CN111534588B

CN111534588B - 基于荧光定量pcr检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111534588B
Application number: CN202010325605.3A
Authority: CN
Inventors: 唐春花; 张鹏; 邢宽; 何志健; 谢珍; 夏统前; 袁鸣; 何贵伦; 安雪茹; 李平
Original assignee: Nanjing Experimental Medicine Examines Co ltd
Current assignee: Nanjing Experimental Medicine Examines Co ltd
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: CN111534588A

Abstract

本发明公开了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括PCR引物对和探针，2x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase‑Free ddH₂O。本发明的优点在于：采用荧光定量PCR方法对PAX5和IKZF1基因突变区域序列进行特异性扩增检测，在保证高灵敏度和特异性的同时兼顾更多的突变位点。本发明实施例提供的检测试剂盒灵敏度高，特异性好，并且操作简单，是一种性能优良的人类PAX5和IKZF1基因突变检测试剂盒。

Description

基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法。

背景技术

白血病是一组危及生命的血液和骨髓恶性疾病。在青少年和年轻人中，急性白血病最为普遍，慢性髓系白血病少见。其诊断治疗及预后需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行MICM综合分析，分子生物学角度主要检测的是基因表达、融合基因以及基因变异，基因变异中又以点突变、拷贝数的变异(扩增/缺失)为主，而基因PAX5、IKZF1拷贝数异常是B-ALL中最常见的变异。

急性淋巴细胞白血病(ALL)现在已经超过80％，但是目前的治疗有明显的毒性作用，20％的患者在最初的治疗后复发。而ALL中的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是儿童(0-14岁)最常见的肿瘤，占所有婴儿和儿童白血病的70％，同样也影响着成年人。B-ALL是一种复杂的获得性遗传疾病，在调节造血、细胞周期和细胞增殖的基因中存在多种病变。在B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中，越来越多权威文献报道对正常B细胞发育至关重要的转录因子经常发生突变，PAX5和IKZF1拷贝数异常对B-ALL具有高度特异性，可作为B-ALL的分子诊断标记之一。

转录因子PAX5和IKZF1在调节正常B淋巴细胞分化中起着重要作用。PAX5转录因子又称B细胞特异激活蛋白(BSAP)，是PAX家族的9个成员之一，是B细胞发育的主要调控因子，该因子的表达主要参与了B细胞分化中免疫球蛋白基因重排、BCR信号转导和B细胞存活，PAX5缺失或失活突变可导致B细胞前期细胞停滞。PAX5在B细胞前体中的表达对B细胞的正常分化和成熟至关重要。约有三分之一的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者在恶性细胞中获得PAX5杂合失活突变。PAX5基因的体细胞改变导致B细胞发育停滞，而生殖细胞PAX5突变与家族性B-ALL易感性有关。近年来，PAX5基因的点突变、片段缺失和各种重排在多种人类血液肿瘤中报道。然而，PAX5基因片段缺失与B-ALL之间有着密切的关系，中国当代儿科杂质中提及无特殊重现染色体异常B-ALL患者存在一定比例的PAX5基因片段缺失，该基因缺失往往提示患儿具有较高的白细胞水平及较短的缓解期。适当缩短化疗间期、加强化疗强度可能有望延长这部分患儿的缓解时间，为其争取更多的治疗机会，得到更加满意的治疗效果。

IKZF1位于染色体7p12，编码淋巴细胞转录因子IKAROS。其两个主要领域:由外显子4-6编码DNA结合锌指结构和由外显子8编码锌指二聚作用。IKZF1整个基因(exon 1-8)的缺失或部分外显子的缺失均会导致基因不完整，从而影响IKAROS表达不完全、显性失活或完全丧失的负效应。IKZF1缺失发生于大约15％的B-ALL患者中，在BCR-ABL1和Ph-like-ALL亚群中更为频繁，分别影响70％和40％以上的患者。IKZF1基因缺失与儿童和成人B-ALL的预后不良有关。由于其临床相关性，在过去研究中，IKZF1基因缺失已经成为一个B-ALL重要的预后生物标志物，并已经作为一项预测复发儿童和成人B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的重要检测。

