CN117604103B - 引物和探针组合物、试剂盒及在检测ikzf1基因缺失中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了引物和探针组合物、试剂盒及在检测IKZF1基因缺失中的应用,所述引物和探针组合物包括分别用于检测IKZF1基因的2‑7号外显子缺失的引物对和探针以及β‑globin内参基因引物对和探针;利用多重TaqMan探针/引物和多通道数字PCR结合的技术检测IKZF1基因缺失,设计并优化针对IKZF1基因多个外显子的高特异性引物和探针序列,实现了IKZF1基因多个外显子在同一反应孔中高效筛查及精确定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,特别涉及引物和探针组合物、试剂盒及在检测IKZF1基因缺失中的应用。
背景技术
大量文献研究表明,IKZFl基因缺失在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的发病机制中扮演重要角色,其编码的IKROS蛋白是锌指转录因子之一,在淋系细胞发育中起到重要作用。60%的Ph阳性ALL患者和约68%的Ph-likeALL患者中都可检测到IKZF1基因缺失。另外,这种缺失几乎不存在于CML患者中,但约86%CML患者在ALL急变期时可检测到发生IKZF1缺失,是CML患者急变的重要促进因素。在B-ALL中,该基因变异与不良预后和更高复发率相关,普遍认为IKZF1基因缺失是ALL的独立危险因素。
IKZFl基因共有8个外显子,其编码的IKROS蛋白具有两个功能域:其一为邻近N端的DNA结合区,由4、5、6号外显子编码出的4个锌指结构域组成,具有DNA结合能力和转录活性;另一功能域为邻近C端的二聚体形成区,由8号外显子编码出的2个锌指结构域组成,参与IKROS蛋白二聚体的形成。通过选择性剪接,共产生13种不同的转录异构体,相应的蛋白亚型分别为:IK1,IK2,IK2a,IK3,IK3a,IK4,IK4a,IK5,IK6,IK7,IK8,IK9和IK10(图1),其中IK1-IK3为功能亚型,其余均为功能缺失亚型,以IK6和IK10最为常见。IK6是IKZFl基因4号外显子到7号外显子出现缺失(△4-7),IK6亚型缺乏DNA结合区,它不仅能抑制与之结合的功能亚型IKROS发挥正常的生理功能,并且是IKROS家族中最强的抑制因子。而IK10是2号位点外显子到7号位点外显子出现缺失(△2-7),突变率仅次于IK6。IKZFl基因缺失的患者多对诱导缓解化疗反应较差,缓解率低,在复发的患者中有更高的检出率,可能与IKZFl基因缺失对部分化疗药物耐药有关。
目前针对IKZF1基因缺失的检测方法并不多,主要有单核苷酸多态性阵列(SNP-array)以及多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)。
SNP(Single Nucleotide Polymorphisms,单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性而形成的遗传标记。SNP-array技术利用待测样本与芯片探针进行单杂交,通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。SNP-array是一种高通量的DNA序列检测技术,能快速帮助我们检测基因拷贝数的变化。而且图谱清晰度高,目前探针密度最高的芯片,可使SNP-array的分辨率达到3kb。但是这些探针在基因组中并非均衡分布,在部分复杂和重复序列的CNV区域,SNP密度是较小的,这时就无法得到较为清晰的CNV图谱。而且SNP-array所需仪器、试剂成本费用高昂,对操作者的要求较高,对于明确单个基因例如IKZF1基因缺失的检测没有优势,所以在临床上难以全面开展。
多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)是在DNA靶序列的特定变异位点(如点突变)两侧设计一对MLPA探针。每条探针包含一段通用引物序列和一段特异性杂交序列。杂交序列与靶序列杂交后,使用连接酶将两部分探针连接成一条核苷酸单链,再使用通用引物进行PCR扩增。通过比较待测DNA与正常对照DNA的PCR产物量,来确定待测样本DNA靶序列的拷贝数。值得注意的是,只有在检测位点处探针与靶序列完美互补配对的情况下,连接酶才能将两部分探针顺利连接成单链进行后续扩增。如果检测位点存在甲基化、点突变、CNV,则探针连接失败,不能进行后续PCR扩增,该方法操作繁琐,耗时较长、灵敏度不高,同时也不具备基因缺失拷贝数定量的能力。
基于以上,有必要开发一种IKZF1基因缺失引物和探针组合物、试剂盒及方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提出引物和探针组合物、试剂盒及在检测IKZF1基因缺失的应用,以至少解决以上现有技术存在的诸多缺陷之一。
鉴于此,本发明的方案为:
