CN116219020A - 一种甲基化内参基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲基化内参基因及其应用，涉及生物技术及疾病检测领域。本发明提供一种新的内参基因SDF4，该内参基因具有较高GC含量；且在人的不同疾病、不同组织和不同样本类型的DNA中CpG二核苷酸的C高度甲基化且甲基化水平无明显差异；与靶基因共同扩增时的扩增效率优于现有常见的内参基因，能更加准确地反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量；可应用于基于甲基化特异性PCR检测的癌症早筛、早诊、术后风险评估、动态监测和辅助判断疾病进程等领域。

Description

一种甲基化内参基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及疾病检测领域，具体而言，涉及一种甲基化内参基因及其应用。
背景技术
甲基化(Methylation)是人基因组DNA常见的一种表观遗传修饰，是指在DNA甲基化转移酶的作用下，将甲基(-CH3)转移到DNA胞嘧啶碱基C的第5号碳原子上。DNA甲基化参与细胞分化、基因组稳定性、X染色体失活和基因印记等多种细胞生物学过程。在哺乳动物体内常见的甲基转移酶有DNMT3a、DNMT3b和DNMT1，其中DNMT3a和DNMT3b实现DNA的从头甲基化(De novo Methylation)，而DNMT1负责复制DNA模板序列的甲基化模式。
DNA的甲基化主要发生CpG二核苷酸的碱基C上。约70％的人类基因上游的启动子区上有多个密集的CpG二核苷酸，形成CpG岛(CpG Island)。CpG岛的甲基化导致基因表达沉默。除了基因启动子区CpG岛的甲基化，基因的第一号外显子与启动子区类似，也存在甲基化，而导致基因表达的沉默。基因的DNA甲基化在肿瘤发生发展中亦发挥重要作用。抑癌基因启动子区的高甲基化抑制基因的表达，使抑癌基因功能丧失，导致肿瘤细胞的增殖失控和侵袭转移，最终导致癌症的发生发展。
有研究表明，甲基化修饰发生于肿瘤早期，早于基因突变的发生。CpG二核苷酸的甲基化常常成簇出现，呈连锁状态。因此，DNA甲基化比碱基突变、cfDNA分子片段特征等的检测更灵敏、更稳定，非常适合肿瘤的早筛、早诊。另外，由于CpG岛与控制基因的表达相关，CpG岛的甲基化可呈现出组织特异性模式，因此，可以用DNA甲基化进行癌症的组织溯源。基于以上特征，甲基化是癌症早筛、早诊极为理想的生物标志物。
目前，DNA甲基化的检测方法可分为化学转化法、酶转化法、酶切法和甲基化DNA免疫沉淀法。化学转化法即通过重亚硫酸氢盐将5甲基化胞嘧啶(5-mC)转化成尿嘧啶U，然后进行PCR检测或测序，此类方法有WGBS(Whole-Genome Bisulfite Sequencing)、BSAS(Bisulfite Amplicon Sequencing)、MSP(Methylation Specific PCR)、BSP(BisulfiteSequencing PCR)、QMSP(Quantitative Methylation Specific PCR)。酶转化法即通过TET酶将5-mC转化为5-caC，再用APOBEC酶将5-caC转化为尿嘧啶U或者通过吡啶硼烷将5-caC转化为DHU，如NEB公司的NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit和Base Genomics公司的TAPS方法。酶切法即通过甲基化敏感或不敏感的内切酶切割甲基化或非甲基化位点，通过PCR或测序进行DNA模板的选择性分析，如简化基因组重亚硫酸盐测序RRBS。甲基化DNA免疫沉淀法Methylated DNA Immunoprecipitation(MeDIP)，通过抗5-mC的抗体分离出甲基化的DNA片段，然后进行相关检测分析。酶转化法对DNA的损伤小，转化后的DNA回收率高，片段较为完整，但转化效率不稳定。酶切法对DNA的损伤小，酶切效率高，但需要对一种或一类DNA序列寻找特异性的内切酶，不具有普适性。甲基化DNA免疫沉淀法的捕获效率受体系影响较大。重亚硫酸氢盐转化虽然对DNA的损伤大，转化后的DNA呈片段化，转化回收率低，但转化效率高，转化率稳定，可以识别单碱基甲基化，是DNA甲基化检测的金标准，在科研与临床上广泛应用。
基于重亚硫酸氢盐转化的荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高、检测体系封闭，不易被污染、技术成熟、成本低等优势广泛用于癌症的早筛、早诊。甲基化特异性荧光定量PCR(Quantitative Methylation Specific PCR，QMSP)在进行靶基因甲基化含量检测时，需要以内参基因作为对照来计算甲基化的相对含量，进行归一化处理，同时减少系统误差，并以内参基因扩增的Ct值大小作为判断样本合格的标准。当内参基因的Ct值超过某一阈值，认为样本含量过低，判断为样本失不合格，无法进行分析。用靶基因扩增的Ct值减去内参基因的Ct值，计算△Ct值，根据癌症与对照人群的△Ct值大小或进一步建模来判断受检者是否患有某种癌症。
内参基因一般选择人基因组上的管家基因(Housekeeping Gene)，其在不同的条件下均稳定表达，如ACTB、B2M、GAPDH、18S rRNA等。ACTB、B2M、GAPDH常作为基因突变、拷贝数变异检测的内参基因。但用ACTB、B2M、GAPDH作为基因甲基化检测的内参基因时，存在不足：(1)当DNA模板含量较低时，经重亚硫酸氢盐转化后，有效的DNA模板含量会更低，出现内参基因不扩增，样本被判断为不合格，无法进行分析；(2)现有内参基因不能准确反映DNA样本的起始量与靶基因的甲基化含量，导致计算的靶基因△Ct值并不准确。
因此，有必要挖掘一种新的内参基因，能适用于基于重亚硫酸氢盐转化的靶基因甲基化含量检测，且能准确地反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种甲基化内参基因及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种甲基化内参基因，所述内参基因包括：目的序列的全长序列和/或基因片段；所述目的序列包括：SDF4基因5`端上游的启动子区、SDF4基因的外显子区与内含子区及基因3`下游调控区。
第二方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其有效组分包括：检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂。
第三方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备靶基因的甲基化检测的内参基因的检测试剂中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：(1)检测或辅助检测靶基因的甲基化相对含量；(2)预测或辅助预测由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病的风险；(3)诊断或辅助诊断由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病。