目前，对于检测PAX5和IZKF1基因片段缺失主要的检测技术有细胞遗传学技术以及分子生物学技术。细胞遗传学技术主要运用染色体核型分析及FISH技术检测；分子生物学技术主要运用高通量测序技术(NGS)全基因组分析、一代测序及荧光PCR(RT-PCR)技术。经典的细胞遗传学方法染色体核型分析和FISH有许多限制，阻止了进一步有效准确地对肿瘤基因组进行分析。次优染色体形态、低分辨率(300-500bp)和复杂的重排造成了染色体核型分析技术在识别基因特定区域的改变上比较困难，特别是在低年龄儿童组，细胞培养受到限制，即使是大体核型异常也未能核型分析检测到。而FISH商业化探针进行分析时部分病例中也可能会产生假阴性结果。运用高通量测序技术(NGS)全基因组分析高额的费用让普通患者望而却步，况且全基因组分析依赖于成熟的生物信息技术以及遗传解读经验。一代测序技术由于扩增局限于1kb左右的片段长度，无法对基因组大片段拷贝数变异进行检测，因此会产生假阴性。而荧光PCR(RT-PCR)技术快速、高效、高灵敏度及高特异性等优点，在临床上得到广泛推广应用。

发明内容

本发明的主要目的在于，克服现有的技术中存在的缺陷，而提供一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法，所要解决的技术问题是使其具有特异性好、灵敏度高并且高效快速、易于操作的优势，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-17号试剂，所述1-17号试剂的每一个包含PCR引物对和探针，其中：

该第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

该第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

该第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

该第4号试剂包含：用于扩增PAX5基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

该第5号试剂包含：用于扩增PAX5基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

该第6号试剂包含：用于扩增PAX5基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

该第7号试剂包含：用于扩增PAX5基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

该第8号试剂包含：用于扩增PAX5基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

该第9号试剂包含：用于扩增PAX5基因第9号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

该第10号试剂包含：用于扩增PAX5基因第10号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

该第11号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

该第12号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

该第13号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

该第14号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；

该第15号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；

该第16号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；

该第17号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。

在本发明的一些实施方案中，所述探针SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.27，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.42，SEQ IDNO.45，SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.51的5’端均连接有荧光报告基团。

在本发明的一些实施方案中，所述第1-17号试剂中所述引物对和所述探针的浓度比为3:2。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括第18号试剂，所述第18号试剂包含内标系统，所述内标系统包含参基因Actin特异性的引物对和探针，其正向内标引物和反向内标引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示，其内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示，并且所述内标探针5’端连接有荧光报告基团6-FAM，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ1。

在本发明的一些实施方案中，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5；所述荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和NFQ。

在本发明的一些实施方案中，所述第1-17号试剂中还包含2x PCR NucleotideMix反应液和RNase-Free ddH₂O，所述2x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase-Free ddH₂O体积比为10:3。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括第19号试剂，所述第19号试剂是空白对照，所述的空白对照是体积为20μl的RNase-Free ddH₂O。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括第20号试剂，所述第20号试剂是阳性对照，所述阳性对照是含有PAX5基因10种突变类型和IKZF1基因7种突变类型质粒和内标质粒的混合液。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。

本发明还提供了一种用于PAX5和IKZF1基因检测的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用TheBlood DNA Kit，购于北京全式金生物技术有限公司，检测DNA的浓度和完整性，将提取的DNA稀释，使得其浓度在20ng/μl～50ng/μl之间；

(2)荧光PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增，并收集荧光信号；

荧光PCR扩增的体系为：10μl 2x PCR Nucleotide Mix反应液；2μl PCR引物对和探针组成的混合液(其中，引物和探针的配比为3:2)；5μl 20ng/μl DNA；3μl RNase-FreeddH2O，反应体系的总体积为20μl；

荧光PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性10min、95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号；

