JP2023524067A - ヌクレアーゼ、ライゲーション、脱アミノ化、ｄｎａ修復、およびポリメラーゼ反応と、キャリーオーバー防止との組み合わせを用いた、核酸配列、変異、コピー数、またはメチル化変化の特定および相対的定量化のための方法およびマーカー - Google Patents
ヌクレアーゼ、ライゲーション、脱アミノ化、ｄｎａ修復、およびポリメラーゼ反応と、キャリーオーバー防止との組み合わせを用いた、核酸配列、変異、コピー数、またはメチル化変化の特定および相対的定量化のための方法およびマーカー Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、低存在量、ヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、またはゲノムレベルでの他の再編成、および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を、特定および／または定量化するための方法、そしてまた、早期がんを同定する、がん治療をモニタリングする、および早期がんの再発を同定するマーカーに関する。
Description
本出願は、２０２０年５月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
分野
本出願は、ヌクレアーゼ、ライゲーション、決定、ＤＮＡ修復、およびポリメラーゼ反応をキャリーオーバー防止と組み合わせて使用して、核酸配列、変異、コピー数、および／またはメチル化変化を特定および定量化するための方法およびマーカーに関する。
本出願は、ヌクレアーゼ、ライゲーション、決定、ＤＮＡ修復、およびポリメラーゼ反応をキャリーオーバー防止と組み合わせて使用して、核酸配列、変異、コピー数、および／またはメチル化変化を特定および定量化するための方法およびマーカーに関する。
背景
がんは、先進国では主要な死因であり、途上国では２番目に主要な死因である。がんによって、米国では年間５８万人、ヨーロッパでは１３０万人、中国では２８０万人の患者がなくなっている（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６，”ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６６（１）：７－３０（２０１６））。がんは、現在、世界中で死亡率の最大の原因であり、２０１２年のがんによる死亡者は８２０万人と推定されている（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１２，”ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６５（２）：８７－１０８（２０１５））。世界中のがん症例は、今後２０年間で７５％増加し、２，５００万件近くに達すると予想される。女性が侵襲がんで死亡する生涯リスクは１９％で、男性の場合は２３％である。米国のがん治療の年間総費用は４，０００億ドルを超えており、これほど緊急に知的な解決策を必要とする医療問題は他にない。
がんは、先進国では主要な死因であり、途上国では２番目に主要な死因である。がんによって、米国では年間５８万人、ヨーロッパでは１３０万人、中国では２８０万人の患者がなくなっている（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６，”ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６６（１）：７－３０（２０１６））。がんは、現在、世界中で死亡率の最大の原因であり、２０１２年のがんによる死亡者は８２０万人と推定されている（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１２，”ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６５（２）：８７－１０８（２０１５））。世界中のがん症例は、今後２０年間で７５％増加し、２，５００万件近くに達すると予想される。女性が侵襲がんで死亡する生涯リスクは１９％で、男性の場合は２３％である。米国のがん治療の年間総費用は４，０００億ドルを超えており、これほど緊急に知的な解決策を必要とする医療問題は他にない。
米国では、男性の新規がん症例は、主に前立腺がん（２１％）、肺がん（１４％）、大直腸がん（８％）、膀胱がん（７％）、黒色腫（６％）、非ホジキンリンパ腫（５％）、腎臓がん（５％）、頭頸部がん（４％）、白血病（４％）、および肝臓がんおよび胆管がん（３％）である。女性の場合、新たに診断されたがんのほとんどは、乳がん（２９％）、肺がん（１３％）、大腸がん（８％）、子宮体がん（７％）、甲状腺がん（６％）、非ホジキンリンパ腫（４％）、黒色腫（３％）、白血病（３％）、膵臓がん（３％）、および腎臓がん（３％）である。がんの主要な死因は、男女それぞれ、肺がん（２７％）、前立腺がん（８％）、大腸がん（８％）、および肺がん（２６％）、乳がん（１４％）、大腸がん（８％）である。これらのがんは、異なる生物学的プロセスによって引き起こされ、標的治療薬および免疫療法の出現など、いくつかのがんの治療では素晴らしい進歩があったが、ほとんどのがんは、生存率が低い後期に見出される。信頼性の高い安価な早期発見検査の欠如により、多くの種類のがんは後期に診断され、いくつかのがんでは生存率が１０％未満に低下する。現在のスクリーニング技術は、患者のコンプライアンスが低く、費用が高く、感度および特異性が低いため、失敗している（（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ８７：８－１９（２０１６））。例えば、結腸内視鏡検査の高いコスト、不快感、および侵襲性は、ＣＲＣスクリーニングに対する患者のコンプライアンスの重大な障害である（Ｂｅｙｄｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｂｅｈａｖｉｏｒｓ Ａｍｏｎｇ Ａｖｅｒａｇｅ－ｒｉｓｋ Ｏｌｄｅｒ Ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｕｓｅｓ＆Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＣＣＣ １９（４）：３３９－３５９（２００８））。同様に、糞便を取り扱うことに対する患者の嫌悪感から、ＦＯＢＴ／ＦＩＴの成功が限定的となり、コンプライアンスが低い場合の救済策としての便に基づく検査が排除された。対照的に、現在の提案は、広く採用されるようになる可能性を有する血液検査を開発することによって、これらの問題に対処する。ＣＲＣ検査に対する患者のコンプライアンスを向上させることは、より早期の発見につながり、最終的には患者の生存率が上昇する。
最終的には、早期がんを検出する非侵襲的、高感度、高特異性、費用対効果の高い検査を開発することが急務である。がん研究における比較的最近の２つの進展は、これらのタスクの指針となる。１つ目は、現代的なゲノムツール（ゲノム全体の配列決定、転写、およびメチル化プロファイリングなど）の使用である。これらの研究から生成された膨大なデータベースへの一般公開により、より幅広いリストの分子マーカー（例えば、プロモーターメチル化、変異、コピー数、またはｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、およびがんの進行に関連する長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の発現レベルなど）の発見が加速された。２つ目は、がん細胞から核酸が患者の血流中に放出され得るという発見である。がん細胞は、アポトーシス（誘発された細胞死）を起こす場合があり、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を患者の血液中に放出する（Ｓａｌｖｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｓ ａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，” ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：６５４９－６５５９（２０１６））。がん患者由来の血清中のｃｆＤＮＡのレベルは、消えゆくほど少ないものから高いものまで様々であるが、がんの病期とは相関しない（Ｐｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｒｕｍ ＤＮＡ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５８（５）：６０１－６０２（１９７２）、Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｒｕｍ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７（３）：６４６－６５０（１９７７））。さらに、がん細胞によって血液中に放出されるエクソソーム（３０～１００ｎｍの範囲の脂質小胞）は、同じＲＮＡ分子を含んでいる場合があり、腫瘍の転写シグネチャーとして機能する。エクソソームまたは腫瘍関連小胞は、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、および変異腫瘍ＤＮＡさえ外因性ヌクレアーゼから遮蔽し、したがって、マーカーは、保護された状態にある。他の保護された状態には、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）内、小胞もしくは粒子内を含む他の非細胞性膜内、ヌクレオソーム内、またはアルゴノートもしくは他のタンパク質複合体内の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。特に、ｃｆＤＮＡには、高／低メチル化変異、コピー数変化、または染色体再編成などの固形腫瘍と同じ分子異常が含まれている（Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｄｒｅａｍ ｏｒ Ｒｅａｌｉｔｙ？”Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（１２）：２３０４－２３１３（２０１４））。
腫瘍特異的なＣｐＧメチル化は、非メチル化シトシンのバイサルファイト変換、メチル化感受性酵素、または５－メチルシトシンの免疫沈降を伴う様々な技術を介して（Ｊｏｒｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ，” Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．６９３（１－２）：８４－９３（２０１０））、様々な固形腫瘍を有する患者由来の血漿中で検出されている（Ｐｒａｔｔ ＶＭ，“Ａｒｅ Ｗｅ Ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ａ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｔｅｓｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ？”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（９）：１１４１－１１４２（２０１４）、Ｗａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２：１３（２０１５））。メチル化シグネチャーは、メチル化パターンが高度に組織特異的であるため、特定のがんの種類に対してより良好な特異性を有する（Ｉｓｓａ ＪＰ，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（６）：１６３４－１６３７（２００７））。最もよく研究されたＣＲＣ検出のための血液ベースのメチル化マーカーは、ＳＥＰＴ９遺伝子のプロモーター領域に位置する（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｇｕｔ ６３（２）：３１７－３２５（２０１４）、Ｌｏｆｔｏｎ－Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（２）：４１４－４２３（２００８）、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ＤＮＡ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（９）：１１８３－１１９１（２０１４）、Ｒａｖｅｇｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＥＰＴ９ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｕｓ，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ａｎｄ Ｆｏｌａｔｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：Ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ，” Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６（１２）：２８４８６－２８４９７（２０１５）、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｉｓ ａ Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｏｔｈ Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ Ｒｉｇｈｔ－ｓｉｄｅｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒｓ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（９）：ｅ４６０００（２００２）、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｓｅｐｔｉｎ ９ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ９（１２）：ｅ１１５４１５（２０１４）、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｐｔｉｎ ９ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓ ａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１３３（２０１１））。ＣＲＣ診断のための他の潜在的なマーカーとしては、ＴＨＢＤ（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）：ｅ５０２６６（２０１２））、Ｃ９ｏｒｆ５０（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）：ｅ５０２６６（２０１２））、ＺＮＦ１５４（Ｍａｒｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＺＮＦ１５４ ａｓ ａ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，” Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ １８（２）：２８３－２９８（２０１６））、ならびにＡＧＢＬ４、ＦＬＩ１、およびＴＷＩＳＴ１（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｒｒａｙ，” Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ１４１９－１４２７（２０１５））のプロモーター領域のＣｐＧ部位が挙げられる。乳がんでは、腫瘍抑制遺伝子（ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＲＡＳＳＦ１、ＡＰＣ、およびＲＡＲβを含む）のプロモーター領域のメチル化は、患者のｃｆＤＮＡにおいて検出されている（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ： ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１１５（２０１６））。メチル化マーカーを使用するための注意点は、バイサルファイト変換がＤＮＡを破壊する傾向があり、したがって、検出され得る全体的なシグナルが減少することである。メチル化検出技術はまた、非メチル化シトシンの不完全な変換に起因する偽陽性シグナルをもたらし得る。本明細書に記載されるように、血漿中でがんを検出するのに好適なＣＲＣ特異的および組織特異的メチル化マーカーを特定するために、公開データベースの広範なバイオインフォマティクス解析が行われている。メチル化マーカーの検出アッセイは、単一分子検出能力を有するより高いレベルの多重化を可能にし、広範囲のがんにわたってより高い感度および特異性を可能にすることが予測される。
信頼性の高い診断検査およびスクリーニング検査を開発するための課題は、疾患（例えば、早期がん）を示す腫瘍が発するマーカーを、正常組織が発する同じマーカーの存在（偽陽性シグナルをもたらす可能性がある）と区別することである。また、アッセイの特異性および感度により、検査するマーカーの数と検査のコストをバランスさせる必要がある。がんゲノム・アトラス・コンソーシアム（ＴＣＧＡ）による数千の腫瘍の網羅的な分子プロファイリング（ｍＲＮＡ、メチル化、コピー数、ｍｉＲＮＡ、変異）により、大腸腫瘍は、乳がん、前立腺がん、または他の上皮がんからのものと同様に、互いに異なることが明らかになった（ＴＣＧＡ “Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ４８７：３３０－３３７（２０１４））。さらに、それらが共有するいくつかのマーカーは、複数のがんの種類にも存在し、原発組織を特定する能力を妨げる。ＢＲＡＦ変異は、黒色腫（４２％）および甲状腺がん（４１％）で頻繁に発生し、一方、ＫＲＡＳは、膵臓がん（５５％）および肺がん（１６％）でも高度に変異している（Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＣＯＳＭＩＣ：Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ’ｓ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ８０５－８１１（２０１５））。一般に、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦのようなＣＲＣ変異マーカーは、後期原発がんおよび転移において見出される（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １０（４）：ｅ０１０８２４７（２０１５）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，“ＢＲＡＦ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｆｒｅｅ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＲＡＦ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，” Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．２５（６）：４８６－４９５（２０１５）、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ＲＡＳ ａｎｄ ＢＲＡＦ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １０（５）：ｅ０１２１８９１（２０１５））。がんの早期発見のために、核酸アッセイは、主にスクリーニングツールとしての役割を果たすべきであり、二次診断フォローアップ（例えば、大腸がん用の結腸内視鏡検査）の利用可能性を必要とする。
生物学的な問題を複雑にしているのは、ごく少数の初期細胞（すなわち、ＣＴＣ由来）から変異、ＣｐＧメチル化、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのコピー数を確実に定量化する必要があるか、あるいはがんのシグナルが血液中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）由来であり、正常細胞から生じる過剰な核酸、または試料処理中に正常な血液細胞から不注意に放出される過剰な核酸によって希釈されている場合である（Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，” Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５：４４８（２０１４）、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ Ｕｓｉｎｇ ｃｔＤＮＡ ｔｏ Ａｃｈｉｅｖｅ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，” ＢｉｏＲｘｉｖ．２３７５７８（２０１７））。
一部のがんＩＶＤ企業は、市販のメチル化検出試験を開発している。前述のＳＥＰＴ９のメチル化は、Ｅｐｉ ｐｒｏＣｏｌｏｎ検査、すなわち、ＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓによるＣＲＣ検出アッセイの基礎となっている（Ｌｏｆｔｏｎ－Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（２）：４１４－４２３（２００８））。より小さな試料セットにおける初期の結果は有望性を見せたが、１，５４４個の血漿試料を用いた大規模な研究では、ステージＩ～ＩＩＩのＣＲＣに対して感度が６４％、特異性が７８％～８２％であり、１，０００個体中１８０～２２０個体を、不必要な結腸内視鏡検査へと効果的に送ることになった（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ＤＮＡ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（９）：１１８３－１１９１（２０１４））。臨床ゲノミクスは、現在、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の遺伝子のメチル化に基づいて、血液ベースのＣＲＣ検出試験を開発している（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＢＣＡＴ１ ａｎｄ ＩＫＺＦ１ ｉｎ Ｐａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，” ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １５：６５４（２０１５））。この２個のマーカー検査の２，１０５個の血漿試料を使用した大規模試験は、６６％の全体的な感度、ステージＩのＣＲＣに対して３８％の感度、および９４％の印象的な特異性を示した（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ａ Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ａ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＢＣＡＴ１ ａｎｄ ＩＫＺＦ１ Ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ＣＥＡ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１０）：２７６３－２７７２（２０１６））。Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓおよび共同研究者らは、Ｋ－ｒａｓ変異、ならびにＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化マーカー（Ｌｉｄｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，” Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１１（１０）：１３１３－１３１８（２０１３））を加えることによって、ＣＲＣ糞便検査の感度をわずかに改善した（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｏｏｌ Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，” Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ．（Ｄｏｒｄｒ） ３５（４）：３０９－３１５（２０１２）、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １７（５）：４０１－４０６（２０１３）、Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ－Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，” Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３７０（１４）：１２８７－１２９７（２０１４）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ （ＭＳ－ＨＲＭ） ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，” Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４３１：１５４－１６３（２０１４）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｄｅｎｏｍａ： ａ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｃａｎ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２７（８）：４６７－４７５（２０１３））。１２，５００の便試料に対する大規模な研究では、９３％の感度が主張されているが、特異性はまだ８５％でしかなく、本質的に、１，０００人のうち１５０人を不必要な結腸内視鏡検査へと送ってしまう。糞便の取り扱いには物流上の問題があるにもかかわらず、Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓは、最近、１００万検査を売り上げた。Ｃｏｌｏｇｕａｒｄのウェブサイトでは、検査結果に偽陽性と偽陰性の両方があり、患者が痔、月経、または血便を有している場合は、検査を使用すべきではない。また、Ｃｏｌｏｇｕａｒｄのウェブサイトでは、この検査は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、またはがんの家族歴のある患者は使用しないように警告している。言い換えれば、Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓは、正確なＣＲＣ検出試験から最も恩恵を受けるであろう患者を除外している。最近、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｄｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（カリフォルニア州アーバインに拠点を置き、様々な中国の学術機関に関連している）は、大腸がんの血液ベースの検出のために単一のＣｐＧ部位（ｃｇ１０６７３８３３）のメチル化状態を調べることの可能性を示した（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ｅｎａｂｌｅ Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２：（５２４）（２０２０））。
一連の診断ニーズは、一連の診断検査を必要とする
がんにおける現在の分子診断の取り組みの大部分は、以下を中心としている：（ｉ）予後および予測ゲノミクス、例えば、ＢｒＣＡ１、ＢｒＣＡ２、（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：６７６－６８９（１９９８））などのがん素因遺伝子の遺伝的変異の特定、（ｉｉ）個別化治療、例えば、個別化医療を導くＥＧＦＲ遺伝子における変異（Ｓｅｑｕｉｓｔ ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ，５９：４２９－４４２（２００８））、および（ｉｉｉ）再発モニタリング、例えば、薬物治療に対する耐性を発現する患者に現れるＫＲＡＳ変異の検出（Ｈｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５：４５３（２０１４）；Ａｍａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１６２６－１６３４（２００８））。しかし、これは、がん分子診断連続体における主要な機会：（ｉ）家族歴のある人のより頻繁なスクリーニング、（ｉｉ）早期疾患の検出のためのスクリーニング、および（ｉｉｉ）治療有効性のモニタリング、を見逃している。これらの満たされていない３つのニーズに対処するために、ウイルス負荷に類似した「がんマーカー負荷」と呼ばれる血液ベースの検出のための新しい測定基準が、本明細書で提案される。
がんにおける現在の分子診断の取り組みの大部分は、以下を中心としている：（ｉ）予後および予測ゲノミクス、例えば、ＢｒＣＡ１、ＢｒＣＡ２、（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：６７６－６８９（１９９８））などのがん素因遺伝子の遺伝的変異の特定、（ｉｉ）個別化治療、例えば、個別化医療を導くＥＧＦＲ遺伝子における変異（Ｓｅｑｕｉｓｔ ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ，５９：４２９－４４２（２００８））、および（ｉｉｉ）再発モニタリング、例えば、薬物治療に対する耐性を発現する患者に現れるＫＲＡＳ変異の検出（Ｈｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５：４５３（２０１４）；Ａｍａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１６２６－１６３４（２００８））。しかし、これは、がん分子診断連続体における主要な機会：（ｉ）家族歴のある人のより頻繁なスクリーニング、（ｉｉ）早期疾患の検出のためのスクリーニング、および（ｉｉｉ）治療有効性のモニタリング、を見逃している。これらの満たされていない３つのニーズに対処するために、ウイルス負荷に類似した「がんマーカー負荷」と呼ばれる血液ベースの検出のための新しい測定基準が、本明細書で提案される。
ＤＮＡ配列決定は、疾患に関連するすべての核酸変化を識別する究極の能力を提供する。しかしながら、このプロセスは、依然として、複数の事前の試料および鋳型調製を必要とし、したがって、ＤＮＡ配列決定は、常に費用対効果が高いとは限らない。ＤＮＡマイクロアレイは、ＳＮＰまたは異なるＲＮＡ発現レベルなどの複数の配列バリアントに関する実質的な情報を提供することができ、したがって配列決定よりも低コストではあるが、それらは、非常に定量的な結果を得ること、または存在量が低い変異を検出することにはあまり好適ではない。このスペクトルの他端には、既知の遺伝子のリアルタイム定量化を提供するＴａｑＭａｎ（商標）反応があるが、複数の配列バリアントまたは低存在量の変異を識別するのにはあまり好適ではない。
ＮＧＳは、末端を研磨し、リンカーを付加するために、実質的な事前の試料調製を必要とし、０．７％の現在の誤差率は、１０，０００倍過剰の野生型分子のうち２～３個の変異体配列の分子を特定するには、高過ぎる。「ディープ配列決定」プロトコルは、個々の断片の両方の鎖に固有分子識別子を付加することによって、この欠陥を克服するために開発されている。これらのアプローチは、次のように知られている：Ｔａｍ－Ｓｅｑ＆ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｃｉｒｃｌｅ－Ｓｅｑ（Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＴｈｒｕＰｌｅｘ（Ｒｕｂｉｃｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ＮＥＢＮｅｘｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＱＩＡｓｅｑ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｄｕｐｌｅｘ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ（Ｓｃｈｍｉｔｔ）、ＳＭＲＴ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＳｉＭＳｅｎ－Ｓｅｑ（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ）、およびｓｍＭＩＰ（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）。しかしながら、これらの方法は、各変異を検証し、他の種類の配列決定エラーと識別するために、変異鎖あたり３０～１００倍の深度を必要とする。ＭＳＫＣＣからの最近の研究は、転移性がん患者由来の血漿における変異を正確に特定するために、６０，０００倍のカバレッジが必要であることを実証している（感度９１％、５０８遺伝子パネル、６０，０００倍）。課題をさらに複雑にしているのは、ＮＥＢの最近の論文は、希少バリアントおよび体細胞変異について最も広く使用されるデータベースの質に疑問を呈している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ｉｓ ａ Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｒｒｏｒｓ，Ｄｉｒｅｃｔｌｙ Ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５（６３２６）：７５２－７５６（２０１７））。
それぞれの満たされていない診断ニーズを、適切な診断検査と一致させることが重要である。これは、低コストで高い感度（すなわち、低い偽陰性）と高い特異性（すなわち、低い偽陽性）の両方を達成するという異なる目標を組み合わせたものである。例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療を決定するための腫瘍生検からのＥＧＦＲのエキソンの直接配列決定は、すでに薬物応答がカタログ化されている１８０を超える既知の変異についてＴａｑＭａｎ（商標）プローブを設計するよりも有意に正確であり、費用対効果が高い（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３：１４３４－１４４５（２０１３））。「ＢＥＡＭｉｎｇ」（Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８８１７－８８２２（２００３））などの点変異を検出するための最も感度の高い技術は、どの変異を探すべきかについての事前の知識に依存しており、したがって、早期発見よりも、疾患の再発のモニタリングに最も好適である。同様に、ＣＭＬ患者をＧｌｅｅｖｅｃ（Ｊａｂｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １１２：２１１２－２１１８（２００８））で治療する際に、Ｂｃｒ－Ａｂｌ転座の血中レベルをモニタリングするために、単純な定量的逆転写ＰＣＲアッセイは、１ｍｌの血液中の全ゲノムＤＮＡを配列決定すること（９００万個の細胞×３ＧＢ＝２７００万Ｇｂの生データ）よりもはるかに好ましい。
ＮＳＣＬＣ患者から単離されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の各２．１Ｇｂの配列決定が、１２５ｋｂの標的化ＤＮＡに対して１０，０００倍のカバレッジを提供するに使用された（Ｋａｎｄｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０２：３３３－３３９（２０１３））。このアプローチは、対応した腫瘍に存在する変異を正しく特定したが、ステージ１の腫瘍のわずか５０％しかカバーさなかった。このアプローチは、試料が平均５～２０個の変異／ＭｂであるＮＳＣＬＣに対しては有望であるが、１Ｍｂあたり平均１～２個未満の変異である乳がんおよび卵巣がんなどの他のがんに対して、標的化ＮＧＳは費用対効果が高くない。高度に正確な標的化されたディープ配列決定に必要な現在の事前のライゲーション、増幅、および／または捕捉ステップは、多重化ＰＣＲ－ＴａｑＭａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＬＤＲアッセイよりも依然として複雑である。
３０，０００倍のカバレッジでの５８個のがん関連遺伝子のｃｆＤＮＡのディープ配列決定により、適度に高い感度でステージ１または２のがんを検出することができるが、それぞれ、２９％のＣＲＣ、４１％の乳がん、４１％の肺がん、および３２％の卵巣がんを見逃した（Ｐｈａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（４０３）（２０１７））。代替的な戦略は、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮを含む１６個の遺伝子における「ホットスポット」変異を調べるために、６１セグメントにおいて平均３０塩基の標的化配列決定に依存し、より早期のがんを見逃した（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ Ｃａｎｃｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｍｕｌｔｉ－ａｎａｌｙｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８））．変異配列決定の感度を延長するために、Ｈｏｐｋｉｎｓのチームは、つい最近、ＮＧＳを、血清タンパク質マーカー（ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＯＰＮ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１など）の定量化と組み合わせ、６９％～９８％の範囲の感度で、５種類のがん（卵巣がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、および食道がん）の検出を改善した（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ Ｃａｎｃｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｍｕｌｔｉ－ａｎａｌｙｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８））．これらのタンパク質マーカーを使用する際の１つの注意点は、年齢適合対照（ｎ＝２２，０００）を用いた以前の大規模な研究では、臨床的有用性が示されていないことである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ ｂｙ ＣＡ １２５ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ，” ＢＭＪ ３０６（６８８４）：１０３０－１０３４（１９９３））。したがって、２０１８年のＪＡＭＡの報告では、「ＵＳＰＳＴＦは、無症候性の女性の卵巣がんの［ＣＡ－１２５］スクリーニングを推奨しない。この推奨は、高リスクの遺伝性がん症候群を有することが知られていない無症候性女性に適用される」（ＵＳＰＳＴＦ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ：ＵＳ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ” ＪＡＭＡ ３１９（６）：５８８－５９４（２０１８））。これらのタンパク質マーカーを使用する際の別の注意点は、それらが組織損傷を反映し、関節炎などの炎症性疾患を有する患者にも現れる可能性が高いことである（Ｋａｉｓｅｒ，“’Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｍｉｓｅｓ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９（６３７３）：２５９（２０１８））。米国では肥満の蔓延および高齢化の進行に伴い、肥満と加齢による炎症とともに、タンパク質マーカー由来の偽陽性のリスクが増加する。