第五方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在靶基因的甲基化检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种新的内参基因，该内参基因具有较高的GC含量；且在人的不同疾病、不同组织和不同样本类型的DNA中CpG二核苷酸的C高度甲基化且甲基化水平无明显差；与靶基因共同扩增时的扩增效率优于现有常见的内参基因，能更加准确的反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量；可应用于基于甲基化特异性PCR检测的癌症早筛、早诊、术后风险动态监测和辅助判断疾病进程等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为肝癌组织与癌旁组织DNA，肝癌、肝硬化与健康人血浆cfDNA中SDF4基因序列中CG、CHG、CHH中C的甲基化含量；
图2-1为转化后白细胞DNA起始量与不同内参基因扩增Ct值的相关性；其中，(a)转化后白细胞DNA起始量与ACTB扩增Ct值的相关性；(b)转化后白细胞DNA起始量与SDF4(引物探针组合5)扩增Ct值的相关性；(c)转化后白细胞DNA起始量与SDF4(引物探针组合6)扩增Ct值的相关性；
图2-2为转化后白细胞DNA不同起始量下内参基因扩增Ct值的相关性；其中，(a)内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合5)扩增Ct值的相关性；(b)内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合6)扩增Ct值的相关性；(c)内参基因SDF4两套引物探针扩增Ct值的相关性；
图3-1为不同内参基因在肝癌组织与癌旁组织中扩增Ct值的比较；其中，(a)不同内参基因在肝癌组织与癌旁组织间扩增Ct值的比较；(b)不同内参基因在肝癌组织与癌旁组织中扩增Ct值的两两比较；
图3-2为肝癌与癌旁组织中靶基因扩增Ct值的比较；其中，(a)靶基因在肝癌组织与癌旁组织间扩增Ct值的比较；(b)靶基因在肝癌组织与癌旁组织中扩增Ct值的两两比较；
图3-3为不同内参基因时靶基因扩增Ct值的相关性；其中，(a)以ACTB与SDF4(引物探针组合5)作为内参基因时，靶基因扩增Ct值的相关性；(b)以ACTB与SDF4(引物探针组合6)作为内参基因时，靶基因扩增Ct值的相关性；
图3-4为不同内参基因时靶基因扩增Delta_Ct值的相关性；其中，(a)以ACTB与SDF4(引物探针组合5)作为内参基因时，靶基因扩增Delta_Ct值的相关性；(b)以ACTB与SDF4(引物探针组合6)作为内参基因时，靶基因扩增Delta_Ct值的相关性；
图4-1为乳腺癌与肺癌组织中不同内参基因扩增的Ct值比较；其中，(a)乳腺癌与肺癌组织间不同内参基因扩增Ct值的比较；(b)乳腺癌与肺癌组织样本中不同内参基因扩增Ct值的两两比较；
图4-2为乳腺癌与肺癌组织中靶基因ZIC4扩增Ct值的比较；其中，(a)乳腺癌与肺癌组织样本间靶基因扩增Ct值的比较；(b)乳腺癌与肺癌组织样本中靶基因扩增Ct值的两两比较；
图4-3为乳腺癌与肺癌组织中内参基因扩增Ct值的相关性；其中，(a)内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合5)扩增Ct值的相关性；(b)内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合6)扩增Ct值的相关性；(c)内参基因SDF4两套引物探针组合扩增Ct值的相关性；
图4-4为乳腺癌与肺癌组织中不同内参基因时靶基因ZIC4扩增Ct值的相关性；其中，(a)以ACTB与SDF4(引物探针组合5)作为内参基因时靶基因扩增Ct值的相关性；(b)以ACTB与SDF4(引物探针组合6)作为内参基因时靶基因扩增Ct值的相关性；(c)以SDF4作为内参基因时靶基因扩增Ct值的相关性；
图5-1为不同来源的血浆cfDNA中内参基因与靶基因扩增Ct值的比较；其中，(a)不同内参基因扩增Ct值的比较；(b)不同内参基因时靶基因扩增Ct值的比较；
图5-2为不同来源血浆cfDNA中靶基因与不同内参基因扩增曲线的比较；
图6-1为两种不同内参基因时靶基因区分肝癌与肝硬化的ROC曲线；
图6-2为肝癌与肝硬化血浆样中内参基因ACTB与SDF4扩增Ct值的相关性；
图6-3为肝癌与肝硬化血浆中不同内参基因时靶基因1扩增的Delta_Ct值的相关性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
通过分析现有的内参基因ACTB、B2M、GAPDH的DNA序列会发现，这些内参基因DNA序列的GC含量偏低，且CG二核苷酸中的C并不是甲基化的，经过重亚硫酸氢盐转化后，这些内参基因的GC含量会极低。而用于癌症检测的靶基因一般是处于CpG岛，其GC含量高，且CpG二核苷酸中的C是高度甲基化的，经过重亚硫酸氢盐转化后，DNA序列的GC含量依然能维持在40％-60％的水平。这样在同一管QMSP反应内，因为靶基因与内参基因DNA序列的GC含量差异过大，导致靶基因会处于优势扩增，内参基因扩增处于弱势，由此带来两个弊端：(1)当DNA模板含量较低时，内参基因出现不扩增，样本被判断为不合格，无法进行分析；(2)由于靶基因与内参基因扩增效率的不均衡，当样本中靶基因甲基化含量高时，靶基因扩增的优势更甚；当样本中靶基因甲基化含量低时，靶基因相对内参基因扩增优势并不明显，因此会造成不同临床样本中靶基因与内参基因扩增效率有差异，内参基因不能准确地反映DNA样本的起始量，从而导致计算的靶基因△Ct值并不准确，最终影响癌症的检测性能。
因此，有必要挖掘一种新的内参基因，这种内参基因的DNA序列具有较高的GC含量，且与靶基因类似，有较多的CpG二核苷酸，且CpG二核苷酸中的C是高度甲基化的，这样经过重亚硫酸氢盐转化后，内参基因的GC含量与靶基因处于相同水平，在进行QMSP扩增时具有相同的扩增效率。同时，这种新的内参基因与ACTB、B2M、GAPDH一样稳定，在人的不同疾病、器官来源下的表达、CpG甲基化水平没有显著差异。即正常细胞、炎症反应细胞、良性疾病细胞、癌细胞来源的基因组DNA，不同器官来源的基因DNA，不同样本类型，如组织、细胞、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、痰液、胸水、腹水、粪便、咽拭纸、鼻拭纸、肛拭纸等来源的基因组DNA中，这种内参基因的表达、甲基化水平都是高度一致的。
本发明提供了一种新的内参基因，该内参基因具有较高GC含量；且在人的不同疾病、不同组织、不同样本类型的DNA中CpG二核苷酸中的C高度甲基化且甲基化水平无明显差；与靶基因共同扩增时的扩增效率优于现有常见的内参基因，能更加准确的反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量；可应用于基于甲基化特异性PCR检测的癌症早筛、早诊、术后风险动态监测、辅助判断疾病进程等领域。
具体的技术方案
一方面，本发明实施例提供了一种甲基化内参基因，所述内参基因包括：目的序列的全长序列和/或基因片段；所述目的序列包括：SDF4基因5`端上游的启动子区、SDF4基因的外显子区与内含子区及基因3`下游调控区。
