CN103013993B - 引物及该引物质谱检测pik3ca基因热点突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了一种引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，包括如下步骤：⑴、定位PIK3CA基因的热点突变位点；⑵、根据这些突变位点两端的DNA序列设计出用于扩增反应的引物和用于延伸反应的引物；⑶、扩增反应；⑷、SAP酶（碱性磷酸酶）处理；⑸、延伸反应；⑹、使用树脂纯化延伸反应的产物；⑺将树脂纯化过的产物转移到芯片上；⑻、将芯片置于质谱仪中，运行检测程序；⑼、读取并分析检测数据，确定PIK3CA基因目的位点的基因型。相对于传统的检测方法，本发明具有灵敏度高，准确率高，通量高，成本低的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法。
背景技术
（1）、单核苷酸多态性
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。
（2）、PIK3CA基因
PIK3CA是PI3K家族的关键成员-IA类磷脂酰肌醇-3激酶的p110α催化亚基。PIK3CA是一个34kb的基因，定位于染色体3q26.32，含20个外显子，编码1068个氨基酸，生成124kDa蛋白质，它是逆转录病毒v-p3k癌基因在细胞内的同系物。PIK3CA的功能是催化4,5-PIP2成为3,4,5-PIP3。研究已经发现在多种人类癌症（结肠癌，乳癌，脑癌，肝癌，胃癌和肺癌等）中存在PIK3CA的扩增、缺失、及体细胞突变。体细胞突变的PIK3CA其激酶活性增加并导致细胞转化。PIK3CA基因在癌症中呈现高频突变：人们对PIK3CA在多种癌症中的突变进行了检测，大量的数据表明PIK3CA有3个热点突变区，即第9外显子的E542K和E545K，以及第20号外显子的H1047R。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患者对EGFR-TKI等药物的耐药性。
（3）、目前的PIK3CA突变的检测方法
目前PIK3CA突变的检测方法有直接测序法，实时定量PCR法，液态芯片法等。其中，直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20%，且检测成本也较高；实时定量PCR法的灵敏度较直接测序法高，可达5%左右，但其通量低，且需面对其假阳性高的问题。液态芯片法的特异性和准确率高，但是需要针对突变位点设计探针和相应的微球，成本较高。
因此，我们需要找到一种灵敏度高，操作简便，成本低的方法，以求可以实现对PIK3CA热点突变快速简便准确的检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种引物及该引物质谱检测PIK3CA热点突变的方法；旨在解决现有技术灵敏度低，通量低，准确度不高，成本高的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：引物，包括扩增引物和测序引物，
所述的扩增引物序列如下：
SEQIDNO:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’
SEQIDNO:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’
SEQIDNO:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’
SEQIDNO:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’
SEQIDNO:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’
SEQIDNO:65’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’
SEQIDNO:75’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’
SEQIDNO:85’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’；
所述的延伸引物序列如下：
SEQIDNO:95’-TCCAGCCACCATGAT-3’
SEQIDNO:105’-CCTCTCTCTGAAATCACT-3’
SEQIDNO:115’-CACGAGATCCTCTCTCT-3’
SEQIDNO:125’-GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。
本发明的另一目的是利用该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，包括如下步骤：
⑴、确定PIK3CA热点突变在基因序列中的位置；
⑵、根据突变位点及其两端的序列设计用于扩增反应的引物对和用于延伸反应的引物；
⑶、使用扩增引物对进行扩增反应以获得包含突变位点及其两端序列的扩增产物；
⑷、使用SAP酶处理扩增产物，去除残留在反应体系中多余的脱氧核苷酸；
⑸、使用延伸引物进行延伸反应；
⑹、然后使用树脂纯化延伸产物；
⑺、将延伸产物转移到芯片上；
⑻、将芯片放置于质谱仪中，运行程序进行检测；
⑼、读取并分析检测数据，确认样本PIK3CA基因目的位点的基因型。
所述步骤⑴热点突变定位于PIK3CA基因的第542位、545位、1047位密码子中的一种或几种；所述步骤⑵扩增反应所使用的扩增引物包括SEQIDNO:1至SEQIDNO:8所示序列中的一对组合或多对组合；所述步骤⑵延伸引物包括SEQIDNO:9至SEQIDNO:12所示序列中的一条或多条；
所述第542位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，延伸引物为SEQIDNO:9；
所述第545位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，延伸引物为SEQIDNO:10；
所述第1047位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基和第二位碱基上，均为错义突变，扩增引物分别为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的组合以及SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的组合，延伸引物分别为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。
本发明的有益技术效果是：与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)、检测灵敏度高，质谱仪将不同质量的产物加以区分，可以检测出PIK3CA突变比率低于1％的样本。
(2)、通量高，使用384孔板进行实验，可一次性对190例样本同时进行检测。
(3)、准确率高，不出现假阳性的检测结果。
(4)、检测成本低。
图1、使用延伸引物SEQIDNO:9和SEQIDNO:10对测试样本PIK3CA基因545位密码子的第一位碱基以及1047位密码子的第一位碱基进行检测的结果；
附图说明
图2、使用延伸引物SEQIDNO:11和SEQIDNO:12对测试样本PIK3CA基因542位密码子的第二位碱基以及1047位密码子的第二位碱基进行检测的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合具体样本对本发明进行具体说明：
