CN111850116A - 一组nk/t细胞淋巴瘤的基因突变位点群、靶向测序试剂盒及应用 - Google Patents

一组nk/t细胞淋巴瘤的基因突变位点群、靶向测序试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群，其试剂盒及应用。本发明提出一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群，可用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型、预测患者预后、指导患者用药。本发明的试剂盒采用Illumina Miseq测序平台及性能测序，可以高效、准确的检测出一系列NK/TCL疾病相关的突变基因，检测周期短、检测成本低、适用范围广、准确率高。

Description

一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群、靶向测序试剂盒及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群，其试剂盒及应用。
背景技术
NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)是一类CD56阳性/胞浆CD3阳性的淋巴细胞恶性增殖性疾病，好发于亚洲地区，与Epstein-Barr病毒(EB病毒)感染密切相关。NK/TCL呈高度恶性，侵袭性强，常规化疗耐药，预后极差，进展期患者五年生存率仅为20％，已成为严重危害人民健康的疾病，给患者本人、家庭和社会带来了深重的负担和痛苦。
NK/TCL的恶性程度高，患者预后差，发病机制尚待阐明。既往的细胞遗传学研究显示，NK/TCL呈现明显的基因组及表观遗传学不稳定性。比较基因组杂交检测表明，NK/TCL在6q等染色体上存在缺失，导致PRDM1、ATG5、AIM1、FOXO3和HACE等抑癌基因的沉默。同时，启动子区域甲基化水平分析亦发现启动子区域普遍呈现高甲基化以及相关基因低表达。在分子生物学层面，之前关注的热点主要集中在TP53和NRAS等已知肿瘤相关基因上，而近年来随着高通量测序技术的发展，关于NK/TCL基因组学研究也有了新进展，新加坡学者对4例NK/TCL进行了外显子组测序，发现JAK3基因p.A572V和p.A573V两个热点突变。美国学者通过测序同样找到了STAT3和STAT5B基因的相关突变。表达谱芯片分析显示，NK/TCL表达异常的基因主要调控NF-κB、MAPK、JAK-STAT等细胞信号通路。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群.
本发明的第二发明目的在于提出该基因突变位点群的应用。
本发明的第三发明目的在于提出一种靶向测序试剂盒。
本发明的第四发明目的在于提出该靶向测序试剂盒的应用。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明提出一组用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的基因突变位点群，所述基因突变位点群如表1所示。
本发明提出如表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的试剂盒中的应用。
本发明提出一组用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的基因突变位点群，所述基因突变位点群如表1所示。
本发明提出如表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的试剂盒中的应用。
本发明提出一组用于指导NK/T细胞淋巴瘤患者用药的基因突变位点群，所述基因突变位点群如表1所示。
本发明提出一组用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的基因突变位点群，其特征在于，所述基因突变位点群如表1所示。
本发明提出如表1所示的基因突变位点群作为靶点在制备用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的试剂盒中的应用。
可选的，所述突变位点群中的所述突变位点的所在染色体、所在基因、突变类型、转录本编号和氨基酸变化信息如表2所示。
本发明提出一种靶向测序试剂盒，其特征在于，所述靶向测序试剂盒中含有用于检测如表1所示的基因突变位点群的试剂；
优选的，所述靶向测序试剂盒采用Illumina Miseq测序平台进行测序；
更优选的，所述靶向测序试剂盒的待测样本选自冰冻组织样本、石蜡组织样本、新鲜组织样本。