(3)结果的定量分析。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中所述DNA的浓度通过NANO300检测，其中合格样本DNA的A260/A280值在1.8～2.0之间；所述DNA的完整性通过采用琼脂糖凝胶电泳检测。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(3)中所述定量分析是按照公式2-^ΔΔCt的公式进行，其中，ΔΔCt＝ΔCt_IKZF1/PAX5-ΔCt_Actin＝(待测样本Ct_IKZF1/PAX5-正常对照Ct_IKZF1/PAX5)-(待测样本Ct_Actin-正常对照Ct_Actin)，2-^ΔΔCt在0.75～1.25之间被判定为基因拷贝数正常，2-^ΔΔCt>1.25被判定为基因拷贝数发生扩增，2-^ΔΔCt<0.75被判定为基因拷贝数缺失。

借由上述技术方案，本发明的试剂盒及检测方法至少具有下列优点：

(1)本发明提供了进行操作简便、高灵敏度和高特异性的荧光PCR检测技术及完整的反应体系试剂盒。整个荧光PCR反应经过多次试验并优化调整反应条件，基于荧光PCR技术引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性，上机全封闭反应，无须PCR后处理，防止受到环境及其他因素的污染，保证实验结果的准确可靠。

(2)从时间及经济角度而言，本发明运用荧光PCR技术检测急性淋巴细胞白血病中PAX5基因及IKZF1基因拷贝数的变异(扩增/缺失)更加的经济、快速、简便。因此本发明可为临床提供高灵敏度、高特异性的PAX5基因及IKZF1基因拷贝数的变异检测，具有广泛的临床应用价值。

(3)本发明利用荧光PCR(RT-PCR)技术来检测PAX5、IKZF1拷贝数的变异(扩增/缺失)，是一种高效快速、易于操作的在急性淋巴细胞白血病中PAX5基因及IZKF1基因拷贝数的变异(扩增/缺失)定量检测方法，并且为临床提供了精确的、无偏倚的基因拷贝数评估方法。

综上所述，本发明特殊的基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中PAX5和IKZF1基因突变的试剂盒及方法，其高效快速、易于操作，并且检测结果精确。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品和方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

本发明的具体实施方法及其结果分析由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：

图1示出了本发明的试剂盒检测基因PAX5(exon5-7、10)及内参基因Actin的扩增曲线图；

图2示出了本发明的试剂盒检测基因IKZF1(exon2-5)及内参基因Actin的扩增曲线图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方案仅仅用以解释本发明，并不限制本发明。

本发明的实施例提供了一种针对人类急性淋巴细胞白血病中基因突变的检测试剂盒，该检测试剂盒的检测原理基于基于荧光定量PCR技术。具体而言，该检测试剂盒包括分开设置的第1-17号试剂，第1-17号试剂依次用于检测PAX5基因和IKZF1基因，转录本编号分别为：PAX5(NM_016734)、IKZF1(NM_006060)，其中，PAX5基因检测的外显子拷贝数区域包括外显子1-10，IKZF1基因检测的外显子拷贝数区域包括外显子2-8：1-17号试剂的每一个包含PCR引物对和探针，其中：第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；第4号试剂包含：用于扩增PAX5基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；第5号试剂包含：用于扩增PAX5基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；第6号试剂包含：用于扩增PAX5基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；第7号试剂包含：用于扩增PAX5基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；第8号试剂包含：用于扩增PAX5基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.24所示；第9号试剂包含：用于扩增PAX5基因第9号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；第10号试剂包含：用于扩增PAX5基因第10号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；第11号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；第12号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；第13号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；第14号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，其探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.42所示；第15号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；第16号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；第17号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。