SDF4(Gene ID:51150)基因，官方名全称为StromalCell Derived Factor 4，别名为Cab45、SDF-4，Ensemble数据库的ID为ENSG00000078808，MIM数据库的ID为614282。该基因是一种蛋白质编码基因，编码一种基质细胞衍生因子，其为CREC(网腔钙结合蛋白)蛋白家族的成员之一，该编码蛋白质包含六个EF-hand基序和钙结合基序。这种蛋白质定位在高尔基体腔，可能参与调节钙依赖的细胞活动。
在一些实施例中，所述全长序列和/或所述基因片段的GC含量为40％～80％。该GC含量具体可以为40％、50％、60％、70％和80％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述全长序列和/或所述基因片段的序列中含有CpG二核苷酸，CpG二核苷酸的密度为每100bp长度至少有2个CpG二核苷酸。
在一些实施例中，所述全长序列和/或所述基因片段的序列中CpG二核苷酸的C为甲基化的5-mC，每个CpG二核苷酸中C的甲基化水平为80％～100％，具体可以为80％、85％、90％、95％和100％中的任意一种或任意两种之间的范围；优选为95％～100％。
在一些实施例中，所述全长序列或所述基因片段经过重亚硫酸氢盐转化后，序列中的GC含量在30％～70％，具体可以为30％、40％、50％、60％和70％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为30％-50％。
在一些实施例中，所述基因片段的序列长度为≥80bp，具体可以为80bp、100bp、150bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp、320bp、340bp、350bp、500bp、1000bp、2000bp、10,000bp、20,000bp、30,000bp中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述全长序列和/或所述基因片段的甲基化水平在：不同年龄和/或性别的样本、不同器官来源的样本、不同健康状态的样本和不同类型DNA样本中的任意一种或多种中无显著差异。
不同器官来源包括：肝、肺、胃、食管、肠、胰腺、前列腺、乳腺、宫颈、卵巢、脑、甲状腺、鼻、眼、口腔、皮肤和血液中的任意一种或多种。
不同健康状态包括：不同器官组织的癌变、炎症、良性病变和健康生理状态中的任意一种或多种。
不同类型DNA样本包括：组织DNA、细胞DNA、全血DNA、血浆cfDNA、血清cfDNA、尿液DNA、脑脊液DNA、唾液DNA、痰液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、咽拭纸DNA、鼻拭纸DNA、肛拭纸DNA中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述SDF4基因位于基因组版本号hg19的1号染色体(chr1)的第1,152,288～1,163,580位碱基与1号染色体的第1,163,740-1,167,447。
在一些实施例中，所述基因片段选自片段1～片段6中的任意一种或几种，片段1～6选自SDF4基因序列中GC含量较高且CpG二核苷酸密度较高的区域，适用于基于重亚硫酸氢盐转化的靶基因甲基化含量检测，能更准确地反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量。
片段1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，chr1:1,155,322-1,155,615(GC含量＝63.9％，CpG二核苷酸密度＝4.47％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝34.7％)：
Figure BDA0004119129540000041
片段2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,chr1:1,155,856-1,156,129(GC含量＝59.1％，CpG二核苷酸密度：2.95％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝32.5％)：
Figure BDA0004119129540000042
片段3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，chr1:1,156,132-1,156,427(GC含量＝59.1％，CpG二核苷酸密度＝5.12％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝39.5％)：
Figure BDA0004119129540000043
片段4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，chr1:1,158,071-1,158,275(GC含量＝62.4％，CpG二核苷酸密度＝4.95％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝32.2％)：
Figure BDA0004119129540000044
片段5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，chr1:1,159,192-1,159,483(GC含量＝64.7％，CpG二核苷酸密度＝5.88％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝32.5％)：
Figure BDA0004119129540000045
片段6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,chr1:1,160,857-1,161,127(GC含量＝69.0％，CpG二核苷酸密度＝6.72％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝36.5％)：
Figure BDA0004119129540000046
需要说明的是，片段1～6的核苷酸中加粗且下划线的部分为CG二碱基中的C均为甲基化，且均以基因组版本号hg19为参照。
另一方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其有效组分包括：检测前述任意实施例所述的甲基化内参基因的试剂。
在一些实施例中，检测甲基化内参基因的试剂的类型包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述试剂盒包括：引物探针组合1～引物探针组合7中的任意一种；
引物探针组合1包括：核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的探针；
引物探针组合2包括：核苷酸序列如SEQ ID No.10～11所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探针；
引物探针组合3包括：核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的探针；
引物探针组合4包括：核苷酸序列如SEQ ID No.16～17所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的探针；