本发明提出该靶向测序试剂盒在用于制备评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的制剂中的应用。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明提出一组NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群，可用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型、预测患者预后、指导患者用药。本发明的试剂盒采用Illumina Miseq测序平台及性能测序，可以高效、准确的检测出一系列NK/TCL疾病相关的突变基因，检测周期短、检测成本低、适用范围广、准确率高。在疾病确诊时即可获得基因突变特征，指导临床分层治疗，帮助医生进行用药指导，实现精准医疗，以提高患者的生存率，减轻患者生命健康及经济负担，对于改善患者预后、患者进行精准治疗具有重要的临床意义。
中国作为NK/T细胞淋巴瘤的高发地区，患病人数呈逐年上升趋势。本发明试剂盒对组织标本的要求较低，石蜡组织和冰冻组织抽提DNA均可用于检测，此类标本运输稳定性相对高，检测开展的门槛较低，提高了检测能力和效率，同时极大降低了检测成本，便于在各级别医院推广。
附图说明
图1为实施例2的一代测序实验结果；
图2为ucsc数据库中人类基因组序列hg19示意图。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本发明的范围。
具体实施方式
下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
NK/T细胞淋巴瘤具有明显地域分布特点的一种肿瘤，在北美和欧洲相对少见，亚洲和南美高发，约占淋巴瘤病例数的5％～15％。NK/T细胞淋巴瘤呈高度恶性，侵袭性强，常规化疗耐药，预后极差，进展期患者五年生存率仅为20％，已成为严重危害人民健康的疾病，给患者本人、家庭和社会带来了深重的负担和痛苦。研究发现，DDX3X、TP53等基因的突变与化疗疗效及预后密切相关。早期明确疾病相关基因突变情况，可指导临床化疗方案的选择，提高疾病治愈率。本发明实施例针对这一具有独特地域性的血液肿瘤，运用多种组学方法进行研究。一方面，从基因组学技术入手，运用全外显子测序的方法对105例NK/TCL患者肿瘤组织进行检测，发现RNA调控的重要基因-RNA解旋酶DDX3X基因在NKTCL中存在高频突变，其他高频突变基因还包括抑癌基因(TP53和MGA)、JAK-STAT通路相关基因(STAT3和STAT5B)和表观遗传学调控基因(MLL2、ARID1A、EP300和ASXL3)。存在DDX3X突变的患者治疗效果很差，中位生存期只有10个月，提示是NK/TCL的重要致病基因。进一步功能研究显示，DDX3X具有抑癌基因的生物学功能，其突变赋予NK细胞恶性增殖的能力，并导致淋巴细胞的关键细胞信号通路NF-κB和MAPK通路的异常激活，两者在NKTCL的发病机制中发挥着重要作用。本发明实施例提出了NK/T细胞淋巴瘤的基因突变位点群共235各突变位点，是NK/TCL全面系统的基因图谱，为NKTCL的预后预测提供了新的分子标志和药物靶点，为后续开展NKTCL联合靶向治疗的探索提供了依据。具体的，基因突变位点群的详细信息如表1所示。
表1
Figure BDA0002086570130000031
Figure BDA0002086570130000041
Figure BDA0002086570130000051
Figure BDA0002086570130000061
Figure BDA0002086570130000071
Figure BDA0002086570130000081
Figure BDA0002086570130000091
进一步的，本发明实施例还对基因突变位点群的所在染色体、所在基因、突变类型、转录本编号和氨基酸变化等详细信息进行了研究，具体如表2所示：
表2
Figure BDA0002086570130000092
Figure BDA0002086570130000101
Figure BDA0002086570130000111
Figure BDA0002086570130000121
Figure BDA0002086570130000131
Figure BDA0002086570130000141
Figure BDA0002086570130000151
本发明实施例的基因突变位点群具有多种用途，首先，其可用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型，根据突变的类型，可将NK/T细胞淋巴瘤再分为不同的亚型，从而可分层治疗，实现精准用药。NK/T细胞淋巴瘤目前没有经典分型，可根据突变类型简单分为MGA突变型、EP300突变型、HDAC9突变型、ARID1A突变型。其次，其可用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后，用于指导NK/T细胞淋巴瘤患者用药。例如，存在MGA突变患者疾病分期较高且预后较差。EP300、HDAC9、ARID1A等表观遗传学乙酰化调控相关基因突变患者对于靶向药物Chidmide治疗敏感。最后，其还可以作为靶点用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤的药物。