より最近では、ＮＧＳ配列決定企業（Ｇｒａｉｌ、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｅｒａ、Ｆｒｅｅｎｏｍｅ）は、それらの標的化配列決定パネルを拡大するように積極的に動いており、現在では、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）および全ゲノムバイサルファイト配列決定（Ｂｉｓ－ＷＧＳ）も含まれるようになった。Ｇｒａｉｌによる最近の結果、２０１８年のＡＳＣＯで公開された要約（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ （ｃｆＤＮＡ） Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ｔｙｐｅｓ：Ｔｈｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ （ＣＣＧＡ） Ｓｔｕｄｙ，” ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１８，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌ；Ａｂｓｔｒａｃｔ １２０２１＃１３４））では、「早期」ＣＲＣを検出する感度が６３％であることを明らかにしているが、その主張は、ほんの２７個の試料に基づいており、そのほとんどがステージＩＩＩである。変異に富む肺がんでも５０％の感度を与え、また、ほとんどの試料がステージＩＩＩである。ほとんどの試料が、前立腺がんなどのステージＩおよびＩＩである場合、「早期がん」の検出に対する感度は、５％未満に低下する。乳がんの最も一般的な形態（ＨＲ＋／ＨＥＲ２）を検出しようとすると、感度が１３％未満に低下する。さらに悪いことに、スクリーニングによって診断された乳がんは、１１％未満の感度を与えた。要するに、ＮＧＳアプローチは、３０％～８０％の早期がん（すなわち、ステージＩ＆ＩＩ）を一貫して見逃していることから失敗である。２０１９年のＡＳＣＯ会議で最初に報告された研究（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉ－ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ （ＴＯＯ） Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ （ｃｆＤＮＡ），” ＡＳＣＯ Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ２０１９））、続いて２０２０年に発表された研究（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉ－ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ，” Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ（２０２０））では、ＧＲＡＩＬは、それらのＭｕｌｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｓｔが、７６％の全体的な検出率（１２種類の致命的ながん）（特異性９９．３％）を示すことを示した。この群のがんの複合解析は、すべてのステージにわたって堅牢な検出を示し、ステージＩ（ｎ＝６２）、ステージＩＩ（ｎ＝６２）、ステージＩＩＩ（ｎ＝１０２）、ステージＩＶ（ｎ＝１３０）における検出率が、それぞれ３９パーセント（２７～５２％）、６９パーセント（５６～８０％）、８３パーセント（７５～９０％）、および９２パーセント（８６～９６％）であった。別の会議では、ＧＲＡＩＬおよび共同研究者は、がんと診断された患者１，５３０名、およびがんを有しない人２，０５３名を含む、３，５８３人の血液試料中のセルフリーＤＮＡ（かつて細胞に限局されていたが、細胞死の際に血流に入ったＤＮＡ）の分析結果を報告した（Ｏｘｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉ－ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ （ＴＯＯ） Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ （ｃｆＤＮＡ），” ＥＳＭＯ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ（２０１９））。患者試料には、２０種類以上のがんが含まれ、ホルモン受容体陰性乳がん、大腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、リンパ性白血病、多発性骨髄腫、卵巣がん、および膵臓がんが含まれた。全体的な特異性は９９．４％であり、結果の０．６％のみが、がんが存在することを誤って示したことを意味する。事前に指定された高死亡率がんを検出するためのアッセイの感度（がんの検査で陽性であったこれらの患者由来の血液試料のパーセント）は７６％であった。この群の中で、ステージＩのがん患者の感度は３２％、ステージＩＩが７６％、ステージＩＩＩが８５％、ステージＩＶが９３％であった。すべてのがんの種類にわたる感度は５５％であり、ステージ別の検出でも同様の増加が見られた。原発組織の結果を返した試料の９７％について、試験は、８９％の症例で原発臓器または原発組織を正しく特定した。しかし、（ＧＲＡＩＬおよび共同研究者によって報告された）２０１９年の別の研究は、前述の報告の妥当性に疑問を呈した（Ｒａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｖａｒｉａｎｔｓ，” Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５（１２）：１９２８－１９３７（２０１９））。２Ｍｂ、５０８遺伝子パネルの配列決定（６０，０００倍の深度）を通して、著者らは、非がん対照およびがん患者の両方におけるセルフリーＤＮＡ変異の大多数が、クローン性造血と一致する特徴を有していることを実証した。クローン性造血は、白血球が、血液学的状態または悪性腫瘍を必ずしも生みだすことなく体細胞変化を徐々に蓄積するプロセスである。実際、変異は、がんを有しない個体の白血球の９３．６パーセントに現れ、がんを有する個体の９９．１パーセントに現れた。最近開催されたカンファレンスで、ＧＲＡＩＬおよびその共同研究者は、彼らの血液ベースの検査が、ステージＩの場合は感度が５０％未満、ステージＩ～ＩＩＩの場合は感度が７３％で、複数のＧＩがんを検出できることを報告した（Ｗｏｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅｓ，” Ｉｎ：Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ２０２０（２０２０））。Ｆｒｅｅｎｏｍｅの場合、最近のＡＳＣＯプレゼンテーションは、彼らのプラットフォーム（全ゲノム配列決定、バイサルファイト配列決定、およびタンパク質定量化法による血漿分析）が、大腸腺がんの検出について、９０％の特異性で、早期（ｎ＝１７）で９２％および後期（ｎ＝１１）で８４％の平均感度を達成することができたことを示した。すべてのＣＲＣ病理学的サブタイプで、Ｆｒｅｅｎｏｍｅ検査は、９０％の特異性、ならびに早期（ｎ＝１９）および後期（ｎ＝１２）について、それぞれ８０％および８３％の感度を達成した。ＦｒｅｅｎｏｍｅのＣＳＯを辞任したばかりのＩｍｒａｎ Ｈａｑｕｅとのプライベートなディスカッションで、彼は、７，０００万ドルの予算、ならびに８１７検体のＣＲＣ患者および適合対照患者の血漿を配列決定するための３０人の科学者を有しており、彼は、Ｆｒｅｅｎｏｍｅ（ならびにＧＲＡＩＬ）がデータをオーバーコールしており、費用対効果の高い真のがんの早期発見を達成するための強力なアプローチを、彼らの誰も持っていなかったことを認めた（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ，” ＢｉｏＲｘｉｖ ４７８０６５（２０１８））。
腫瘍不均一性、腫瘍クラスター、および個々のマーカーあたり３％～１０％の範囲の生物学的／技術的な偽陽性を考慮した６００を超える大腸がん試料の網羅的データ解析は、大腸がんの最適な早期発見スクリーニングが、試験される２４個のマーカーのうち、少なくとも５～６個の陽性マーカーを必要とすることを示した（Ｂａｃｏｌｏｄ ｅｔ ａｌ，．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９：７２３－７２７（２００９）；Ｔｓａｆｒｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：２１２９－２１３７（２００６）；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５：１１１３－１１２０（２０１３）；Ｎａｖｉｎ Ｎ．Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５：４５２（２０１４）；Ｈｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５：４５３（２０１４））；Ｅｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １５：ｅ２３４－２４２（２０１４））。さらに、マーカー分布は、異なる腫瘍クレードで偏っており、例えば、いくつかの腫瘍は重度にメチル化され、他の腫瘍はほとんどメチル化されておらず、隣接組織の加齢関連メチル化と区別できない。したがって、すべての異なる腫瘍クレードの十分なカバレッジを得るために、多次元のアプローチが必要であり、変異、メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、コピーバリエーション、選択的スプライシング、または転座マーカーのうちの３～５セットの組み合わせを使用する。三染色体についての非侵襲的出生前スクリーニングに類似して、ｆＤＮＡのランダムな断片に対する配列決定またはライゲーション検出の実施に基づいて（Ｂｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．４２（１）：１５－３３（２０１３）；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １０５：２０４５８ － ２０４６３（２００８）；Ｊｕｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．３６（４）（２０１４））、がん検診でスコア付けされた実際のマーカーは、血漿中のそれらの陽性マーカーの正確な定量化に次ぐものである。
上で指摘したように、がん特異的ＲＮＡマーカー（マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、およびｍＲＮＡを含む）は、血液中に存在している場合もあり、コンパートメントに含まれていないか（Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉＲＮＡｓ ａｓ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ，” ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １２（９）：ｅ０１８４０９４（２０１７））、またはエクソソーム（Ｎｅｄａｅｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４（２）：４８－５６（２０１７）、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｓ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ Ｅｘｏｓｏｍａｌ Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１ Ｌｅｖｅｌｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ３９：８６－９３（２０１７））もしくは循環腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）に含まれているかのいずれかであり、早期がんの潜在的な指標としてタグ付けされている。周囲の細胞に由来するマーカーと比較して、がんの早期発見における血漿由来の核酸マーカー（血液中にごくわずかな量のこれらのマーカーを含む）の使用に関する課題が多く存在する。実際、これらの制限により、これらの「早期」検出アッセイは、後期原発性がんおよび転移性がんを検出する可能性がより高いように見える（Ｐａｎｔｅｌ “Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，” ＰＬｏＳ Ｍｅｄ １３（１２）：ｅ１００２２０５（２０１６））。
がん診断検査の開発の技術的課題
非常に希少なまたは低存在量の変異体配列を見つけることを目的とした診断検査は、以下から生じる潜在的な偽陽性に直面する：（ｉ）野生型標的の複製の際のポリメラーゼエラー、（ｉｉ）ＤＮＡ配列決定エラー、（ｉｉｉ）野生型標的でのミスライゲーション、（ｉｉｉ）標的非依存性のＰＣＲ産物、および（ｉｖ）以前の陽性試料から生じるＰＣＲ産物のキャリーオーバー汚染。がんのスクリーニング時の陽性の検査結果の深刻な臨床的意味は、偽陽性を事実上排除するために、かかる検査が、可能なあらゆる手段の使用を必要とする。
非常に希少なまたは低存在量の変異体配列を見つけることを目的とした診断検査は、以下から生じる潜在的な偽陽性に直面する：（ｉ）野生型標的の複製の際のポリメラーゼエラー、（ｉｉ）ＤＮＡ配列決定エラー、（ｉｉｉ）野生型標的でのミスライゲーション、（ｉｉｉ）標的非依存性のＰＣＲ産物、および（ｉｖ）以前の陽性試料から生じるＰＣＲ産物のキャリーオーバー汚染。がんのスクリーニング時の陽性の検査結果の深刻な臨床的意味は、偽陽性を事実上排除するために、かかる検査が、可能なあらゆる手段の使用を必要とする。
核酸検出の概念の核心は、正常細胞からの同じマーカーまたは密接に類似したマーカーから、所望のがんに特異的なマーカーを選択的に増幅または精製することである。これらのアプローチとしては、（ｉ）直交的な増幅および検出のための複数のプライマー結合領域、（ｉｉ）ＣＴＣまたはエクソソームの親和性選択、および（ｉｉｉ）試料の空間的希釈、が挙げられる。
感度および特異性を確保するために４つのプライマー結合領域を使用するＰＣＲ－ＬＤＲの成功は、以前に実証されている。所望の領域は、対のＰＣＲプライマー、またはさらにタンデム対のＰＣＲプライマー、続いて検出用の直交ネステッドＬＤＲプライマー対を使用して増幅される。ＰＣＲ－ＬＤＲを使用する利点の１つは、複数の断片の比例的なＰＣＲ増幅を行って低コピーの標的を濃縮し、次いで定量的ＬＤＲを使用してがん特異的変異を直接特定することができることである。Ｂｉｏｆｉｒｅ／ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘは、「フィルムアレイ」と呼ばれる同様の技術を開発している。この技術では、初期の多重化ＰＣＲ反応生成物が個々のウェルに再分配され、次いでＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素検出を用いてネステッドリアルタイムＰＣＲが行われる。
抗体またはアプタマー捕捉を使用したＣＴＣの親和性精製が実証されている（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０：８６３３－８６４１（２００８）；Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ３０：３２８９－３３００（２００９）；Ｓｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２１：１９３２－１９４２（２００６））。エクソソームのペプチド親和性捕捉は、文献に報告されている。血液からこれらの腫瘍特異的画分を濃縮することで、コピー数の定量化、ならびにスクリーニングおよび検証アッセイの簡略化が可能になる。
最後のアプローチとしての試料の空間的希釈は、デジタルＰＣＲ、ならびにＢＥＡＭｉｎｇとして知られるその類似法で用いられる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９６（１６）：９２３６－４１（１９９９）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８８１７－８８２２（２００３））。デジタルＰＣＲの理論的根拠は、試料が、野生型ＤＮＡの１，０００～１０，０００倍過剰の既知の変異を含む非常に少ない標的分子を含む場合に、酵素識別の限界を克服することである。２０，０００個以上の液滴またはビーズに入力ＤＮＡを希釈して、１液滴あたり１分子未満の標的を分配することによって、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、次いでプローブハイブリダイゼーションまたはＴａｑＭａｎ（商標）反応により検出し、本質的に０／１のデジタルスコアを得ることができる。このアプローチは、現在、血漿中で点変異を見つけるのに最も感度が高いが、スコアリングされる変異についての事前の知識、ならびに各変異についての別個のデジタル希釈を必要とするため、わずかな変異をスコアリングするために試料全体を枯渇させてしまうであろう（Ａｌｃａｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｙ ＫＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２１：２８－３３（２０１９）、Ｇｕｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ ｏｆ Ｆｉｎｅ－Ｎｅｅｄｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，” Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ １７６８：１９３－２０７（２０１８）、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＫ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ Ｕｓｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，” ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １８：１１３６（２０１８））。
多重化アッセイを開発する場合、（ユニプレックスｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ、ユニプレックス・ドロップレットＰＣＲ、またはマルチプレックス・ドロップレットＰＣＲに希釈するときに、真陽性であればシグナルを得るのに十分なコピーがあるように）十分なコピーの各変異体またはメチル化領域を生成するのに十分なＰＣＲもしくは他の増幅技術の予備的なサイクルを行うことと、（一部のマーカーが過剰増幅される一方で、他のマーカーが抑制されるかもしくは相対的な定量化が失われるような）多過ぎるＰＣＲサイクルを行うこととの間に難しいバランスがある。
本開示は、これらの欠点、および当該技術分野における他の欠点を克服することを対象とする。
概要
本出願の第一の局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、プライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各プローブセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、３'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）５'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブは、第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドして、１つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成する。１つまたは複数のライゲーション反応混合物を１つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供し、それにより、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせて、ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを含む。方法はさらに、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）ライゲーション産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ライゲーション産物配列と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願の第一の局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、プライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各プローブセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、３'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）５'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブは、第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドして、１つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成する。１つまたは複数のライゲーション反応混合物を１つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供し、それにより、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせて、ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを含む。方法はさらに、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）ライゲーション産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ライゲーション産物配列と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。方法はさらに、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階、および１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階を含む。処理済み試料と、１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成されたポリメラーゼ伸長産物の一部分に相補的である３'部分とを有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分の相補物とを含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の三次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素および１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的である３'部分を有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分を有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。処理済み試料と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカー、４８～７２のマーカー、７２～９６のマーカーまたは＞９６のマーカーを含むセット中にある、方法に関する。所与のセット中の各マーカーは、以下の基準：疾患状態を有すると診断された個体からの疾患細胞または組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；疾患状態を有しない個体からの正常な細胞または組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；疾患状態を有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；疾患状態を有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階を含む。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つまたは３つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つまたは５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つまたは６つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～７２のマーカーを含むマーカーセット中、最低６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、７２～９６のマーカーを含むマーカーセット中、最低７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、９６～「ｎ」（「ｎ」＞１６８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低８つ、９つ、１０、１１、１２、１３または「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、疾患状態を有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法に関する。複数のマーカーは、全部で４８～７２のがんマーカー、全部で７２～９６のがんマーカーまたは全部で≧９６のがんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／４超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、全部で４８～７２のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で７２～９６のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で９６～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１８のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法に関する。複数のマーカーは、３６～４８のグループ特異的がんマーカー、４８～６４のグループ特異的がんマーカーまたは≧６４のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／３超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～６４のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、６４～「ｎ」（「ｎ」＞６４）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんを含む消化器がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～１８のマーカー、１８～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカーまたは≧４８のマーカーを含むセット中にある、方法に関する。各マーカーは、消化器がんに関する以下の基準：消化器がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；消化器がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；消化器がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；消化器がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つまたは４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～１８のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つ、４つまたは５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１８～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つまたは６つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、消化器がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、全部で３６～４８のがんマーカー、全部で４８～６４のがんマーカーまたは全部で≧６４のがんマーカーを含むセット中にある、方法に関する。所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、全部で３６～４８のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で４８～６４のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で６４～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、２４～３６のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測して、治療を誘導し、モニタリングする方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、所与の組織特異的がんを有する個体は、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、その後の治療を誘導し、モニタリングするために、検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされた特定されたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされた特定されたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、治療プロトコル中、マーカーシグナルの損失をモニタリングするために、個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば、該マーカーの継続的存在が、がん治療法を変更する決定を導き得る。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの再発に関して疾患状態を診断または予後予測する方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、所与の組織特異的がんを有する個体は、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、再発をモニタリングするために、検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、マーカーシグナルのゲインをモニタリングするために、治療成功後の個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば、患者特異的マーカーセット中の再出現または上昇またはカットオフレベルを超える上昇が、がん治療法を再開する、または新たながん治療法へと変更する決定を導き得る。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する２工程法に関する。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するエクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。第一の工程を、生物学的試料に対し、＞８０％の全感度および＞９０％の全特異度または＞１．２８の全Ｚスコアで適用して、疾患状態を有すると診断または予後予測される可能性が比較的高い個体を特定する。次いで、第二の工程を、第一の工程で特定された個体からの生物学的試料に対し、＞９５％の全特異度または＞１．６５の全Ｚスコアで適用して、疾患状態を有する個体を診断または予後予測する。第一の工程および／または第二の工程は、本出願の方法を使用して実行される。
本出願は、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼ反応を使用して標的核酸分子における変異、発現、スプライスバリアント、転座、コピー数および／またはメチル化変化を検出するためのいくつかの手法を記載する。本出願は、キャリーオーバー予防の課題を解決し、デジタルＰＣＲと同様な相対的定量化を提供するための空間多重化を可能にする。そのような技術は、血漿または血清試料からのがんの非侵襲的早期検出、がんの非侵襲的予後予測およびがん再発のモニタリングに利用され得る。
本出願は、固形組織がんおよび対応する正常組織に特異的である核酸メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡエクソンならびにがん関連タンパク質マーカーの包括的なロードマップを提供する。本出願は、患者の治療を改善するよう医師を導くために、汎がん分析（ｐａｎ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ）と特定のがん（すなわち（ｉ．ｅ．）結腸直腸がん）の両方のために所望の数のマーカーおよびマーカーのタイプを選択する技術を教示する。汎がん分析と特定のがんの両方の場合にこれらの検査の迅速な検証を可能にするために、プライマー設計および最適化されたプライマー配列の詳細が提供される。この２工程手法は、はじめに、早期がんを宿す個体の大多数を特定するために広い網を打ち、次いで、より厳密な第二の工程を実施して特異度を改善し、患者を、隠れたがんを宿す可能性が最も高い患者（その後、画像診断およびフォローアップに回される）へと絞り込むように設計されている。この２工程手法の利点は、潜在的な原発組織を特定するだけでなく、最高の陽性適中率（ＰＰＶ）を提供するように設計されていることである。したがって、希少がんの場合の結果が推定陽性（すなわち（ｉ．ｅ．）早期卵巣がん）として返される場合、医師は、画像診断およびフォローアップを最も必要とする患者にそれを提供することに焦点を絞ることができ、検査は、不必要な不安および望まれない侵襲的処置を招く偽陽性を最小限にする。
本出願は、自動化しやすく、容易に入手可能な市販の計器上で作動するプロトコルを使用して、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲリードアウトを使用してがんのマーカー（例えば変異、発現、スプライスバリアント、転座、コピー数および／またはメチル化変化）を検出するためのロバストな手法を提供する。この手法は、検査装置のために統合され、好都合であるという利点を提供して、コスト削減、スケーラビリティならびにＣＬＩＡ準拠自動化設定における医療および検査室フローとの適合を可能にする。世界中で命が救われる恩恵は計り知れない価値を有するであろう。
詳細な説明
「がんマーカー量」を使用するがん早期検出のためのユニバーサルデザイン
最も費用効果的な早期がん検出検査は、初期の多重化結合増幅とライゲーションアッセイとを組み合わせて「腫瘍量（ｃａｎｃｅｒ ｌｏａｄ）」を決定し得る。早期がん発見の場合、これは、すべてのがん（汎がん分析）に関し、＞９５％の感度を＞９７％の特異度で達成するであろう。これらの設計原理はまた、治療効能のモニタリングおよびがん再発の早期検出を含むように拡張され得る。
「がんマーカー量」を使用するがん早期検出のためのユニバーサルデザイン
最も費用効果的な早期がん検出検査は、初期の多重化結合増幅とライゲーションアッセイとを組み合わせて「腫瘍量（ｃａｎｃｅｒ ｌｏａｄ）」を決定し得る。早期がん発見の場合、これは、すべてのがん（汎がん分析）に関し、＞９５％の感度を＞９７％の特異度で達成するであろう。これらの設計原理はまた、治療効能のモニタリングおよびがん再発の早期検出を含むように拡張され得る。
がん腫瘍量アッセイのためのいくつかのフローチャートが図１に示されている。その最も簡単な形態において、アッセイは、早期結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を特定するための１工程アッセイであろう。血液試料を血漿および必要ならば他の成分へと分画し、１２のマーカーのセットを平均感度７５％でアッセイし、結果を記録する（図１Ａ）。例えば、変異、メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、代替スプライシングおよび／または転座のための初期多重化ＰＣＲ／ＬＤＲスクリーニングアッセイスコアリングが、陽性結果を示す試料を特定する。医師は、どの特定のマーカーが陽性であるのかを気にすることなく、簡単な指示を出すだけである。０～１のマーカーが陽性である患者は、心配無用です、お帰りください、がんではありませんと告げられる。１２のマーカーのうち≧３つが陽性である患者は、結腸内視鏡検査を受けるよう指示される。陽性マーカーが中間の数（２）である患者は、３～６ヶ月後に再検査を受けるよう指示される。このように、検査は、全がんマーカー量に基づき、検査結果が陽性である特定のマーカーに依存しない。
検査の先進バージョンにおいては、患者が結腸直腸がんを有するどうかを特定するための２工程アッセイが実行されるであろう。２工程検査の原理は、はじめに、潜在的ながんを有する最大数の個体を特定する際に感度を最大化するために広い網を打ち、その後、陽性試料（真陽性と偽陽性の両方を含む）に対してのみ第二の工程を実行して、特異度を最大化し、事実上すべての偽陽性を排除し、がんを有する可能性が最も高い個体に絞り込む。第一の工程で、血液試料を血漿および必要ならば他の成分へと分画したのち、１２のマーカーの初期セットを平均感度７５％でインタロゲートするアッセイを実施する（図１Ｂ）。第一の工程のアッセイは、多重化ＰＣＲ／ＬＤＲまたはデジタルＰＣＲスクリーニングを用いて変異、メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、代替スプライシングおよび／または転座のイベントをスコアリングすることができる。１工程アッセイと同様、０～１のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定される。他方、≧２のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受け、その中で、２４の（新たな）マーカーが感度７５％でアッセイされ、以下のようにスコアリングされる：陽性マーカー０～２は無がん状態と見なされ；陽性マーカー３つは、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；陽性マーカー≧４は、結腸内視鏡検査を受けるように指示される。
１工程ＣＲＣ検査のより高い精度のために、血液試料を分画したのち、１８のマーカーのセットを平均感度７５％でアッセイし、結果を記録する（図１Ｃ）。０～２のマーカーが陽性である患者は無がん状態と見なされ；３つのマーカーが陽性である患者は、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；≧４のマーカーが陽性である患者は、結腸内視鏡検査を受けるよう指示される。
２工程ＣＲＣ検査のより高い精度のために、血液試料を分画したのち、１８のマーカーのセットを平均感度７５％でアッセイし、結果を記録する（図１Ｄ）。１工程アッセイと同様、０～２のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定される。他方、≧３のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受け、その中で、３６の（新たな）マーカーが感度７５％でアッセイされ、以下のようにスコアリングされる：陽性マーカー０～３は無がん状態と見なされ；陽性マーカー４つは、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；陽性マーカー≧５は、結腸内視鏡検査を受けるよう指示される。
検査の汎がん分析バージョンにおいては、第一の工程で、アッセイは９６のマーカーをスクリーニングし、その中で、平均で≧３６のそのようなマーカーが大部分の主要ながんに関して５０％の平均感度を示すであろう（図１Ｅを参照）。それらのがんは、グループ１（結腸直腸、胃、食道）；グループ２（乳房、子宮体内膜、卵巣、子宮頸部、子宮）；グループ３（肺、頭頸部）；グループ４（前立腺、膀胱）およびグループ５（肝臓、膵臓、胆嚢）を含む特定のグループにまとまるであろう。０～４のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定されるが、≧５のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受ける。そして、推定陽性試料を、１グループあたり６４のマーカーを使用して１つまたは２つのグループを検査する第二の工程でアッセイし、その中で、初期結果を検証し、原発組織を特定するための組織特異的マーカーを使用することを含め、平均で≧３６のそのようなマーカーが、そのグループ内のがんの特定のタイプごとに５０％の平均感度を示すであろう。結果を以下のようにスコアリングする：陽性マーカー０～３は無がん状態と見なされ；陽性マーカー４つは、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；陽性マーカー≧５は、原発組織である可能性が最も高いがんのタイプに対応する画像診断を受けるよう指示される。より高い感度のために、第一の工程における初期の９６のマーカーおよび第二の工程におけるグループ特異的マーカーはいずれも６６％の平均感度を有するであろう（図１Ｉ）。次いで、医師は、患者のための治療決定をさらに誘導するために標的化シーケンシングを指示してもよい。