引物探针组合5包括：核苷酸序列如SEQ ID No.19～20所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的探针；
引物探针组合6包括：核苷酸序列如SEQ ID No.22～23所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的探针；
引物探针组合7包括：核苷酸序列如SEQ ID No.25～26所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的探针。
引物探针组合1～7的序列信息具体序列见表1。需要说明的是，引物探针组合1～7不能代表优选片段1～6的所有可能的引物探针组合，按照行业内熟知的引物探针设计原则，可以设计出多种可能的引物探针组合。为了说明SDF4作为内参基因的优势，只挑选片段3、5、6各设计2～3种引物探针组合进行发明内容的阐述。
表1中探针5`端的荧光基团修饰可以是Taqman探针、MGB探针、分子信标、BQ探针等各种类型探针使用的荧光基团，如FAM、TET、JOE、VIC、HEX、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Cy5、AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、Oregon Green 488、R6G、Yakima Yellow、Quasar570、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、Quasar 670、Cy5.5、Cy7、IR Dye 750等；探针3`端的荧淬灭基团修饰可以是Taqman探针、MGB探针、分子信标、BQ探针等各种类型探针使用的淬灭基团，如BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB、Dabcyl、DBQ1等。
表1序列信息
Figure BDA0004119129540000051
另一方面，本发明实施例提供了检测前述任意实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备靶基因的甲基化检测的内参基因的检测试剂中的应用。
另一方面，本发明实施例提供了检测前述任意实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：(1)检测或辅助检测靶基因的甲基化相对含量；(2)预测或辅助预测由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病的预后风险；(3)诊断或辅助诊断由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病。
在一些实施例中，检测靶基因的甲基化可以包括：甲基化特异性QPCR。
在一些实施例中，(2)和(3)中由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病可以理解为：检测标志物包括靶基因的甲基化水平的相关疾病，即基于靶基因的甲基化含量检测，能判断受检者是否患有某种癌症或患有某种癌症的风险高低。
在一些实施例中，所述相关疾病包括：肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色剂细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓系白血病、脑低级胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌肉瘤和葡萄膜黑色素瘤中的任意一种或多种。
另一方面，本发明实施例提供了检测前述任意实施例所述的甲基化内参基因的试剂在靶基因的甲基化检测中的应用。
在靶基因的甲基化检测中，该内参基因可作为靶基因甲基化含量检测的基线，尤其适用于甲基化特异性QPCR中靶基因甲基化含量的检测。将靶基因扩增的Ct值减去该内参基因扩增的Ct值的差值，作为判断靶基因甲基化含量的相对水平。具体的检测步骤可基于常规技术内容获取，不再赘述。
在一些实施例中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施例中，所述甲基化检测的样本包括：DNA样本或含DNA的环境样本。、细胞、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、痰液、胸水、腹水、粪便、咽拭纸、鼻拭纸、肛拭纸中的任意一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：内参基因SDF4的发现
1、甲基化捕获测序
(1)样本
收集43例肝癌组织与配对的32例癌旁组织DNA，55例肝癌、55例肝硬化和50例健康人血浆，每例血浆2mL。
(2)血浆cfDNA提取
a、将血浆室温或37℃解冻后，于16,000g、4℃离心10分钟；
b、向15mL离心管中加入80μL的Proteinase K(Apostle MiniMax游离DNA分离试剂盒，货号A17622CN-384)，随后加入离心后的血浆，转移血浆时不要吸到离心沉淀或者絮状物，然后旋涡混匀；
c、向上述15mL离心管中加入200μL的Sample Lysis Buffer，旋涡混匀，然后60℃水浴20分钟，每隔5分钟颠倒混匀数次；
d、水浴结束后，将15mL离心管取出，室温静止10分钟，然后短暂离心，使得管壁上的血浆裂解液收集到管底；
e、取6个深孔板，准备核酸的自动化提取。板1：加入2.5mL的cfDNA Lysis/BindingSolution、30μL的Magnetic Nanoparticles和上述全部的血浆裂解液，板2：加入1mL的cfDNA Wash Solution，板3：加入1mL的cfDNA Wash Sloution，板4：加入2mL稀释的2ndWash Solution，板5：加入500μL稀释的2nd Wash Solution，板6：加入50μL的cfDNAElution Solution；
f、在第7号板位，放置新的Deep-Well Tip Comb板，开始仪器自检，自检合格后，选择核酸自动化提取程序，开始cfDNA自动化提取，按照顺序依次放入板1～板6；
g、仪器提取完成后，取下板6吸取cfDNA。
(3)甲基化捕获文库制备与上机测序
用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher Scientific，货号Q32854)测定cfDNA浓度。
取40μL的cfDNA加入160μL的重亚硫酸氢盐转化试剂(Zymo Research，EZ DNAMethylation Lightning Kits)中进行转化，98℃变性8分钟，54℃转化1小时，4℃保持。
转化后的cfDNA采用Hieff NGS Methyl-seq DNA Library Prep Kit forIllumina试剂盒(YEASEN，货号：12211ES24)进行建库，操作步骤见试剂盒说明书。
文库用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行浓度测定并用4200生物分析仪进行文库片段质检(Agilent DNA 1000Kit，货号：5067-1504)。质检合格后的文库进行液相杂交捕获。捕获后的文库用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行浓度测定并用4200生物分析仪进行文库片段质检。捕获文库质检合格后在Illumina测序仪NovaSeq上进行测序，读长PE150。