具体地，上述第1-17号试剂可与其他组分构成PCR反应体系，也可自身包含有PCR反应所必须的组分以进行荧光定量PCR检测。在第1-17号试剂各自单独作为PCR反应体系时，该第1-17号试剂除了各自包含其对应的引物探针SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:51之外，还包含2x PCR Nucleotide Mix反应液，并可通过加RNase-Free ddH₂O补充体积。在该试剂盒中还可以包括第18号试剂的内标体系，其内标引物序列为SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53，内标探针序列为SEQ ID NO.54。由100umol/ml母液稀释到工作液浓度为2umol/ml，Taqman探针的工作液浓度为3umol/ml，将同一基因同一外显子引物和探针按比例3:2混合，最终保证反应体系中引物的总量/探针的总量是3:2，每个反应中加入引物探针混合液2ul，每个反应总体系保证在20ul。在进行检测时可分别将待测样品DNA和正常人对照DNA样本加入至上述第1-18号试剂中进行PCR检测，根据分别含有上述第1-18号试剂的PCR反应体系的检测结果的Ct值比较差值来确定突变情况。

具体地，上述试剂盒可添加第19-20号试剂作为辅助试剂，其中，第19号试剂是空白对照，组成为20μl RNase-Free ddH₂O；其中第20号试剂为阳性对照，组成为含有含有PAX5基因10种突变类型和IKZF1基因7种突变类型质粒和内标质粒的混合液，用于试剂的质量控制。

具体地，上述引物、探针序列分别为：

正向引物SEQ ID NO.1 5’-CGAGAACAGGACATGATCTCACA-3’

反向引物SEQ ID NO.2 5’-GGTAGCTGATCACTGAGCTGAAAC-3’

探针SEQ ID NO.3 5’-FAM-TTCCTTAATCATTTCACGGTGCCTTCGG-3’

正向引物SEQ ID NO.4 5’-GGCCACTCCCGGATGTAGT-3’

反向引物SEQ ID NO.5 5’-TGCCTTTACCTGCCAAGAATTT-3’

探针SEQ ID NO.6 5’-FAM-TGTCAGGCCCTGCGACATCTCCA-3’

正向引物SEQ ID NO.7 5’-TGGAGGATCCAAACCAAAGG-3’

反向引物SEQ ID NO.8 5’-TGATCTCCCAGGCAAACATG-3’

探针SEQ ID NO.9 5’-FAM-CGCCACACCCAAAGTGGTGGAAA-3’

正向引物SEQ ID NO.10 5’-AGCTTGGGTATGAGTTTTCTGGTT-3’

反向引物SEQ ID NO.11 5’-GGGTGGCTGCTGTACTTTTGTC-3’

探针SEQ ID NO.12 5’-FAM-TTTTGTTTTTCAACTGCCCACAGGATCATC-3’

正向引物SEQ ID NO.13 5’-TACTCCATCAGCGGCATCCT-3’

反向引物SEQ ID NO.14 5’-CTTCGTCTCTCTTGCGCTTGT-3’

探针SEQ ID NO.15 5’-FAM-CGTCCCCCAGCGCCGACA-3’

正向引物SEQ ID NO.16 5’-CTGGACCGCGTGTTTGAGA-3’

反向引物SEQ ID NO.17 5’-GTGCATCACGAGGCGTACCT-3’

探针SEQ ID NO.18 5’-FAM-TACTCAGACATCTTCACCACCACAGAGCCC-3’

正向引物SEQ ID NO.19 5’-GCTGACATCGGGAGCAGTGT-3’

反向引物SEQ ID NO.20 5’-TGGCCAATCACATCCAAACA-3’

探针SEQ ID NO.21 5’-FAM-CAGGCCCGCAGTCCTACCCCATT-3’

正向引物SEQ ID NO.22 5’-CGTCCAAACGTGACAAATGTG-3’

反向引物SEQ ID NO.23 5’-GGTCGTGCTCGCCAAGTC-3’

探针SEQ ID NO.24 5’-FAM-CCGCGAAGATGCTCACCCTGTGA-3’

正向引物SEQ ID NO.25 5’-CCAGGGCCTTTTCTGAACTG-3’

反向引物SEQ ID NO.26 5’-GGAACCTCCAGGAGTCGTTGT-3’

探针SEQ ID NO.27 5’-FAM-TGGTTCCTGTTTCTCTCTCCACCCACC-3’