汎がん分析検査の変形においては、第一の工程で、アッセイは９６のマーカーをスクリーニングし、その中で、平均で≧３６のそのようなマーカーが大部分の主要ながんに関して５０％の平均感度を示すであろう（図１Ｆを参照）。０～４のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定されるが、≧５のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受ける。そして、推定陽性試料を、１グループあたり４８のマーカーを使用して１つまたは２つのグループを検査する第二工程でアッセイし、その中で、平均で≧３６のそのようなマーカーが、そのグループ内のがんの特定のタイプごとに７５％の平均感度を示すであろう。結果を以下のようにスコアリングする：陽性マーカー０～３は無がん状態と見なされ；陽性マーカー４つは、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；陽性マーカー≧５は、原発組織である可能性が最も高いがんのタイプに対応する画像診断を受けるよう指示される。グループ特異的マーカーのこれらのセットは、正確な原発組織を常に特定し得るわけではないが、それを特定のグループへと絞り込むはずである。原発組織を特定するための代替手法として、上記工程２に代えて、またはそれに加えて標的化バイサルファイトシーケンシングを使用して、より多くの、またはさらなるメチル化マーカーにアクセスすることによってメチル化マーカーをスコアリングしてもよい。より高い感度のために、第一の工程における初期の９６のマーカーは６６％の平均感度を有するであろう（図１Ｊ）。次いで、医師は、患者のための治療決定をさらに誘導するために標的化シーケンシングを指示してもよい。
汎がん分析検査のより合理化されたバージョンにおいては、第一の工程で、アッセイは４８のマーカーをスクリーニングし、その中で、平均で≧２４のそのようなマーカーが大部分の主要ながんに関して７５％の平均感度を示すであろう（汎がん分析検査、図１Ｇを参照）。０～３のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定されるが、≧４のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受ける。初期スクリーニングにおけるより高い精度のために、第一の工程で、アッセイは６４のマーカーをスクリーニングし、その中で、平均で≧３６のそのようなマーカーが大部分の主要ながんに関して７５％の平均感度を示すであろう（図１Ｈを参照）。ここでは、０～４のマーカーが陽性である患者は無がん状態と推定されるが、≧５のマーカーが陽性である患者は第二の工程を受ける。そして、推定陽性試料を、９６マーカー汎がん分析アッセイを使用する第二の工程でアッセイし、その中で、初期結果を検証し、原発組織を特定するための組織特異的マーカーを使用することを含め、平均で≧３６のそのようなマーカーが、そのグループ内のがんの特定のタイプごとに５０％の平均感度を示すであろう。結果を以下のようにスコアリングする：陽性マーカー０～３は無がん状態と見なされ；陽性マーカー４つは、３～６ヶ月後に再検査を受けるようアドバイスされ；陽性マーカー≧５は、原発組織である可能性が最も高いがんのタイプに対応する画像診断を受けるよう指示される。より高い感度のために、第二の工程における９６のマーカーは６６％の平均感度を有するであろう（図１Ｋおよび１Ｌ）。原発組織を特定するための代替手法として、上記工程２に代えて、またはそれに加えて標的化バイサルファイトシーケンシングを使用して、より多くの、またはさらなるメチル化マーカーにアクセスすることによってメチル化マーカーをスコアリングしてもよい。次いで、医師は、患者のための治療決定をさらに誘導するために標的化シーケンシングを指示してもよい。
７５％の平均感度を有する前述の５グループ４８種のマーカーは、治療をモニタリングするためにも使用されるように設計されていた（図１Ｍを参照）。現在、新たにがんが診断されると、治療法を導くために使用され得る変異または遺伝子再編成を特定するために、がん組織（または液体生検材料）が標的化シーケンシングに供される。所与のがん（すなわち（ｉ．ｅ．）、グループ１の胃がん）の場合、がん組織または液体生検材料を４８マーカーグループ（１）パネルで検査し得る。まず、図１Ｆまたは１Ｊで特定された２工程スクリーニングを使用してがんが特定されていたならば、そのアッセイの工程２で４８マーカーグループ特異的検査をすでに受けているであろう。検査される４８のマーカーのうち、平均で１２～２４が陽性であろう。次いで、治療効能をモニタリングするために、それらを患者特異的検査へと束ね得る。そのような患者の血漿が手術後および治療レジメンの間に検査されるであろう。血漿は、１２～２４のマーカーシグナルの損失に関してモニタリングされるが、≧３の陽性マーカーが陽性のままであるならば、それは、治療法を変更するよう医師を導き得る。
前述の５グループ４８種のマーカーは、再発をモニタリングするためにも使用されるように設計されていた（図１Ｎを参照）。まず、図１Ｆおよび１Ｊで特定された２工程スクリーニングを使用してがんが特定されていたならば、および／または、図１Ｍに記載されたようにがんがモニタリングされたならば、４８マーカーグループ特異的検査をすでに受けているであろうし、その場合、平均で１２～２４が陽性であろう。次いで、再発をモニタリングするために、それらを患者特異的検査へと束ね得る。原発がんから回復したそのような患者の血漿が、１２～２４マーカーパネルからのマーカーのゲインに関してモニタリングされるであろう。結果は以下のようにスコアリングされる：陽性マーカー０～２は無がん状態と見なされ；陽性マーカー≧３は第二工程に進むよう指示される。再発腫瘍の治療を誘導するために使用され得る変異または遺伝子再編成を特定するために、血漿が標的化シーケンシングに供されるであろう。
本出願は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の最善の特徴を、５ｍＣ（５－メチルシトシン）および５ｈｍＣ（５－ヒドロキシメチルシトシン）をカスケード反応によって５－カルボキシシトシンへと変換する［すなわち、５－メチルシトシン（５ｍＣ）→５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）→５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）→５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）］ためのＴＥＴ２の使用と組み合わせ、それにより、５ｍＣおよび５ｈｍＣを、ＡＰＯＢＥＣによる脱アミノ化（全体として参照により本明細書に組み入れられるＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗｉｔｈ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｐｒｏｄｕｃｔ： ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｋｉｔ Ｅ７１２０を参照）、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）および複数の疾患マーカー、例えばがんマーカーの定量的検出から保護し、かつ非メチル化シトシンを保護しないことを求める普遍的な診断手法に関する。
多重化、偽陽性回避およびキャリーオーバー保護
所望の疾患特異的核酸差から生成される真のシグナルと、試料中に存在する正常な核酸から生成される偽のシグナルと、疾患特異的核酸差（すなわち体細胞変異）の非存在において生成される偽のシグナルとを識別する技術的難題がある。
所望の疾患特異的核酸差から生成される真のシグナルと、試料中に存在する正常な核酸から生成される偽のシグナルと、疾患特異的核酸差（すなわち体細胞変異）の非存在において生成される偽のシグナルとを識別する技術的難題がある。
これらの難題に対するいくつかの解決手段が以下に提示されるが、それらはいくつか共通のテーマを共有する。
第一のテーマは多重化である。ＰＣＲは、プライマー濃度が比較的高く、多重化を制限する５０ｎＭ～５００ｎＭであるとき、最高の性能を発揮する。さらに、ＰＣＲプライマーペアが加えられれば加えられるほど、誤った産物を増幅したり、プライマーダイマーを生成したりする危険性は指数関数的に増す。対照的に、ＬＤＲプローブの場合、４ｎＭ～２０ｎＭ程度の低い濃度が使用され、プローブダイマーは、ライゲーションイベントを許すための標的上の近接ハイブリダイゼーションの必要性によって制限される。ユニバーサルプライマー配列「テール」を含有する低濃度の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーまたはＬＤＲプローブの使用は、初期ＰＣＲまたはＬＤＲ産物の比例的増幅を達成するために、より高濃度のユニバーサルプライマーをその後に追加することを可能にする。偽のＰＣＲアンプリコンまたはプライマーダイマーを回避または最小化するためのもう１つの方法が、いくつかの余分な塩基と、標的にハイブリダイズしたときのみヌクレアーゼによる切断によって解放されて自由な３'ＯＨを形成するブロッキング基（例えばブロッキング基としてリボヌクレオチド塩基および切断ヌクレアーゼとしてＲＮアーゼＨ２）を含有するＰＣＲプライマーを使用する方法である。
第二のテーマは、低いインプット標的核酸によるシグナルの変動である。多くの場合、標的核酸は、ＣＴＣとして捕捉されたいくつかの細胞に由来したもの、またはアポトーシスを受け、そのＤＮＡを小さな断片（１４０～１６０ｂｐ）として血清中に放出した腫瘍細胞に由来したものである。そのような条件下では、少数の出発分子を個々のウェル中に分注するときの変動のせいでシグナルを一斉に失うこと、または誤ったコピー数を報告することを避けるために、何らかのレベルの比例的増幅を実行することが好ましい（リアルタイムまたはドロップレットＰＣＲ定量化の場合）。これらの初期増幅が妥当なレベル（約１２～２０サイクル）に維持される限り、その後の検出／定量化（リアルタイムまたはドロップレットＰＣＲ定量化を使用する）のためのチューブ開封時およびアンプリコン分注時のキャリーオーバー汚染の危険は最小化される。他のスキームは、より低い量の限られた増幅（約８～１２サイクル）しか使用しない。
第三のテーマは、ＮＴＣ（Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）とも知られる標的非依存性シグナルである。これは、正しい標的の非存在において起こるポリメラーゼまたはリガーゼ反応から生じる。賢明なプライマー設計によってこのシグナルを最小化し得る。ライゲーション反応の場合、ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性を使用して、ライゲーションに好適であるよう、下流のライゲーションプライマーの５'リン酸基を解放し得る（標的にハイブリダイズしたときのみ）。ＬＤＲを使用して低レベルの変異の存在を識別するためのさらなる特異度が、（ｉ）３'ＯＨ塩基から２番目または３番目の位置にミスマッチを含有する上流の変異特異的ＬＤＲプローブを使用すること、（ｉｉ）野生型配列への変異特異的ＬＤＲプローブのハイブリダイゼーションを減らすであろうＬＮＡまたはＰＮＡプローブを野生型配列に対して使用すること、（ｉｉｉ）（任意で）ライゲーションはするがさらなる増幅を受けないＬＤＲプローブを野生型配列に対して使用すること、および（ｉｖ）いくつかの余分な塩基と、相補的標的にハイブリダイズしたときのみヌクレアーゼによる切断によって解放されて自由な３'ＯＨを形成するブロッキング基（例えばＲＮアーゼＨ２およびリボヌクレオチド塩基）を含有する上流ＬＤＲプローブを使用することにより、達成され得る。ＰＣＲを使用して低レベル変異の存在を識別するために特異度を改善するための類似の手法が、（ｉ）３'ＯＨ塩基から２番目または３番目の位置にミスマッチを含有する変異特異的ＰＲＣプライマーを使用すること、（ｉｉ）野生型配列への変異特異的ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーションを減らすであろうＬＮＡまたはＰＮＡプローブを野生型配列に対して使用すること、（ｉｉｉ）ブロックされ、さらなる増幅を受けないＰＣＲプライマーを野生型配列に対して使用すること、および（ｉｖ）いくつかの余分な塩基と、相補的標的にハイブリダイズしたときのみヌクレアーゼによる切断によって解放されて自由な３'ＯＨを形成するブロッキング基（例えばＲＮアーゼＨ２およびリボヌクレオチド塩基）を含有する上流のＰＣＲプライマーを使用することにより、達成され得る。
第四のテーマは、反応における未使用のプライマーによる抑制された（減少した）増幅または誤った（偽の）増幅である。そのような未使用のプライマーを除くための１つの手法が、ゲノムＤＮＡまたは標的もしくは増幅された標的ＤＮＡを固体支持体上に捕捉し、ライゲーションプローブがハイブリダイズし、連結することを許し、次いで、ハイブリダイズしないプローブまたは産物を除去する手法である。代替解決手段は、プロセス中で第二のレベルの選択が行われるような、前増幅と、それに続くネステッドＬＤＲおよび／またはＰＣＲ工程とを含む。
第五のテーマはキャリーオーバー防止である。キャリーオーバーシグナルは、ユニバーサルＰＣＲ増幅中の標準的なウラシル取り込みおよび前増幅ワークアップ手順中のＵＤＧ（および任意でＡＰエンドヌクレアーゼ）の使用によって排除し得る。キャリーオーバー防止の包含は、以下さらに詳細に説明するように、本出願の方法にとって中核的である。初期ＰＣＲ増幅は、ウラシルの取り込みを使用して実行される。ＬＤＲ反応は、ウラシルを有しないＬＤＲプローブを用いて実行される。したがって、ＬＤＲ産物がリアルタイムＰＣＲ定量化に供されるとき、ＵＤＧの付加は、初期ＰＣＲ産物を破壊し、かつＬＤＲ産物を破壊しない。さらに、ＬＤＲは線形プロセスであり、タグプライマーは、ヒトゲノムにはない配列を使用するため、元からのＰＣＲへのＬＤＲ産物の偶発的なキャリーオーバーが鋳型非依存的な増幅を生じさせることはない。メチル化標的とでキャリーオーバー防止を提供するためのさらなるスキームは、ＰＣＲ増幅の前に制限エンドヌクレアーゼを使用して非メチル化ＤＮＡを破壊すること、またはメチル特異的ＤＮＡ結合分子もしくは抗体を使用してメチル化ＤＮＡを捕捉し、富化することを含む。
第六のテーマは、多重化反応において数多くの変異特異的またはメチル化特異的標的の均等な増幅を達成することである。すでに上述した１つの手法が、限定的な初期ＰＣＲ増幅（８～１２または１２～２０サイクル）を実行することである。しかし、ときには、特に変異またはメチル化特異的プライマーを使用するとき、またはブロッキングＬＮＡもしくはＰＮＡプローブまたは他の手段を使用して野生型ＤＮＡの増幅を抑制するとき、異なる産物が異なる速度で増幅する。理由は、通例のＰＣＲ反応は、同時に作用するフォワードプライマーとリバースプライマーの両方を有するからである。例としてリバースメチル化特異的プライマーを使用する優先的な増幅があり得るが（すなわち、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣ処理を使用したのち）、フォワードプライマーは、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの両方を増幅し（同じく、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣ処理を使用したのち）、したがって、フォワードプライマー増幅の初期速度の差を拡大する。さらに、これは、変異特異的フォワードプライマーを使用する場合にも当てはまり、非選択性リバースプライマーの使用は、初期増幅産物が実質的な量の野生型ＤＮＡ配列をなおも含有し、それが、後続の増幅工程において望まれない偽陽性を招き得ることを意味する。１つの手法は、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを増幅するプライマーを使用して、初期の片側線形増幅を実行することである。これは、２つの結果的な鎖がもはや互いに対して相補的ではない、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣ処理されたＤＮＡを増幅する場合に特に有用である。このテーマの重要な変形が、線形増幅工程ののち初期標的ＤＮＡを破壊することである。これは、初期伸長産物をエキソヌクレアーゼＩ消化から保護する（ただし、元からのｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを保護しない）１つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、例えばα－チオ－ｄＮＴＰを取り込むことによって達成され得る。
がんメチル化およびヒドロキシメチル化マーカーを特定する方法
本出願の第一の局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、プライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各プローブセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、３'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）５'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブは、第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドして、１つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成する。１つまたは複数のライゲーション反応混合物を１つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供し、それにより、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせて、ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを含む。方法はさらに、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）ライゲーション産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ライゲーション産物配列と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
本出願の第一の局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、プライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各プローブセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、３'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）５'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブは、第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドして、１つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成する。１つまたは複数のライゲーション反応混合物を１つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供し、それにより、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせて、ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを含む。方法はさらに、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）ライゲーション産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ライゲーション産物配列と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
図２および３は、本出願のこの局面にしたがって低レベルメチル化を検出するためのｅｘＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離したのち、任意で、それをＤＮＡ修復キットで処理する（図２および３の工程Ａ）。その後、ＤＮＡを、１０－１１転座（ＴＥＴ２）ジオキシゲナーゼで処理して、５ｍＣ（５－メチルシトシン）および５ｈｍＣ（５－ヒドロキシメチルシトシン）をカスケード反応によって５ｃａＣ（５－カルボキシシトシン）へと変換し、それにより、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ）による脱アミノ化（全体として参照により本明細書に組み入れられるＴｅｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗｉｔｈ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｐｒｏｄｕｃｔ： ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｋｉｔ Ｅ７１２０を参照）から５ｍＣおよび５ｈｍＣを保護し、かつ非メチル化Ｃを保護しない。ＤＮＡポリメラーゼが「Ａ」塩基を脱アミノ化Ｃ（換言するならば、ｄＵ）の反対側に挿入し、ＡＰＯＢＥＣによる脱アミノ化に耐性である「Ｇ」を５ｃａＣの反対側に挿入する。したがって、ＴＥＴ２とその後のＡＰＯＢＥＣとの組み合わせがＤＮＡ配列中で効果的にＣを「Ｔ」に変換し、かつ５ｍＣまたは５ｈｍＣを「Ｔ」に変換しない。関心対象の領域は、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的な下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長される。この態様において、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層が方法に組み込まれてもよい。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図２または３の工程Ｂ；例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるＤｏｂｏｓｙ ｅｔ． ａｌ． “ＲＮａｓｅ Ｈ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ （ｒｈＰＣＲ）： Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｅｄ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１（８０）： １０１１ （２０１１）を参照）。試料をＵＤＧまたは類似の酵素で処理して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで処理されたインプットＤＮＡを含有するｄＵを除去する。好適な酵素としては、非限定的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧまたはヒト一本鎖選択的単官能ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＳＭＵＧ１）がある。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、遺伝子座特異的上流プライマーを加え、次いで、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスを使用して限定的（８～２０サイクル）または完全（２０～４０サイクル）ＰＣＲを実施する（図２の工程Ｃ）。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２で変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図２の工程Ｃ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各ＰＣＲラウンド中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。下流プライマーは、プライマーダイマーを防ぐために同一のユニバーサルプライマーテールを含有する。さらに、そのようなテールは、ＰＣＲ工程中にユニバーサルプライマーを含む選択肢を提供する。これは、多重化ＰＣＲ反応中、より等しい量の産物を生成することを支援し得る。図２の工程Ｄに示すように、増幅された産物はｄＵを含有し、それが、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素によるその後の処理を可能にする。
図２の工程Ｅに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、リガーゼ（黒丸）が、２つのオリゴヌクレオチドを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょに共有結合的にシールする。この態様において、関心対象の５－メチル－Ｃまたは５－ヒドロキシメチル－Ｃ領域を検出するための特異的な配列を有する上流のオリゴヌクレオチドプローブはさらに、ライゲーション産物のその後の検出を容易にするための５'プライマー特異的部分（Ａｉ）を含有する。ここでもまた、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、ＰＣＲ増幅工程中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化標的配列（メチル化またはヒドロキシメチル化配列の富化ののち存在するならば）へのライゲーションを抑制する。ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化および非メチル化配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは３'プライマー特異的部分（Ｃｉ'）を含有し、この部分が、メチル化またはヒドロキシメチル化領域を検出するための特異的な配列を有する上流プローブの５'プライマー特異的部分（Ａｉ）といっしょになって、その後、所望のライゲーション産物のみの増幅および検出を可能にする。図２の工程Ｅに示すように、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、もう１つの特異度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ライゲーション可能な３'ＯＨ基を解放する（図２の工程Ｅ）。
図２の工程Ｆに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、リガーゼ（黒丸）が、２つのオリゴヌクレオチドを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょに共有結合的にシールする。上流オリゴヌクレオチドプローブは５'プライマー特異的部分（Ａｉ）を含有し、下流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物のその後の増幅を可能にする３'プライマー特異的部分（Ｃｉ'）を含有する。ライゲーションののち、ライゲーション産物を、１つまたは複数のタグ特異的プライマーペア（各ペアは、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉを含む）を含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取し、ＵＤＧまたは類似の酵素で処理してｄＵ含有増幅産物または汚染物を除去し、ＰＣＲ増幅し、検出する。図２の工程ＧおよびＨに示すように、ライゲーション産物の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを使用して実施することができる（全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅらへの米国特許第６，２７０，９６７号およびＡｎｄｅｒｓｏｎらへの米国特許第７，６０１，８２１号を参照）。ＴａｑＭａｎ（商標）を使用する検出の場合、ライゲーション接合部に及ぶオリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーションに好適なプライマーとともに、増幅および検出のためのライゲーション産物のプライマー特異的部分において使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、蛍光レポーター基（Ｆ１）を一端に含有し、クエンチャー分子（Ｑ）を他端に含有し、これらは、インタクトなプローブ中、クエンチャー分子がレポーター基の蛍光をクエンチするのに十分な近さで互いに近接している。増幅中、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブおよび上流プライマーは、ライゲーション産物のそれらの相補領域にハイブリダイズする。ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性が、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光基を解放して、検出可能なシグナルを生成する（図２の工程Ｈ）。好ましい態様において、Ｔａｑｍａｎプローブは、蛍光レポーター基から約９塩基イン側に第二のクエンチャー基（ＺＥＮ）を含有し、プローブは、ＺＥＮ基が変異体塩基の位置にくる、またはそれに隣接するように設計されている。増幅反応中のｄＵＴＰの使用が、ｄＵを含有する産物を生成し、それを、その後、キャリーオーバー防止のために、ＵＤＧを使用して破壊することができる。
図３の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、リガーゼ（黒丸）が、２つのオリゴヌクレオチドを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょに共有結合的にシールする。この態様において、関心対象の変異を検出するための特異的な配列を有する上流ヌクレオチドプローブはさらに、ライゲーション産物のその後の検出を容易にするための５'プライマー特異的部分（Ａｉ）を含有する。ここでもまた、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、ＰＣＲ増幅工程中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化標的配列（ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化配列の富化ののち存在するならば）へのライゲーションを抑制する。ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列とメチル化（またはヒドロキシメチル化）配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは３'プライマー特異的部分（Ｂｉ－Ｃｉ'）を含有し、この部分が、メチル化またはヒドロキシメチル化領域を検出するための特異的な配列を有する上流プローブの５'プライマー特異的部分（Ａｉ）といっしょになって、その後、所望のライゲーション産物のみの増幅および検出を可能にする。図３の工程Ｄに示すように、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、もう１つの特異度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ライゲーション可能な３'ＯＨ基を生成する（図３の工程Ｄ）。
この態様において、ライゲーションプローブは、検出を容易にするためにＵｎｉＴａｑプライマーおよびタグ配列を含有するように設計されている。ＵｎｉＴａｑシステムは、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｐｉｅｒへの米国特許出願公開第２０１１／０２１２８４６号に詳細に記載されている。ＵｎｉＴａｑシステムは３つのユニークな「タグ」配列の使用を含み、表３の工程ＤおよびＥに示すように、ユニークなタグ配列の少なくとも１つ（Ａｉ）が第一のオリゴヌクレオチドプローブ中に存在し、第二および第三のタグ部分（Ｂｉ'およびＣｉ'）が第二のオリゴヌクレオチドプローブ配列中にある。プローブセット中でオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションが起こると、得られるライゲーション産物は、Ａｉ配列－標的特異的配列－Ｂｉ'配列―Ｃｉ'配列を含有する。ＵｎｉＴａｑ手法の本質は、陽性シグナルを得るためには、ライゲーションプローブセットの両オリゴヌクレオチドプローブが正しくなければならないことであり、それが、高度に多重化された核酸検出を可能にする。例えば、本明細書に記載されるように、これは、２つの部分、すなわち２つのタグの互いへのハイブリダイゼーションを要求することによって達成される。
ライゲーション産物を検出する前に、試料をＵＤＧで処理して元からの標的アンプリコンを破壊して、真正のライゲーション産物だけが検出されるようにする。ライゲーションののち、ライゲーション産物を、１つまたは複数のタグ特異的プライマーペアを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。検出工程のために、Ａｉ（第一のプライマー特異的部分）、Ｂｉ'（ＵｎｉＴａｑ検出部分）およびＣｉ'（第二のプライマー特異的部分）を含有するライゲーション産物を、両鎖上で、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、Ｃｉ'に相補的（すなわちＣｉ）である第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを使用してプライミングする。第一のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、検出可能なラベルＦ１を一端に有し、クエンチャー分子（Ｑ）を他端に有するＵｎｉＴａｑ検出プローブ（Ｂｉ）を含む（Ｆ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ）。任意で、クエンチャーに近接して、ポリメラーゼブロッキング単位、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ－１８、ＺＥＮまたはポリメラーゼ伸長を止めるのに十分である、当技術分野において公知の任意の他のブロッカーが配置される。また、もう１つの態様においては、より完全なクエンチングを保証するために、ＺＥＮクエンチャー基が蛍光レポーター基から約９塩基の位置にある。ＰＣＲ増幅は、図３の工程Ｇに示すように、二本鎖産物の形成を生じさせる。この例においては、産物が一本鎖になるとき産物の下鎖がヘアピンを形成し得ないよう、ポリメラーゼブロッキング単位が、ポリメラーゼが第一のユニバーサルプライマーの５'部分（Ｂｉ）をコピーすることを阻止する。そのようなヘアピンの形成は、ステムの３'末端がアンプリコンにアニールして、この３'末端のポリメラーゼ伸長がＰＣＲ反応を終結させる結果をもたらすであろう。
二本鎖ＰＣＲ産物は変性され、その後、温度が低下すると、産物の上鎖が、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５'部分（Ｂｉ）と鎖の反対側端の部分Ｂｉ'との間にステムを有するヘアピンを形成する（図３の工程Ｈ）。また、この工程中、第二のオリゴヌクレオチドプライマーはヘアピン型産物の５'プライマー特異的部分（Ｃｉ'）にアニールする。工程Ｈで第二のユニバーサルプライマーが伸長すると、ポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性が検出可能なラベルＤ１またはクエンチャー分子をアンプリコンの５'末端から切断して、それにより、ラベルとクエンチャーとの間の距離を増し、ラベルの検出を可能にする。
本出願の方法に使用されるライゲーション反応は当技術分野において周知である。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブをいっしょに連結する（任意で、第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の３'リボースおよびブロッキング基または第二のオリゴヌクレオチドプローブ上の５'フラップの切断ののち）のに好適なリガーゼとしては、非限定的に、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼ、大腸菌リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、９ＮリガーゼおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓリガーゼまたは当技術分野において公知の任意の他の熱安定性リガーゼがある。本出願にしたがって、本出願のヌクレアーゼライゲーションプロセスは、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応（全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｌｉｇａｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７－８０ （１９８８）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ―Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９－３７ （１９８８）およびＬａｎｄｅｇｒｅｎらへの米国特許第４，９８８，６１７号を参照）、１セットの相補的オリゴヌクレオチドプローブを利用するライゲーション検出反応（ＬＤＲ）（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、ＢａｒａｎｙらへのＷＯ９０／１７２３９を参照）または２セットの相補的オリゴヌクレオチドプローブを利用するライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、ＢａｒａｎｙらへのＷＯ９０／１７２３９を参照）を用いることによって実施することができる。
プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、修飾ペプチドヌクレオチド類似体、修飾リン酸－糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物の形態にあることができる。
好ましくは熱ハイブリダイゼーション処理である、リガーゼ検出反応中のハイブリダイゼーション工程は、ライゲーション接合部における識別ヌクレオチドに基づいてヌクレオチド配列を識別する。標的ヌクレオチド配列間の違いは、例えば、単一核酸塩基差、核酸欠失、核酸挿入または再編成であることができる。また、２つ以上の塩基を伴うそのような配列差を検出することもできる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、実質的に類似するハイブリダイゼーション条件で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするよう、実質的に同じ長さを有する。
様々なプローブ設計特徴を用いることによってリガーゼ識別をさらに高めることができる。例えば、意図的なミスマッチまたはヌクレオチド類似体（例えばイノシン、ニトロインドールまたはニトロピロール）を、第一のオリゴヌクレオチドプローブ中、３'接合端から２番目または３番目の塩基に取り込んで、３'末端で完全にマッチする場合には３'末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化し、３'末端でミスマッチする場合には３'末端のハイブリダイゼーションを有意に不安定化することもできる。この設計は、変異体プローブが野生型標的にハイブリダイズするときの不適切なミスライゲーションを減らす。あるいはまた、ＲＮアーゼによって切断されるＲＮＡ塩基をオリゴヌクレオチドプローブに取り込んで、鋳型依存的な産物形成を保証することもできる。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるＤｏｂｏｓｙ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮａｓｅ Ｈ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ （ｒｈＰＣＲ）： Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｅｄ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ”， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１ （８０）：１０１１ （２０１１）は、３'－ブロック末端を有するオリゴヌクレオチドプローブの３'末端に近いＲＮＡ塩基を使用し、それをＲＮアーゼＨ２で切断して、ＰＣＲ伸長可能かつライゲーション可能な３'－ＯＨを生成することを記載している。この手法は、ライゲーション可能な３'ＯＨ（標準的なＤＮＡリガーゼの場合）または５'－Ｐまたは両方を生成するために使用することができる（後者の場合、５'－ＲＮＡ塩基を連結することができるリガーゼが利用されるという条件で）。