2、内参基因的筛选
对下机后的捕获数据进行分析，按照如下条件进行甲基化内参基因的挖掘：
(1)使用fastp软件对下机数据进行数据过滤，包括过滤测序接头序列，去除测序读长小于50bp的DNA片段，去除平均测序质量较低的DNA片段；
(2)使用Bismark将过滤后的数据与hg19参考基因组(携带decoy诱饵序列)进行比对，得到每个DNA片段对应的具体基因组位置信息，并且得到每个CpG位点的甲基化状态信息；
(3)使用picard软件对top链和bottom链分别去除PCR扩增过程中引入的冗余数据，然后合并数据；
(4)使用bamUtil软件对较短的插入片段重叠区域进行soft-clipped标记，防止甲基化水平检测时发生重复统计；
(5)使用bamtools软件去除比对质量较低、未比对上、双端reads未能完全配对的DNA片段；
(6)统计捕获区域内所有上下文为CG、测序深度大于10×、且在肝癌群体中覆盖度大于80％的位点的甲基化水平，其中甲基化水平定义为：甲基化水平＝甲基化的C/(甲基化的C+未甲基化的C)；
(7)仅保留肝癌组织与癌旁组织差异倍数<1.2倍、肝癌血浆与肝硬化血浆差异倍数<1.2倍、肝癌血浆与健康人血浆的差异倍数<1.2倍的CpG位点，其中差异倍数定义为：差异倍数＝阳性群体中该CpG位点的甲基化水平的均值/阴性群体中该CpG位点的甲基化水平的均值；
(8)仅保留肝癌组织甲基化水平中位值>60％、癌旁组织甲基化水平中位值>60％、肝癌血浆甲基化水平中位值>60％、肝硬化血浆甲基化水平中位值>60％、健康人血浆甲基化水平中位值>60％的CpG位点，其中甲基化水平定义为：甲基化水平＝甲基化的C/(甲基化的C+未甲基化的C)；
(9)要求上述得到的CpG位点在TCGA Illumina Human Methylation 450K数据库肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓系白血病、脑低级胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌肉瘤、葡萄膜黑色素瘤等癌组织及其对应的癌旁组织中甲基化水平无统计学差异(P>0.05)，其中P-value为One-way Anova单因素方差分析检验结果；
(10)要求上述得到的CpG位点所位于的基因在TCGA mRNA数据库中肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色剂细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓系白血病、脑低级胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌肉瘤、葡萄膜黑色素瘤等癌组织中基因表达量无统计学差异(P>0.05)，其中P-value为One-way Anova单因素方差分析检验结果；
(11)要求上述得到的CpG位点所位于的基因不存在假基因(Pseudogene)；
(12)要求上述得到的CpG位点所组成的区段所位于的基因内，CpG二核苷酸的密度为每100bp长度至少有2个CpG二核苷酸；
(13)要求上述得到的CpG位点所组成的区段长度大于等于80bp；
(14)要求上述得到的CpG位点组成的区段(Block)内尽量不存在单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism，或SNP)。
3、筛选结果
由图1可见，基因SDF4序列中碱基C在CpG二核苷酸中的甲基化水平显著高于CHG、CHH三核苷酸；在肝癌组织与癌旁组织DNA中，基因SDF4序列中CpG二核苷酸中的C处于高度甲基化，没有显著差异；在肝癌、肝硬化与健康人血浆cfDNA中，基因SDF4序列中CpG二核苷酸中的C处于高甲基化，没有显著差异。由此可见，基因SDF4序列中CpG二核苷酸序列中的C处于高度甲基化，与样本类型与疾病状态无关，而CHG、CHH三核苷酸中的C均无甲基化或甲基化水平极低。
实施例2：内参基因SDF4的QMSP验证
1、不同起始量的白细胞DNA的验证
(1)样本
准备1例白细胞DNA，Qubit定量浓度为11.2ng/μL，取一部分白细胞DNA进行重亚硫酸氢盐转化，重亚硫酸氢盐转化试剂和方法具体参见实施例1。转化后的白细胞DNA用QubitssDNA Assay Kit(Thermo Fisher，货号：Q10212)进行定量。
(2)单重QMSP
取重亚硫酸氢盐转化后的白细胞DNA 0ng、5ng、10ng、20ng、30ng、50ng、100ng、200ng(样本浓缩后)进行QMSP扩增。使用针对SDF4基因优选区段SEQ ID No.5设计的2套引物和探针(引物探针组合5和6)进行扩增。
为了与常见内参基因作对比，针对ACTB基因设计一套引物探针，序列如下：
上游引物:5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAG-3`；
下游引物：5`-CRGTATTCTTTACACTTTCTA-3`；
探针：5`-NED-AACCTAACTATCCCCAATAACTTCCCC-3`BHQ2。
该引物探针对应的扩增子序列为(GC含量＝33.6％，CpG＝1.87％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝31.8％)：
5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAGGTAGAGATATATTATGTTATATTGGGGAAGTTATTGGGGATAGTTAGGTTAGACGGGGGATA TGTAGAAAGTGTAAAGAATACGG-3`。
按照如下体系配制QMSP反应混合液：
表2-1 QMSP反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 350μM
Taq酶(5U/μL) 3U
引物对1 0.2μM
探针2 200nM
DNA模板3 0-200ng
无核酸酶水 补水到25μL
总体积 25μL
备注：
1：引物对指SDF4基因的两套引物与ACTB的引物对之一；
2：探针指SDF4基因的两条探针与ACTB的探针之一；
3：模板指重亚硫酸氢盐转化后的白细胞DNA，包含8个起始量，即0ng、5ng、10ng、20ng、30ng、50ng、100ng、200ng。
按照如下程序进行QMSP反应
表2-2 QMSP反应程序
Figure BDA0004119129540000081
(3)QMSP结果
表2-3不同内参基因QMSP扩增的Ct值
模板起始量 SDF4(引物探针组合5) SDF4(引物探针组合6) ACTB
0ng Undetermined Undetermined Undetermined
5ng 14.41 14.53 16.90
10ng 13.21 13.50 15.70
20ng 12.08 12.36 14.28
30ng 11.40 11.74 13.70
50ng 10.60 10.97 13.07
100ng 10.08 10.41 12.62