本发明实施例提出表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的试剂盒中的应用。
本发明实施例提出表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的试剂盒中的应用。
本发明实施例提出表1所示的基因突变位点群作为靶点在用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的试剂盒中的应用。
本发明实施例提出一种靶向测序试剂盒，该试剂盒中含有检测如表1所示的基因突变位点群的试剂。
进一步可选的，靶向试剂盒的待测样本选自冰冻组织样本、石蜡组织样本、新鲜组织样本。本发明实施例的靶向试剂盒对组织标本的要求较低，石蜡组织和冰冻组织抽提DNA均可用于检测，这类标本运输稳定性相对高，因此本发明实施例提出的试剂盒适用于在各级医院推广使用。
进一步可选的，靶向试剂盒采用Illumina Miseq测序平台进行测序。IlluminaMiseq测序平台是近年来推出的新一代小型化测序仪，这款仪器使用了Illumina TruSeq可逆中止碱基边合成边测序的化学方法，与HiSeq 2000相比，虽然每个Run的测序通量很低，但是久经考验的新一代测序试剂带来无可比拟的准确性，结合上全新的流体系统，使得一个测序循环时间缩短了8倍以上。具有以下特点：
1.测序周期短，Miseq运行时间短至24小时，可用于快速高效的扩增子测序或小基因组测序，以极少的时间完成数据量需求较少的项目。
2.Pair-end读长达250bp这款仪器使用了Illumina TruSeq可逆中止碱基边合成边测序的化学方法，与HiSeq 2000相比，虽然每轮的测序通量很低，但是久经考验的新一代测序试剂带来无可比拟的准确性，结合上全新的流体系统，使得一个测序循环时间缩短了8倍以上。
3.测序流程便捷：小巧、一体化的MiSeq平台整合了簇(cluster)生成，双端(Pair-end)测序和完整的数据分析，节省了实验室空间。通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID追踪，具有自动化的便利。此外，上述检测平台所需DNA用量极少，对于冰冻、石蜡组织具有较好的稳定性及准确性。
本发明实施例还涉及该靶向试剂盒在用于制备评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的制剂中的应用。
本发明实施例还涉及该靶向试剂盒在用于制备评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的制剂中的应用。
本发明实施例还涉及该靶向试剂盒在用于制备筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的制剂中的应用。
下面通过具体实施方式对上述内容展开进一步详细说明。
实施例1
本实施例所使用的试剂具体如表3所示，其他试剂如无具体说明均为市售试剂。
表3
Figure BDA0002086570130000161
Figure BDA0002086570130000171
一、样本的获得
NK/T细胞淋巴瘤患者102例，有分子检测意愿并征得知情同意后，获取患者冰冻组织样本、石蜡组织样本，也可采用活检组织标本。
二、样本的抽提DNA流程：
①冰冻标本DNA抽提试剂均购自Promega(Beijing，China)，具体步骤如下：
将肿瘤组织放入盛有600μL核裂解液和20μL蛋白酶K的1.5mL离心管中，56℃金属浴孵育至肿瘤组织完全消化(最长不超过8小时)。向上述样本中加入3μL RNA酶，36℃金属浴孵育15-30分钟。加入200μL蛋白沉降液，vortex震荡至浑浊液体均匀，14500rpm离心3分钟。将上清转移至盛有600μl异丙醇的1.5mL离心管中(上清液/异丙醇＝1/1，v/v)。上下颠倒轻柔混匀至白色絮状沉淀析出，14500rpm离心2分钟，弃上清，加入75％乙醇，14500rpm离心2分钟，弃上清，最大转速空转，将管底残余乙醇析出。通风橱内静置晾干至白色DNA变为透明，加入30-60μL TE溶解液。4℃过夜或室温放置3h(每半小时混匀一次)充分溶解DNA样品。
②石蜡标本DNA抽提采用QIAGEN公司试剂盒GeneRead DNA FFPE Kit(Hilden，Germany)，具体步骤如下：
石蜡标本中加入160μL脱蜡液(Deparaffination Solution)，vortex震荡10秒后快速离心，56℃金属浴孵育3分钟，冷却至室温观察石蜡是否凝固，若凝固则加大Deparaffination Solution用量后重复上述步骤，若不凝固则进入下一步。