他の可能な修飾としては、脱塩基部位、例えば内部脱塩基フランまたはオキソＧがある。これら異常な「塩基」は特定の酵素によって除去されて、ライゲーション可能な３'－ＯＨまたは５'Ｐ部位を生成する。ライゲーションオリゴヌクレオチドが標的核酸にアニールしたのち、エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｔｔｈ ＥｎｄｏＩＶ（ＮＥＢ）が脱塩基残基を除去する（ただし、一本鎖ＤＮＡからは除去しない）。同様に、オキソＧをＦｐｇとともに、またはイノシン／ウラシルをＥｎｄｏＶとともに、またはチミングリコールをＥｎｄｏＶＩＩＩとともに、使用することができる。
ライゲーション識別はまた、全体として参照により本明細書に組み入れられる、ＢａｒａｎｙらへのＷＯ２０１３／１２３２２０またはＡｎｄｅｒｓｏｎらへの米国特許出願公開第２００６／０２３４２５２号に記載されている結合ヌクレアーゼ－リガーゼ反応を使用することによって高めることもできる。この態様において、第一のオリゴヌクレオチドプローブはライゲーション可能な３'ＯＨ基を有し、第二のオリゴヌクレオチドプローブはライゲーション可能な５'末端を有する（すなわち、５'リン酸基を有しないオリゴヌクレオチドプローブ）。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、第一のオリゴヌクレオチドプローブの最も３'側の塩基が、標的核酸分子に相補的である第二のオリゴヌクレオチドプローブの隣接する最も５'側の塩基と重複するように設計されている。重複するヌクレオチドは「フラップ」と呼ばれる。第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複するフラップヌクレオチドが標的核酸分子配列および第一のオリゴヌクレオチドプローブの終端３'ヌクレオチドと同じ配列に相補的であるとき、第二のオリゴヌクレオチドプローブのフラップヌクレオチドのすぐ上流のホスホジエステル結合は、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）または５'ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって識別的に切断される。その特異的なＦＥＮ活性が、第一のオリゴヌクレオチドプローブの隣接する３'ＯＨの脇に沿って正確に配置されている第二のオリゴヌクレオチドプローブ上に新たなライゲーション可能な５'リン酸末端を生成して、２つのプローブのライゲーションが起こることを可能にする。この態様にしたがって、ライゲーションの前に第二のオリゴヌクレオチドプローブの５'フラップを切断するのに好適であるフラップエンドヌクレアーゼまたは５'ヌクレアーゼとしては、非限定的に、５'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼならびにＴａｑおよびＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のポリメラーゼならびにＴ４ ＲＮアーゼＨがある。もう１つの態様において、プローブセットの第二のプローブは、３'プライマー特異的部分と、標的特異的部分と、５'ヌクレオチド配列とを有し、５'ヌクレオチド配列は３'プライマー特異的部分の少なくとも一部分に相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドプローブが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズいないとき、５'ヌクレオチド配列が３'プライマー特異的部分のその相補的部分にハイブリダイズしてヘアピン型の第二のオリゴヌクレオチドプローブを形成する。
あるいはまた、図４に示すように、関心対象の領域を、遺伝子座特異的上流プライマーと、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図４の工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各伸長ラウンド中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、遺伝子座特異的下流プライマーを加え、次いで、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスを使用して限定的（８～２０サイクル）または完全（２０～４０サイクル）ＰＣＲを実施する（図４の工程Ｃ）。下流プライマーは、プライマーダイマーを防ぐために同一のユニバーサルプライマーテールを含有する。さらに、そのようなテールは、ＰＣＲ工程中にユニバーサルプライマーを含める選択肢を提供する。これは、多重化ＰＣＲ反応中、より等しい量の産物を生成することを支援し得る。
図４の場合、テールを含有するメチル化特異的上流および遺伝子座特異的下流プローブ（Ａｉ、Ｃｉ'）が、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）塩基含有ＰＣＲ産物の存在下、ライゲーション産物の形成を可能にする。ライゲーションののち、図２に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにライゲーション接合部に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図２の工程Ｅ～Ｈを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
あるいはまた、テールを含有するメチル化特異的上流および遺伝子座特異的下流プローブ（Ａｉ、Ｂｉ'－Ｃｉ'）が、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）塩基含有ＰＣＲ産物の存在下、ライゲーション産物の形成を可能にする。ライゲーションののち、ライゲーション産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図３に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。方法はさらに、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階、および１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階を含む。処理済み試料と、１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成されたポリメラーゼ伸長産物の一部分に相補的である３'部分とを有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分の相補物とを含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の三次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物配列の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
図５、６、７、１３および１４は、本出願のこの局面の様々な態様を示す。
図５は、低レベルメチル化を検出するための例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、ＤＮＡ修復キットで処理する（図５の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図５の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。
図５の工程Ｃに示すように、初期伸長反応ののち、伸長産物を、５'プライマー特異的部分を含む１つまたは複数のメチル化特異的プライマー（Ａｉ）（低濃度）、５'プライマー特異的部分を含む遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｉ）（低濃度）ならびにマッチするタグ特異的プライマーＡｉおよびＣｉならびにメチル化特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（高濃度）を含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。これらのプライマーが組み合わさって、メチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する（図５の工程Ｃ）。この態様において、関心対象のメチル化を検出するための特異的な配列を有する上流メチル化特異的プライマーはさらに、ネステッドＰＣＲ産物のその後の検出を容易にするための５'プライマー特異的部分（Ａｉ）を含有する。ここでもまた、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、初期伸長工程中、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化標的配列（メチル化配列の富化ののち存在するならば）の伸長を抑制する。ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化配列とＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列の両方に共通の配列を有するリバース遺伝子座特異的プライマーは５'プライマー特異的部分（Ｃｉ）を含有し、この部分が、メチル化領域を検出するための特異的な配列を有する上流プライマーの５'プライマー特異的部分（Ａｉ）といっしょになって、その後、変換されたメチル化ＰＣＲ配列のみの増幅および検出を可能にする。図５の工程Ｃに示すように、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を変異特異的および遺伝子座特異的プライマーに含めることにより、もう１つの特異度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長可能な３'ＯＨ基を生成する（図５の工程Ｃ）。初期プライマー伸長（工程Ｂ）中、解放された３'ＯＨ塩基は、メチル化位置から数塩基上流にあり、したがって、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列とメチル化配列（切断されたならば）の両方を伸長するであろう（しかし、ブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列にハイブリダイズしたプライマーの切断を制限するはずである）。対照的に、ネステッドＰＣＲ（工程Ｃ）において、プライマーのメチル化特異的塩基は３'ＯＨ塩基の位置にあり、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列上での伸長は、塩基がミスマッチであるため、起こる可能性は低いであろう。ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に対するＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化配列のポリメラーゼ伸長の特異度は、（ｉ）３'ＯＨ塩基から２番目または３番目の位置にミスマッチを含有するメチル化変換された特異的ＰＲＣプライマーを使用すること、（ｉｉ）ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への変異特異的ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーションを減らすであろうＬＮＡまたはＰＮＡプローブをＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に対して使用すること、（ｉｉｉ）ブロックされ、さらなる増幅を受けないＰＣＲプライマーをＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に対して使用すること、および（ｉｖ）プライマーと、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された３'ＯＨ塩基の非メチル化配列との間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチを回避することにより、さらに改善され得る。さらに、長いほうの標的特異的プライマーは、Ｔａｑｍａｎプローブおよびタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）よりも有意に低い濃度にあり、長いほうの変異特異的プライマーが枯渇して、Ｔａｑｍａｎプローブおよびタグ特異的プライマーがハイブリダイズし、標的依存的な検出を可能にするようになっている。
図５の工程Ｄに示すように、ネステッドＰＣＲ産物は、５'プライマー特異的部分（Ａｉ）標的特異的配列と、ネステッドＰＣＲ産物のその後の増幅を許す３'プライマー特異的部分（Ｃｉ'）とを含む。図５の工程ＥおよびＦに示すように、ネステッドＰＣＲ産物の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを使用して実施することができる。理由は、タグ特異的プライマーペア（各ペアが、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉを含む）およびプローブがすべてウェル、マイクロポアまたはドロップレット中に存在するからである（全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅらへの米国特許第６，２７０，９６７号およびＡｎｄｅｒｓｏｎらへの米国特許第７，６０１，８２１号を参照）。ＴａｑＭａｎ（商標）を使用する検出の場合、変異特異的領域に及ぶオリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーションに好適なプライマーとともに、増幅および検出のためのネステッドＰＣＲ産物のプライマー特異的部分において使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、蛍光レポーター基（Ｆ１）を一端に含有し、クエンチャー分子（Ｑ）を他端に含有し、これらは、インタクトなプローブ中、クエンチャー分子がレポーター基の蛍光をクエンチするのに十分な近さで互いに近接している。増幅中、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブおよび上流プライマーは、ネステッドＰＣＲ産物のそれらの相補領域にハイブリダイズする。ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性が、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光基を解放して、検出可能なシグナルを生成する（図５の工程Ｆ）。好ましい態様において、Ｔａｑｍａｎプローブは、蛍光レポーター基から約９塩基イン側に第二のクエンチャー基（ＺＥＮ）を含有し、プローブは、ＺＥＮ基が変異体塩基の位置にくる、またはそれに隣接するように設計されている。増幅反応中のｄＵＴＰの使用が、ｄＵを含有する産物を生成し、それを、その後、キャリーオーバー防止のために、ＵＤＧを使用して破壊することができる。
あるいはまた、図６の工程Ｃに示すように、ネステッドＰＣＲ産物は、５'プライマー特異的部分（Ａｉ）標的特異的配列と、ネステッドＰＣＲ産物のその後の増幅を許す３'プライマー特異的部分（Ｂｉ'－Ｃｉ'）とを含む。限定サイクルＰＣＲののち、ＵｎｉＴａｑ法を使用してネステッドＰＣＲ産物の検出を実施することができる。理由は、１つまたは複数のタグ特異的プライマーペア（各ペアが、マッチしたプライマーＦ１－Ｂｉ－Ｑ－ＡｉおよびＣｉを含む）がすべてウェル、マイクロポアまたはドロップレット中に存在するからである。ＰＣＲ増幅は、図６の工程Ｄに示すように、二本鎖産物の形成を生じさせる。この例においては、産物が一本鎖になるとき産物の下鎖がヘアピンを形成し得ないよう、ポリメラーゼブロッキング単位が、ポリメラーゼが第一のユニバーサルプライマーの５'部分（Ｂｉ）をコピーすることを阻止する。そのようなヘアピンの形成は、ステムの３'末端がアンプリコンにアニールして、この３'末端のポリメラーゼ伸長がＰＣＲ反応を終結させる結果をもたらすであろう。
二本鎖ＰＣＲ産物は変性され、その後、温度が低下すると、産物の上鎖が、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５'部分（Ｂｉ）と鎖の反対側端の部分Ｂｉ'との間にステムを有するヘアピンを形成する（図６の工程Ｆ）。また、この工程中、第二のオリゴヌクレオチドプライマーはヘアピン型産物の５'プライマー特異的部分（Ｃｉ'）にアニールする。工程Ｆで第二のユニバーサルプライマーが伸長すると、ポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性が検出可能なラベルＤ１またはクエンチャー分子をアンプリコンの５'末端から切断して、それにより、ラベルとクエンチャーとの間の距離を増し、ラベルの検出を可能にする。増幅反応中のｄＵＴＰの使用が、ｄＵを含有する産物を生成し、それを、その後、キャリーオーバー防止のために、ＵＤＧを使用して破壊することができる。
あるいはまた、図７に示すように、関心対象の領域を、遺伝子座特異的上流プライマーと、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ１およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図７の工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各ＰＣＲラウンド中、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。
次いで、図５および７の工程Ｃに示すように、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ａｉを含む）と、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ｃｉを含む）とを加えて、限定サイクルのネステッドＰＣＲを実行して、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する。任意で、野生型配列（またはその相補物）を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、元からメチル化（またはヒドロキシメチル化）状態にあるアレルの増幅を可能にするが、元から非メチル化状態にあるアレルの増幅は可能にしない。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、図２に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的領域に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図５および７の工程Ｄ～Ｆを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、産物を検出することができる。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素および１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーはさらに５'プライマー特異的部分を含む。処理済み試料と、プライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的である３'部分を有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分を有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
図８、９、１０、１５および１６は、本出願のこの局面の様々な態様を示す。
図８は、低レベルメチル化を検出するためのもう１つの例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、ＤＮＡ修復キットで処理する（図８の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図８の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。その後、関心対象の領域を、遺伝子座特異的上流プライマーと、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図８の工程Ｃ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各ＰＣＲラウンド中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。
限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマーならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマーを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取して、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する（図８の工程Ｄ）。ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化遺伝子座特異的プライマーならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを使用して（図８の工程Ｄ～Ｅを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有産物を増幅し、検出する。
図９および１０は、低レベルメチル化を検出するためのさらなる例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、ＤＮＡ修復キットで処理する（図９および１０の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図９の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、関心対象の領域を、遺伝子座特異的上流プライマーと、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図９の工程Ｃ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各ＰＣＲラウンド中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。
あるいはまた、図１０に示すように、関心対象の領域を、遺伝子座特異的上流プライマーと、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１０の工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的に重複するＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列への結合を求めて上流プライマーよりも優先的に競合し、したがって、各ＰＣＲラウンド中、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、５'プライマー特異的部分および３'標的特異的部分を含む遺伝子座特異的下流プライマーを加え、次いで、限定サイクルＰＣＲ（８～１２サイクル、図１０の工程Ｃ）を実施する。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。
図９および１０に示すプロトコルの場合、限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（Ａｉ）、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（Ｃｉ）ならびにマッチするプライマーＡｉおよびＣｉを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。これらのプライマーが組み合わさって、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する（図９および１０の工程Ｄ）。ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、元からメチル化またはヒドロキシメチル化状態にあるアレルの増幅を可能にするが、元から非メチル化状態にあるアレルの増幅は可能にしない。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、図５に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的領域に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図９の工程Ｅ～Ｇを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、産物を検出することができる。
あるいはまた、限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（Ａｉ）、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（Ｂｉ－Ｃｉ）ならびにマッチするＵｎｉＴａｑプライマーＦ１－Ｂｉ－Ｑ－ＡｉおよびＣｉを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。野生型配列（またはその相補物）を含む任意のブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが、元からメチル化状態にあるアレルの増幅を可能にするが、元から非メチル化状態にあるアレルの増幅は可能にしない。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図６に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
図１１および１２は、低レベルメチル化を検出するためのさらなる例示的なｅｘＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離したのち、（ｉ）メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）で処理して非メチル化ＤＮＡを完全に消化し、キャリーオーバーを防止する、または（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを捕捉し、富化したのち（ｉｉｉ）ＤＮＡ修復キットで処理する（図１１および１２の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図１１の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、関心対象の領域を、５'ユニバーサル１０～１５塩基テール配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的上流プライマーを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）または完全サイクルＰＣＲ（２０～４０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１１の工程Ｃ）。遺伝子座特異的上流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。下流プライマーは、プライマーダイマーを防ぐために同一のユニバーサルプライマーテールを含有する。さらに、そのようなテールは、ＰＣＲ工程中にユニバーサルプライマーを含む選択肢を提供する。これは、多重化ＰＣＲ反応中、より等しい量の産物を生成することを支援し得る。図１１の工程Ｄに示すように、増幅された産物はｄＵを含有し、それが、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素によるその後の処理を可能にする。
あるいはまた、図１２に示すように、関心対象の領域を、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡのための、５'ユニバーサル１０～１５塩基テール配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的上流プライマーを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１２の工程Ｂ）。遺伝子座特異的上流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーを加え、次いで、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスを使用して限定的（８～２０サイクル）または完全（２０～４０サイクル）ＰＣＲを実施する（図１２の工程Ｃ）。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図１２の工程Ｃ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。下流プライマーは、プライマーダイマーを防ぐために同一のユニバーサルプライマーテールを含有する。さらに、そのようなテールは、ＰＣＲ工程中にユニバーサルプライマーを含む選択肢を提供する。これは、多重化ＰＣＲ反応中、より等しい量の産物を生成することを支援し得る。図１２の工程Ｄに示すように、増幅された産物はｄＵを含有し、それが、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素によるその後の処理を可能にする。
図１１および１２の場合、テールを含有するメチル化特異的上流および遺伝子座特異的下流プローブ（Ａｉ、Ｃｉ'）が、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化塩基含有ＰＣＲ産物の存在下、ライゲーション産物の形成を可能にする。ライゲーションののち、図２に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにライゲーション接合部に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１１の工程Ｅ～Ｈを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
あるいはまた、テールを含有するメチル化特異的上流および遺伝子座特異的下流プローブ（Ａｉ、Ｂｉ'－Ｃｉ'）が、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基含有ＰＣＲ産物の存在下、ライゲーション産物の形成を可能にする。ライゲーションののち、ライゲーション産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図３に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
図１３および１４は、低レベルメチル化を検出するためのさらなる例示的なｅｘＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、（ｉ）メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）で処理して非メチル化ＤＮＡを完全に消化し、キャリーオーバーを防止する、または（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを捕捉し、富化したのち（ｉｉｉ）ＤＮＡ修復キットで処理する（図１３および１４の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図１３の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。
あるいはまた、図１４に示すように、関心対象の領域を、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡのための、５'ユニバーサル１０～１５塩基テール配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的上流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（または非メチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１４の工程Ｂ）。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。
図１３および１４の工程Ｃに示すように、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ａｉを含む）と、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ｃｉを含む）とを加えて、限定サイクルのネステッドＰＣＲを実行して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、図５に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的領域に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１３および１４の工程Ｄ～Ｆを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、産物を検出することができる。
あるいはまた、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ａｉを含む）と、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（５'プライマー特異的部分Ｂｉ－Ｃｉを含む）とを加えて、限定サイクルのネステッドＰＣＲを実行して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図６に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
図１５は、低レベルメチル化を検出するためのもう１つの例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、（ｉ）メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）で処理して非メチル化ＤＮＡを完全に消化し、キャリーオーバーを防止する、または（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを捕捉し、富化したのち（ｉｉｉ）ＤＮＡ修復キットで処理する（図１５の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡのための、５'ユニバーサル１０～１５塩基テール配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化標的塩基から１５塩基以上上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１５の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的上流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１５の工程Ｃ）。遺伝子座特異的上流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。
限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマーならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマーを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する（図１５の工程Ｄ）。図８に関して上述したように（図１５の工程Ｄ～Ｅを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有産物を増幅し、検出する。
図１６は、低レベルメチル化を検出するためのさらなる例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、（ｉ）メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）で処理して非メチル化ＤＮＡを完全に消化し、キャリーオーバーを防止する、または（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを捕捉し、富化したのち（ｉｉｉ）ＤＮＡ修復キットで処理する（図１６の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡのための、５'ユニバーサル１０～１５塩基テール配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的下流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化標的塩基から１５塩基以上上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１６の工程Ｂ）。遺伝子座特異的下流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、関心対象の領域を、５'ユニバーサルプライマー配列および３'標的特異的配列を含む遺伝子座特異的上流プライマーと、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１６の工程Ｃ）。遺伝子座特異的上流プライマーが１つまたは複数のメチル化部位をカバーするならば、野生型の非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。
図１６に示すプロトコルの場合、限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（Ａｉ）、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（Ｃｉ）ならびにマッチするプライマーＡｉおよびＣｉを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。これらのプライマーが組み合わさって、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化含有配列（試料中に存在するならば）を増幅する（図１６の工程Ｄ）。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、図５に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的領域に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１６の工程Ｅ～Ｇを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、産物を検出することができる。
あるいはまた、限定サイクルＰＣＲののち、ＰＣＲ産物を、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的プライマー（Ａｉ）、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的プライマー（Ｂｉ－Ｃｉ）ならびにマッチするＵｎｉＴａｑプライマーＦ１－Ｂｉ－Ｑ－ＡｉおよびＣｉを含有する別々のウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分取する。正しい標的に結合しているときのみ、プライマーはＲＮアーゼＨ２でブロック解除される。ＰＣＲののち、産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図６に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
本出願のもう１つの局面は、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を試料中で特定する方法に関する。方法は、他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階を含む。試料中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供して、処理済み試料を製造する。試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供し、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）５'プライマー特異的部分と、１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。処理済み試料と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成する。１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する。一次伸長産物を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。次いで、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドして、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する。方法はさらに、１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別して、試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定する段階を含む。