200ng 9.23 9.55 11.92
备注：前15个循环不收集荧光。
由图2-1可见，随着转化后白细胞DNA起始量的增加，内参基因ACTB、内参基因SDF4(两套引物探针组合)扩增的Ct值降低，R2值分别为0.6260、0.6899、0.7106(P<0.05)，Ct值与DNA起始量中度相关。可见，内参基因SDF4与ACTB一样，其Ct值与DNA起始量呈线性相关，且相关性更好。
由图2-2可见，转化后白细胞DNA不同起始量下，内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合5)扩增的Ct值相关性高，R2＝0.9928(P<0.05)，相关性极高；内参基因ACTB与SDF4(引物探针组合6)扩增的Ct值相关性高，R2＝0.9896(P<0.05)，相关性极高；内参基因SDF4的两套引物探针组合(引物探针组合5与引物探针组合6)扩增Ct值的相关性极高，R2＝0.9992(P<0.05)。
由此可见，内参基因SDF4随着DNA起始量增加，Ct值降低，Ct值与DNA起始量呈中度相关，且相关性比ACTB更高；内参基因SDF4与内参基因ACTB在不同的DNA起始量下，Ct值的相关性极高。数据表明内参基因SDF4同ACTB一样，能正确反应DNA的模板起始量，且相关性更好。
实施例3：肝癌组织与癌旁组织DNA的验证
ZIC4(Zic family member 4，Gene ID:84107)是锌指蛋白家族成员，锌指蛋白与肝癌发生相关，有文献报道尤其与非酒精型脂肪肝发生相关，最终通过细胞周期、细胞凋亡甚至代谢影响肝癌的发生(G.Li et al.Liver Research 4(2020)35-39；Int.J.Mol.Sci.2020,21,8138；Li et al.Biomarker Research(2022)10:2)。肝癌组织DNA与肝癌血浆cfDNA中大部分样本呈现ZIC4基因的高甲基化，其分别与肝癌癌旁组织DNA、肝硬化与健康人血浆cfDNA中ZIC4基因的甲基化水平呈显著差异(数据未提供)。因此，本实施例以ZIC4基因作为检测的靶基因，用ACTB与SDF4作为内参基因，比较不同内参基因在肝癌与癌旁组织DNA中对靶基因甲基化检测的差异。
(1)样本
19例肝癌组织DNA与配对的19例癌旁组织DNA，首先将组织DNA进行重亚硫酸氢盐，转化试剂与方法见实施例1。转化后的DNA进行Qubit浓度测定，浓度测定试剂与方法见实施例1。转化后的DNA进行二重QMSP扩增，DNA起始量10ng。
(2)QMSP反应
ZIC4基因扩增的引物探针序列如下：
上游引物：5`-CGTTTAAGTCGGCGGTACG-3`；
下游引物：5`-GCCCTCGTCGAACTACGA-3`；
探针：5`6-FAM-CGTCGTTATCGTCGTCGAGGAGGTTATTTGGG-3`BHQ1；
内参基因SDF4扩增(引物探针组合5)的序列见表1；
内参基因SDF4扩增(引物探针组合6)的序列见表1；
内参基因ACTB扩增的引物探针序列如下：
上游引物：5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAG-3`；
下游引物：5`-CRGTATTCTTTACACTTTCTA-3`；
探针：5`-NED-AACCTAACTATCCCCAATAACTTCCCC-3`BHQ2。
按照下表配制QMSP反应体系：
表3-1二重QMSP反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 350μM
Taq酶(5U/μL) 3U
ZIC4引物对(5μM) 0.2μM
ZIC4探针(10μM) 250nM
内参基因引物对(5μM) 0.2μM
内参基因探针(10μM) 250nM
DNA模板 10ng
无核酸酶水 补水至25μL
总体积 25μL
按表2-2设置QMSP反应程序：
表3-2二重QMSP反应程序
Figure BDA0004119129540000091
(3)验证结果
表3-3内参基因扩增的Ct值
Figure BDA0004119129540000092
/>
Figure BDA0004119129540000101
/>
Figure BDA0004119129540000111
/>
Figure BDA0004119129540000121
表3-4不同内参基因下靶基因扩增的Ct值
Figure BDA0004119129540000122
/>
Figure BDA0004119129540000131
/>
Figure BDA0004119129540000141
/>
Figure BDA0004119129540000151
由图3-1的图(a)可见，内参基因ACTB扩增的Ct值在肝癌组织与癌旁组织间没有显著差异(P＝0.6)，内参基因SDF4的两套引物探针组合(引物探针组合5与引物探针组合6)扩增的Ct值在肝癌组织和癌旁组织间也没有显著差异(P＝0.23)。说明内参基因ACTB、SDF4扩增的Ct值与疾病(癌与癌旁)无关。
由图3-1(b)可见，在所有肝癌组织与癌旁组织样本中，内参基因ACTB扩增的Ct值大于SDF4的两套引物探针组合(引物探针组合5与引物探针组合6)扩增的Ct值，均有显著差异，P值均远小于0.05；内参基因SDF4的两套引物探针扩增的Ct值相比，差异也显著(P＝0.003)，但差异远小于基因间的差异。由此可见，内参基因与靶基因进行二重QMSP扩增时，内参基因SDF4扩增的效率显著高于ACTB。
由图3-2(a)可见，以ACTB作为内参基因时，靶基因ZIC4在肝癌组织与癌旁组织间扩增的Ct值差异显著(P＝0.008)；以SDF4作为内参基因时，靶基因ZIC4在肝癌组织与癌旁组织间扩增的Ct值差异也显著，P值分别为0.01与0.0042。由此可见，ACTB与SDF4均可以作为内参基因，用于肝癌组织与癌旁组织DNA中靶基因ZIC4甲基化相对含量的检测。将肝癌组织与癌旁组织样本作为整体分析，内参基因ACTB与SDF4的两套引物探针组合下靶基因ZIC4扩增的Ct值两两比较无显著差异(P＝0.59，P＝0.88，P＝0.49)，说明内参基因SDF4同ACTB一样，不会抑制靶基因ZIC4的扩增(图3-2(b))。
从图3-3、图3-4可见，分别以ACTB与SDF4作为内参基因时，靶基因ZIC4扩增的Ct值、ZIC4扩增的Delta_Ct值的相关性极高。
实施例4:其它癌种组织DNA的验证
为了验证内参基因SDF4在其他癌种中与内参基因ACTB扩增的差异，收集了12例乳腺癌组织DNA和20例肺癌组织DNA进行验证。
(1)样本
表4-1组织样本信息
Figure BDA0004119129540000152
Figure BDA0004119129540000161
(2)QMSP反应
ZIC4基因扩增的引物探针序列如下：
上游引物：5`-CGTTTAAGTCGGCGGTACG-3`；
下游引物：5`-GCCCTCGTCGAACTACGA-3`；
探针：5`6-FAM-CGTCGTTATCGTCGTCGAGGAGGTTATTTGGG-3`BHQ1；内参基因SDF4扩增(引物探针组合5)的序列见表1；
内参基因SDF4扩增(引物探针组合6)的序列见表1；
内参基因ACTB扩增的引物探针序列如下：
上游引物:5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAG-3`；
