，好发于亚洲及南美洲地区，与EB病毒感染密切相关。NK/TCL呈高度恶性及侵袭性，对基于蒽环类药物的化疗方案耐药，临床预后极差。大约75％的Ann Arbor分期为I-II期的NK/TCL患者病灶局限累积鼻腔及其邻近组织，放疗作为一种有效的抗肿瘤治疗方法，被常规应用于此类早期患者。然而，放疗联合化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和强的松(prednisone)等组成CHOP或CHOP-like方案的疗效和长期生存并不理想，治疗的总反应率(overall response rate，ORR)低于60％，5年总生存率(overall survival，OS)低于50％。在过去数十年中，基于门冬酰胺酶的抗代谢治疗方案，如地塞米松(dexamethasone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、异环磷酰胺(ifosfamide)、左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase)和依托泊苷(etoposide)组成的SMILE化疗方案，左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase)、甲氨蝶呤(methotrexate)和地塞米松(dexamethasone)组成的AspaMetDex化疗方案等，均显著改善了NK/TCL患者的生存和预后。其中，SMILE化疗方案联合放疗用于初发的结外鼻型NK/TCL的治疗有效率高达90％。AspaMetDex化疗方案用于复发/难治的NK/TCL的治疗总有效率高达78％。MESA化疗方案作为早期NK/TCL患者一线治疗方案ORR为92.1％。在当前最优的治疗策略——基于门冬酰胺酶的抗代谢治疗下，早期患者的5年生存率仅为72％(155例患者统计数据)，晚期患者的5年生存率仅为50％(87例患者统计数据)。在过去二十年间，一系列组学研究报道了与NK/TCL疾病发生进展相关的多种遗传学及分子生物学异常。Ko et al.通过对7例鼻型NK/TCL进行比较基因组研究(Comparative genomic hybridization，CGH)报道了一系列疾病相关DNA基因拷贝数变化(copy number alterations)，包括2q5，13q4，10q3，21q2，3q2，5q2和17q2等染色体区段的扩增，以及1p4，17p4，12q3，13q2和6q1等染色体区段的缺失，进而引起癌基因激活和抑癌基因抑制，导致肿瘤发生。Jiang et al.通过对105例NK/TCL患者进行全外显子测序研究，首次报道了以DDX3X，TP53，MGA，JAK-STAT信号分子(STAT3和STAT5B)，表观遗传学调控分子(MLL2，EP300，ARID1A和ASXL3)等为代表的一系列肿瘤相关的重现性突变。上述结果在Dobashi et al.的研究中也得到证实，通过对25例结外NK/TCL患者进行靶向捕获测序发现BCOR3，TP53，DDX3X，MLL3等一系列高频重现突变。在一系列疾病相关重要基因突变的基础之上，癌症相关的JAK-STAT信号通路、NF-kB信号通路和MAPK信号通路的异常激活在肿瘤发生发展中扮演重要角色。Ng et al.对9例NK/TCL肿瘤组织标本和5株NK细胞株的全基因组表达谱(comprehensive genome-wide geneexpression profiling，GEP)研究发现，细胞周期相关信号通路及信号分子，如PLK1、CDK1、Aurora-A等，抗凋亡信号通路及信号分子，如MYC、TP53、NF-kB p50等，均存在显著异常调控。Chen et al.报道了位于6号染色体长臂的受体型酪氨酸激酶k(receptor-typetyrosine-protein phosphatase k，PTPRK)在NK/TCL中显著低表达，促进STAT3Tyr705的磷酸化，进而形成二聚体并向胞核转移集合特定DNA，与疾病的发生进展及预后不良密切相关，在阐明其分子机制之余，也进一步论证了前期组学研究报道的结果。表观遗传学异常也广泛存在于NK/TCL中，除了前面提到的表观遗传学调控基因突变外，
et al.对12例NK/TCL患者和7株NK细胞株开展的启动子及位点特异性甲基化分析发现，NK/TCL中存在显著的高甲基化，表现为以抑癌基因及BCL2L11(BIM)，DAPK1，PTPN6(SHP1)，TET2，SOCS6和ASNS等基因的转录抑制，与NK/TCL致癌机制及左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase)治疗靶点及疗效反应密切相关。Ng等人对30例NK/TCL患者和7株NK细胞株开展的microRNA芯片检测，发现miR-101，miR-26a，miR26b，miR-28-5和miR-363存在显著异常表达，通过调控靶基因MUM1，BLIMP1和STMN1等，引起细胞周期、TP53和MAPK等信号通路异常。Li et al.等人通过对192例NK/TCL患者和2476例正常志愿者进行的全基因组关联研究(genome-wide associationstudy，GWAS)发现HLA-DPB1的基因组多态性与疾病发生密切相关，并为NK/TCL免疫治疗提供了分子生物学和遗传学的理论证据。