本发明的第一个方面,提供用于检测IKZF1基因缺失的引物和探针组合物,包括分别用于检测IKZF1基因的2-7号外显子的引物对和探针以及β-globin内参基因引物对和探针;所述用于检测IKZF1基因的2号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:1-2所示,所述用于检测IKZF1基因的3号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:4-5所示,所述用于检测IKZF1基因的4号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:7-8所示,所述用于检测IKZF1基因的5号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:10-11所示,所述用于检测IKZF1基因的6号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:13-14所示,所述用于检测IKZF1基因的7号外显子的引物对序列如SEQ ID NO:16-17所示,所述用于检测IKZF1基因2-7号外显子的探针序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18所示;所述用于检测β-globin内参基因的引物对序列如SEQ ID NO:19-20所示,探针序列如SEQ ID NO:21所示。
进一步地,所述用于检测IKZF1基因的2号和5号外显子的探针序列5'端标记FAM荧光报告基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;所述用于检测IKZF1基因的3号和6号外显子的探针序列5'端标记VIC荧光报告基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;所述用于检测IKZF1基因的4号和7号外显子的探针序列5'端标记ROX荧光报告基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;所述β-globin内参基因探针序列5'端标记有CY5荧光报告基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团。
本发明的第二个方面,提供一种试剂盒,包括以上第一个方面所述的引物和探针组合物。
进一步,所述试剂盒还包括阳性标准品、阴性标准品、ddPCR Supermix和ddH2O。
进一步,所述引物对浓度均为6-9μM,探针组浓度为3-8μM。
本发明第三个方面,提出第二个方面所述试剂盒在非诊断为目的检测IKZF1基因缺失中的应用。
上述检测方法中,非诊断为目的的检测包括无法追溯至人的样本的检测,如某样本在实验室条件下基因缺失的检测,检测结果仅代表样本自身结果,即IKZF1基因缺失的存在或不存在。
本发明第四个方面,提出一种非诊断目的检测IKZF1基因缺失的方法,步骤包括:
S1.提取样品中基因组DNA;
S2.将样品DNA、以上第一个方面所述的引物和探针组合物以及ddPCR Supermix混合,制备ddPCR混合液;
S3.将ddPCR混合液制成PCR微反应液滴,进行数字PCR扩增反应;
S4.对PCR扩增反应后的产物进行多重荧光信号的采集,根据荧光信号的类型判断IKZF1基因缺失情况。
进一步地,步骤S1中,所述基因组DNA核酸浓度应该满足检测要求。
进一步地,步骤S2中,所述用于检测IKZF1基因缺失的引物和探针组合物的浓度为10×,其中,所述用于检测IKZF1基因2-7号外显子和所述β-globin内参基因的引物浓度均为6~9μM,探针浓度为3~8μM。
进一步地,步骤S3中,所述ddPCR混合液加入到数字PCR仪中,将ddPCR混合液制成15000-20000个微反应液滴。
进一步地,步骤S3中,所述PCR扩增反应程序如下:60℃启动5min,95℃预变性15min,95℃变性30s,60℃退火60s,共进行40个循环。
进一步地,步骤S4中,所述PCR扩增结束后,对液滴信号进行多荧光通道的信号检测,采集的荧光信号通道包括FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5,其中FAM、VIC、ROX、CY5作为检测IKZF1基因缺失的荧光信号通道,CY5.5作为液滴质控荧光信号通道。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
1.本发明提供针对IKZF1基因多个外显子设计的高特异性引物和探针序列,以及β-globin内参基因引物对和探针,构成引物和探针组,能够用于多通道数字PCR结合的技术检测IKZF1基因缺失,实现IKZF1基因多个外显子在同一反应孔中高效检测,有效地降低了检测成本。
2.本发明提供的检测方法通过数字PCR实现了不依赖标准曲线的绝对定量,消除PCR扩增效率偏差对定量结果的影响,使IKZF1基因缺失的拷贝数定量更准确;数字PCR对抑制物的耐受度强,可以克服抑制物对定量结果的干扰,对于提取质量较差的样本,依然能够定量检测。