正向引物SEQ ID NO.28 5’-GACCGTCACTGACCCTTGGA-3’

反向引物SEQ ID NO.29 5’-TGGGCTCTCTGGCTATCTTCA-3’

探针SEQ ID NO.30 5’-FAM-CCAGGCGGGCACCAAACACTGAT-3’

正向引物SEQ ID NO.31 5’-GGATGCTGATGAGGGTCAAGA-3’

反向引物SEQ ID NO.32 5’-CCTATTCCTCCCCCATGAGC-3’

探针SEQ ID NO.33 5’-FAM-GCACTGTGACTTCCGGCCCCAG-3’

正向引物SEQ ID NO.34 5’-GAAGCCCAGGCACCTTGA-3’

反向引物SEQ ID NO.35 5’-CGCCCTCATCTGGAGTATCG-3’

探针SEQ ID NO.36 5’-FAM-CATGACCGCCCGAGACTCACACTTC-3’

正向引物SEQ ID NO.37 5’-AGAATGTGCGGAGGATTTACGA-3’

反向引物SEQ ID NO.38 5’-GCCTCCAACTCCCGACAAA-3’

探针SEQ ID NO.39 5’-FAM-CTCCCACAGGGACCAAGGCAGCTC-3’

正向引物SEQ ID NO.40 5’-GCCCTTCCAGTGCAATCAGT-3’

反向引物SEQ ID NO.41 5’-GTGGCATTTGAAGGGCTTCTC-3’

探针SEQ ID NO.42 5’-FAM-TCATTCACCCAGAAGGGCAACCTGC-3’

正向引物SEQ ID NO.43 5’-CAGCGAAGCTCTTTAGAGGAACA-3’

反向引物SEQ ID NO.44 5’-CCGAGCAGCAGCGCTTAC-3’

探针SEQ ID NO.45 5’-FAM-ATGGGCCTTCCGGGCACACTGTAC-3’

正向引物SEQ ID NO.46 5’-TCGTGCTGGACAGACTAGCAA-3’

反向引物SEQ ID NO.47 5’-CTTGCATCTAAAACACCCACATAGTT-3’

探针SEQ ID NO.48 5’-FAM-TAACGTCGCCAAACGTAAGAGCTCTATGCC-3’

正向引物SEQ ID NO.49 5’-CGGCTTCCGTGATCCTTTT-3’

反向引物SEQ ID NO.50 5’-GCGTTATGTGCGACGAGAACT-3’

探针SEQ ID NO.51 5’-FAM-TGCAACATGTGCGGCTACCACAGC-3’

内标正向引物SEQ ID NO.52 5’-ATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3’

内标反向引物SEQ ID NO.53 5’-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTG-3’

内标探针SEQ ID NO.54 5’-FAM-TCCATCGTCCACCGCAAATGCTTC-3’-BHQ1

具体地，上述探针序列5’端连接的荧光报告基团为FAM；上述内标探针序列5’端连接的荧光报告基团可以为FAM，还可以选用其他合适的荧光报告基团，包括但不限于VIC、ROX、CY3、CY5、HEX。优选地，为FAM。该内标探针序列3’端连接的淬灭基团可为本领域技术人员熟知的淬灭基团，包括但不限于BHQ1、BHQ2、TAMRA、NFQ。优选地，为BHQ1。探针5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近的时候，荧光报告基团不能发出荧光，但随着PCR扩增反应的进行，5’端的荧光基团随着探针的水解而脱落下来，从而能发出荧光，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。上述的探针和引物设计基于Genbank数据库中PAX5基因及IKZF1基因设计特异性引物及探针，严格遵循引物及探针设计原则。引物Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％，尽量避免产生引物二聚体。探针Tm值在65-70℃，通常比引物Tm值高5-10℃，可以避免探针出现非特性序列结合及本身形成DNA折叠和二级结构。本发明设计的引物和探针序列特异性更强。