在新的抗代谢治疗方案下，NK/TCL的预后评估体系及预后相关分子靶标有待深入研究。经典的淋巴瘤国际预后指数(International prognostic index，IPI)，以及新建立的针对NK/TCL的临床预后指数PINK(prognostic index of natural-killer lymphoma)和PINK-E(PINK in combination with peripheral blood Epstein-Barr virus DNA)在抗代谢治疗时代具有广泛的应用价值。然而，预后相关分子生物学靶标领域的研究仍旧是一片空白。针对128例NKTCL肿瘤样本的基因组测序(WGS/WES)、拷贝数变异(CNV)和转录组测序(RNA sequencing)整合研究提出基于分子遗传学特征、表达谱特征、细胞来源(cell oforigin)和EB病毒潜伏感染类型及病毒基因表达特征的三种不同分子亚型，进一步系统揭示了NKTCL的致病分子机制。TSIM(Tumor Suppressor and Immune Modulator)亚型表现为6号染色体长臂(6q)缺失，抑癌基因TP53突变，9号染色体短臂(9p24.1)PD-L1/2基因区段扩增和JAK-STAT基因突变；下游JAK-STAT信号通路、免疫相关NK细胞介导细胞毒性和抗原呈递通路激活；NK细胞来源为主；EB病毒II型潜伏感染及病毒基因BALF3高表达。MB亚型表现为MGA基因突变，1号染色体短臂(1p22.1)BRDT基因区段杂合性缺失；下游MAPK、WNT和NOTCH信号通路激活；T细胞来源为主；EB病毒I型潜伏感染。HEA亚型表现为表观遗传学相关HDAC9、EP300和ARID1A基因突变；下游NF-κB和T细胞受体信号通路激活；T细胞来源为主；EB病毒II型潜伏感染及病毒基因BNRF1高表达。更重要的是，研究证实分子分型与临床预后显著相关，并为NKTCL靶向治疗提供潜在靶点。三种分子分型在培门冬酶为基础的抗代谢治疗中呈现不同的预后特征：TSIM亚型和HEA亚型预后显著优于MB亚型患者。临床前研究发现，TSIM亚型对免疫抑制剂PD-1抗体Pembrolizumab敏感，MB亚型患者对高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)敏感，HEA亚型患者对组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达苯胺敏感，为上述靶向药物应用于NKTCL临床诊疗提供重要理论依据，有望通过临床分型改善NKTCL患者的临床疗效。
目前淋巴瘤靶向测序，尤其是深度靶向测序，敏感性高，可同时对数十个甚至数百个基因和/或拷贝数变异进行检测。鉴于此，本发明提出一种基于靶向测序的NK/TCL相关基因检测试剂盒及扩增子文库的构建方法。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有用于捕获目的基因的探针，目的基因包括：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC。可选的，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
可选的，所述检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。
可选的，所述建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；所述建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；所述建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)。
本发明还提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；所述探针用于捕获以下目的基因：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
可选的，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
本发明的技术效果至少为：
本发明通过联合瑞金医院淋巴瘤多学科整合(MDT)团队和来自全国血液/肿瘤临床多中心协作组(M-HOPES)的22家医院，完成128例NK/T细胞淋巴瘤肿瘤样本的基因组测序(WGS/WES)、拷贝数变异(CNV)和转录组测序(RNA sequencing)，提出基于分子遗传学特征、表达谱特征、细胞来源(cell of origin)和EB病毒潜伏感染类型及病毒基因表达特征的三种不同分子亚型，进一步系统揭示了NKTCL的致病分子机制，提出涉及RNA helicase，tumorsuppressor，JAK-STAT pathway，Epigenetic modifier，MAPK pathway等通路，并整合EB病毒致病相关基因的65个基因突变及拷贝数变异。这是目前为止NK/T细胞淋巴瘤群体进行的最大数量最全面的多组学研究，为抗代谢治疗时代预后分层级靶向治疗奠定基础。本发明的NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒包括针对65个目的基因捕获探针。本发明试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短、覆盖率高、比对率高、均一性好、操作简单等优点。
附图说明
图1为DNA文库峰形图(Agilent Bioanalyzer 2100)；
图2为杂交捕获文库峰形图(Agilent Bioanalyzer 2100)；
