CN103103284A

CN103103284A - 一种用于定量检测ikzf1基因突变的试剂盒

Info

Publication number: CN103103284A
Application number: CN201310047359XA
Authority: CN
Inventors: 阮国瑞; 黄晓军; 江滨; 刘开彦; 陈珊珊; 江浩; 刘艳荣; 赖悦云; 李玲娣; 冷馨; 黎宁
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103103284B

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒。本发明所提供的用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No：1所示，另一条引物序列如SEQ ID No：2所示，探针的序列如SEQ ID No：3所示。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测IKZF1基因突变水平，且简便、灵敏，从而用于血液肿瘤患者（特别是ALL白血病患者、CML急淋变患者）的辅助诊断、MRD监测、预后的评估等等，将在医学检测领域发挥重要作用。

Description

一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒。

背景技术

Ph阳性白血病包括慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)和某些急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL),其始作俑者是Ph染色体导致的BCR-ABL1融合基因。然而，以BCR-ABL1为靶点的治疗对某些Ph阳性白血病却并不见效。最新研究发现，在这类白血病的发生及进展过程中，包括IKZF1基因缺失在内的其他遗传学因素的作用也不可忽视。

IKZF1基因编码一种具有锌指结构的转录因子蛋白，在淋巴细胞的分化和发育过程中起着重要的调控作用。IKZF1基因的下游产物Ikaros是淋巴细胞特异性转录因子。IKZF1基因缺失可导致Ikaros表达的不足、显性失活或完全丧失。

IKZF1突变主要见于ALL，约20%的儿童B-ALL、15～30%的成人B-ALL和5%的T-ALL患者有IKZF1突变。BCR-ABL1阳性B-ALL患者常伴有IKZF1基因突变，MLL相关融合基因阳性的ALL患者也可伴有IKZF1突变，约20%染色体核型正常的ALL患者中可检测到IKZF1基因突变。IKZF1突变发生于基因组水平，是ALL发病的一个重要促进因素，也是ALL患者独立的预后不良因素。IKZF1突变很少发生于髓性白血病，但约86%的CML患者急淋变时可检测到发生IKZF1突变，是CML患者急变的重要促进因素。

目前，检测IKZF1突变的方法主要为测序的方法，不能定量分析IKZF1突变的水平。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒。

本发明所提供的用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No：1所示，另一条引物序列如SEQ ID No：2所示，探针的序列如SEQ ID No：3所示。

SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示引物对和SEQ ID No：3所示探针在制备定量检测IKZF1基因突变的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

上述技术方案中，所述IKZF1基因突变可为单纯的缺失突变，还可为缺失突变和插入突变并存，还可为缺失突变和替换突变并存；

以野生型IKZF1基因的全基因组序列(NCBI Reference Sequence:NT_079592.2)为参照物来描述该突变应当满足的条件，该突变必须满足如下条件：

1）缺失突变、插入突变或替换突变均发生在参照物的自5ˊ末端起第25185——76017位核苷酸之间；（参照物的自5ˊ末端起第25185——76017位核苷酸实际上位于参照物的第2内含子-第6内含子这段区域内）

2）在参照物的自5ˊ末端起第25185——76017位核苷酸之间，发生所述突变后，所剩余的DNA片段大小能够被SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所述引物对扩增得到PCR扩增曲线。

本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测IKZF1基因突变水平，且简便、灵敏，从而用于血液肿瘤患者（特别是ALL白血病患者、CML急淋变患者）的辅助诊断、MRD监测、预后的评估等等，将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为IKZF1基因突变测序结果。

图2为标准曲线。

图3为对病人样本的灵敏度检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测IKZF1基因突变

一、检测样本

成人初诊为ALL306例，非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma,NHL)10例，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia，CLL)21例，诊断标准依据世界卫生组织新的分型标准。提取DNA的样本为上述患者的外周血或骨髓，均经过患者的知情同意。

二、测序方法检测IKZF1基因突变

以提取的DNA为模板，以上游引物：5-ccacagggcaagtcatccacattttg-3’，下游引物：5-cagaccatagagtccctcctaggggaaaaa-3’进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl：2×PCR扩增预混试剂（天根生物有限公司）25μl，上、下游引物各400nM，300ng DNA。PCR反应条件为：先95℃5分钟；然后95℃40秒，58℃40秒，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃10分钟。扩增产物纯化后，使用测序引物5-ttcttagaagtctggagtctgtgaaggtca-3’由北京天一辉远生物技术有限公司在ABI3700DNA分析仪上完成测序工作。其中发现的部分突变被克隆进入pMD18-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、进一步测序验证。

结果，306例ALL中，有58例的IKZF1基因存在突变，其余均不存在IKZF1基因突变。其中一例的测序结果如图1。

以野生型IKZF1基因(NCBI Reference Sequence:NT_079592.2)的全基因组序列为参照物描述58个突变。58个突变中，有的仅为缺失突变（即仅丢失大片段），有的为缺失突变和插入突变并存（即在缺失大片段的同时有少数几个碱基的插入）；但是无论哪种突变，突变均发生在参照物的自5ˊ末端起第25185——76017位核苷酸之间；无论哪种突变，与参照物相比丢失的碱基数目在50730bp-50786bp之间（表1）。