具体地，本发明中所用到的特异性引物探针均为特色定制，由100umol/ml母液稀释到工作液浓度为2umol/ml，Taqman探针的工作液浓度为3umol/ml，将同一基因同一外显子引物和探针按浓度比为3:2的比例混合，最终保证反应体系中引物/探针是3:2，每个反应中加入引物探针混合液2ul，每个反应总体系保证在20ul。

本发明实施例提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，检测周期短，操作简便，实现了对于样品的准确、快速检测。整个荧光PCR反应经过多次试验并优化调整反应条件，基于荧光PCR技术引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性，上机全封闭反应，无须PCR后处理，防止受到环境及其他因素的污染，保证实验结果的准确可靠。

本发明的实施例还提供一种针对PAX5和IKZF1基因突变的检测方法，该方法利用本发明实施例提供的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：

(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用TheBlood DNA Kit，购于北京全式金生物技术有限公司，通过NANO300检测检测DNA的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，将提取的DNA稀释，使得其浓度在20ng/ul～50ng/μl；

荧光PCR扩增的体系为：10μl 2x PCR Nucleotide Mix反应液；2μl PCR引物对和探针组成的混合液(其中，引物和探针的配比是3:2)；5μl 20ng/μl DNA；3μl RNase-FreeddH2O，反应体系的总体积为20μl；

(3)结果的定量分析，Roche Z480荧光PCR仪运行反应时间大约1小时，运行结束后，分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，结合Ct值进行准确定量分析。

具体地，本发明进行整个实验过程会加入正常人样本作为对照，检测基因拷贝数的变异(扩增/缺失)时每个基因靶标做两个重复，结果合格(曲线的一致性)时取二者平均值。首先对实验结果数据进行处理，查看荧光PCR扩增后的曲线是否正常，如果其C_T值小于35，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其C_T值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量的好坏，所有待测样本/正常人对照样本C_T值均小于35。设定域值后通过荧光信号收集到的Ct值计算，将Ct值带入公式中2^-ΔΔCt进行结果的最终计算，其中，ΔΔCt＝ΔCt_IKZF1/PAX5-ΔCt_Actin＝(待测样本Ct_IKZF1/PAX5-正常对照Ct_IKZF1/PAX5)-(待测样本Ct_Actin-正常对照Ct_Actin)，2-^ΔΔCt在0.75～1.25之间被判定为基因拷贝数正常，2-^ΔΔCt>1.25被判定为基因拷贝数发生扩增，2-^ΔΔCt<0.75被判定为基因拷贝数缺失。

具体地，上述含有第1-17号试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。本发明的优选实施例中上述含有第1-17号试剂的PCR反应体系的反应体积为20μl，可按照如下比例配制：

具体地，在进行PAX5和IKZF1基因突变的检测时，上述第1-17号试剂在相同的反应条件下进行。优选地，上述第1-17号试剂的PCR反应条件为：

37℃2min

95℃10min

95℃10s，60℃30s(收集信号)，40个循环；

在上述40个循环中，每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，该过程由反应仪器(Roche Z480荧光PCR仪)自动完成。

上述的反应中应注意避免扩增效率降低：(1)反应试剂中水解探针荧光染料降解；(2)加样过程移液器体积的准确；(3)反应条件应经过优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法，适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；(4)反应体系中应避免有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把样本DNA模板浓度适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

本发明实施例中采用了荧光定量PCR方法，对PAX5和IKZF1基因总共17种突变类型进行特异性扩增检测，实现17种突变高灵敏度和特异性扩增，利用该结果与质控反应体系的检测结果的比较实现了在NRAS基因17种突变的检出。本发明建立的检测方法简单有效，检测特异性好、灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类PAX5和IKZF1基因突变的方法。

以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

制备PAX5基因(1-10)和IKZF1基因(2-8)突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：

1.合成引物及探针序列

合成PCR引物探针序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.51，其中，特异性探针序列5’端标记FAM荧光基团。合成内标引物探针序列SEQ ID NO.52-SEQ ID NO.54，其中，内标探针序列SEQ ID NO.54在5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1猝灭基团。