图3为实施例2中样本序号为1的片段化质检结果；
图4为实施例2中样本序号为2的片段化质检结果；
图5为实施例2中样本序号为3的片段化质检结果；
图6为实施例2中样本序号为1的预文库质检结果；
图7为实施例2中样本序号为2的预文库质检结果；
图8为实施例2中样本序号为3的预文库质检结果；
图9为实施例2中样本序号为1和2的终文库质检结果；
图10为实施例2中样本序号为3的终文库质检结果。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，含有用于捕获目的基因的探针，目的基因包括：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC。
探针可采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；具体的，采用的数据库包括：RefSeq。外显子区域坐标具体图表1所示：
表1
S2、截取一个外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，调整为调整评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对外显子区域的集合按照S2～S4方法获取探针，获得探针的集合。
可选的，检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)。Pre-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)具体如表2和表3所示：
表2
表3
具体的，接头混合液可采用迪赢生物产品(货号为LP2004A)。杂交捕获试剂盒包括杂交捕获试剂盒-1、杂交捕获试剂盒-2和杂交捕获试剂盒-3；杂交捕获试剂盒-1中含有杂交液1、杂交液2、洗液1、洗液2和洗液3；杂交捕获试剂盒-2中含有杂交液3和探针保护液；杂交捕获试剂盒-3中含有通用封闭液和后PCR引物混合液。上述可采用迪赢生物产品(货号为C1001A)。
本发明实施例还提出一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；探针用于捕获以下目的基因：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
其中，探针采用上述方法设计得到。
实施例1
本发明实施例试剂盒的组成如表1所示：采用迪赢生物产品(货号为L1001A、LP2004A、C1001A、CP3004A、Y1016A)。
表1
捕获探针的设计方法为：
S1、根据数据库提取目的基因的外显子坐标，外显子区域坐标具体图表1所示；
S2、截取一个外显子区域的1～120bp作为第一个探针单元，截取外显子区域的60～180bp作为第2个探针单元，截取外显子区域的120～240bp作为第3个探针单元，截取外显子区域的180～300bp作为第4个探针单元，依次截取，获得该外显子区域的探针；
S3、对探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，调整评分低于阈值的探针的序列截取时的长度为50～70bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对表1的外显子区域按照S2～S4方法获取探针，获得探针的集合，人工合成用于杂交。
试剂盒的具体使用方法为：
1、基因组打断
1.1启动Covaris S220 system：确保新鲜的去离子水超过Covaris槽上level12；事先预冷并脱气半小时。
1.2转移50μL的DNA样本到Covaris micro Tube，贴壁慢慢打出液体，小心不要在tube底部产生气泡。
1.3在Covaris S220和M220的超声条件设置如表5所示：
表5
| 仪器型号 | Covaris S220、M220 |
| 温度(℃) | 20 |
| Peak Incident Power(W) | 75 |
| Duty Factor(％) | 20 |
| Cycles Per Burst | 200 |
| 打断时间(秒) | 205(100For FFPE) |
2、补平修复加A
2.1配置表6反应体系，并吹打混合均匀。
表6
| 组分 | 体积(μL) |
| 上步产物或DNA样本 | 39 |
| FFPE DNA修复混合液 | 3 |
| 末端修复加尾缓冲液 | 6.8 |
| 末端修复加尾酶 | 1.2 |
| 共计 | 50 |
2.2放置于PCR仪上执行表7程序：
表7
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 30 | 30 分钟 |
| 2 | 65 | 30 分钟 |
| 3 | 4 | 孵育 |
3、接头连接
3.1配制表8所示的接头连接的反应体系：
表8
| 组分 | 体积(μL) |
| 上述产物 | 50 |
| 接头混合液 | 2.5 |
| 连接缓冲液 | 16 |
| 连接酶 | 6 |
| 无核酸酶水 | 5.5 |
| 共计 | 80 |
3.2吹打混合均匀，瞬时离心。
3.3放置于PCR仪上执行表9所示程序，同时取出磁珠室温孵育30分钟备用，用无核酸酶水配置足够80％的乙醇。
表9
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 25 | 15分钟 |
| 2 | 4 | 孵育 |
3.4加入64μL的纯化磁珠，Vortex混合均匀。