3.本发明提供的检测方法通过数字PCR仪自动化程度高,实验结果判别准确;多通道数字PCR可以实现单个基因拷贝数变异的检测,技术灵活、高效、时效性强,只需要几个小时即可获取检测结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明背景技术中IKZF1各种亚型模式。
图2为本发明实施例2中检测体系验证的一维结果图。
图3为本发明实施例2中检测体系验证的二维结果图。
图4为本发明实施例3中编号为N1的样本检测结果图。
图5为本发明实施例3中编号为N2的样本检测结果图。
图6为本发明实施例3中编号为N3的样本检测结果图。
图7为本发明实施例3中编号为N4的样本检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白,以下结合附图和具体实施方式,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明,并不是为了限定本发明。
实施例1 IKZF1基因缺失检测体系的建立
1.1引物、探针的设计合成及筛选
通过文献报到IKZFl基因共有8个外显子,通过选择性剪接共产生13种不同的转录异构体,功能缺失亚型以IK6(△4-7)和IK10(△2-7)最为常见,因此,通过NCBI数据库下载IKZFl基因序列,借助Primer5.0引物设计软件,选择IKZFl基因的2、3、4、5、6、7号外显子区域以及β-globin内参基因1号外显子区域进行引物探针设计合成。
根据引物设计基本原则,分析引物的Hairpin、Dimer结构,扩增片段长度约80~150bp。引物及其合成产物的正确性,均在美国国立生物技术信息中心进行blast验证,通过引物的筛选得到扩增效率高,特异性好的引物组合。
根据探针设计基本原则,应用Primer Express3.0.1设计IKZFl基因的2-7号外显子区域的探针,其中2/5号外显子的5'端标记FAM荧光信号基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;3/6号外显子的5'端标记VIC荧光信号基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;4/7号外显子的5'端标记ROX荧光信号基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团;再设计一条β-globin内参基因的探针,5'端标记CY5荧光信号基团,3'端标记MGB荧光淬灭基团。
上述设计的引物探针组通过正交试验的方法,在NCBI-blast上进行特异性的筛选,能够比对到目的片段且和其他基因没有同源性的引物探针序列为特异性好的组合,经筛选比对完成的IKZF1基因缺失检测的引物和探针序列如下表1所示:
表1:IKZF1基因缺失检测的引物和探针序列
1.2反应体系的优化及建立
反应体系总体积为20μL,不足的体积用无酶水补足。ddPCR酶预混液终浓度为1×,调整反应体系中各引物、探针浓度的比例到最适浓度,使反应体系的灵敏度和特异性最好,然后配置成浓度为10×IKZFl基因拷贝数变异检测的引物和探针组合物,反应体系的配制组分如下表2所示:
表2:IKZF1基因拷贝数变异检测的反应体系
ddPCR混合液转移至数字PCR仪制备生成微滴,每孔生成约15000-20000个微滴,并进行微滴式PCR反应,反应程序为:60℃启动5min,95℃预变性15min,95℃变性30s,60℃退火60s,共进行40个循环。如下表3所示:
表3:IKZF1基因拷贝数变异检测的上机程序
通过数字PCR仪采集多重荧光信号,分析得到检测模板中IKZF1基因缺失情况,给出判定结果。
实施例2 IKZF1基因缺失检测体系的验证
取试剂盒中阴阳性对照各1例,并且进行多重ddPCR方法的IKZF1基因缺失检测,验证检测体系的有效性。
配制ddPCR反应体系,加入上述1例阴性对照模板和1例阳性对照模板,上样总量设置为50-100ng,总体积20μL。应用数字PCR仪制备生成微滴并进行微滴式PCR反应。反应程序为:60℃启动5min,95℃预变性15min,95℃变性30s,60℃退火60s,共进行40个循环。
数字PCR仪荧光信号收集系统收集FAM、VIC、ROX、CY5和CY5.5通道的荧光信号,检测结果如下图2-3所示,FAM、VIC、ROX、CY5通道荧光对应的检测信号可以清晰检出,引物探针特异性好,灵敏度高,无相互干扰,结果直观、客观,证明检测体系的有效性和可靠性。
具体检测的结果如图2-3,蓝色代表FAM荧光信号,红色代表VIC荧光信号,绿色代表ROX荧光信号,黄色代表CY5荧光信号。图2为IKZF1基因缺失检测体系的验证一维结果,图3为IKZF1基因缺失检测体系的验证二维结果。
实施例3 IKZF1基因缺失临床样本的检测
取4例人骨髓血1.5mL置于EDTA抗凝的采血管中,并且进行多重ddPCR方法的IKZF1基因缺失检测,明确了IKZF1基因缺失类型,做好样本标记并确保标签信息无误,4℃保存。