（1）、确定PIK3CA热点突变在基因序列中的位置；
人们对PIK3CA在多种癌症中的突变进行了检测，大量的数据表明PIK3CA有3个热点突变区，分别是第9号外显子的542位密码子和545位密码子以及第20号外显子的1047位密码子；这3个热点突变位置共包括4个碱基的错义突变（其中1047位密码子的第一和第二位碱基均为突变位点；542、545位密码子则均为第一位碱基发生突变），每一个突变对应一个SNP号（rs号）；具体如下：
542位密码子第一位碱基对应rs号为：rs121913273；
545位密码子第一位碱基对应rs号为：rs104886003；
1047位密码子第一位碱基对应rs号为：rs121913281；
1047位密码子第二位碱基对应rs号为：rs121913279。
为了避免延伸反应中延伸引物之间形成二聚体，将这个4个突变检测分为两组：rs104886003和rs121913281一组；rs121913273和rs121913279一组，在扩增反应和延伸反应中，始终分为这两组进行。
（2）、根据步骤(1)中的SNP位点设计扩增引物，遵循引物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则；
rs121913273使用扩增引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6;
rs104886003使用扩增引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4;
rs121913281使用扩增引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2;
rs121913279使用扩增引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;
SEQIDNO:1至SEQIDNO:4混合为一管扩增引物工作液，工作液浓度为1μM；
SEQIDNO:5至SEQIDNO:8混合为一管扩增引物工作液，工作液浓度为1μM；
（3）、根据步骤(1)中的SNP位点设计延伸引物，遵循每条延伸引物的分子量相互间的差别要大于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量要在4500-8500Da之间的原则。
rs121913273使用延伸引物SEQIDNO:11;
rs104886003使用延伸引物SEQIDNO:10;
rs121913281使用延伸引物SEQIDNO:9;
rs121913279使用延伸引物SEQIDNO:12;
（4）、使用扩增引物对进行扩增反应以获得包含突变位点及其两端序列的扩增产物；
扩增体系为：
反应条件：
（5）、使用SAP酶（碱性磷酸酶）处理扩增产物，去除残留在反应体系中多余的脱氧核苷酸；
反应体系：
| 试剂 | 终浓度 | 加样体积（μl） |
| 超纯水 | / | 1.53 |
| SAP缓冲液 | 0.243x | 0.17 |
| SAP酶(1.7U/ul) | 0.5U | 0.30 |
| 总体积[uL] | / | 2 |
将表中的混合液加入扩增产物中，最终体积为7μl；
反应条件：
| 温度 | 时间 |
| 37°C | 40分钟 |
| 85°C | 5分钟 |
| 4°C | 保持 |
SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。
（6）、延伸反应：
使用延伸引物进行延伸反应：
反应体系：
| 试剂 | 终浓度 | 加样体积（μl） |
| 超纯水 | / | 0.619 |
| iPLEX缓冲液 | 0.222X | 0.200 |
| iPLEX终止缓冲液 | 1X | 0.2005 --> |
| 延伸引物混合液 | / | 0.94 |
| iPLEX酶 | 1X | 0.041 |
| 总体积[μl] | / | 2.000 |
将表中的混合液加入SAP反应产物中，最终体积为9μl；
反应条件：
延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。
延伸引物混合液配比如下：
（7）、使用树脂纯化延伸产物；
在延伸产物中加入41μl超纯水，再加入15mg树脂，上下颠倒15分钟，使反应产物脱盐纯化，3200g离心5分钟后的上清可以直接上机反应。
（8）、质谱检测：将反应产物转移到芯片上，上质谱仪检测。
质谱检测结果见附图：图1所示为使用延伸引物SEQIDNO:9和SEQIDNO:10对检测样本PIK3CA基因1047位密码子第一位碱基和545位密码子第一位碱基进行检测的结果；对1047位密码子的第一位碱基检测的延伸引物大小为4784.2Da，其碱基为C；对545位密码子的第一位碱基检测的延伸引物大小为5656.7Da，其碱基为G；两者均未发生突变。
图2所示为使用延伸引物SEQIDNO:11和SEQIDNO:12对检测样本PIK3CA基因542位密码子第一位碱基和1047位密码子第二位碱基进行检测的结果。对542位密码子的第一位碱基检测的延伸引物大小为5368.5Da，其碱基为G；对1047位密码子的第二位碱基检测的延伸引物大小为6454.3Da，其碱基为A。两者均未发生突变。
本发明使用的质谱仪（MassARRAYAnalyzer4）以及文中提到的芯片均来自美国Sequenom公司。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的保护范围，在本发明说明书基础上所作的等效结构，或直接、间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.引物，包括扩增引物和延伸引物，其特征在于：
所述的扩增引物序列如下：
SEQIDNO:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’
SEQIDNO:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’
SEQIDNO:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’
SEQIDNO:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’
SEQIDNO:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’
SEQIDNO:65’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’
SEQIDNO:75’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’
SEQIDNO:85’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’；
所述的延伸引物序列如下：
SEQIDNO:95’-TCCAGCCACCATGAT-3’
SEQIDNO:105’-CCTCTCTCTGAAATCACT-3’
SEQIDNO:115’-CACGAGATCCTCTCTCT-3’
SEQIDNO:125’-GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。
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