3.5室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
3.6放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
3.7加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
3.8再加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
3.9快速离心后用10μL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。
3.10从磁力架上取下管子，加入14μL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。
3.11放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
4、Pre-PCR反应
4.1配置表10所示反应体系，并Vortex混合均匀。
表10
| 组分 | 体积(μL) |
| 上述洗脱产物 | 14 |
| PCR混合液 | 25 |
| QU试剂 | 3 |
| Pre-PCR P5(1-8) | 4 |
| Pre-PCR P7(1-12) | 4 |
| 共计 | 50 |
4.2根据不同的样本类型，样本起始量，按照表11所示的PCR条件执行PCR扩增：
表11
4.3在PCR管中加入40μL的纯化磁珠，Vortex混合均匀。
4.4室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
4.5放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
4.6加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
4.7加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
4.8快速离心后用10μL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。
4.9从磁力架上取下管子，加入20μL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。
4.10放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
4.11质控步骤：安捷伦2100或4200仪器检测片段范围和Qubit BR测定浓度。片段范围在225bp～275bp。DNA文库产量不低于500ng。得到的文库峰形图如图1所示。
5、样本及探针杂交
5.1根据Qubit浓度取总量500ng的建库文库进行后续杂交，cfDNA样本建议使用所有的文库已获得完整的样本信息。使用浓缩干燥仪进行浓缩，温度不超过45℃，刚好干燥完成后加入5μL无核酸酶水和7.7μL的universal blocker通用封闭液充分震荡混匀，混匀后静置。
PS：若无浓缩干燥仪，也可采用加入1.8倍的纯化磁珠进行步骤4.4-4.8，但DNA损失会较大。
5.2放置于PCR仪上执行表12所示程序，带热盖模式运行。
表12
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 95 | 5分钟 |
| 2 | 65 | 孵育 |
5.3在1.5mL EP管中制备表13所示杂交混合液，根据样本量配置单个或多个：
表13
5.4使用旋涡混匀仪剧烈震荡2秒后快速离心。
5.5转移全部18.5μL的杂交探针混合溶液到5.1步的文库混合液中(一直保持在PCR仪上操作)，轻轻吹打10次。
5.6密封好管盖，在65℃杂交16小时。
6、链霉亲和素磁珠准备
6.1实验前至少2小时将洗液3放置65℃水浴锅预热(每个样本需要600μL，建议可预热准备650μL，温度计测量水温确保水浴锅65℃)。
6.2在漩涡震荡器上重悬QuarAcces Hyper Enrichment beads(室温平衡30分钟以上)。
6.3每个反应吸取50μL QuarAcces Hyper Enrichment beads到1.5mL LoBind管中。
6.4加200μL的洗液1，在漩涡振荡器上震荡5秒钟，充分混匀磁珠。
6.5快速离心后，放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
6.6重复步骤6.4-6.5，总共3次清洗，最后用200μL的洗液1重悬磁珠，室温放置待用。
7、捕获磁珠富集文库及清洗
7.1杂交混合液65℃孵育约16小时后，确保剩余杂交体系体积不低于20μL。然后直接在PCR仪上打开PCR管，将杂交混合液吸出，加入200μL磁珠混悬液中，震荡混匀5秒。
7.2室温将管子放置在垂直旋转器上旋转孵育30分钟。
7.3从旋转器上取下8连管或96孔板，简短离心后，放置磁力架5分钟，待液体清澈后，吸走上清。
7.4加200μL的洗液2来重悬磁珠，在振荡器上混匀5秒钟，室温孵育15分钟，每间隔5分钟，在漩涡振荡器上振荡一次。
7.5简短离心后，放置磁力架上待液体清澈后，吸走上清液；放置65℃的PCR仪上，马上加200μL的在6.1步预热好的洗液3，在PCR仪上吹吸10次使磁珠完全混匀，65℃孵育10分钟。
7.6重复步骤7.5，共3次，注意第二次和第三次洗的过程在磁力架上的时间尽可能短，最后吸走上清后再简短离心，用20μL的移液器吸走残余液体。