人骨髓血提取基因组DNA,使用NanoDrop超微量分光光度计检测DNA浓度,260/280比值满足1.6~1.8;提取的DNA建议立即进行检测,否则应在-20℃以下保存,样本保存期间避免反复冻融。
配制ddPCR反应体系,加入上述4例DNA模板,上样总量设置为50-100ng,总体积20μL。应用数字PCR仪制备生成微滴并进行微滴式PCR反应。反应程序为:60℃启动5min,95℃预变性15min,95℃变性30s,60℃退火60s,共进行40个循环。
数字PCR仪荧光信号收集系统收集FAM、VIC、ROX、CY5和CY5.5通道的荧光信号,对PCR微反应液进行定量分析,得到IKZF1基因2-7号外显子以及内参基因的拷贝数定量,通过分析软件可以清楚判断IKZF1是否存在基因缺失。
具体检测的结果如图4~7,蓝色代表FAM荧光信号,红色代表VIC荧光信号,绿色代表ROX荧光信号,黄色代表CY5荧光信号。图4为IKZF1基因缺失野生型(无缺失)结果图,图5为IKZF1基因缺失亚型IK6(△4-△7)结果图,图6为IKZF1基因缺失亚型IK10(△2-△7)结果图,图7为IKZF1基因单独7号外显子缺失(△7)结果图。
具体检测的拷贝数据如表4所示。
表4:4例临床样本的IKZF1基因缺失检测结果
综上所述,以上实施例提供的基于多通道ddPCR检测IKZF1基因缺失的方法和试剂盒,设计与优化的引物和探针序列特异性好,准确性高,相比市场上其它检测方法可以实现IKZF1基因缺失的快速检测,该技术灵活、高效、时效性强,多个外显子在同一反应孔中高效检测的技术方法大大降低了ddPCR的检测成本,同时多通道的ddPCR仪器自动化程度高,高效的软件分析系统让实验结果判别更加直观、客观和准确,相对于其它方法具有明显优势,在临床检验中具有较高的应用价值。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述,因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改,故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下,本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。
Claims (10)
1.引物和探针组合物,用于检测IKZF1基因缺失,其特征在于,包括引物对及探针组,引物对包括如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:4-5、SEQ ID NO:7-8、SEQ ID NO:10-11、SEQ IDNO:13-14、SEQ ID NO:16-17、SEQ ID NO:19-20所示的核苷酸序列;探针组包括如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物,其特征在于,所述探针组中,如SEQ IDNO:3、12所示的探针序列5 '端标记FAM荧光报告基团,3 '端标记MGB荧光淬灭基团;如SEQID NO:6、15所示的探针序列5 '端标记VIC荧光报告基团,3 '端标记MGB荧光淬灭基团;如SEQ ID NO:9、18所示的探针序列5 '端标记ROX荧光报告基团,3 '端标记MGB荧光淬灭基团;如SEQ ID NO:21所示的探针序列5 '端标记有CY5荧光报告基团,3 '端标记MGB荧光淬灭基团。
3.IKZF1基因缺失检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的引物和探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性标准品、阴性标准品、ddPCR Supermix和ddH2O。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述引物对浓度均为6-9μM,探针组浓度为3-8μM。
6.权利要求3-5任意一项所述试剂盒在非诊断为目的检测IKZF1基因缺失中的应用。
7.一种非诊断目的检测IKZF1基因缺失的方法,其特征在于,步骤包括:
S1.提取样品中基因组DNA;
S2.将样品DNA、权利要求1或2所述的引物和探针组合物以及ddPCR Supermix混合,制备ddPCR混合液;
S3.将ddPCR混合液制成PCR微反应液滴,进行数字PCR扩增反应;
S4.对PCR扩增反应后的产物进行多重荧光信号的采集,根据荧光信号的类型判断IKZF1基因缺失情况。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,步骤S3中,所述ddPCR混合液加入到数字PCR仪中,将ddPCR混合液制成15000-20000个微反应液滴。
9.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,步骤S3中,所述PCR扩增反应程序如下:60℃启动5min,95℃预变性15min,95℃变性30s,60℃退火60s,共进行40个循环。