図１７は、本出願のこの局面の様々な態様を示す。
図１７は、低レベルメチル化を検出するためのさらなる例示的なｅｘＰＣＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡを単離し、任意で、（ｉ）メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）で処理して非メチル化ＤＮＡを完全に消化し、キャリーオーバーを防止する、または（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを捕捉し、富化したのち（ｉｉｉ）ＤＮＡ修復キットで処理する（図１７の工程Ａ）。ＤＮＡをＴＥＴ２で処理して５ｍＣおよび５ｈｍＣを５ｃａＣに変換したのち、ＡＰＯＢＥＣで処理して非メチル化ＣをｄＵに変換し、かつ５ｃａＣ（直前までは５ｍＣまたは５ｈｍＣ）をｄＵに変換しない。関心対象の領域を、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換された遺伝子座特異的下流プライマー（図１７の場合、Ｃｉ）と、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して選択的に伸長する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を下流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に好適である３'ＯＨ基を解放する（図１７の工程Ｂ）。この態様において、遺伝子座特異的下流プライマーは１つまたは複数のメチル化部位をカバーし、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。ＵＤＧを加えると、ＵＤＧが、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたＤＮＡを破壊する（ただし、プライマー伸長産物は破壊しない）。任意で、初期伸長工程の前に、試料を１２、２４、３６、４８または９６のウェルの中に分取する。その後、関心対象の領域を、５'プライマー特異的部分を含むＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化塩基特異的上流プライマー（Ａｉ）と、ｄＵＴＰを含まないデオキシヌクレオチドミックスとを使用して、限定サイクルＰＣＲ（８～２０サイクル）で選択的に増幅する。この態様においては、３'切断可能なブロッキング基（Ｂｌｋ ３'、例えばＣ３スペーサー）およびＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、もう１つの選択度の層を方法に組み込むこともできる。標的特異的ハイブリダイゼーションが起こると、ＲＮアーゼＨ（星印）がＲＮＡ塩基を除去して、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化（またはヒドロキシメチル化）標的塩基から数塩基上流にある、ポリメラーゼ伸長に好適な３'ＯＨ基を解放する（図１７の工程Ｃ）。メチル化塩基特異的上流プライマーは１つまたは複数のメチル化部位をカバーするため、ＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換された非メチル化配列に一致する配列を有するブロッキングプライマーを使用することにより、もう１つの特異度の層が加えられてもよい。
図１７の工程Ｄに示すように、限定サイクルＰＣＲ産物は、Ａｉタグ配列、メチル化特異的配列およびＣｉ'タグ配列を含み、Ｔａｑｍａｎ（商標）反応のためにウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分注される。ＰＣＲののち、図５に関して上述したように、マッチしたプライマーＡｉおよびＣｉのペアならびにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣで変換されたメチル化標的領域に及ぶＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１７の工程Ｄ～Ｆを参照）または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して、産物を検出することができる。
あるいはまた、限定サイクルＰＣＲ産物は、Ａｉタグ配列、メチル化特異的配列およびＢｉ'－Ｃｉ'タグ配列を含み、Ｔａｑｍａｎ（商標）反応のためにウェル、マイクロポアまたはドロップレットの中に分注される。ＰＣＲののち、産物を、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して増幅し、図６に関して上述したように、または当技術分野において公知の他の適当な手段を使用して検出する。
上記方法はさらに、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するための該ブレンドの前に、またはそれと同時並行的に、試料を少なくとも第一のメチル化感受性酵素と接触させて１つまたは複数の制限酵素反応混合物を形成する段階を含み得る。第一のメチル化感受性酵素は、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つまたは複数の非メチル化残基を含有する試料中の核酸分子を切断し、検出工程は、標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の検出を含み、親核酸分子は１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基をはじめから含有する。
本発明のこの局面およびすべての局面にしたがって、「メチル化感受性酵素」とは、その同族認認識配列がメチル化残基を含有するとき、核酸分子中のその同族認識配列を切断しない、またはその切断効率を低下させる（すなわち、その認識配列内のメチル化残基の存在に感受性である）エンドヌクレアーゼである。「メチル化感受性酵素認識配列」とは、メチル化感受性酵素のための同族認識配列である。いくつかの態様において、メチル化残基は、配列ＣｐＧ内の５－メチル－Ｃ（すなわち５－メチルＣｐＧ）である。本発明の方法における使用に好適であるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素の非限定的なリストは、非限定的に、ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｈａＩまたはそれらの任意の組み合わせを含む。
特定の態様においては、試料を、固定化されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸結合タンパク質または抗体と接触させて、試料中のメチル化またはヒドロキシメチル化核酸を選択的に結合させ、富化する。
１つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたときヌクレオチド配列ミスマッチを有しない、または１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときはポリメラーゼ伸長を妨害する１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する部分を含み得る。
特定の態様において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーおよび／または二次オリゴヌクレオチドプライマーの一方もしくは両方の二次オリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの３'末端がポリメラーゼ伸長には不適であるような、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含む３'部分を有し得る。この態様にしたがって、ハイブリダイゼーション処理中に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、該伸長処理の前に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの自由な３'ＯＨ末端を解放する。
本態様はまた、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列とは異なる配列を含む１つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。その違いは、解放された自由な３'ＯＨ末端から２または３ヌクレオチド塩基の位置にある。
切断可能なヌクレオチドは１つまたは複数のＲＮＡ塩基を含み得る。
本出願の方法はさらに、１つまたは複数のミスマッチ塩基を３'末端に含む、または１つまたは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を３'末端に含む、その３'末端が、野生型核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたときポリメラーゼ伸長には不適であるような１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階を含み得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーは、ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする野生型核酸配列またはその相補物配列中のヌクレオチド配列部分と同じであるヌクレオチド配列を有する部分を含むが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分への１つまたは複数のヌクレオチド配列ミスマッチを有する。ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション反応の前に、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを試料または試料からその後に製造される産物とブレンドし、それにより、ハイブリダイゼーション工程中、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーは野生型核酸配列またはその相補物配列に優先的に塩基特異的な形でハイブリダイズして、それにより、プライマーまたはプローブがＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズする反応中にポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する。
１つの態様において、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーは５'プライマー特異的部分を有し、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーは５'プライマー特異的部分を有する。１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットはさらに、第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第三の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｄ）第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第四の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。
もう１つの態様において、方法は、第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階、および１つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中にブレンドする段階を含む。
本明細書に記載される方法にしたがって、ＤＮＡ修復酵素は１０－１１転座（ＴＥＴ２）ジオキシゲナーゼであり得、ＤＮＡ脱アミノ化酵素はアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ）であり得る。
１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブセットの第二のオリゴヌクレオチドプローブはさらにＵｎｉＴａｑ検出部分を含み、それにより、５'プライマー特異的部分、標的特異的部分、ＵｎｉＴａｑ検出部分および３'プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成する。この態様にしたがって、方法はさらに、１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、検出プローブが、クエンチャー分子と、クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階を含む。１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加え、第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供する間、１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブをライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせ、伸長処理中にクエンチャー分子および検出可能なラベルは１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、検出は、切断された検出可能なラベルの検出を含む。
特定の態様において、１つの一次オリゴヌクレオチドプライマーまたは１つの二次オリゴヌクレオチドプライマーはさらにＵｎｉＴａｑ検出部分を含み、それにより、５'プライマー特異的部分、標的特異的部分、ＵｎｉＴａｑ検出部分および他方の５'プライマー特異的部分の相補物ならびにそれらの相補物を含む伸長産物配列を形成する。この態様にしたがって、方法は、１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、検出プローブが、クエンチャー分子と、クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階を含む。１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加え、第一のポリメラーゼ連鎖反応後のポリメラーゼ連鎖反応サイクル中、１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブをライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせ、伸長処理中にクエンチャー分子および検出可能なラベルは１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、検出は、切断された検出可能なラベルの検出を含む。
もう１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブセットの一方または両方のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたときヌクレオチド配列ミスマッチを有しない、または１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該オリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときはライゲーションを妨害する１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する部分を含む。
１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブセットの第一のオリゴヌクレオチドプローブの３'部分は、３'末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションには不適であるような、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含む。この態様にしたがって、プローブが一次伸長産物のその相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするとき第一のオリゴヌクレオチドプローブの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、ライゲーション工程の前に第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の３'ＯＨを解放する。
オリゴヌクレオチドプローブセットの１つまたは複数の第一のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列とは異なる配列を含み得る。違いは、解放された自由な３'ＯＨ末端から２または３ヌクレオチド塩基の位置にある。
もう１つの態様において、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、第一のオリゴヌクレオチドプローブの３'末端と重複する同一のヌクレオチドをその５'末端に有し、プローブセットの第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが一次伸長産物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置にハイブリダイズして接合部を形成すると、第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドプローブとの接合部にフラップを形成する。方法はさらに、第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドを、５'ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断して、それにより、ライゲーション工程の前に第二のオリゴヌクレオチドプローブの５'末端のリン酸基を解放する段階を含む。
１つの態様において、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットはさらに、標的特異的部分を有する第三のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブは、それらの間の接合部をもって互いに隣接して標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーションを可能にして、プローブセットの第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成するように構成されている。
本明細書に記載される方法に関し、試料は、非限定的に、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、セルフリー循環核酸、セルフリー循環腫瘍核酸、妊娠女性中のセルフリー循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料およびエクソソームであり得る。
１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化またはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を含む低存在量核酸分子であり得る。
本明細書中で使用される「低存在量核酸分子」とは、試料中に１％～０．０１％の低いレベルで存在する標的核酸分子を指す。換言するならば、１つまたは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、ゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化ヌクレオチド塩基を有する低存在量核酸分子が、低存在量核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するが、１つまたは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、ゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化ヌクレオチド塩基を有しない、試料中の１００～１０，０００倍過剰量の核酸分子（すなわち高存在量核酸分子）から識別されることができる。
本発明のいくつかの態様においては、１つまたは複数の低存在量標的ヌクレオチド配列のコピー数が、低存在量核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有する試料中の高存在量核酸分子のコピー数に対して定量化される。本発明の他の態様においては、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、試料中の他のヌクレオチド配列に対して定量化される。本発明の他の態様においては、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対コピー数が定量化される。相対および絶対（すなわちコピー数）定量化の方法は当技術分野において周知である。
検出される低存在量標的核酸分子は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、セルフリー循環核酸、セルフリー循環腫瘍核酸、妊娠女性中のセルフリー循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料およびエクソソームをはじめとする任意の生物学的試料中に存在することができる。
本発明の方法は、疾患状態を診断または予後予測する、および／または遺伝子型または疾患素因を識別するのに好適である。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカー、４８～７２のマーカー、７２～９６のマーカーまたは＞９６のマーカーを含むセット中にある、方法に関する。所与のセット中の各マーカーは、以下の基準：疾患状態を有すると診断された個体からの疾患細胞または組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；疾患状態を有しない個体からの正常な細胞または組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；疾患状態を有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；疾患状態を有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階を含む。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つまたは３つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つまたは５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つまたは６つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～７２のマーカーを含むマーカーセット中、最低６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、７２～９６のマーカーを含むマーカーセット中、最低７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、９６～「ｎ」（「ｎ」＞１６８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低８つ、９つ、１０、１１、１２、１３または「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、疾患状態を有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法に関する。複数のマーカーは、全部で４８～７２のがんマーカー、全部で７２～９６のがんマーカーまたは全部で≧９６のがんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／４超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、全部で４８～７２のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で７２～９６のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で９６～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１８のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法に関する。複数のマーカーは、３６～４８のグループ特異的がんマーカー、４８～６４のグループ特異的がんマーカーまたは≧６４のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／３超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～６４のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、６４～「ｎ」（「ｎ」＞６４）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんを含む消化器がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～１８のマーカー、１８～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカーまたは≧４８のマーカーを含むセット中にある、方法に関する。各マーカーは、消化器がんに関する以下の基準：消化器がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；消化器がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；消化器がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；消化器がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つまたは４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～１８のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つ、４つまたは５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、１８～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つまたは６つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、消化器がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、複数のマーカーが、全部で３６～４８のがんマーカー、全部で４８～６４のがんマーカーまたは全部で≧６４のがんマーカーを含むセット中にある、方法に関する。所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、全部で３６～４８のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で４８～６４のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で６４～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／１２のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、２４～３６のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが存在する、またはカットオフレベルよりも上であるならば、個体は、固形組織がんを有すると診断または予後予測される。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測して、治療を誘導し、モニタリングする方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、所与の組織特異的がんを有する個体は、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、その後の治療を誘導し、モニタリングするために、検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされた特定されたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされた特定されたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、治療プロトコル中、マーカーシグナルの損失をモニタリングするために、個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが依然として存在する、または依然としてカットオフレベルよりも上であるならば、該マーカーの継続的存在が、がん治療法を変更する決定を導き得る。
本出願のもう１つの局面は、個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの疾患状態再発を診断または予後予測する方法に関する。複数のマーカーは、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーする。所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択され；所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つまたは複数のメチル化残基を含む、および／または、存在する、またはカットオフレベルよりも上である、または＞１．６５のｚ値で存在するセット中のマーカーの少なくとも５０％が１つまたは複数のメチル化残基を含む。方法は、細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階を含む。生物学的試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される。試料を１つまたは複数の画分へと分画し、少なくとも１つの画分は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む。１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する。該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する。方法はさらに、複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階を含み、所与の組織特異的がんを有する個体は、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、再発をモニタリングするために、検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、マーカーシグナルのゲインをモニタリングするために、治療成功後の個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つまたは「ｎ」／８のマーカーが再出現する、またはカットオフレベルよりも上昇するならば、患者特異的マーカーセット中の再出現または上昇またはカットオフレベルを超える上昇が、がん治療法を再開する、または新たながん治療法へと変更する決定を導き得る。
特定の態様において、所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーは、その固形組織がんに関する以下の基準：所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、の任意の１つまたは複数を有することによって選択される。
特定の態様において、少なくとも２つの富化工程は、以下の工程：エクソソームもしくは細胞外小胞または他の保護された状態にあるマーカーを捕捉または分離する工程；血小板画分を捕捉または分離する工程；循環腫瘍細胞を捕捉または分離する工程；ＲＮＡ含有複合体を捕捉または分離する工程；ｃｆＤＮＡ－ヌクレオソームまたは差次的に修飾されたｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉または分離する工程；タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉または分離する工程；自己抗体を捕捉または分離する工程；サイトカインを捕捉または分離する工程；メチル化またはヒドロキシメチル化ｃｆＤＮＡを捕捉または分離する工程；磁気ビーズ上またはマイクロアレイ上、溶解状態の相補的捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによってマーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは増幅された相補物を捕捉または分離する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応および／またはライゲーション反応により、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エクソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカーまたはコピー数変動マーカーを一次関数的または指数関数的に増幅する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応および／またはライゲーション反応により、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列を含有する標的領域の増幅を抑制しながらも、変異マーカーまたはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されて変換されたＤＮＡメチル化マーカーを含有する１つまたは複数の標的領域を選択的に一次関数的または指数関数的に増幅する工程；酵素および配列依存的プロセスで３'－ＯＨ末端が解放された１つまたは複数のプライマーまたはプローブを優先的に伸長、ライゲーションまたは増幅する工程；標的特異的プライマーまたはプローブをＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズさせる該反応中、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する条件下、１つまたは複数のミスマッチ塩基を３'末端に含む、または１つまたは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を３'末端に含む１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程、の１つまたは複数を含む。
もう１つの態様において、複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイは、以下：定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）；逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴＰＣＲ）；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｑＰＣＲ法；デジタルＰＣＲ法（ｄＰＣＲ）；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｄＰＣＲ法；ライゲーション検出法；リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法；ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼ切断法；マイクロアレイハイブリダイゼーション法；ペプチドアレイ結合法；抗体アレイ法；質量分析法；液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）；毛管またはゲル電気泳動法；化学発光法；蛍光法；ＤＮＡ配列決定法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ＤＮＡ配列決定法；ＲＮＡ配列決定法；近接ライゲーション法；近接ＰＣＲ法；抗体－標的複合体を固定化することを含む方法；アプタマー－標的複合体を固定化することを含む方法；イムノアッセイ法；ウエスタンブロットアッセイを含む方法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法、の１つまたは複数を含む。
特定の実施形態では、複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質マーカーを検出および識別するための１つ以上のアッセイの１つ以上のカットオフレベルは、疾患由来の試料に対して正常個体由来の試料を比較する１つ以上のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較、または決定のうちの１つ以上を含む：マーカーのΔＣｔ値が２超であること、マーカーのΔＣｔ値が４超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が１．５超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が３超であること、マーカー濃度の比率が１．５超であること、マーカー濃度の比率が３超であること、列挙されたマーカー特異的シグナルが２０％超異なること、列挙されたマーカー特異的シグナルが５０％超異なること、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、もしくは９８％超であること、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、１．０３超、１．２８超、１．６５超、１．７５超、１．８８超、もしくは２．０５超のｚスコアを有すること。
本出願の別の態様は、細胞または組織の疾患状態を診断または予測する２ステップの方法に関し、個体の生体試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づく。本方法は、細胞または組織、および１つ以上の他の組織または細胞に由来する、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を含む生体試料を得ることを伴う。生体試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体液、体分泌物、体排泄物、およびそれらの分画からなる群から選択される。第１のステップは、全体的な感度が８０％超、全体的な特異性が９０％超、または全体的なＺスコアが１．２８超の生体試料に適用され、疾患状態と診断または予測される可能性がより高い個体を特定する。第２のステップは、次いで、全体的な特異性が９５％超、または全体的なＺスコアが１．６５超の第１のステップで特定されたこれらの個体由来の生体試料に適用され、疾患状態と個体を診断または予測する。本出願の方法を使用して、第１のステップおよび／または第２のステップを実施する。
蛍光標識
それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５の５つの蛍光シグナルを検出することができる機器を検討する。一例として、結腸がんの場合、Ｋ－ｒａｓ、ｐ５３、ＡＰＣ、およびＢＲＡＦについて、最も高い頻度の変異が見出されるとする。これらの４つの遺伝子における変異は、単一の蛍光シグナル（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）で検出することができる。スケールが１０００ＦＵである場合、これらの遺伝子の変異標的上でのＬＤＲ産物の増幅が、プラトーで約３００ＦＵが得られるように、標識および非標識ＵｎｉＴａｑプライマーの比を使用してプライマーを添加する。対照について、Ｆ５は、１：１，０００希釈の定量化対照に対して１００ＦＵのシグナル、さらに野生型対照上の変異型プローブのライゲーションに対して３００ＦＵを与えるように較正する（バックグラウンドシグナルがないか、または低くなるようにする必要がある）。
それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５の５つの蛍光シグナルを検出することができる機器を検討する。一例として、結腸がんの場合、Ｋ－ｒａｓ、ｐ５３、ＡＰＣ、およびＢＲＡＦについて、最も高い頻度の変異が見出されるとする。これらの４つの遺伝子における変異は、単一の蛍光シグナル（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）で検出することができる。スケールが１０００ＦＵである場合、これらの遺伝子の変異標的上でのＬＤＲ産物の増幅が、プラトーで約３００ＦＵが得られるように、標識および非標識ＵｎｉＴａｑプライマーの比を使用してプライマーを添加する。対照について、Ｆ５は、１：１，０００希釈の定量化対照に対して１００ＦＵのシグナル、さらに野生型対照上の変異型プローブのライゲーションに対して３００ＦＵを与えるように較正する（バックグラウンドシグナルがないか、または低くなるようにする必要がある）。
以下に示されるように、結腸がんにおいて一般的に変異している他の遺伝子（またはｐ５３遺伝子におけるより低い存在量の変異）については、以下のコーディングシステムを使用してもよい：同じＵｎｉＴａｑの５’末端に等モル量の２つの蛍光シグナルがあり、非標識プライマーで、両方の蛍光シグナルがプラトーで１００ＦＵになるように滴定されている。蛍光シグナルがＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４である場合、それは、単一の蛍光シグナルを使用して、４つの遺伝子の変異を検出する能力、および蛍光シグナルの組み合わせを使用して、６つの遺伝子の変異を検出する能力を与える：
上位の遺伝子における１つの変異と併せて、２つ目の変異があると仮定する。これは、上位の遺伝子が他の蛍光シグナルと重複しているかどうかにかかわらず、常により多くの独立したシグナルを与えるため、識別が容易である。例えば、蛍光シグナルが、Ｆ１で１００ＦＵ、Ｆ２で４００ＦＵである場合、それは遺伝子２および遺伝子５における変異に対応する。
一般的に変異がより少ない遺伝子（遺伝子５～遺伝子１０）から２つの変異がある場合、結果は、蛍光シグナルの重複として現れる（すなわち、Ｆ１で２００ＦＵ、Ｆ２で１００ＦＵ、Ｆ４で１００ＦＵ、または４つすべての蛍光シグナル）。蛍光シグナルが２：１：１の比率である場合、２つの変異はかなり簡単に分かる：上の例で、Ｆ１で２００ＦＵ、Ｆ２で１００ＦＵ、Ｆ４で１００ＦＵは、遺伝子５および遺伝子７の変異に対応するであろう。異なる色を多重化するための同様のアプローチは、Ｋａｒｔａｌｏｖグループによって記載されている（Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｐｅｒｃｏｌｏｒ Ｃｏｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ，”Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５（１６）：７６２９－３６（２０１３）、米国特許出願公開第２０１４／０２１３４７１Ａ１号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。
より最近では、臨床試料中の変異体またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化分子の数の正確な定量化を提供するために、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されている。一般に、液滴中での増幅は、少なくとも標的の単一分子が、その液滴中に存在していたことを意味する。したがって、初期標的の数を上回る十分な数の液滴を使用する場合、所与の液滴は、標的の単一の分子のみを有していたと仮定される。したがって、エンドポイントＰＣＲは、多くの場合、産物の数をモニタリングするために使用される。
それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５の５つの蛍光シグナルを検出することができる機器を検討する。結腸がんでしばしばメチル化されているいくつかの遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化を、最初の４つのチャネル（例えば、Ｆ１＝ＶＩＭ、Ｆ２＝ＳＥＰＴ９、Ｆ３＝ＣＬＩＰ４、およびＦ４＝ＧＳＧ１Ｌ）に対して使用することができる。最後のチャネルのＦ５は、所与の液滴が適切な試薬などを含んでいることを確実にするための対照として使用される。再び、蛍光シグナルの組み合わせを使用して、１０個の異なるプロモーター領域でのメチル化を同時に検出してもよい。
簡単には、ｄｄＰＣＲを使用して、ｅｘＰＣＲ－ｄｄＰＣＲを使用して４つのプロモーター領域における元のメチル化またはヒドロキシメチル化分子の数を正確に列挙する方法を検討する（例えば、図５～１０および１３～１７を参照）。また、このアプローチは、ＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲまたはｅｘＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲを使用しても機能する（図２、３、４、１１、および１２を参照されたい）。この例示のために、１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む単一のｄｄＰＣＲ反応において、４個のプロモーター領域で、合計４８のメチル化領域が検出される場合を検討する。ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、およびＧＳＧ１Ｌについて、それぞれ２、４、５、および１分子（複数可）のメチル化プロモーター領域を含む試料を検討する。ブロッキングプライマーを有する初期の片側プライマー伸長が５０％の効率を有すると仮定すると、２０サイクル後、ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、およびＧＳＧ１Ｌについて、それぞれ２０、４０、５０、および１０個のメチル化プロモーター領域の伸長産物が存在する。また、トップ鎖のブロッキングプライマーでは、再び、５０％の一般的な効率を仮定すると、１０サイクルのＰＣＲの後、５７（＝１．５の１０乗）×初期伸長産物の数＝１，１４０、２，２８０、２，８５０、および５７０コピーのメチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、およびＧＳＧ１ＬのＰＣＲ産物がそれぞれ存在する。次いで、かかる生成物を１２のｄｄＰＣＲ反応に希釈すると、平均で、所与のチャンバーは、メチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、およびＧＳＧ１ＬのＰＣＲ産物を、それぞれ９５、１９０、２３７、および４８コピーを含むことになる。これは、合計で約５７０個の分子であり、プライマーで増幅されるメチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、およびＧＳＧ１Ｌの総ＰＣＲ産物である。ｄｄＰＣＲが、１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む場合、平均で、２０個のうちの１個のみが実際にＰＣＲ反応を含み、所与の液滴が、リソースに対して互いに競合する２つのアンプリコンを有する可能性は、約４００個のうちの１個、すなわち、約２５個の液滴が２つのアンプリコンを含み、液滴の総数のわずか５％が、単一のアンプリコンのみを有する。２つの異なるアンプリコンの６つの組み合わせがあるため、平均で、２％未満の液滴が、２つのアンプリコンを含んでいるであろう。言い換えると、２色、３色、または４色を含む希少な液滴は、逆重畳する必要はなく、元の試料中の単一の分子から生じる約４８個の液滴と比較して、それらは、約４～６個の液滴を表すため、単純に無視することができる。２３７個の液滴から１９０個を識別すること（すなわち、所与のメチル化標的の４個または５個の分子から始まること）は、少し難しいかもしれないが、９５、１９０、および４８コピー（元の試料中の２、４、および１個の標的分子に対応する）を識別することは、比較的簡単なはずである。
単一のｄｄＰＣＲ反応において１０個のメチル化マーカーを同時に識別および列挙するために、１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む単一のｄｄＰＣＲ反応において、１０個のプロモーター領域で、合計５０個のメチル化またはヒドロキシメチル化領域が検出される場合を検討する。ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、ＧＳＧ１Ｌ、ＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＫＣＮＡ３、ＧＤＦ６、ＺＮＦ６７７、ＣＣＮＡ１、およびＳＴＫ３２Ｂについて、それぞれ２、４、５、１、０、１、３、２、０、および１分子（複数可）のメチル化プロモーター領域を含む試料を検討する。ブロッキングプライマーを有する初期の片側プライマー伸長が５０％の効率を有すると仮定すると、２０サイクル後、ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、ＧＳＧ１Ｌ、ＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＫＣＮＡ３、ＧＤＦ６、ＺＮＦ６７７、ＣＣＮＡ１、およびＳＴＫ３２Ｂについて、それぞれ２０、４０、５０、１０、０、１０、３０、２０、０、および１０個のメチル化プロモーター領域の伸長産物が存在する。また、トップ鎖のブロッキングプライマーでは、再び、５０％の一般的な効率を仮定すると、６サイクルのＰＣＲの後、１１（＝１．５の６乗）×初期伸長産物の数＝２２０、４４０、５５０、１１０、０、１１０、３３０、２２０、０、および１１０コピーのメチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、ＧＳＧ１Ｌ、ＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＫＣＮＡ３、ＧＤＦ６、ＺＮＦ６７７、ＣＣＮＡ１、およびＳＴＫ３２ＢのＰＣＲ産物がそれぞれ存在する。次いで、かかる生成物を５つのｄｄＰＣＲ反応に希釈すると、平均で、所与のチャンバーは、メチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、ＧＳＧ１Ｌ、ＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＫＣＮＡ３、ＧＤＦ６、ＺＮＦ６７７、ＣＣＮＡ１、およびＳＴＫ３２ＢのＰＣＲ産物を、それぞれ４４、８８、１１０、２２、０、２２、６６、４４、０、および２２コピーを含むことになる。これは、合計で約４１８個の分子であり、プライマーで増幅されるメチル化ＶＩＭ、ＳＥＰＴ９、ＣＬＩＰ４、ＧＳＧ１Ｌ、ＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＫＣＮＡ３、ＧＤＦ６、ＺＮＦ６７７、ＣＣＮＡ１、およびＳＴＫ３２Ｂの総ＰＣＲ産物である。ｄｄＰＣＲが、１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む場合、平均で、２５個のうちの１個のみが実際にＰＣＲ反応を含み、所与の液滴が、リソースに対して互いに競合する２つのアンプリコンを有する可能性は、約６２５個のうちの１個、すなわち、約１６個の液滴が２つのアンプリコンを含み、液滴の総数のわずか４％が、単一のアンプリコンのみを有する。２つの異なるアンプリコンの４５の組み合わせがあるため、平均で、０．１％未満の液滴が、所与の２つのアンプリコンを含んでいるであろう。言い換えると、２色、または３色、または４色を含む希少な液滴は、逆重畳する必要はなく、元の試料中の単一の分子から生じる約２２個の液滴と比較して、それらは、１個または２個の液滴を表すため、単純に無視することができる。１１０個の液滴から８８個を識別すること（すなわち、所与のメチル化またはヒドロキシメチル化標的の４個または５個の分子から始まること）は、少し難しいかもしれないが、４４、８８、および２２コピー（元の試料中の２、４、および１個の標的分子に対応する）を識別することは、比較的簡単なはずである。
上記のアプローチはまた、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ標的分子を正確に列挙するためにも機能するであろう。試料を、その後のｄｄＰＣＲ列挙のために直接使用する。単一のｄｄＰＣＲ反応において１０個のｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡマーカーを同時に識別および列挙するために、１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む単一のｄｄＰＣＲ反応において、合計５０個のｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ領域が検出される場合を検討する。再び、蛍光シグナルの組み合わせを使用して、１０個のｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡマーカーを同時に検出してもよい。
２、４、１５、１、０、１０、３、２０、０、および１個の分子（複数可）のｍＲＮＡ１～４およびｎｃＲＮＡ５～１０をそれぞれ含む試料を検討する。６サイクルのＲＴ－ＰＣＲで、６４ｃＤＮＡコピーの各転写産物が生成される（＝１２８、２５６、９６０、６４、０、６４０、１９２、１２８０、０、および６４コピーのｍＲＮＡ１～４およびｎｃＲＮＡ５～１０が生成される）。次いで、かかる生成物を５つのｄｄＰＣＲ反応に希釈すると、平均で、所与のチャンバーは、ｍＲＮＡ１～４およびｎｃＲＮＡ５～１０のＰＣＲ産物を、それぞれ２５、５１、１９２、１３、０、１２８、２８、２５６、０、および１３コピーを含むことになる。これは、合計で約７０６個の分子であり、プライマーで増幅されるメチル化ｍＲＮＡ１～４およびｎｃＲＮＡ５～１０の総ＰＣＲ産物である。ｄｄＰＣＲが１０，０００個の液滴、またはマイクロポア、またはマイクロウェルを含む場合、平均で、１４個のうちの１個のみが実際にＰＣＲ反応を含むことになる。この実施例における最も一般的な２つのＲＮＡ（ｍＲＮＡ３およびｎｃＲＮＡ５）は、平均で、５２個のうちの１個および３９個のうちの１個に存在し、したがって、所与の液滴が、リソースに対して互いに競合するこれらの２つのアンプリコンを有する可能性は、約２０２８個のうちの１個、すなわち、約５個の液滴が２つのアンプリコンを含み、増幅後の単一の分子の場合（１３個のコピーを生成する）よりも依然として少ない。言い換えると、２色、３色、または４色を含む希少な液滴は、逆重畳する必要はなく、元の試料中の単一の分子から生じる少なくとも１３個の液滴と比較して、それらは、約１～５個の液滴を表すため、単純に無視することができる。前に説明したように、一部のＲＮＡ分子がより多量に存在する場合でも、異なるレベルのＦＵで異なる色のプローブの同じアプローチを使用して、所与の液滴中の２つのアンプリコンから生じる複数のシグナルを逆重畳することができる（すなわち、単一色の産物では、３００ＦＵ、２色を使用する産物では、それぞれ１００ＦＵ）。
本出願の別の態様は、血液試料内のマーカーを分析する場合、最も早い段階でがんを識別する能力に関する。身体には、平均で約６リットル（６，０００ｍｌ）の血液が含まれている。すると、１０ｍＬの試料は、試料の６００分の１を含む。いくつかのがん（すなわち、肺がん、黒色腫）は、高い変異負荷を有するが、他のがん（すなわち、乳がん、卵巣がん）は、ほとんど変異を有さず、最も早い段階ではさらに少ない。対照的に、プロモーター領域（すなわち、メチル化マーカー）におけるメチル化変化は、初期事象であるように見える。以下の計算の目的のために、マーカーが試料中に存在する場合、マーカーを特定するために使用されている技術とは無関係に、単一分子レベルまで検出することができると仮定する。
実用的なレベルでは、異なるがんは、異なる変異マーカーについて異なる頻度を有する。例えば、遺伝子Ｋ－ｒａｓの変異率は、大腸がんおよび膵臓がんで、それぞれ約３０％および９０％超である。ｐ５３は、すべてのがんの約５０％で変異して見出されるが、より頻繁に、そうした変異は、後期腫瘍で現れる。ベンチマークとして、所与のがんは、その最も早い段階で、少なくとも１つの検出可能な変異を生成する。ある時点で、患者の血漿中に２００個の変異分子が循環していると仮定する。全体積を考慮すると、１０ｍＬの試料を採取した場合、試料が少なくとも１個の変異分子を含む可能性は約１／３である。より正確な予測は、ポアソン分布に基づくであろう。２００個の対象物（ｏｂｊｅｃｔ）（すなわち、変異した分子）が、６００ビンに分配された場合（すなわち、患者の全血液量を表す１０ｍｌの６００アリコート）、ポアソンの計算は、ウェルの７２％には０個の対象物があり、２３．７％には１個の対象物があり、３．９％には２個の対象物があり、０．４％には３個の対象物があることになる。言い換えると、２８．１％のアリコートは、少なくとも１つの変異分子を有するであろう。アッセイがすべての単一の変異分子を検出することができる場合、その感度は、２８．１％になる。同様に、３００個の対象物（すなわち、変異分子）が、６００ビン（すなわち、１０ｍｌの６００アリコート）に分配された場合、ウェルの６１％には０個の対象物があり、３０．３％には１個の対象物があり、７．６％には２個の対象物があり、１．３％には３個の対象物があることになる。言い換えると、３９．４％のアリコートは、少なくとも１つの変異分子を有するであろう。アッセイがすべての単一の変異分子を検出することができる場合、その感度は、３９．４％になる。同様に、４００個の対象物（すなわち、変異分子）が、６００ビン（すなわち、１０ｍｌの６００アリコート）に分配された場合、ウェルの５１％には０個の対象物があり、３４．３％には１個の対象物があり、１１．５％には２個の対象物があり、２．５％には３個の対象物があることになる。言い換えると、４９％のアリコートは、少なくとも１つの変異分子を有するであろう。アッセイがすべての単一の変異分子を検出する場合、その感度は、４９％になる。同様に、６００個の対象物（すなわち、変異分子）が、６００ビンに分配された場合（すなわち、１０ｍｌの６００アリコート）、ポアソンの計算は、ウェルの３６．８％には０個の対象物があり、３６．８％には１個の対象物があり、１８．３％には２個の対象物があり、６．１％には３個の対象物があることになる。言い換えると、６３．２％のアリコートは、少なくとも１つの変異分子を有するであろう。アッセイがすべての単一の変異分子を検出する場合、その感度は、６３．２％となる。それにもかかわらず、実用的なレベルでは、検出可能なマーカー負荷が６００分子のように高くても、アッセイは、その種類の腫瘍について、早期がんの３６．８％を依然として見逃すであろう。最近の文献の結果は、何が「早期がん」を構成しているのかについて議論しており、一部のグループは、ステージＩおよびＩＩが早期がんであると主張し、他のグループは、ステージＩ、ＩＩ、およびＩＩＩが早期がんであると主張しており、定義と種類の両方が異なり、しかし、一般的に、形態変異をスコアリングするとき、その結果は、約２０％～約７０％の範囲の感度を報告しており、これは、早期がんの３０％～８０％を見落としていることを意味する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ｔｙｐｅｓ：Ｔｈｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＣＣＧＡ）Ｓｔｕｄｙ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３６（１５）：１２０２１－１２０２１（２０１８）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ｒｅｆｌｅｃｔ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＣＣＧＡ）Ｓｔｕｄｙ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３６（１５）：５３６－５３６（２０１８）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。
上記の計算は、患者を陽性と判断するのに、単一の変異を検出するだけで十分であるという仮定に基づいて行われたものである。転移性疾患を有する患者由来の血液中の変異を特定した初期の研究では、患者だけでなく、年齢適合対照においても平均５つの変異が明らかになった（Ｒａｚａｖｉ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ Ｔｅｓｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５（１５）：１１５２６－１１５２６（２０１７）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。この現象は、クローン性造血として知られ、白血球で変異が蓄積し、次いで、クローン増殖を起こすことに起因する。そのような変異の存在が説明されると（同じ個体由来のＷＢＣ ＤＮＡのアリコートを配列決定することによって）、これらの検査の精度または特異性が９８％に設定された。変異負荷が低い卵巣がんのようながんの場合、その初期段階で、推定６０％の疾患が見逃される。これらの数値を概観すると、２０１８年に、米国では２０，２４０例の卵巣がんの新規症例があった。したがって、約５５００万人の女性（５０歳以上）が、この疾患の検査を受ける必要がある。かかる検査は、卵巣がんを有する８，０９６人の女性を特定する。しかし、偽陽性者は、約１１０万人になる。かかる検査の陽性予測値は、０．７４％程度であろう。言い換えると、検査で陽性であった１３６人の女性のうち１人だけが実際に卵巣がんを有し、残りは偽陽性であろう。
本出願の複数マーカー検査の場合、全体的なスクリーニング結果が陽性と見なされるためには、２つ以上のマーカーが陽性と見なされる必要がある。使用される個々のマーカーの総数、およびスクリーニング検査全体を陽性と判定するために必要なマーカーの数を増やすことで、早期がんを発見するための感度および特異性の両方を改善することができる。全体的な早期がん発見の感度は、血液中の各マーカーの平均数、陽性マーカーの平均数、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数、およびスコアリングされたマーカーの総数の関数である。例えば、検査が１２個のメチル化マーカーを使用する場合、そのがんの種類について、平均で腫瘍の５０％超においてメチル化（またはヒドロキシメチル化）され、次いで、所与の試料について、平均で約６個のマーカーがメチル化されている。各マーカーについて、血液中に平均で６００個のメチル化分子が存在する場合、すると、平均で合計６００×６００＝３，６００個の対象物（すなわち、メチル化分子）が６００ビンに分配されている（すなわち、１０ｍｌの６００アリコート）。ポアソン計算に基づく近似計算として、分布は次のようになる：ウェルの０．２％には０個の対象物があり、１．５％には１個の対象物があり、４．５％には２個の対象物があり、８．９％には３個の対象物があり、１３．３％には４個の対象物があり、１６．０％には５個の対象物があり、１６．０％には６個の対象物があり、１３．８％には７個の対象物があり、１０．３％には８個の対象物があることになる。少なくとも２個のマーカーが陽性と判定される必要があるとする。この場合、０個または１個の対象物（すなわち、メチル化マーカー）のいずれかを有するアリコートの１．７％（＝０．２％＋１．５％）は、陰性と判定される。したがって、試料を陽性と判定するために少なくとも２個のマーカーが必要な場合、アッセイの感度は、１００％－１．７％＝９８．３％となる。少なくとも３個のマーカーが陽性と判定される必要があるとする。この場合、０個、１個、または２個の対象物（すなわち、メチル化マーカー）のいずれかを有するアリコートは、陰性（０．２％＋１．５％＋４．５％＝６．２％）と判定される。したがって、試料を陽性と判定するために少なくとも２個のマーカーが必要な場合、アッセイの感度は、１００％－６．２％＝９３．８％となる。３個のマーカーが陽性であるごく一部のアリコートは、２分子の１個マーカー、および１分子の第２のマーカーを含み、したがって、少なくとも３つの異なるマーカーが陽性ではないことが理解されるが、それにもかかわらず、これは、上記の近似計算からのわずかなずれである。
全体的な早期がん発見の特異性は、陽性マーカーの平均数、各個々のマーカーの偽陽性率、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数、およびスコアリングされたマーカーの総数の関数である。全体的な偽陽性率を推定するために、異なる色の靴下をいくつかの引き出しにビン分割する確率に基づいて、式を使用する。各マーカーの偽陽性の割合「％ＦＰ」、マーカーの総数「ｍ」、および試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数「ｎ」を検討する。次いで、全体的な偽陽性を計算するための式は、次のようになる：（％ＦＰ）ｎ×［ｍ！／（ｍ－ｎ）！ｎ！］。各マーカーの偽陽性の割合「％ＦＰ」が４％であり、マーカーの総数「ｍ」が１２であり、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数「ｎ」が３であると仮定する。すると、全体的な偽陽性の上記の式は、（４％）３×［１２！／９！３！］＝（４％）３×［１２×１１×１０／６］＝１．４％となる。したがって、全体的な特異性は、［１００％－１．４％］＝９８．６％となる。実際の個々の偽陽性率は、異なるマーカーによって異なる場合がある。さらに、偽陽性シグナルのソースに依存し得る。例えば、加齢関連メチル化がクローン性造血による場合、すなわち、白血球でメチル化が蓄積し、次いで、クローン増殖を起こすことに起因する。この種類の偽陽性は、同じ患者由来の白血球のメチル化変化についてもスコアリングすることによって軽減され得る。一方、偽陽性シグナルの供給源が、組織炎症による血漿中へのＤＮＡの放出、または例えば、重量挙げからの筋肉組織の破壊に起因する場合、そのシグナルを軽減するには、身体が安静であるとき、または炎症が治まった１ヶ月後の別の時点で血液をサンプリングする必要があり得る。
図１８、１９、および２０は、それぞれ、２４、３６、および４８個のマーカーについて計算された全体的な感度および特異性の結果を示す。これらのグラフは、個々のマーカーの平均感度が５０％であり、個々のマーカーの平均偽陽性率が２％～５％であるという仮定に基づいている。感度曲線は、各マーカーの血液中の分子の平均数の関数として全体的な感度を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を提供する。特異性曲線は、個々のマーカーの偽陽性率の関数として全体的な特異性を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を再び提供する。１２、２４、３６、４８、７２、および９６個のマーカーの全体的な感度および特異性の計算値を、それぞれ以下の表に提供する。
（表１）
（表２）
（表３）
（表４）
（表５）
（表６）
（表７）
（表８）
（表９）
（表１０）
（表１１）
（表１２）
上の表から、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、感度を１－特異性に対してプロットすることによって計算され得る。これらは理論的な計算であるため、２％、３％、４％、および５％の異なるレベルの平均マーカー偽陽性率について曲線を生成した。グラフの視覚化およびＡＵＣ（曲線下面積）の計算を支援するため、端値をそれぞれ１００％および０％に設定した。ＲＯＣ曲線を、２４個のマーカー（平均マーカー偽陽性が３％および４％）、３６個のマーカー（平均マーカー偽陽性が３％および４％）、ならびに４８個のマーカー（平均マーカー偽陽性が２％、３％、４％、および５％）について、それぞれ以下の表１３、ならびに図２１および２２（４８個のマーカーについて示される）に提供する。概して、ＡＵＣが１に近いほど、検査の精度が高くなり、９５％超の値が望ましく、９９％超の値は優れている。早期がん（ステージＩおよびＩＩ）の血液中の平均３００分子のベンチマークを使用して、ＡＵＣ値は、２４個のマーカーで９５％であり、３６個のマーカーで９９％に改善し、平均マーカー偽陽性値に応じて、４８個のマーカーで９８％～９９％超の範囲である。これらのグラフは、良好な感度および特異性を達成するための複数のマーカーアッセイの能力の例示を提供する。
（表１３）
１ステップがんアッセイで、上記のマーカーは、どのように機能であろうか？早期がん発見のスクリーニングの開発の課題を説明するために、米国で５０歳以上の成人１億７００万人を大腸がんについてスクリーニングする（そのうち、年間約１３５，０００例が新規症例として診断されている）という課題を検討する。この例では、早期がんについて血液中に平均３００個の分子が存在し（ステージＩおよびＩＩ）、個々のマーカーのＦＰ率が２％であるベストケースシナリオを取り、次いで、少なくとも３個のマーカーがあるとした場合、２４個のマーカーについては、全体的なＦＰ率が１．６％、特異性が９８．４％である（図１８Ｂを参照）。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、６．２％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は９３．８％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９３．８％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１２６，６３０人になるであろう。９８．４％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、１．６％×１０７，０００，０００＝１，７１２，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は１２６，６３０／（１２６，６３０＋１，７１２，０００）＝約６．８％であり、言い換えると、検査で陽性であった１４人のうち１人だけが、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。
しかしながら、個々のマーカーのＦＰ率が、例えば４％など、より現実的である場合、すると、９８％よりも優れた特異性を達成するには、より多くのマーカーが必要になり、これによって、感度が犠牲になる。個々のマーカーのＦＰ率が４％である場合、さらに、少なくとも５個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全体的なＦＰ率は０．４％であり、特異性は９９．６％である（図１８Ｂを参照）。５個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、２８．５％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は７１．５％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の７１．５％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）９０，５４０人になるであろう。９９．６％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．４％×１０７，０００，０００＝４２８，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は９０，５４０／（９０，５４０＋４２８，０００）＝約１７．５％であり、言い換えると、検査で陽性であった５．７人のうち１人だけが、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。１７．５％のＰＰＶはかなり立派であるが、早期がんの２８．５％を見落とすという犠牲を払って達成されるだろう。
上述のとおり、本出願の別の態様は、細胞または組織の疾患状態を診断または予測する２ステップの方法に関し、個体の生体試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づく。本方法は、細胞または組織、および１つ以上の他の組織または細胞に由来する、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を含む生体試料を得ることを伴う。生体試料は、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体液、体分泌物、体排泄物、およびそれらの分画からなる群から選択される。第１のステップは、全体的な感度が８０％超、全体的な特異性が９０％超、または全体的なＺスコアが１．２８超の生体試料に適用され、疾患状態と診断または予測される可能性がより高い個体を特定する。次いで、第２のステップは、全体的な特異性が９５％超、または全体的なＺスコアが１．６５超の第１のステップで特定されたこれらの個体由来の生体試料に適用され、疾患状態と個体を診断または予測する。本出願の方法を使用して、第１のステップおよび第２のステップを実施する。
本出願の方法を使用して、第１のステップおよび第２のステップを実施する。第１のステップは、多くのがんをカバーするためにマーカーを使用する。その目的は、血液中のマーカー分子の数が制限され得る早期がんに対して高い感度を得ることである。次いで、第２のステップは、追加のマーカーについてスコアリングして、初期結果が真陽性であることを検証するとともに、可能性のある原発組織を特定する。第２のステップは、本明細書に記載の方法、および／または次世代配列決定などの追加の方法を含んでいてもよい。
かかる２ステップのがん検査がどのように設計され得るかについての一実施形態を例示するために、再び、早期大腸がんを有する患者を特定する課題を検討する。２０１７年、米国では、推定９５，５２０例の結腸がん、および３９，９１０例の直腸がんの新規症例が診断されており、合計で約１３５，０００例の新規症例があった。２４個のマーカーを使用した初期検査を検討する。この例では、早期がんについて血液中に平均３００個の分子が存在する場合（ステージＩ＆ＩＩ）、およびそれが少なくとも１つの変異をカバーする場合、次世代配列決定によってかかるがんを特定する感度は、３９．４％になる（図１８Ａを参照）。個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、少なくとも３個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全体的なＦＰ率は５．４％であり、特異性は９４．６％である（図１８Ｂを参照）。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、６．２％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は９３．８％になる（図１８Ａを参照）。これらの感度と特異性のレベルは、市場の現在の検査よりも優れていることに留意されたい。しかし、個々のマーカーのＦＰ率が５％である場合、さらに、少なくとも４個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全体的なＦＰ率は６．６％であり、特異性は９３．４％である（図１８Ｂを参照）。４個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、１５．１％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、感度は８４．９％になる（図１８Ａを参照）。これらのグラフは、ほとんどの診断検査の基本的な競合を示している。検査の感度を改善する（つまり、偽陰性が少ない）が、検査の特異性を犠牲にする（つまり、偽陽性がより多い）、または検査の特異性を改善する（偽陽性が少ない）が、検査の感度を失うリスクがある（つまり、偽陰性がより多い）。
２ステップのがん検査を使用することによって、感度および特異性の両方を改善するようにパラメータを調整することができる。例えば、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）対して３個のマーカーを使用した前述の２４個のマーカー検査は、全体的な感度が９３．８％である。第１のステップ（ＧＩがんに特異的な２４マーカー）で陽性としてスコアリングされた試料（偽陽性を含む）は、大腸がんのカバレッジを提供するために、４８個のマーカーの拡張パネルを用いて第２のステップで再検査される。個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、少なくとも５個のマーカーがある場合、すると、４８個のマーカーの全体的なＦＰ率は４．２％であり、特異性は９５．８％である（図２０Ｂを参照）。５個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、０．７％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、感度は９９．３％になる（図２０Ａを参照）。技術的には、試料は、第１のステップですでに選別されているため、全体的な感度は、９３．８％×９９．３％＝９３．１％である。個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、少なくとも６個のマーカーがある場合、すると、４８個のマーカーの全体的なＦＰ率は、１％未満であり、特異性は９９．１％である（図１８Ｂを参照）。６個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、１．９％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩ＆ＩＩのがんに対して、感度は９８．１％になる（図２０Ａを参照）。試料は、第１のステップですでに選別されているため、全体的な感度は、９３．８％×９８．１％＝９２．０％である。個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、７マーカーの最小値がある場合、４８個のマーカーの全体的なＦＰ率は、９９．８％の特異性について、０．２％未満である（図２０Ｂを参照）。７個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、検査は、４．４％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩ＆ＩＩのがんに対して、感度は９５．６％になる（図２０Ａを参照）。試料は、第１のステップですでに選別されているため、全体的な感度は９３．８％×９５．６％＝８９．７％である。
大腸がんの例、特に、変異負荷が低いマイクロサテライト安定性腫瘍（ＭＳＳ）の例に戻ると、これらの計算が、ＮＧＳ配列決定のみに依存する場合（血液中に１つの変異を有する３００分子を仮定する）、推定６０％の早期大腸がんが見逃されることになる。再び、これらの数字を概観すると、米国では、２０１８年に、約１３５，０００例の大腸がんの新規症例が予測されている。米国では５０歳以上の約１億７００万人が大腸がんの検査を受けるべきである。血液中に１つの変異を有する少なくとも３００個の分子を含むこれらの試料を仮定すると、かかる検査は、（１３５，０００例の新規症例のうち）大腸がんを有する５４，０００人の男女を発見するであろう。しかしながら、特異性が９８％の配列決定では、約２１０万の偽陽性が存在することになる。かかる検査の陽性予測値は、約２．６％であり、言い換えると、検査で陽性であった３９人のうち１人だけが、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。対照的に、上に記載の２ステップのメチル化マーカー検査を検討し、ここで、第１のステップが、ＧＩがんに特異的な２４個のメチル化マーカーを有し、第２のステップが、大腸がんに特異的な４８個のメチル化マーカーを有する。この例では、上述のように、血液中の陽性マーカーあたり平均３００個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して、計算が行われる。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、少なくとも３個の陽性マーカーを必要とし、さらに、全体的な特異性が９４．６％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳以上の全成人１０７，０００，０００人のうち）５，７７８，０００人の個体を特定するであろう。これは、９３．８％の感度で、ステージＩ＆ＩＩの大腸がんを有する（合計１３５，０００人のうち）約１２６，６３０人の個体を含むことになる。しかし、これらの５，７７８，０００人の推定陽性者は、少なくとも６個の陽性マーカーを必要とする４８個のマーカーの第２のステップで評価され、次いで、２ステップ検査で、大腸がんを有する（１３５，０００例の新規症例のうち）９８．１％×９３．８％＝９２．０％＝１２４，２００人の個体が特定されるであろう。９９．１％の特異性では、２回目の検査は、５，７７８，０００×０．９％＝５２，０００の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、１２４，２００／１７６，２００＝７０．５％である。言い換えると、検査で陽性であった３人のうち２人が実際に大腸がんを有すであろう。これは、フォローアップの結腸内視鏡検査で最も恩恵を受ける患者に焦点を当てた非常に成功したスクリーニングである。救われる人命における恩恵は、計り知れない価値があるだろう。