配制预混液：55μL RNase-free water+25μL Buffer FTB+20μL Proteinase K，加入上述样品中。56℃金属浴孵育1小时，90℃金属浴孵育1小时，快速离心后将下层液体转入新的离心管，加入115μL RNase-free water后vortex震荡混匀，加入35μL UNG后vortex震荡混匀，快速离心后置于50℃金属浴孵育1小时，快速离心后加入2μLRNase A(100mg/mL)，vortex震荡混匀，室温孵育2分钟，加入250μL Buffer AL后vortex震荡混匀，加入250μL96-100％的乙醇溶液后vortex震荡混匀，快速离心后转入QIAamp微量洗脱离心柱(MinElute Column)中，12000rpm离心1分钟弃废液，加入500μL Buffer AW1，12000rpm离心1分钟弃废液，加入250μL无水乙醇，12000rpm离心1分钟弃废液，12000rpm空转2分钟，将离心柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入20-40μL Buffer ATE，室温静置5分钟后，离心收集洗脱DNA样品。
样本质控：抽提基因组DNA样本应用Qubit定量保证有效浓度大于10ng/μL。
目的片段扩增：将符合质控要求的样本稀释至10ng/μL，应用Righton公司扩增试剂盒(Shanghai，China)进行扩增。
配制反应体系如表4所示：
表4
Figure BDA0002086570130000181
反应条件如表5所示：
表5
Figure BDA0002086570130000182
目的片段纯化：应用Beckman公司试剂盒Agencourt AMPure XP Kit(KraemerBoulevard Brea，CA，USA)进行纯化。试剂盒室温放置平衡30分钟充分混匀。将上述扩增PCR产物中加入30μL Agencourt AMPure XP磁珠(1.2倍体积)，充分混匀后快速离心，室温静置5分钟。将盛有上述样品的PCR反应管置于磁力架上，室温静置3分钟待管中液体澄清透明，吸弃管中液体。依次加入100μL现配的70％乙醇溶液(用于Hot-start扩增PCR产物)或85％乙醇溶液(用于Mix(GC)扩增PCR产物)，室温静置30秒后置于磁力架上吸弃管中液体，重复一次。室温静置3分钟待乙醇挥发，从磁力架上取下PCR反应管，每管加入洗脱液25μL，震荡混匀快速离心，室温静置5分钟。将PCR反应管置磁力架上室温静置3分钟，待管中液体澄清透明，收集管中液体，即为纯化后的目的片段。用Qubit测定浓度并记录。
三、文库构建：
将纯化后的目的片段稀释至2ng/μL。
末端修补及添加polyA，配制反应体系如表6所示：
表6
试剂名称 体积(μL)
KAPA End Repair&A-Tailing Buffer 7
KAPA End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3
目的片段(2ng/ul) 50
总体积 60
扩增条件如表7所示：
表7
温度 时间
20℃ 30分钟
65℃ 30分钟
连接Adapter，配制反应体系如表8所示：
表8
试剂名称 体积(μL)
PCR产物 60
Ligation Buffer 30
DNA Ligase 10
Adapter Kit Index X 2
PCR-grade water 8
总体积 110
扩增条件如表9所示：
表9
温度 时间
20℃ 30分钟
产物纯化步骤同前。
文库富集，配制反应体系如表10所示：
表10
Figure BDA0002086570130000191
Figure BDA0002086570130000201
扩增条件如表11所示：
表11
Figure BDA0002086570130000202
文库纯化及质控：步骤同前。
四、文库测序
文库稀释后上机测序，本实验使用测序仪器为Miniseq测序仪(Illumina，SanDiego，CA，USA)。
1.文库稀释：
a)取10mol/L的NaOH稀释至0.2mol/L(现配现用)，取5ul 1ng/μl(4nmol/L)文库稀释液与5ul 0.2mol/LNaOH混匀，静置5min。
b)加990μl HT1Buffer，补齐至1mL。取一新的1.5mL离心管，从上述混合液中取280μl混合液，再加HT1Buffer320μl至600μl，加入试剂槽的加样孔中。
2.测序试剂准备及芯片清洗：
a)提前3h将试剂盒从-20℃冰箱中取出，放在常温水槽中融化，上机之前检查试剂是否融化，是否有气泡。
b)带乳胶手套，将芯片从高盐溶液中取出，用双蒸水充分冲洗干净，用擦镜纸将芯片上的水渍吸干净。
3.上机测序：
a)取出水洗槽，放入加好文库液的试剂槽，将芯片放在芯片槽上。放入新的PR2Buffer，倒掉废液缸里的废液。
b)设置模板：打开Illumina Experiment Manager，