7.7加20μL无核酸酶水重悬磁珠，上下吹打均匀后全部磁珠悬液加入新的PCR管。
8、Post-PCR反应
8.1配置表14所示的反应体系，上下吹打混合均匀，注意不要快速离心。
表14
| 组分 | 体积(μL) |
| 磁珠混悬液 | 20 |
| PCR混合液 | 25 |
| 后PCR引物混合液 | 5 |
| 共计 | 50 |
8.2放置于PCR仪上，按照表15所示的条件执行PCR扩增：
表15
8.3将PCR管放置于磁力架上，静置1分钟后吸取大约50μL的上清液转移至新的PCR管中(注意：上清液中包括捕获后文库，请勿遗弃)，然后加入40μL混匀的纯化磁珠，吹打混匀。
8.4室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
8.5放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
8.6加入200μL的80％乙醇(当天配置)，静置1分钟后弃上清。
8.7再次加入200μL的80％乙醇(当天配置)，静置30秒后弃上清，快速离心后弃去残余乙醇，室温放置3分钟。
8.8从磁力架上取下管子，加入30μL的Low TE缓冲液洗脱，吹打均匀后室温静置2分钟。
8.9放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
9、文库质检和上机准备
9.1使用Agilent Bioanalyzer 4200或2100仪器对样本进行质检，4200所需试剂为High Sensitivity D1000或D5000 ScreenTape，2100所需试剂为High Sensitivity DNAAssay。
9.2杂交捕获文库的峰形如图2所示，峰值约为250～350bp，一般的浓度约5～50nmol/μL。
9.3文库适用于Illumina(HiSeq 3000/4000，NextSeq platform，X-Ten及NovaSeq等平台)2×150测序模式，Index为双端(8bp)Index。对于新鲜FFPE样本测序数据量基于Panel大小和期望测序深度；对于中度降解样本(DIN值在3～8)测序数据量额外提高2～4倍；对于严重降解样本(DIN值小于3)测序数据量需额外提高5～10倍。
10、结果判定：峰值约为250～350bp，一般的浓度约5～50nmol/μL。
实施例2
1、以4个样本采用本发明实施例1的试剂盒及方法进行检测，得到的实验结果和数据如下。样本信息如表16所示：
表16
| 样本序号 | 浓度(ng/μL) | 样本类型 | 样本描述 |
| 1 | 173.6 | DNA | 临床诊断为NK-TCL |
| 2 | 8.26 | 石蜡包埋样本 | 临床诊断为NK-TCL |
| 3 | 71.0 | 胸腹水 | 临床诊断为NK-TCL |
| 4 | 78.0 | 细胞gDNA | 人T细胞白血病细胞 |
2、片段化后的实验结果如表17所示：
表17
备注：1)打断时间为：205s；2)目标片段化长度150bp。
片段化后质检结果如图3～5所示。其中，图3为样本序号为1的片段化质检结果，图4为样本序号为2的片段化质检结果，图5为样本序号为3的片段化质检结果。由图3～5可知：样本质量较好。
3、Pre-PCR反应的关键信息和实验结果如表18所示：
表18
采用QSEP机器对预文库进行质控，得到的实验结果如图6～8所示。其中，图6为样本序号为1的预文库质检结果，图7为样本序号为2的预文库质检结果，图8为样本序号为3的预文库质检结果。由图6～8可知：样本质量较好。
4、样本及探针杂交关键信息和实验结果如表19所示：
表19
终文库质检情况如图9、10所示。其中，图9为样本序号为1和2的终文库质检结果，图10为样本序号为3的终文库质检结果。由图9、10可知：样本质量较好。
5、测序：采用NovaSeq进行测序。
6、数据分析(QC)得到数据分析结果如表20：
表20
根据表20所示的实验结果可知，本实施例的试剂盒的重复率(Duplication rate)低，说明扩增的冗余性良好，正确比例率(Accurate mapping rate)高、比对到目标区域的Read占总read数的百分比(Reads capture rate)高、比对到目标区域的碱基占总碱基数的百分比(Bases capture rate)高，说明本发明试剂盒探针的捕获效率良好，试剂盒的整体性能良好。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒及建库方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggacca 8
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacggtca 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccacttg 8
<210> 4
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttggca 8
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttggtcaa 8
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtatga 8
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acactctt 8