下游引物：5`-CRGTATTCTTTACACTTTCTA-3`；
探针：5`-NED-AACCTAACTATCCCCAATAACTTCCCC-3`BHQ2。
按照下表配制QMSP反应体系：
表4-2QMSP反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 350μM
Taq酶(5U/μL) 3U
ZIC4引物对(5μM) 0.2μM
ZIC4探针(10μM) 250nM
内参基因引物对(5μM) 0.2因引
内参基因探针(10μM) 250nM
DNA模板 10ng
无核酸酶水 补水至25μL
总体积 25μL
按照表4-3设置QMSP反应程序：
表4-3 QMSP反应程序
Figure BDA0004119129540000171
(3)验证结果
表4-4内参基因与靶基因扩增的Ct值
Figure BDA0004119129540000172
/>
Figure BDA0004119129540000181
/>
Figure BDA0004119129540000191
由图4-1(a)可见，内参基因ACTB和内参基因SDF4在乳腺癌与肺癌组织DNA间扩增的Ct值均无显著差异(P>0.05)，说明在固定的DNA模板起始量下，内参基因SDF4同ACTB一样，扩增的Ct值与癌种无关，只与DNA起始量相关。将乳腺癌与肺癌组织样本为一个整体，内参基因ACTB扩增的Ct值显著大于SDF4扩增的Ct值，P值远小于0.05，而内参基因SDF4的两套引物探针组合扩增的Ct值无显著差异(P>0.05)(图4-1(b))。说明与靶基因进行二重QMSP扩增时，内参基因SDF4的扩增效率显著优于ACTB。
由图4-2(a)可见，以ACTB与SDF4作为内参基因时，靶基因ZIC4在乳腺癌与肺癌组织DNA间扩增的Ct值均无显著差异(P>0.05)。将乳腺癌与肺癌组织样本作为整体分析，以ACTB和SDF4作为内参基因时，靶基因ZIC4扩增的Ct值均无显著差异(P>0.05)。说明，内参基因SDF4同ACTB一样，不会对靶基因的扩增造成抑制。
由图4-3、4-4可见，内参基因ACTB和SDF4扩增Ct的相关性高，R2分别为0.7493、0.8157和0.9472；以内参基因ACTB与SDF4分别作为内参基因时，靶基因ZIC4扩增的Ct值相关性极高，R2值均为1.0。
综上，对于不同的癌种，如乳腺癌与肺癌，内参基因SDF4与ACTB一样，扩增的Ct值与癌种无关，只与DNA起始量相关；与靶基因进行二重QMSP扩增时，SDF4扩增的效率显著优于ACTB，且不会对靶基因ZIC4的扩增造成抑制。
实施例5：血浆cfDNA的验证
为了比较不同内参基因在不同样本类型间扩增的差异，用13例肝癌血浆、3例肝硬化血浆和10例产前血浆进行验证。
(1)样本与血浆cfDNA提取
血浆cfDNA的提取试剂与方法见实施例1，cfDNA浓度如表5-1。
表5-1 18例血浆样本与提取的cfDNA浓度
序号 样本类别 cfDNA浓度(ng/μL)
1 肝癌血浆 10.200
2 肝癌血浆 7.640
3 肝癌血浆 4.500
4 肝癌血浆 3.320
5 肝癌血浆 3.120
6 肝癌血浆 2.520
7 肝癌血浆 2.420
8 肝癌血浆 1.790
9 肝癌血浆 1.740
10 肝癌血浆 1.740
11 肝癌血浆 1.710
12 肝癌血浆 1.490
13 肝癌血浆 1.450
14 肝硬化血浆 1.700
15 肝硬化血浆 1.460
16 肝硬化血浆 1.400
17 产前血浆 0.390
18 产前血浆 0.386
19 产前血浆 0.356
20 产前血浆 0.338
21 产前血浆 0.338
22 产前血浆 0.352
23 产前血浆 0.348
24 产前血浆 0.378
25 产前血浆 0.376
26 产前血浆 0.382
(2)QMSP扩增
ZIC4基因扩增的引物探针序列如下：
上游引物：5`-CGTTTAAGTCGGCGGTACG-3`；
下游引物：5`-GCCCTCGTCGAACTACGA-3`；
探针：5`6-FAM-CGTCGTTATCGTCGTCGAGGAGGTTATTTGGG-3`BHQ1；
内参基因SDF4扩增(引物探针组合6)的序列见表1；
内参基因ACTB扩增的引物探针序列如下：
上游引物:5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAG-3`；
下游引物：5`-CRGTATTCTTTACACTTTCTA-3`；
探针：5`-NED-AACCTAACTATCCCCAATAACTTCCCC-3`BHQ2。
按照下表配制QMSP反应体系：
表5-2二重QMSP体系
Figure BDA0004119129540000201
Figure BDA0004119129540000211
按下表5-3设置QMSP反应程序：
表5-3 QMSP反应程序
Figure BDA0004119129540000212
(3)验证结果
表5-4基因扩增的Ct值
Figure BDA0004119129540000213
/>
Figure BDA0004119129540000221
由图5-1(a)可见，在肝癌、肝硬化与产前血浆cfDNA中，内参基因SDF4扩增的Ct值显著低于ACTB(P<0.05)，说明内参基因SDF4的扩增效率显著优于ACTB，而靶基因扩增的Ct值无显著差异(P>0.05)(图5-1(b))。由图5-2可见，内参基因SDF4的扩增曲线有明显的平台期，而ACTB的扩增曲线呈直线，没有平台期。
综上，不同起始量的白细胞DNA验证、肝癌组织与癌旁组织DNA的验证、乳腺癌与肺癌组织DNA的验证与血浆cfDNA的验证结果表明，内参基因SDF4同ACTB一样，扩增的Ct值与DNA起始量呈线性负相关，且相关性更好；SDF4同ACTB一样，扩增Ct值与样本类型、疾病种类无关；SDF4与高甲基化的靶基因扩增时，扩增效率显著优于ACTB，且不会对靶基因的扩增造成抑制。
实施例6:内参基因SDF4的应用
由实施例1～5可见，内参基因SDF4仅与DNA的起始量相关；在癌种(肝癌、乳腺癌、肺癌)，不同类型(组织DNA、血浆cfDNA)中，内参基因SDF4与ACTB扩增的Ct值相关性高，靶基因ZIC4扩增的Ct值相关性高；通过血浆cfDNA低起始量样本测试，内参基因SDF4的扩增曲线有明显的平台期，而内参基因ACTB扩增曲线没有明显平台期。由此判断，在进行靶基因甲基化含量检测时，基因SDF4比ACTB更适合作为内参基因，反映DNA样本的模板量与靶基因甲基化含量的高低。本实施例测试22例肝癌血浆、23例肝硬化血浆与23例健康人血浆，进一步验证低起始量样本下，以ACTB与SDF4作为内参基因时，靶基因进行肝癌早诊时的性能差异。
(1)样本
肝癌血浆22例，为2019年采集血浆；肝硬化血浆23例，其中2019年血浆6例，2020年血浆17例；健康人血浆23例，均为2021年采集血浆。
(2)cfDNA提取与重亚硫酸氢盐转化
血浆样本提取起始量2mL/例，提取试剂与方案见实施例1，每批提取设置提取对照样本，用于质控提取过程。
重亚硫酸氢盐转化的试剂与方案同实施例1，提取的cfDNA除用于Qubit检测浓度外，剩余用于重亚硫酸氢盐转化，转化起始量不超过100ng/例。
(3)QMSP扩增
本实施例的靶基因1为一种肝癌特异性基因，可用于肝癌的早诊(数据未展示)。
靶基因1扩增的引物探针序列如下：
正向引物：5`-GAGGTTCGAGTAGTCGTGTAGAGT-3`；