c)点击Create Sample Sheet,选择Miseq，点击NEXT；
d)点击other,选择Fast Q，点击NEXT；
e)填写试剂编号，命名，输入测序长度，点击next；
f)添加Adapter.txt文件。
g)开始测序：选择Sequence，根据仪器向导运行仪器。
4.结果分析：
a)在测序仪电脑上，找到此次实验的fastq.gz文件，
b)将此次实验的fastq.gz文件拷贝至服务器的DATA文件夹内，
c)运行Cancer Test分析软件，
d)选择此次实验数据及Adapter信息，确认信息无误即可点击运行，
e)软件运行时请勿关闭电源，分析完成后即可得到此次实验数据，
f)分析完成的结果保存在服务器的文件夹中，
g)分析完成后的结果可使用IGV可视化软件进行筛选。
五、数据分析流程
步骤一、数据基本统计及评估
采用Illumina测序平台的双端测序(2×150bp)模式对样本进行高通量测序，测序数据以FASTAQ文件格式存储，其中包含测序序列的序列信息和测序质量信息。一般情况下，测序序列5’端前几个碱基错误率较高，3’端碱基错误率随着序列延伸而不断升高。根据测序数据的低质量碱基集中于末端的分布特点，利用Trimmomatic软件对测序数据进行处理，标准如下：从3’端去除接头序列片段和Q值小于25的低质量片段，同时去除长度小于35bp的片段，得到的干净的序列片段用于后续分析。
针对人外显子组测序数据，采用GATK软件进行变异检测。
步骤二、Bam文件预处理：
1.Mark Duplicate&Sort
建库过程中，由于PCR扩增存在一些偏差，有些序列会被过量扩增。这些重复序列会比对到基因组的相同位置，但它们并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据。采用Picard软件去除由于在建库过程中PCR产生的重复序列。如果两条测序条数(reads)具有相同的长度而且比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的测序条数是由PCR扩增而来，就会被GATK标记。
2.Indel Realignment
采用Smith-Waterman alignment algorithm针对已知indels(来自dbSNP142数据库，1KG indels)附近区域进行局部重新比对，去除在比对中的错误，以提高变异检测特别是SNP的准确性。
如果采用MuTect2来变异检测体细胞突变(somatic mutation)，indelrealignment这步可以省略。如果其它方法检测体细胞突变，则做indel realignment这一步。
3.Base Recalibration
针对来自测序仪产生的碱基质量分数(Quality Score)进行校正，校正的原理是考虑测序仪产生的质量分数、测序条数分组(read group)、碱基在测序条数中的位置、邻近碱基等因素计算碱基的经验质量分数。校正目的是对bam文件里测序条数的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中测序条数中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率。
步骤三、样本交叉污染评估
癌症基因组测序污染主要来源于以下三个方面：样本间(cross-individual)、样本内(within-individual)和物种间(cross-species)。物种间污染可以将测序片段比对到参考基因组，通过统计比对率(mapping ratio)来排除其它物种的污染。样本内污染主要指癌组织样本取样不纯，里面混入了正常DNA组织，导致敏感性降低。样本间污染指混入了其它样本的DNA组织，这一步是非常重要的，因为即使混入了少量其它个体的DNA，也会导致大量的假阳性体细胞突变位点。
本发明实施例采用ContEst算法(Kristian Cibulskis和Aaron McKenna开发)评估样本间污染。当样本间污染达到15～50％时，这对癌/癌旁样本认为重度污染，在排除其它一些影响因素比如测序深度的情况下，这对样本在接下来的分析中暂时舍弃。当样本间污染达到50％以上时，除了考虑到样本污染问题，还可能存在样本交换的情况。这种异常问题可以通过重新取样，建库测序来进一步排除。
根据提供的癌旁组织的测序数据，选择纯合的突变位点，如果在癌组织中这些纯合的突变位点中出现了与基因组野生型序列相同的序列，则认为这个样本有可能出现了交叉样本污染。此外，这些没有比对上的测序条数只能部分反映污染问题，还需指定一个人群等位基因频率。
步骤四、体细胞突变(somatic mutation)检测
癌症基因组研究的热点是体细胞突变，一般要分析成对的正常和肿瘤组织，得到癌症样品中相对于自身正常样本来说，发生变异的地方，就认为是体细胞突变。癌症基因组重复序列较多，癌症样品复杂，纯度低，异质性和倍型等原因，造成体细胞突变比胚系突变(germline mutation)更难发现。一般肿瘤基因组测序纯度要求达到80％以上，但根据以往的项目经验，不少样本肿瘤纯度远远低于80％。有文献指出，当样本纯度比较低时，MuTect和Strelka方法优于其它几种方法。