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taacacca 8
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtccag 8
<210> 10
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgaccgtt 8
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagtgga 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccaacg 8
<210> 13
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgaccaa 8
<210> 14
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatacag 8
<210> 15
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagagtgt 8
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtgtta 8
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagttca 8
<210> 18
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggcttca 8
<210> 19
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgactgga 8
<210> 20
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagacta 8
<210> 21
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctcctga 8
<210> 22
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtggta 8
<210> 23
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aacaacca 8
<210> 24
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatccgtc 8
<210> 25
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caaggagc 8
<210> 26
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttcacgca 8
<210> 27
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccttac 8
<210> 28
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagacgga 8
Claims (6)
1.一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有用于捕获目的基因的探针，
所述目的基因包括：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；所述建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；所述建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5 (1-8)、Pre-PCR P7 (1-12)。
5.一种NK/T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；所述探针用于捕获以下目的基因：DDX3X、TP53、MGA、STAT5B、STAT3、JAK3、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT6、SOCS1、JAK2、SOCS6、EP300、CREBBP、ARID1A、HDAC9、BCOR、KMT2D、ASXL3、TET2、EZH2、FOXO3、NCOR2、KMT2C、KMT2B、KMT2A、KDM6A、SETD2、KRAS、NRAS、BRAF、RHOA、PTPRK、RRAS、MAP3K5、PRKD1、PTPRQ、PDGFRA、PDGFRA、VEGFA、ALK、KIT、MET、EPHA1、PDGFRB、PDGFRL、VEGFC、HLA-DPB1、HLA-DRB1、CXCR1、NOTCH1、NOTCH2、CTNNB1、NOTCH3、CTNND2、CTNND1、CTNNA3、CDK2、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ITPKB和ITPKC；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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