反向引物：5`-TATACTACCTAACGCGACGCTAAAAC-3`；
探针：5`VIC-ACTAAACCGCTCCGACGTAACGATACCGCT-3`BHQ1；
内参基因SDF4扩增(引物探针组合6)见表1；
内参基因ACTB扩增的引物探针序列如下：
上游引物:5`-GAAGGTTTTAAATATGATTTGTAAG-3`；
下游引物：5`-CRGTATTCTTTACACTTTCTA-3`；
探针：5`-NED-AACCTAACTATCCCCAATAACTTCCCC-3`BHQ2。
按照下表配制QMSP反应体系：
表6-1QMSP反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 350μM
Taq酶(5U/μL) 3U
靶基因引物对(5μM) 0.2μM
靶基因探针(10μM) 200nM
ACTB引物对(5μM) 0.3μM
ACTB探针(10μM) 200nM
SDF4引物对(5μM) 0.2μM
SDF4探针(10μM) 100nM
转化DNA模板 /
无核酸酶水 补水至25μL
总体积 25μL
按照表6-2设置QMSP反应程序：
表6-2QMSP反应程序
Figure BDA0004119129540000241
(4)结果分析
表6-3靶基因与内参基因扩增的Ct值
Figure BDA0004119129540000242
/>
Figure BDA0004119129540000251
由图6-1可见，以SDF4作为内参基因，靶基因1区分肝癌与肝硬化、健康人的AUC(0.877)比以ACTB作为内参基因高(AUC＝0.863)。由图6-2、6-3可见，内参基因SDF4与ACTB扩增的Ct值相关性高(R2＝0.784)，靶基因扩增的Delta_Ct值相关性极高(R2＝0.9798)。综上，SDF4可以作为新的内参基因，用于靶基因的甲基化含量检测，相比ACTB具有更高的扩增效率，甲基化相对含量检测准确度更高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲基化内参基因，其特征在于，所述内参基因包括：目的序列的全长序列和/或基因片段；所述目的序列包括：SDF4基因5`端上游的启动子区、SDF4基因的外显子区与内含子区及基因3`下游调控区。
2.根据权利要求1所述的甲基化内参基因，其特征在于，所述全长序列和/或所述基因片段的GC含量为40％～80％；
优选地，所述全长序列和/或所述基因片段的序列中含有CpG二核苷酸；
优选地，CpG二核苷酸的密度为每100bp长度至少有2个CpG二核苷酸；
优选地，所述全长序列和/或所述基因片段的序列中CpG二核苷酸的C为甲基化的5-mC，每个CpG二核苷酸中C的甲基化水平为80％～100％，优选为95％～100％；
优选地，所述全长序列和/或所述基因片段经经过重亚硫酸氢盐转化后，序列中的GC含量在30％～70％，优选为30％-50％；
优选地，所述基因片段的序列长度≥80bp；
优选地，所述全长序列和/或所述基因片段的甲基化水平在：不同年龄和/或性别的样本、不同器官来源的样本、不同健康状态的样本和不同类型DNA样本中的任意一种或多种中无显著差异。
3.根据权利要求1或2所述的甲基化内参基因，其特征在于，所述SDF4基因位于基因组版本号hg19的1号染色体的第1,152,288～1,163,580位碱基与1号染色体的第1,163,740-1,167,447；
优选地，所述基因片段选自片段1～片段6中的任意一种或几种；片段1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，片段2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，片段3的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，片段4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，片段5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，片段6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述片段1～6中CG二碱基中的C均为甲基化的5-mC。
4.一种试剂盒，其特征在于，其有效组分包括：检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其包括：引物探针组合1～引物探针组合7中的任意一种；
引物探针组合1包括：核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示的引物对和核苷酸序列如SEQID No.9所示的探针；
引物探针组合2包括：核苷酸序列如SEQ ID No.10～11所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探针；
引物探针组合3包括：核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的探针；
引物探针组合4包括：核苷酸序列如SEQ ID No.16～17所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的探针；
引物探针组合5包括：核苷酸序列如SEQ ID No.19～20所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的探针；
引物探针组合6包括：核苷酸序列如SEQ ID No.22～23所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的探针；
引物探针组合7包括：核苷酸序列如SEQ ID No.25～26所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的探针；
优选地，所述试剂盒还包括：用于检测甲基化标志物的试剂。
6.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在制备靶基因的甲基化检测的内参基因的检测试剂中的应用。
7.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，其特征在于，所述用途包括：(1)检测或辅助检测靶基因的甲基化相对含量；(2)预测或辅助预测由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病的风险；(3)诊断或辅助诊断由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病。
8.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在靶基因的甲基化检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测的样本包括：DNA样本或含DNA的环境样本；
优选地，所述DNA样本的来源选自：组织、全血、血浆、血清、细胞、尿液、脑脊液、唾液、痰液、胸水、腹水、粪便、咽拭纸、鼻拭纸和肛拭纸中的任意一种。
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