将上述引物序列(或内标引物)分别配制成100pmol/ul的母液储存，将上述探针序列(内标探针)分别配制成的母液储存。

2.荧光定量PCR反应体系的制备

分别制备含有第1-17号试剂的突变检测反应体系，各组分按照以下进行配比：

2x PCR Nucleotide Mix反应液 10μl

PCR引物对和探针组成的混合液 2μl

RNase-Free ddH2O 3μl

实施例2

用实施例1制备的PAX5和IKZF1基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集对16例(编号B1-B16))临床上初诊、难治及复发的B-ALL患者(16例患者包括儿童及成人，均通过知情并同意进行检测(儿童患者为亲属知情同意检测)的血液样本并从中提取基因组DNA，用实施例1中得到的PAX5和IKZF1基因突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在相应的基因突变，具体操作步骤为：

1.样品基因组DNA的提取

使用DNA提取试剂盒(TheBlood DNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)提取上述B-ALL患者的血液样本的基因组DNA以及正常人的基因组DNA。运用NANO300检测DNA的浓度，合格样本DNA所测A260/A280值在1.8～2.0之间，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。对提取的DNA样本进行适当的浓度稀释，待测样本/正常人对照样本DNA浓度均在20～50ng/ul左右，分别取5μl并加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。

2.样本的荧光PCR扩增

在荧光PCR反应体系中，加入5ul步骤1中抽提好的20ng/ul的DNA样本、10ul的2xPCR荧光Mix、2ul的定制引物及水解探针工作混合液、Nuclease-Free Water 3ul，最终体积是20ul，放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

95℃10min；

95℃10s，60℃30s，40个循环；

全程运行约1h，每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，并设置ROX荧光校正。

3.样本的检测结果分析

本发明通过收集FAM荧光信号检测发生突变DNA模板的扩增，通过查看荧光PCR扩增后的曲线是否正常，如果其C_T值小于35，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其C_T值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量的好坏，所有待测样本/正常人对照样本C_T值均小于35。

具体的结果判读标准如下：

如果其C_T值小于35，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其C_T值大于35，则需要重新上样检测；

设定域值后通过荧光信号收集到的Ct值计算，将Ct值带入公式中2^-ΔΔCt进行结果的最终计算。其中ΔΔCt＝ΔCt_IKZF1/PAX5-ΔCt_Actin＝(待测样本Ct_IKZF1/PAX5-正常对照Ct_IKZF1/PAX5)-(待测样本Ct_Actin-正常对照Ct_Actin)，2^-ΔΔCt在0.75～1.25之间被判定为基因拷贝数正常，2^-ΔΔCt>1.25被判定为基因拷贝数发生扩增，2^-ΔΔCt<0.75被判定为基因拷贝数缺失。具体的检测结果如表1和表2所示：

表1.编号B01～B16的16例样本PAX5基因拷贝数变异荧光PCR检测结果汇总

表2编号B01～B16的16例样本IKZF1基因拷贝数变异荧光PCR检测结果汇总

/>

对比实施例1

在与上述实施例相同的条件下，利用高通量测序技术对16例(编号1-16)B-ALL待测样本进行全基因组分析，数据运用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读，检测结果如表3表4所示：

表3编号B01～B16的16例样本PAX5基因拷贝数变异全基因组分析结果汇总

/>

表4编号B01～B16的16例样本IKZF1基因拷贝数变异全基因组分结果汇总

/>

由表1、2和表3、4以及附图1-2的结果可知，两种检测技术相比而言，本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类PAX5、IKZF1突变检测结果可靠，与高通量测序的符合率≥98％，但是由于高通量测序技术全基因组分析实验成本较高且周期长，分析解读要依赖于成熟的生物信息分析以及遗传解读团队，在临床上应用不太切合实际。况且全基因组测序仅用于分析PAX5、IKZF1基因的拷贝数变异过于大材小用。而从时间及经济角度而言，运用荧光PCR技术检测急性淋巴细胞白血病中PAX5基因及IKZF1基因拷贝数的变异(扩增/缺失)更经济、快速、简便。因此本发明可为临床提供高灵敏度、高特异性的PAX5基因及IKZF1基因拷贝数的变异检测，具有广泛的临床应用价值。因此，本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 南京实践医学检验有限公司