前述の議論は、平均感度が５０％、および個々のマーカーの偽陽性が２％～５％の範囲のメチル化マーカーに焦点を当ててきたが、異なる感度および特異性を有するがんの他のマーカーが多数存在する。一般に、タンパク質マーカー（ＰＳＡおよびＰＳＭＡを除く）は、偽陽性が非常に高く、非常に低い陽性予測値をもたらすため、早期がんの発見に対する臨床的有用性が限られていた。体液（すなわち、血漿、尿）由来のがんマーカーとしては、血漿マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｃｆＤＮＡにおける変異もしくはメチル化、表面がん特異的タンパク質マーカーもしくは内部にｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡを有するエクソソーム、循環サイトカイン、循環タンパク質、もしくはがん抗原に対する循環抗体、または全血中の核酸マーカーが挙げられるが、これらに限定されない（概説は、Ｎｉｋｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｐｒｏｃｔｏｌｏｇｙ（２０１８）を参照されたい。その全体が、参照により本明細書に援用される）。大腸がん（または他の）がんを有する患者の血清または血漿中のがん特異的ｍｉＲＮＡを検出するためのいくつかの方法が報告されている。これらのｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１２９０、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－３２０ａ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉｒ２３ａ、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－１２２９、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－６１２、ｍｉＲ－１２９６、ｍｉＲ－９３３、ｍｉＲ－９３７、ｍｉＲ－１２０７、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－２２４－３ｐ、ｍｉＲ－５７６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２０３が挙げられるが、これらに限定されない（Ｉｍａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１２９０ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７（１０）：１８７９－１８８６（２０１６）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：ａｎ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ Ｄａｔａ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｐｒｅｖ．２３（１２）：２７８３－２７９２（２０１６）、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｌａｓｍａ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２４，ＭｉｃｒｏＲＮＡ－３２０ａ，ａｎｄ Ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ－４２３－５ｐ ａｒｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３４：８６（２０１５）、Ｔｏｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．ｐｉｉ：Ｓ０３０４－４１９Ｘ（１８）３００６７－２（２０１８）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｔｃｈｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２２５３－０１７－０３０８－１（２０１７）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ：ａ Ｐｉｌｏｔ Ｓｔｕｄｙ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．２２（１）：５１（２０１７）、Ｇｅｔｔｓらの米国特許第９，６８９，０３６号、Ｄｕｔｔａｇｕｐｔａらの米国特許第９，７０８，６４３号、Ｇｏｅｌらの米国特許第９，８６８，９９２号、Ｓｏｚｚｉらの米国特許第９，９２６，６０３号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。低存在量のｍｉＲＮＡを検出するためのさらなるアプローチは、ＷＯ２０１６０５７８３２Ａ２に記載されており（その全体が、参照により本明細書に援用される）、または当該技術分野で既知の他の好適な手段が使用される。図３９は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中の他の保護された状態に存在し得るＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して導出された、血液ベースの結腸がん特異的マイクロＲＮＡマーカーのリストを提供する。
大腸がん（および他の）がんを有する患者の血清、血漿、またはエクソソーム中のがん特異的ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡを検出するためのいくつかの方法が報告されている。これらのｎｃＲＮＡとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＮＥＡＴ＿ｖ１、ＮＥＡＴ＿ｖ２、ＣＣＡＴ１、ＨＯＴＡＩＲ、ＣＲＮＤＥ－ｈ、Ｈ１９、ＭＡＬＡＴ１、９１Ｈ、ＧＡＳ５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅａｒ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ １ ａｓ ａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ １４：１９１（２０１５）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＣＣＡＴ１ ａｎｄ ＨＯＴＡＩＲ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ ａｓ ａｎ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８（１１）：１４１３１－４０（２０１５）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍａｌ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＣＲＮＤＥ－ｈ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｒｕｍ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（５１）：８５５５１－８５５６３（２０１６）、Ｓｌａｂｙ Ｏ，“Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．９３７：１５３－７０（２０１６）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｌｎｃＲＮＡ ９１Ｈ ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｐｏｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＨＮＲＮＰＫ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ．２３；１８：１１（２０１８）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＧＡＳ５ ａｎｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２２１ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｖａｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．２２（２）：２８３－２９９（２０１８）、Ｈｏｏｎらの米国特許第９，４１０，２０６号、Ｋａｌｌｕｒｉらの米国特許第９，９２１，２２３号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。低存在量のｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、転座、スプライスバリアント、代替的転写産物、代替的開始部位、代替的コード配列、代替的非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、およびイントロン挿入を検出するためのさらなるアプローチは、ＷＯ２０１６０５７８３２Ａ２に記載されており（その全体が、参照により本明細書に援用される）、または当該技術分野で既知の他の適切な手段が使用される。図２４は、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのトランスクリプトームデータセットを生成するためにＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに整列させた、様々な公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｏｎ ＳＴ ＣＥＬデータの解析を通して導出された、血液ベースの結腸がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーのリストを提供する。これらのデータセット（様々ながんの種類、ならびに正常組織、および末梢血）にわたって比較解析を行い、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーリストを生成した。かかるｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、エクソソームまたは血液中の他の保護された状態で濃縮され得る。加えて、図４１は、血液中のエクソソーム、腫瘍関連小胞、または他の保護された状態で濃縮され得る血液ベースの結腸がん特異的エキソン転写産物のリストを提供する。
大腸がんの最も一般的なタンパク質マーカーは、便中の血液からヘモグロビンを検出することに基づいており、ＦＯＢＴ検査またはＦＩＴ検査として知られている。これらの検査に対する感度および特異性（感度：特異性）は、次のように報告されている：Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ製のＯＣ－Ｌｉｇｈｔ ｉＦＯＢ検査（ＯＣ Ｌｉｇｈｔ Ｓ ＦＩＴとも呼ばれる）（７８．６％～９７．０％：８８．０％～９２．８％）、Ｑｕｉｄｅｌ製のＱｕｉｃｋＶｕｅ ｉＦＯＢ（９１．９％：７４．９％）、Ｈｅｍｏｓｕｒｅ，Ｉｎｃ．製のＨｅｍｏｓｕｒｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｉＦＯＢ検査（５４．５％：９０．５％）、ＣｌｉｎｉｃａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ製のＩｎＳｕｒｅ ＦＩＴ（７５．０％：９６．６％）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＨｅｍｏｃｃｕｌｔ－ＩＣＴ（２３．２％－８１．８％：９５．８％～９６．９％）、Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣｏｌｏｇｕａｒｄ－ｓｔｏｏｌ ＦＩＴ－ＤＮＡ（９２．３％：８４．４％）。感度および特異性の大きな範囲および差異は、早期がんから後期がんの範囲、ならびに方法論、採取された試料の数、および臨床試験サイズの差異を反映し得る。ＦＩＴ検査のカットオフ値は、１０ｕｇ～３００ｕｇのタンパク質／グラムの便までの範囲であり得る（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｆｅｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ａ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｂｙ ｔｈｅ ＵＳ Ｍｕｌｔｉ－Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．８５（１）：２－２１（２０１７）を参照されたい。その全体が、本明細書に援用される）。
いくつかの腫瘍関連抗原は、患者内で免疫応答を誘発し、自己抗体として、または間接的に血清中のサイトカインの増加として特定され得る。いくつかの腫瘍抗原は、血清内、またはがん関連エクソソームもしくは細胞外小胞の表面上で直接検出されてもよく、一方、他の抗原は、例えば、がん関連エクソソームもしくは細胞外小胞内のｍＲＮＡの増加によって間接的に検出されてもよい。これらのがん特異的タンパク質マーカーは、ｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定されてもよい。これらのマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＰＨ３ＡＬ、ＲＰＬ３６、ＳＬＰ２、ＴＰ５３、サバイビン、ＡＮＡＸＡ４、ＳＥＣ６１Ｂ、ＣＣＣＡＰ、ＮＹＣＯ１６、ＮＭＤＡＲ、ＰＬＳＣＲ１、ＨＤＡＣ５、ＭＤＭ２、ＳＴＯＭＬ２、ＳＥＣ６１－β、ＩＬ８、ＴＦＦ３、ＣＡ１１－１９、ＩＧＦＢＰ２、ＤＫＫ３、ＰＫＭ２、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＣ－ＳＩＧＮＲ、ＧＤＦ－１５、ＡＲＥＧ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＭＰＤＨ２、ＭＡＧＥＡ４、ＢＡＧ４、ＩＬ６ＳＴ、ＶＷＦ、ＥＧＦＲ、ＣＤ４４、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ １９－９，ＣＡ １２５、ＮＭＭＴ、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ複合体、ＴＦＡＰ２Ａ、Ｅ２Ｆ５、ＣＬＩＣ４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＣＴＳＤ－３０、ＰＲＤＸ－６、ＬＲＧ１、ＴＴＲ、ＣＬＵ、ＫＬＫＢ１、Ｃ１Ｒ、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＨＯＸＢ１３、ＧＨＲＬ２、ＦＯＸＡ１（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂａｓｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７５：１５７－１６３（２０１７）、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ，Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：ａ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ，”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（４）：ｅ０１２３４８４（２０１５）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｒｕｍ Ｔｒｅｆｏｉｌ Ｆａｃｔｏｒ ３ ａｓ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１６（４）：４４０－４４５（２０１７）、Ｏｖｅｒｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡ１１－１９：ａ Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．８３（３）：５４５－５５１（２０１６）、Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（３）：ｅ０１２０４２５（２０１５）、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＤＣ－ＳＩＧＮ ａｎｄ ＤＣ－ＳＩＧＮＲ，Ｗｈｉｃｈ ａｒｅ Ｎｏｖｅｌ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（１２）：ｅ１１４７４（２０１４）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐａｎｅｌ ｏｆ Ｆｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｂｌｏｏｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｌｉｎ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．９：５１７－５２６（２０１７）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ６４ Ｓｅｒｕｍ Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ Ｔｒｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｅｔｔｉｎｇ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（１３）：１６４２０－３２（２０１６）、Ｒｈｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｍｉｃ Ｐｌａｓｍａ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｍａ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇｕｔ ６７（３）：４７３－４８４（２０１８）、Ｗｉｌｄらの米国特許第９，５１８，９９０号、Ｃｈａｎらの米国特許第９，８３５，６３６号、Ｍａｎらの米国特許第９，８８５，７１８号、Ａｎｄｙ Ｋｏｆｆらの米国特許第９，８８９，１３５号、Ｓｐｅｉｃｈｅｒらの米国特許第９，９０３，８７０号、Ｂａｊｉｃらの米国特許第９，９１４，９７４号、Ｃｈｏｉらの米国特許第９，９８３，２０８号、Ｓｃｈｅｒらの米国特許第１０，０３０，２７１号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。低存在量のｍＲＮＡ転座、スプライスバリアント、代替的転写産物、代替的開始部位、代替的コード配列、代替的非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、およびイントロン挿入を検出するためのさらなるアプローチは、ＷＯ２０１６０５７８３２Ａ２に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）、または当該技術分野で既知の他の好適な手段が使用される。図２６は、大腸腫瘍から生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定されるがんタンパク質マーカーのリストを提供する。これらは、血液中で特定され得、エクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで特定され得る。図２７は、大腸腫瘍によって血液中に分泌され得るタンパク質マーカーを提供する。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較解析を行い、続いて追加のバイオインフォマティクスフィルターを行い、翻訳されたタンパク質が細胞から分泌される可能性を予測する（Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，”Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７（２０１２）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。
大腸がんにおける変異の分布は、公開されているＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的に変化している２０個の遺伝子は以下のとおりである：ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＦＡＴ４、ＬＲＰ１Ｂ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＢＲＡＦ、ＺＦＨＸ３、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＦＢＸＷ７、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＴＲＲＡＰ、ＲＮＦ４３、ＦＡＴ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＰＲＥＸ２（Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＣＯＳＭＩＣ：Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ’ｓ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ８０５－８１１（２０１５）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。しかしながら、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤＲＥＡＤ変異データセットの分析は、以下の遺伝子が、大腸がん原発腫瘍の中で少なくとも１０％の変異率を有することを示す：ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＴＴＮ、ＳＹＮＥ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＡＴ４、ＭＵＣ１６、ＦＢＸＷ７、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＤＮＡＨ５、ＤＭＤ、ＡＮＫ２、ＲＹＲ２、ＦＬＧ、ＨＭＣＮ１、ＦＡＴ２、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＳＭＤ３、ＵＳＨ２Ａ、ＳＤＫ１、ＣＳＭＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＤＮＡＨ２、ＳＭＡＤ４、ＰＫＨＤ１、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＡＴＭ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＭＤＮ１、ＤＣＨＳ２、ＺＦＨＸ４、ＣＵＢＮ、ＣＳＭＤ２、ＦＲＥＭ２、ＲＹＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＹＲ３、ＳＡＣＳ、ＤＮＡＨ１０、ＡＢＣＡ１２、ＢＲＡＦ、ＯＤＺ１、ＰＣＤＨ９、ＭＡＣＦ１、ＡＨＮＡＫ２。本明細書に記載のアプローチに加えて、これらに限定されないが、次世代配列決定、アレル特異的ＰＣＲ、ＡＲＭＳ、ブロッキングプライマーを使用したプライマー伸長ＰＣＲ、完全ＣＯＬＤ－ＰＣＲ、ｆａｓｔ ＣＯＬＤ－ＰＣＲ、ｉｃｅ ＣＯＬＤ－ＰＣＲ、Ｅ－ｉｃｅ－ＣＯＬＤ－ＰＣＲ、ＴＴ－ＣＯＬＤ－ＰＣＲなどを使用することを含むＤＮＡレベルまたはｍＲＮＡレベル（例えば、エクソソーム内のｍＲＮＡ）のいずれかでの低存在量の変異の濃縮および検出のためのいくつかのアプローチがある（Ｍａｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＣＯＬＤ－ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｒｅａ ｏｆ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ．３：２６９－２８３（２０１７）、Ｓｅｆｒｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ａｎｄ Ｅ－ｉｃｅ－ＣＯＬＤ－ＰＣＲ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ－Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｆｒｏｍ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４６５：１－４（２０１７）、Ｐｌａｔｉｃａの米国特許第９，０６２，３５０号、Ｓｏｎｇらの米国特許第９，５９８，７３５号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。低存在量の変異を検出するためのさらなるアプローチは、ＷＯ２０１６０５７８３２Ａ２に記載されており（その全体が、参照により本明細書に援用される）、または当該技術分野で既知の他の好適な手段が使用される。
最もよく研究されたＣＲＣ検出のための血液ベースのメチル化マーカーは、ＳＥＰＴ９遺伝子のプロモーター領域に位置する（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇｕｔ ６３（２）：３１７－３２５（２０１４）、Ｌｏｆｔｏｎ－Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（２）：４１４－４２３（２００８）、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ＤＮＡ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（９）：１１８３－１１９１（２０１４）、Ｒａｖｅｇｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＥＰＴ９ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｕｓ，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ａｎｄ Ｆｏｌａｔｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：Ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６（１２）：２８４８６－２８４９７（２０１５）、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｉｓ ａ Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｏｔｈ Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ Ｒｉｇｈｔ－ｓｉｄｅｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒｓ，”ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（９）：ｅ４６０００（２０１２）、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｓｅｐｔｉｎ ９ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ，”ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ９（１２）：ｅ１１５４１５（２０１４）、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｐｔｉｎ ９ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓ ａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１３３（２０１１）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。ＣＲＣ診断のための他の潜在的なマーカーとしては、ＴＨＢＤ、Ｃ９ｏｒｆ５０、ＺＮＦ１５４、ＡＧＢＬ４、ＦＬＩ１、およびＴＷＩＳＴ１のプロモーター領域上のＣｐＧ部位が挙げられる（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）：ｅ５０２６６（２０１２）、Ｍａｒｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＺＮＦ１５４ ａｓ ａ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＪＭＤ １８（２）：２８３－２９８（２０１６）、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｒｒａｙ，”Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ１４１９－１４２７（２０１５）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。
ＳＥＰＴ９のメチル化は、Ｅｐｉ ｐｒｏＣｏｌｏｎ検査、すなわち、ＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓによるＣＲＣ検出アッセイの基礎となっている（Ｌｏｆｔｏｎ－Ｄａｙ ｅｔ ａｌ：，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（２）：４１４－４２３（２００８）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。より小さな試料セットにおける初期の結果は有望性を見せたが、１，５４４個の血漿試料を用いた大規模な研究では、ステージＩ～ＩＩＩのＣＲＣに対して感度が６４％、特異性が７８％～８２％であり、１，０００個体中１８０～２２０個体を、不必要な結腸内視鏡検査へと効果的に送ることになった（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ＤＮＡ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（９）：１１８３－１１９１（２０１４）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。臨床ゲノミクスは、現在、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の遺伝子のメチル化に基づいて、血液ベースのＣＲＣ検出試験を開発している（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＢＣＡＴ１ ａｎｄ ＩＫＺＦ１ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，”ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １５：６５４（２０１５）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。この２個のマーカー検査の２，１０５個の血漿試料を使用した大規模試験は、６６％の全体的な感度、ステージＩのＣＲＣに対して３８％の感度、および９４％の印象的な特異性を示した。Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓおよび共同研究者らは、Ｋ－ｒａｓ変異、ならびにＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化マーカー（Ｌｉｄｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，”Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１１（１０）：１３１３－１３１８（２０１３）、その全体が、参照により本明細書に援用される）を加えることによって、ＣＲＣ糞便検査の感度をわずかに改善した（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｏｏｌ Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ．（Ｄｏｒｄｒ）３５（４）：３０９－３１５（２０１２）、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １７（５）：４０１－４０６（２０１３）、Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ－Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７０（１４）：１２８７－１２９７（２０１４）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＭＳ－ＨＲＭ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４３１：１５４－１６３（２０１４）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｄｅｎｏｍａ：ａ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｃａｎ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２７（８）：４６７－４７５（２０１３）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。エピジェネティック変化は、ＤＮＡ（プロモーターＣｐＧ部位のメチル化またはヒドロキシメチル化として）だけでなく、これらのプロモーターに結合するヒストンタンパク質上にメチル基またはアセチル基を付加することによってもマークすることができる。これらの異なるエピジェネティックマークは、大腸がん患者の循環ヌクレオソームにおいて検出され得る（Ｒａｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｎｅｗ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：５３（２０１７）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。血液ベースのがん特異的メチル化マーカーの特定は、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）からの追加のメチル化データセット（原発腫瘍、正常組織、細胞株、末梢血、免疫細胞）とともに、ＴＣＧＡ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ４５０Ｋメチル化データセット全体（原発腫瘍からなり、ＣＲＣを含む３３種類のがんに対して正常と適合する）を用いた。ＣＲＣ特異的メチル化マーカーを特定するために、これらのデータセットの比較統計解析を使用して、以下の特徴を有する候補メチル化マーカーを特定した：ＣＲＣの組織および細胞株において高度にメチル化（またはヒドロキシメチル化）されていること、正常な結腸において非メチル化されていること、末梢血および免疫浸潤において非メチル化されていること、ほとんどの他のがん型において非メチル化されていること。バイオインフォマティックスキームを検証することで、これらの方法論はまた、ＣＲＣ患者由来の血漿中で高メチル化されていることが以前に報告されたＣｐＧ部位を同定した（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｇｕｔ ６３（２）：３１７－３２５（２０１４）、Ｌｏｆｔｏｎ－Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（２）：４１４－４２３（２００８）、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＥＰＴ９ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｉｓ ａ Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｏｔｈ Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ Ｒｉｇｈｔ－ｓｉｄｅｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒｓ，”ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（９）：ｅ４６０００（２０１２）、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｐｔｉｎ ９ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓ ａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１３３（２０１１）、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，”ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）：ｅ５０２６６（２０１２）、Ｍａｒｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＺＮＦ１５４ ａｓ ａ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ：ＪＭＤ １８（２）：２８３－２９８（２０１６）、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｒｒａｙ，”Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ１４１９－１４２７（２０１５）、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＢＣＡＴ１ ａｎｄ ＩＫＺＦ１ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，”ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １５：６５４（２０１５）、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。これらのメチル化部位がＣＲＣに特異的であり、加齢関連メチル化の結果ではないことを確実にするために（ＭｃＣｌａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ ｉｎ Ｏｖｅｒ ７００ ｓｕｂｊｅｃｔｓ，”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２３（５）：１１７５－１１８５（２０１４）、その全体が、参照により本明細書に援用される）、ピアソン相関を、メチル化レベルと患者年齢との間で計算した。さらに、これらの部位の高メチル化は、ＭＳＩ状態と有意に相関しておらず、すべてのＣＲＣサブタイプについてマーカーが同定されていることを意味した。全体として、約１０，０００の組織試料、４０億超のデータポイント（試料あたりのデータポイント＝ＣｐＧ％メチル化）を分析して、数百のＣＲＣ特異的マーカーの初期リストを特定した。ＣｐＧマーカーは、多くの種類のがんにおいて一貫して現れ、潜在的な汎腫瘍マーカーとして標識される。低存在量の５ｍＣ（または５ｈｍＣ）を検出するためのさらなるアプローチは、ＷＯ２０１６０５７８３２Ａ２に記載されており（その全体が、参照により本明細書に援用される）、または当該技術分野で既知の他の好適な手段が使用される。図２８は、結腸直腸がんのマーカーおよび結腸組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、結腸直腸がんの存在を特定するために使用され得る。図２９は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、結腸直腸がんのマーカーおよび結腸組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから結腸直腸がんの存在を特定するために使用され得る。これらのメチル化マーカーのうち約６０個についてのプライマーセットは、予言的な実験セクションの表３９に列挙されている。