10.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,步骤S4中,所述PCR扩增结束后,对液滴信号进行多荧光通道的信号检测,采集的荧光信号通道包括FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5,其中FAM、VIC、ROX、CY5作为检测IKZF1基因缺失的荧光信号通道,CY5.5作为液滴质控荧光信号通道。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103103284A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-05-15 | 北京大学人民医院 | 一种用于定量检测ikzf1基因突变的试剂盒 |
CN111534588A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-08-14 | 南京实践医学检验有限公司 | 基于荧光定量pcr检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法 |
JP2020137505A (ja) * | 2019-03-01 | 2020-09-03 | 国立大学法人北海道大学 | Ikzf1遺伝子変異を検出するための核酸プローブセット及び当該プローブセットを用いたikzf1遺伝子変異の検出方法 |
CN114317759A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-12 | 东南大学 | 一种检测恶性血液病ikzf家族基因突变的引物组合及方法 |
CN114807124A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-07-29 | 上海信诺佰世医学检验有限公司 | 一种检测alk融合基因的引物和探针组合物、试剂盒及方法 |
-
2023
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103103284A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-05-15 | 北京大学人民医院 | 一种用于定量检测ikzf1基因突变的试剂盒 |
JP2020137505A (ja) * | 2019-03-01 | 2020-09-03 | 国立大学法人北海道大学 | Ikzf1遺伝子変異を検出するための核酸プローブセット及び当該プローブセットを用いたikzf1遺伝子変異の検出方法 |
CN111534588A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-08-14 | 南京实践医学检验有限公司 | 基于荧光定量pcr检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法 |
CN114317759A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-12 | 东南大学 | 一种检测恶性血液病ikzf家族基因突变的引物组合及方法 |
CN114807124A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-07-29 | 上海信诺佰世医学检验有限公司 | 一种检测alk融合基因的引物和探针组合物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Development of a Fluorescence in Situ Hybridization Probe for Detecting IKZF1 Deletion Mutations in Patients with Acute Lymphoblastic Leukemia;Junichi Hashiguchi,等;《the Journal of Molecular Diagnostics》;20180625;第20卷(第04期);446-454 * |
Highly sensitive MRD tests for ALL based on the IKZF1Δ3-6 microdeletion;NC Venn,等;《Leukemia》;20111209(第26期);1414-1416 * |
Quantitative detection of IKZF1 deletion by digital PCR in patients with acute lymphoblastic leukemia;Junichi Hashiguchi,等;《International Journal of Laboratory Hematology》;20181120;第41卷(第02期);38-40 * |
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