<120> 基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法

<160> 54

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagaacagg acatgatctc aca 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtagctgat cactgagctg aaac 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttccttaatc atttcacggt gccttcgg 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccactccc ggatgtagt 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcctttacc tgccaagaat tt 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtcaggccc tgcgacatct cca 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggaggatcc aaaccaaagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgatctccca ggcaaacatg 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccacaccc aaagtggtgg aaa 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcttgggta tgagttttct ggtt 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggtggctgc tgtacttttg tc 22

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttgttttt caactgccca caggatcatc 30

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tactccatca gcggcatcct 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttcgtctct cttgcgcttg t 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtcccccag cgccgaca 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctggaccgcg tgtttgaga 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgcatcacg aggcgtacct 20

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tactcagaca tcttcaccac cacagagccc 30

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctgacatcg ggagcagtgt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggccaatca catccaaaca 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caggcccgca gtcctacccc att 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtccaaacg tgacaaatgt g 21

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtcgtgctc gccaagtc 18

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccgcgaagat gctcaccctg tga 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccagggcctt ttctgaactg 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggaacctcca ggagtcgttg t 21

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tggttcctgt ttctctctcc acccacc 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaccgtcact gacccttgga 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgggctctct ggctatcttc a 21

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccaggcgggc accaaacact gat 23

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggatgctgat gagggtcaag a 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cctattcctc ccccatgagc 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcactgtgac ttccggcccc ag 22

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaagcccagg caccttga 18

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cgccctcatc tggagtatcg 20

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

catgaccgcc cgagactcac acttc 25

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agaatgtgcg gaggatttac ga 22

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gcctccaact cccgacaaa 19

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctcccacagg gaccaaggca gctc 24

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gcccttccag tgcaatcagt 20

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gtggcatttg aagggcttct c 21

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcattcaccc agaagggcaa cctgc 25

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cagcgaagct ctttagagga aca 23

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ccgagcagca gcgcttac 18

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atgggccttc cgggcacact gtac 24

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tcgtgctgga cagactagca a 21

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cttgcatcta aaacacccac atagtt 26

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

taacgtcgcc aaacgtaaga gctctatgcc 30

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cggcttccgt gatcctttt 19

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gcgttatgtg cgacgagaac t 21

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tgcaacatgt gcggctacca cagc 24

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

atgtggatca gcaagcagga gta 23

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tttctgcgca agttaggttt tg 22

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tccatcgtcc accgcaaatg cttc 24

Claims

1.一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-17号试剂，所述1-17号试剂的每一个包含PCR引物对、探针，其中：

该第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

该第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；

该第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；

该第17号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；

所述第1-17号试剂中还包含2 x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase-Free ddH₂O，所述2 x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase-Free ddH₂O体积比为10:3；

所述试剂盒还包括第19号试剂，所述第19号试剂是空白对照，所述的空白对照是体积为20μl的RNase-Free ddH₂O；

所述试剂盒还包括第20号试剂，所述第20号试剂是阳性对照，所述阳性对照是含有PAX5基因10种突变类型和IKZF1基因7种突变类型质粒和内标质粒的混合液；

所述探针SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.15，SEQID NO.18，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.33，SEQID NO.36，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.51的5’端均连接有荧光报告基团；

所述第1-17号试剂中所述引物对和所述探针的浓度比为3:2；

其中，所述试剂盒还包括第18号试剂，所述第18号试剂包含内标系统，所述内标系统包含参基因Actin特异性的引物对和探针，其正向内标引物和反向内标引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示，其内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示，并且所述内标探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团。

2.根据权利要求1所述的的基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，其中，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5；所述荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和NFQ。