本发明实施例采用MuTect或Strelka进行体细胞突变检测，默认MuTect。该项目采用MuTect进行体细胞检测，后续的所有分析涉及到体细胞的都是MuTect检测结果。
MuTect是基于GATK HaplotypeCaller模块(通过明显的变异证据，找到要进一步分析的区域，称之为ActiveRegions。程序然后会建立一张类似De Brujin的图，重新装配ActiveRegions，探测可能出现的单倍型，使用Smith-Waterman算法重新比对。使用PairHMM算法，在读数据基础上，ActiveRegions与每一单倍型成对的比对，产生一个单倍型似然度矩阵。然后转换这一矩阵，为每一可能的变异位置产生等位基因似然度)，引入了实时的denovo算法，大大减少了由于排序错误导致的假阳性，对检测InDel尤其明显。此外，MuTect2内置了多个过滤器来消除假阳性，增加灵敏度。此外，也可指定多个数据库COSMIC，dbSNP来消除失真和胚系突变。
分析得到的结果如表1和表2所示。
实施例2结果验证
采用高成功率PCR酶KOD FX试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)进行PCR实验对实施例1中的NK/T细胞淋巴瘤患者的其中一例DNA样本的突变位点进行测序，以验证实验结果。
具体的，PCR的反应体系如表12所示：
表12
试剂 用量 终浓度
2x PCR buffer for KOD FX 25μL 1×
2mM dNTPs 10μL 0.4mM each
10pmol/μL Primer#1 1.5μL 0.3μM
10pmol/μL Primer#2 1.5μL 0.3μM
模板DNA 10μL
KOD FX(1.0U/μL) 1μL 1.0U/50μL
Autoclaved,distilled water Up to 50μL
PCR的反应条件如表13所示：
表13
Figure BDA0002086570130000231
得到的测序结果如图1所示。将图1所示的测序结果与ucsc数据库中人类基因组序列hg19(具体如图2所示)为模板进行比对确认突变位点信息，得到的结论为：一代测序获得的突变位点信息与实施例1获得的突变位点相符。
将实施例1中其余101例的NK/T细胞淋巴瘤患者进行上述实验，得到相同的结论。
实施例3判断预后和指导用药
1、存在MGA突变患者疾病分期较高且预后较差。
2、EP300、HDAC9、ARID1A等表观遗传学乙酰化调控相关基因突变患者对于靶向药物Chidmide治疗敏感。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一组用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的基因突变位点群，其特征在于，所述基因突变位点群如表1所示。
2.如表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评估NK/T细胞淋巴瘤分子分型的试剂盒中的应用。
3.一组用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的基因突变位点群，其特征在于，所述基因突变位点群如表1所示。
4.如表1所示的基因突变位点群作为标记物在制备用于评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的试剂盒中的应用。
5.一组用于指导NK/T细胞淋巴瘤患者用药的基因突变位点群，其特征在于，所述基因突变位点群如表1所示。
6.一组用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的基因突变位点群，其特征在于，所述基因突变位点群如表1所示。
7.如表1所示的基因突变位点群作为靶点在制备用于筛选用于治疗NK/T细胞淋巴瘤药物的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1、3、5、6任一项所述的基因突变位点群，其特征在于，所述突变位点群中的所述突变位点的所在染色体、所在基因、突变类型、转录本编号和氨基酸变化信息如表2所示。
9.一种靶向测序试剂盒，其特征在于，所述靶向测序试剂盒中含有用于检测如表1所示的基因突变位点群的试剂；
优选的，所述靶向测序试剂盒采用Illumina Miseq测序平台进行测序；
更优选的，所述靶向测序试剂盒的待测样本选自冰冻组织样本、石蜡组织样本、新鲜组织样本。
10.如权利要求9所述的靶向测序试剂盒在用于制备评价NK/T细胞淋巴瘤患者预后的制剂中的应用。
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