表1、丢失的碱基总数（bp）

样本号	长度	样本号	长度	样本号	长度	样本号	长度	样本号	长度
										1	50764	2	50758	3	50766	4	50779	5	50740
6	50743	7	50740	8	50745	9	50740	10	50734
										11	50740	12	50742	13	50751	14	50740	15	50744
16	50762	17	50739	18	50741	19	50750	20	50741
										21	50741	22	50736	23	50746	24	50737	25	50751
26	50743	27	50730	28	50747	29	50755	30	50735
										31	50739	32	50738	33	50741	34	50739	35	50738
36	50743	37	50763	38	50741	39	50741	40	50740
										41	50762	42	50740	43	50731	44	50740	45	50735
46	50786	47	50754	48	50741	49	50763	50	50741
										51	50762	52	50734	53	50740	54	50758	55	50740
56	50739	57	50740	58	50740

三、本发明方法检测IKZF1基因突变

（一）方法

1、实时荧光定量PCR

引物对：CTTAGAAGTCTGGAGTCTGTGAAGGTC（SEQ ID No：1），

ATTCAGGAATAAAATGCAAATCACC（SEQ ID No：2）。

TaqMan-MGB探针：FAM-CTTCTCCCAGCCCATAGG-MGB（SEQ ID No：3）；5’端标记报告荧光基团FAM（蓝色荧光），3’端标记不发光的淬灭基团，并连接二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3)。

内参基因白蛋白（albumin，ALB）扩增，其特异引物及TaqMan探针如下：

ALB-FP:5’-GCC CAT TGT CCT GTT CTG ACT T-3’

ALB-RP:5’-TTC CAC TGC TGA GCC ATC AC-3’

ALB-Probe:5’-FAM-TAT GAT GCG GTA CAC AGA GCC ATC CAA G-TAMARA-3’

扩增体系：通用PCR扩增预混试剂（购自美国应用生物系统公司），上、下游引物各400nmol/L，荧光标记的TaqMan-MGB探针200nmol/L，150ng DNA。

PCR反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15s，60℃1min，共40个循环。

2、标准曲线的制备

根据上述测序检测结果，从58例含IKZF1基因突变的样本中，选取一例样本。以该样本的DNA为模板，按照测序中的方法，先进行PCR扩增，再进行克隆测序。将测序正确的质粒作为质粒标准品。

通过测定吸光度值计算出拷贝数，分别制备十倍梯度稀释（2x10⁷，2x10⁶，2x10⁵，2x10⁴，2x10³，2x10²个拷贝）样品，用于制作IKZF1型突变的标准曲线。每批定量检测的扩增曲线阈值均固定为0.08，均进行阳性对照（另一例IKZF1型突变阳性病人标本）、无模板空白对照、无相关模板阴性对照（IKZF1突变阴性病人标本）及用于制作标准曲线的质粒标准品的扩增。

荧光标准曲线见图2（阈值为0.082）,函数为log₁₀IKZF1=(Ct-40.60)/-3.56，相关系数均达到0.99以上，检测IKZF1基因片段的灵敏度可达1个拷贝。

3、本发明方法的检测结果计算

利用DNA标本分别扩增ALB及IKZF1突变的Ct值，根据ALB、IKZF1突变标准曲线分别计算出各份标本的ALB及IKZF1突变的拷贝数。以每100拷贝ALB量中IKZF1突变拷贝数作为IKZF1突变基因含量。如ALB拷贝数≥3×10⁴，认为该标本可用于定量检测。

4、结果判断

在内参基因ALB扩增拷贝数≥3×10⁴的前提下，若用SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3成功得到PCR扩增曲线，则证明待测样本中含有IKZF1基因突变，检测结果为阳性；进一步根据IKZF1突变标准曲线计算出各份标本的IKZF1突变的拷贝数，以每100拷贝ALB量中IKZF1突变拷贝数作为IKZF1突变基因含量；若得不到PCR扩增曲线，则证明待测样本中不含有IKZF1基因突变，检测结果为阴性。

（二）结果

结果如表2，在306例ALL病人中有58例成功实现定量检测，其余检测结果为阴性。在10例NHL及21例CLL中检测结果均为阴性。

该58例的患者与上述测序检测出来的58例患者一一对应，完全一致，表明本发明方法正确可行。

IKZF1基因突变样本中突变基因的定量结果如表3。以IKZF1基因的拷贝数与ALB基因的拷贝数的比值表示IKZF1基因的相对表达水平（%）。IKZF1突变阳性的58例标本的IKZF1突变拷贝数/ALB拷贝数平均值为234.36%（范围2.25%-469.49%）。

表2、IKZF1基因突变在306例初诊ALL患者中的检出率

分型	例数	突变型	野生型	突变检出率(%)
					ALL	307	58	249	19.0
NHL	10	0	10	0
					CLL	21	0	21	0

ALL：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)；NHL：非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)；CLL：慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia)。

表3

实施例2、本发明方法的灵敏度

1、对质粒标准品的检测灵敏度：

将质粒标准品分别十倍梯度稀释（10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰个拷贝），然后进行实时荧光定量PCR。每梯度重复3次。

结果显示，其相关系数为0.99以上，检测灵敏度可达1个拷贝。ALB及IKZF1突变的扩增效率相近（标准曲线斜率分别为-3.45、-3.56）。

2、对IKZF1突变阳性病人的检测灵敏度：

对8例IKZF1突变阳性病人DNA标本进行10倍梯度稀释（DNA的初始浓度为150ng/ul），然后进行实时荧光定量PCR。

结果，灵敏度为10^-4或10^-5，相关系数均在0.99以上。其中5例的结果如图3所示。

Claims

1.一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No：1所示，另一条引物序列如SEQ ID No：2所示，探针的序列如SEQ ID No：3所示。

2.SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示引物对和SEQ ID No：3所示探针在制备定量检测IKZF1基因突变的试剂盒中的应用。