変異またはメチル化状態は、明確な分析的カットオフ、すなわち、アッセイは、変異またはＣｐＧメチル化のいずれか事象を記録し得、偽陽性は、例えば、加齢関連メチル化からの生物学的な結果である。他のマーカーでは、特に最も早い段階でがんを特定しようとする際に、がんを有する個体のマーカーレベルと、それらの適合する正常な対照との間に、より大きな重複が生じ得る。そのような場合、カットオフは、正常値を２標準偏差上回る「Ｚスコア」によって、または偽陽性率を任意のレベル（すなわち、年齢適合正常試料の好適なセットを評価する場合は５％）に設定することによって定義され得る。一般に、年齢適合正常のセットは、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルのカットオフを、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％、または９８％超に設定するのに好適に十分大きくなければならない。「Ｚスコア」は、次の式を使用して計算され得る：Ｚ＝（Ｘ－μ）／σ：式中、Ｚ＝Ｚスコア、Ｘ＝データセットの各値、μ＝データセットのすべての値の平均、およびσ＝試料の標準偏差。同様に、Ｚスコアを使用する場合、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルのカットオフは、正常な試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、１．０３超、１．２８超、１．６５超、１．７５超、１．８８超、または２．０５超のＺスコアで設定され得る。いくつかのアッセイでは、マーカーレベル（すなわち、血漿中のいくつかの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化レベル、または尿中のｍｉＲＮＡレベル）は、ｑＰＣＲ反応において内部または外部のいずれかで添加される別のマーカーに関連して定量化され、カットオフは、アッセイにおいてΔＣｔ値として決定される（Ｆａｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ａ Ｒｏｂｕｓｔ Ａｓｓａｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（８）：２１６０－７０（２０１４）、Ｓｕｋｕｍａｒらの米国特許第９，４１６，４０４号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。また、定義されたプロモーター領域におけるメチル化状態は、デジタルバイサルファイトゲノム配列決定およびデジタルＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して、バイサルファイト変換および変換メチル化配列の優先的増幅を使用して、変換非メチル化配列の増幅を妨害するブロッキングプライマーによって、またはメチル感受性制限エンドヌクレアーゼを使用した非メチル化ＤＮＡの枯渇、それに続くＰＣＲを使用して決定されてもよい（Ｌａｉｒｄらの米国特許第９，２９０，８０３号、Ｆｒｕｍｋｉｎらの米国特許第９，４７６，１００号、ＭｃＥｖｏｙらの米国特許第９，７６５，３９７号、Ｔａｂｏｒｉらの米国特許第９，８９６，７３２号、Ｋｏｔｔｗｉｔｚらの米国特許第９，９５７，５７５号を参照されたい。それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。最近になって、５ｍＣおよび５ｈｍＣからＤＨＵへの変換のためにＴＥＴ２およびＡＰＯＢＥＣを使用することを基に、バイサルファイトフリーのＤＮＡ配列決定のためのエレガントな技術が開発されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３７：４２４－４２９ （２０１９））。
ｃｆＤＮＡのゲノムワイドメチル化プロファイル（メチロームとして知られる）は、次世代配列決定を使用して決定することができ、メチル化パターンは、血漿中の胎児、腫瘍、または他の組織ＤＮＡの存在を特定するために使用され得る（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒｅｎａｔａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １１２（４０）：Ｅ５５０３－１２（２０１５）、Ｌｅｈｍａｎｎ－Ｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １１３（１３）：Ｅ１８２６－３４（２０１６）、Ｌｏらの米国特許第９，７３２，３９０号、Ｚｈａｎｇらの米国特許第９，９８４，２０１号、それらの全体が、参照により本明細書に援用される）。
上記の計算は、１個または２個のマーカーの感度の上昇に基づいているが、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に上昇した場合はどうなるであろうか？図３０～３２は、それぞれ、２４個、３６個、および４８個のマーカーについて計算された全体的な感度および特異性の結果を示す。これらのグラフは、個々のマーカーの平均感度が６６％であり、個々のマーカーの平均偽陽性率が２％～５％であるという仮定に基づいている。感度曲線は、各マーカーの血液中の分子の平均数の関数として全体的な感度を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を提供する。特異性曲線は、個々のマーカーの偽陽性率の関数として全体的な特異性を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を再び提供する。個々のマーカーの平均感度が５０％（前述のとおり）または６６％である、それぞれ２４個、３６個、および４８個のマーカーの全体的な感度および特異性の計算値を、以下の表に提供する。
（表１４）
（表１５）
（表１６）
（表１７）
（表１８）
（表１９）
（表２０）
（表２１）
（表２２）
上記の表、および図３０～３２、ならびに図１８～２０は、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善した場合の、感度の全体的な改善における直接的な比較を可能にする。この例では、最も早期のがん（ステージＩ）について血液中に平均１５０個の分子が存在する場合、およびそれが少なくとも１つの変異をカバーする場合、すると、次世代配列決定によってかかるがんを特定する感度は、２２．１％になる（前述の図のいずれかを参照）。ステージＩのがんの検出に対して（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子、図１８Ａおよび３０Ａを参照）、２４個のマーカーで、最低３個のマーカーが陽性で、ＦＰ率が３％である場合、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は、５７．７％から７６．２％に改善する。個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、最低３個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全ＦＰ率は５．４％であり、特異度は９４．６％である（図１８Ｂまたは３０Ｂを参照）。しかし、個々のマーカーのＦＰ率が５％である場合、さらに、最低４個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全ＦＰ率は６．６％であり、特異度は９３．４％である（図１８Ｂを参照）。４個のマーカーでは、ステージＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子）に対して、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は、３５．３％から５６．７％に改善する（図１８Ａおよび図３０Ａを参照）。３６個のマーカーでは、ステージＩのがんの検出に対して最低３個のマーカーが陽性で、ＦＰ率が２％である場合、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は８２．６％から９３．８％に改善する（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子、図１９Ａおよび３１Ａを参照）。個々のマーカーのＦＰ率が２％である場合、さらに、最低３個のマーカーがある場合、すると、３６個のマーカーの全ＦＰ率は５．７％であり、特異度は９４．３％である（図１９Ｂまたは３１Ｂを参照）。しかし、個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、アッセイが最低４個のマーカーを必要とする場合、すると、３６個のマーカーの全ＦＰ率は４．８％であり、特異度は９５．２％である（図１９Ｂを参照）。４個のマーカーでは、ステージＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子）に対して、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は、６５．８％から８４．９％に改善する（図１９Ａおよび図３１Ａを参照）。４８個のマーカーでは、ステージＩのがんの検出に対して（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子、図２０Ａおよび３２Ａを参照）、最低４個のマーカーが陽性で、ＦＰ率が２％である場合、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は、８４．９％から９５．８％に改善する。個々のマーカーのＦＰ率が２％である場合、さらに、最低４個のマーカーがある場合、すると、４８個のマーカーの全ＦＰ率は３．１％であり、特異度は９６．９％である（図２０Ｂまたは３２Ｂを参照）。しかし、個々のマーカーのＦＰ率が３％である場合、さらに、アッセイが最低５つのマーカーを必要とする場合、すると、４８個のマーカーの全ＦＰ率は４．２％であり、特異度は９５．８％である（図２０Ｂを参照）。５個のマーカーでは、ステージＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約１５０分子）に対して、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善すると、全感度は７１．６％から９０．０％に改善する（図２０Ａおよび図３２Ａを参照）。
上記のチャートから、１－特異度に対して感度をプロットすることにより、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が計算され得る。これらは理論的な計算であるため、２％、３％、４％、および５％の異なるレベルの平均マーカー偽陽性率について曲線を生成した。個々のマーカーの平均感度が６６％、ＦＰが２％～３％である２４個のマーカー；個々のマーカーの平均感度が６６％、ＦＰが２％～３％である３６個のマーカー；および個々のマーカーの平均感度が６６％、ＦＰが２％～３％である４８個のマーカーのＲＯＣ曲線について計算されたＡＵＣ値を下の表２３に提供する。最も早期のがん（ステージＩ）について、血液中に平均１５０分子というベンチマークを使用して、個々のマーカーのＦＰ率が３％だけに注目すると、ＡＵＣ値は、（個々のマーカーの平均感度が５０％）の２４個のマーカーでは７７％であり、（個々のマーカーの平均感度が６６％の）２４個のマーカーでは８７％に改善し；ＡＵＣ値は、（個々のマーカーの平均感度が５０％の）３６個のマーカーでは８７％であり、（個々のマーカーの平均感度が６６％の）３６個のマーカーでは９５％に改善し；ＡＵＣ値は、（個々のマーカーの平均感度が５０％の）４８個のマーカーでは８９％であり、（個々のマーカーの平均感度が６６％の）４８個のマーカーでは９７％に改善する。これらの結果は、個々のマーカーの平均感度が５０％から６６％に改善した場合、複数のマーカーのアッセイにとって、最も早期のがんに対して良好な感度および特異度を達成することが助けられることを示している。
（表２３）
個々のマーカーの平均感度が、感度５０％から感度６６％に上昇すると、１ステップがんアッセイで、どのように改善されるだろうか？概説すると：課題は、米国で５０歳以上の成人１億７００万人を大腸がんについてスクリーニングする（そのうち、年間約１３５，０００例が新規症例として診断されている）ことである。この例では、早期がんについて血液中に平均３００個の分子が存在し（ステージＩおよびＩＩ）、個々のマーカーのＦＰ率が２％であるベストケースシナリオを取り、次いで、少なくとも３個のマーカーがあるとした場合、２４個のマーカーについては、全体的なＦＰ率が１．６％、特異性が９８．４％である（図１８Ｂまたは３０Ｂを参照）。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が５０％の場合、検査は、６．２％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は９３．８％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９３．８％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１２６，６３０人になるであろう。９８．４％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、１．６％×１０７，０００，０００＝１，７１２，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１２６，６３０／（１２６，６３０＋１，７１２，０００）＝約６．８％であり、言い換えると、検査で陽性であった１４人のうち１人だけが、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が６６％の場合、検査は、１．４％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は９８．６％になり（図３０Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９８．６％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１３３，１１０人になるであろう。９８．４％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、１．６％×１０７，０００，０００＝１，７１２，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１３３，１１０／（１３３，１１０＋１，７１２，０００）＝約７．２％であり、言い換えると、検査で陽性であった１４人のうち１人だけが、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。したがって、ＦＰが低い場合（すなわち、２％）、マーカーの平均感度が５０％からマーカーの平均感度が６６％になっても、わずかな利益しかない。
しかしながら、個々のマーカーのＦＰ率が、例えば４％など、より現実的である場合、すると、９８％よりも優れた特異性を達成するには、より多くのマーカーが必要になり、これによって、感度が犠牲になる。個々のマーカーのＦＰ率が４％である場合、さらに、少なくとも５個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全体的なＦＰ率は０．４％であり、特異性は９９．６％である（図１８Ｂを参照）。５個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が５０％の場合、検査は、２８．５％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は７１．５％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の７１．５％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）９０，５４０人になるであろう。９９．６％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．４％×１０７，０００，０００＝４２８，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、９０，５４０／（９０，５４０＋４２８，０００）＝約１７．５％であり、言い換えると、検査で陽性であった５．７人のうち１人が、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。１７．５％のＰＰＶはかなり立派であるが、早期がんの２８．５％を見落とすという犠牲を払って達成されるだろう。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が６６％の場合、検査は、１０．０％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全体的な感度は９０．０％になり（図３０Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９０．０％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１２１，５００人になるであろう。９９．６％の特異性で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．４％×１０７，０００，０００＝４２８，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１２１，５００／（１２１，５００＋４２８，０００）＝約２２．１％であり、言い換えると、検査で陽性であった４．５人のうち１人が、実際に大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。２２．１％のＰＰＶは素晴らしく、さらに、早期がんの１０％のみを見落とすという犠牲を払って達成されるであろう。したがって、ＦＰがより現実的（すなわち、４％）である場合、マーカーの平均感度が５０％からマーカーの平均感度が６６％になると、顕著な利益がある。
大腸がんの例、特に、変異負荷が低いマイクロサテライト安定性腫瘍（ＭＳＳ）の例に戻ると、これらの計算が、ＮＧＳ配列決定のみに依存する場合（血液中に１つの変異を有する１５０分子を仮定する）、推定７８％の早期大腸がんが見逃されることになる。再び、これらの数字を概観すると、米国では、２０１８年に、約１３５，０００例の大腸がんの新規症例が診断され、そのうちの約６０％が後期がん（すなわち、ステージＩＩＩおよびＩＶ）である。米国では５０歳以上の約１億７００万人が大腸がんの検査を受けるべきである。隠れたがん（すなわち、ステージＩ）を有する個体（その中には検査に不従順な個体もある）の数は予測できないが、この計算の目的のために、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。血液中に１つの変異を有する少なくとも１５０個の分子を含むこれらの試料を仮定すると、かかる検査は、（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）大腸がんを有する８，９１０人の個体を発見するであろう。しかしながら、特異性が９８％の配列決定では、約２１０万の偽陽性が存在することになる。かかる検査の陽性予測値は、約０．４％であり、言い換えると、検査で陽性であった２３６人のうち１人だけが、実際にステージＩの大腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。対照的に、上に記載の２ステップのメチル化マーカー検査を検討し、ここで、第１のステップが、ＧＩがんに特異的な２４個のメチル化マーカーを有し、第２のステップが、大腸がんに特異的な４８個のメチル化マーカーを有する。この例では、個々のマーカーの平均感度は６６％に設定されている。この例では、上述のように、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して、計算が行われる。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、少なくとも３個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全体的な特異性が９４．６％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳以上の全成人１０７，０００，０００人のうち）５，７７８，０００人の個体を特定するであろう。これは、７６．２％の感度で、すなわち、ステージＩの大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する合計４０，５００人のうち）約３０，８６１人の個体を含むことになる。しかし、これらの５，７７８，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個の陽性マーカーを必要とする４８個のマーカーの第２のステップで評価され、次いで、２ステップ検査で、大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する４０，５００人のうち）７６．２％×９０．０％＝６８．６％＝２７，７７５人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異性では、２回目の検査は、５，７７８，０００×４．２％＝２４２，６７６の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２７，７７５／２７０，４５１＝１０．３％である。言い換えると、検査で陽性であった１０人のうちの１人が実際にステージＩの大腸がんを有するであろう。これは、フォローアップの結腸内視鏡検査で最も恩恵を受ける患者に焦点を当てた非常に成功したスクリーニングである。ステージＩの結腸がんと特定された９０％超の個体は、手術直後に長期生存率を有するため、救われる人命における恩恵は、計り知れない価値があるだろう。
２ステップアッセイの初期検査で３６個のマーカーを使用した場合、上記の数値はどのように変化するであろうか？この例では、上述のように、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して、計算が行われる。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、少なくとも４個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全体的な特異性が９５．２％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳以上の全成人１０７，０００，０００人のうち）５，１３６，０００人の個体を特定するであろう。これは、８４．９％の感度で、すなわち、ステージＩの大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する合計４０，５００人のうち）約３４，３８５人の個体を含むことになる。しかし、これらの５，１３６，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個の陽性マーカーを必要とする４８個のマーカーの第２のステップで評価され、次いで、２ステップ検査で、大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する４０，５００人のうち）８４．９％×９０．０％＝７６．４％＝３０，９４６人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異性では、２回目の検査は、５，１３６，０００×４．２％＝２１５，７１２の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３０，９４６／２４６，６５８＝１２．５％であり、言い換えると、検査で陽性であった８人のうち１人だけが、実際にステージＩの大腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんの特定においても成功する必要がある。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中に陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）のＣＲＣが陽性マーカーあたり少なくとも３００個のメチル化分子を有し、さらにより高いステージを有することを期待して行われる。また、検査が繰り返し使用されるにつれて、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、ステージＩのがんを有する４０，５００人、ステージＩＩのがんを有する４０，５００人、および後期がんを有する残りの５４，０００人（＝米国で年間に特定された大腸がんの総数１３５，０００人）を推定値とした。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供されている。ステージＩＩのがんの場合、９５．８％が、第１のステップで特定され、そのうち、９５．８％×９８．０％＝９３．９％＝３８，０２３人のステージＩＩの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．８％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．８％×（１００％）＝５３，８９２人の後期がんの個体が特定されるであろう。これによって、大腸がんを有する１３５，０００人のうち、合計で、３０，９４６人＋３８，０２３人＋５３，８９２人＝１２２，８６１人の個体が特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２２，８６１／３６９，５１９＝３３．２％となり、言い換えると、陽性と判定された３人のうち１人が、実際に大腸がんを有するであろう。この検査は、早期がんを検出する診断アプローチにおいて、前例のない６８，９６９／８１，０００、すなわち８５％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
目標が初期のハイスループットがんスクリーンにおけるマーカーの合計数を最小化することである場合はどうなるであろうか？個々のマーカーの平均感度が６６％から７５％に上昇した場合はどうなるであろうか？図３３～３８は、それぞれ、１２個、１８個、２４個、３２個、３６個、および４８個のマーカーについて計算された全感度および全特異度の結果を示す。これらのグラフは、個々のマーカーの平均感度が７５％であり、個々のマーカーの平均偽陽性率が２％～５％であるという仮定に基づいている。感度曲線は、各マーカーごとに血液中の分子の平均数の関数として全感度を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を提供する。特異度曲線は、個々のマーカーの偽陽性率の関数として全特異度を提供し、試料を陽性と判定するために必要なマーカーの最小数ごとに別々の曲線を再び提供する。個々のマーカーの平均感度が７５％である、それぞれ１２個、１８個、２４個、３２個、３６個、および４８個のマーカーの全感度および全特異度の計算値を、下の表に提供する。
（表２４）
（表２５）
（表２６）
（表２７）
（表２８）
（表２９）
（表３０）
（表３１）
（表３２）
（表３３）
（表３４）
（表３５）
１ステップがんアッセイでは、個々のマーカーの平均感度が、感度５０％から感度７５％に上昇すると、どのように改善されるであろうか？概説すると：課題は、米国で５０歳を超える成人１億７００万人（そのうち、年間約１３５，０００例が新規症例として診断されている）を結腸直腸がんについてスクリーニングすることである。この例では、早期がん（ステージＩおよびＩＩ）について血液中に平均３００個の分子が存在し、個々のマーカーのＦＰ率が２％であるベストケースシナリオを取り、さらに、最低３個のマーカーがある場合、２４個のマーカーについては、全ＦＰ率が１．６％、特異度が９８．４％である（図１８Ｂまたは３０Ｂを参照）。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が５０％の場合、検査は、６．２％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全感度は９３．８％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９３．８％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１２６，６３０人になるであろう。９８．４％の特異度で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、１．６％×１０７，０００，０００＝１，７１２，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１２６，６３０／（１２６，６３０＋１，７１２，０００）＝約６．８％であり、言い換えると、検査で陽性であった１４人のうち１人だけが、実際に結腸直腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。３個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、わずか１８個のマーカーでマーカーの平均感度が７５％の場合、検査は、３．６％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全感度は９６．４％になり（図３５Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９６．４％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１３０，１４０人になるであろう。９９．３％の特異度で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．７％×１０７，０００，０００＝７４９，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１３０，１４０／（１３０，１４０＋７４９，０００）＝約１４．８％であり、言い換えると、検査で陽性であった６．７人のうち１人だけが、実際に結腸直腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。したがって、ＦＰが低い（すなわち、２％の）場合、マーカーの平均感度が５０％からマーカーの平均感度が７５％になることに幾分の利益がある。
しかしながら、個々のマーカーのＦＰ率が、例えば４％など、より現実的である場合、すると、９８％よりも優れた特異度を達成するには、より多くのマーカーが必要になり、これによって、感度が犠牲になる。個々のマーカーのＦＰ率が４％である場合、さらに、最低５個のマーカーがある場合、すると、２４個のマーカーの全ＦＰ率は０．４％であり、特異度は９９．６％である（図１８Ｂを参照）。５個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、マーカーの平均感度が５０％の場合、検査は、２８．５％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全感度は７１．５％になり（図１８Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の７１．５％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）９０，５４０人になるであろう。９９．６％の特異度で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．４％×１０７，０００，０００＝４２８，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、９０，５４０／（９０，５４０＋４２８，０００）＝約１７．５％であり、言い換えると、検査で陽性であった５．７人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。１７．５％のＰＰＶはかなり立派であるが、早期がんの２８．５％を見落とすという犠牲を払って達成されるであろう。４個のマーカーでは、ステージＩおよびＩＩのがん（血液中の各陽性マーカーが約３００分子）に対して、１８個のマーカーパネルについてマーカーの平均感度が７５％の場合、検査は、９．６％を見逃すであろう。すなわち、ステージＩおよびＩＩのがんに対して、全感度は９０．４％になり（図３５Ａを参照）、例えば、検査は、疾患を有する個体の９０．４％を正しく特定し、それは、（新規症例１３５，０００人のうち）１２２，０４０人になるであろう。９９．２％の特異度で、スクリーニングされた１億７００万人の個体に対して、この検査はまた、０．８％×１０７，０００，０００＝８５６，０００の偽陽性を生成する。したがって、陽性予測値は、１２２，０４０／（１２２，０４０＋８５６，０００）＝約１２．５％であり、言い換えると、検査で陽性であった８人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。１２．５％のＰＰＶはまずまずであり、さらに、早期がんの１０％のみを見落とすという犠牲を払って達成されるであろう。したがって、ＦＰがより現実的（すなわち、４％）である場合、マーカーの平均感度が５０％からマーカーの平均感度が７５％になると、顕著な利益がある。
結腸直腸がんの例、特に、変異負荷が低いマイクロサテライト安定性腫瘍（ＭＳＳ）の例に戻ると、これらの計算が、ＮＧＳ配列決定のみに依存する場合（血液中に１５０個の分子が１つの変異を有すると仮定する）、推定７８％の早期結腸直腸がんが見逃されることになる。再び、これらの数字を概観すると、米国では、２０１８年に、約１３５，０００例の結腸直腸がんの新規症例が診断されたが、そのうちの約６０％が後期がん（すなわち、ステージＩＩＩおよびＩＶ）である。米国では５０歳を超える約１億７００万人が結腸直腸がんの検査を受けるべきである。隠れたがん（すなわち、ステージＩ）を有する個体（その中には検査に不従順な個体もある）の数は予測できないが、この計算の目的のために、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。これらの試料が血液中に１つの変異を有する少なくとも１５０個の分子を含有すると仮定すると、かかる検査は、（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）結腸直腸がんを有する８，９１０人の個体を発見するであろう。しかしながら、特異度が９８％の配列決定では、約２１０万の偽陽性が存在することになる。かかる検査の陽性予測値は、約０．４％であり、言い換えると、検査で陽性であった２３６人のうち１人だけが、実際にステージＩの結腸直腸がんを有し、残りは偽陽性であろう。対照的に、第１のステップが、ＧＩがんに特異的な１８個のメチル化マーカーを平均感度７５％で有し、第２のステップが、結腸直腸がんに特異的な３６個のメチル化マーカーを平均感度７５％で有する、２ステップのメチル化マーカー検査を検討する（図１Ｄを参照）。この例では上述のように、計算は、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して行われる。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、最低３個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９７．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）２，３５４，０００人の個体を特定するであろう。これは、６５．５％の感度でステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約２６，５２７人の個体を含むであろう。しかし、これらの２，３５４，０００人の推定陽性者は、最低５個の陽性マーカーを必要とする３６個のマーカーの第２のステップで評価され、次いで、２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）６５．５％×８０．３％＝５２．６％＝２１，３０２人の個体が特定されるであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、２，３５４，０００×０．９％＝２１，１８６の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２１，３０２／（２１，３０２＋２１，１８６）＝５０．１％である。言い換えると、検査で陽性であった２人のうちの１人が実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。これは、フォローアップの結腸内視鏡検査で最も恩恵を受ける患者に焦点を当てた非常に成功したスクリーニングである。ステージＩの結腸がんと特定された９０％超の個体は、手術直後に長期生存率を有するため、救われる人命における恩恵は、計り知れない価値があるであろう。
最終的な目標は、世界中で発生するがんの大部分を検出するために、ハイスループットの拡張性の高い検査を開発することである。固形腫瘍がんは、両性、男性、および女性に対して下の表３６、３７、および３８に列挙されるように、以下のサブクラスにグループ分けされている。
（表３６）
（表３７）
（表３８）
上記のリストには、液体がん（ｌｉｑｕｉｄ ｃａｎｃｅｒ）も、あまり一般的ではない一部の固形腫瘍も含まれていない。世界的な液体腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ ｔｕｍｏｒ）の発生率（千人単位）には、非ホジキンリンパ腫（２２５）、白血病（１８７）、多発性骨髄腫（７０）、およびホジキンリンパ腫（３３）が含まれる。これらは、本明細書で論じられない別個の検査で検出される。さらに、リストは、黒色腫（２８７）および脳腫瘍（１３４）を除外している。これらの検査は、結腸直腸がんに関して上に記載されるように最適化された別々のセットのマーカーで行われる。加えて、上記の表に列挙されているいくつかのがんは、極めて医学的に重要である一方で（中皮腫、甲状腺がん、および３つの異なるサブカテゴリーの腎臓がん）、それらの生態は、通常、さらに上記のように結腸直腸がん用に最適化されたマーカーの別のセットに値するほど十分に異なっている。
したがって、本出願では、以下のグループ分けによって、以下の主要ながんを含む汎腫瘍検査を開発した。グループ１（結腸直腸がん、胃がん、および食道がん）、グループ２（乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん）、グループ３（肺腺腫、肺小細胞がん、および頭頸部がん）、グループ４（前立腺がんおよび膀胱がん）、およびグループ５（肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん）。なお、グループ３の一部のがんは痰試料として検査される場合があるのに対し、グループ４のがんは尿試料として検査される場合がある。
ＴＣＧＡメチル化データベースの慎重な解析により、これら５つの別々のグループ内のがん間のメチル化パターンにおける一般的な共通性が明らかになった。さらに、正常な白血球には存在しないが、いくつかのがんの間で共通のいくつかのメチル化マーカーが存在する。３つの異なる戦略を使用して、マルチステップの汎腫瘍検査を設計した。
第１の戦略は、上記のグループのうちの１つまたは複数において複数のがんをカバーするマーカーを特定することである。マーカーは、５グループすべてのがんをカバーするのに十分に多様であるべきである。例えば、アッセイの第１のステップは、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む９６個マーカーのセットを使用することになる（５つのグループでカバーされている；図１Ｅを参照；感度６６％については図１Ｉを参照）。少なくとも５個のマーカーが陽性である場合、アッセイは、次いで第２のステップに移り、それを使用して、初期結果を検証し、最も可能性の高い原発組織を特定する。ほとんどの場合、５個超のマーカーが陽性となり、次いで、これらのメチル化マーカーの分布パターンが、第２のステップでどのグループを検査すべきかの選択を導く。アッセイの第２のステップは、平均で、２つ以上のセットのグループ特異的マーカーを検査する。例えば、アッセイの第２のステップは、平均で、そのグループに存在し得る前述の種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が５０％の少なくとも３６個のマーカーから構成される、６４個のグループ特異的マーカーの２つ以上のセットを使用するであろう（６６％の感度については図１Ｉを参照）。陽性であるマーカーをスコアリングし、検査されるグループ内の各がんの種類の予測される陽性と比較することによって、医師は、最も可能性の高い原発組織を特定し、その後、患者を適切な画像診断に送ることができる。
第２の戦略は、上記のグループのうちの１つまたは複数において複数のがんをカバーするマーカーを特定することである。マーカーは、５グループすべてのがんをカバーするのに十分に多様であるべきである。前記と同様、アッセイの第１のステップは、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む、９６個マーカーのセットを使用することになる（５つのグループでカバーされている；図１Ｆを参照；感度６６％については図１Ｊを参照）。少なくとも５個のマーカーが陽性である場合、アッセイは、次いで第２のステップに移り、それを使用して、初期結果を検証し、最も可能性の高い原発組織を特定する。ほとんどの場合、５個超のマーカーが陽性となり、次いで、これらのメチル化マーカーの分布パターンは、第２のステップでどのグループを検査すべきかの選択を導く。アッセイの第２のステップは、平均で、２つ以上のセットのグループ特異的マーカーを検査する。例えば、アッセイの第２のステップは、平均で、そのグループに存在し得る前述の種類の固形腫瘍の各々をカバーする感度が７５％の少なくとも３６個のマーカーから構成される、４８個のグループ特異的マーカーの２つ以上のセットを使用するであろう。陽性であるマーカーをスコアリングし、検査されるグループ内の各がんの種類の予測される陽性と比較することによって、医師は、グループを最も確からしく検証し、原発組織を確からしく検証し、その後、患者を適切な画像診断に送ることができる。
第３の戦略は、グループに関係なくできるだけ多くのがんをカバーするマーカーを特定することである。マーカーは、５グループすべてのがんをカバーするのに十分に多様であるべきである。例えば、アッセイの第１のステップは、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が７５％で少なくとも２４個のマーカーを平均で含む４８個マーカーのセットを使用することになる（５つのグループでカバーされている；図１Ｇを参照）。早期がんのよりいっそう高感度の検出のために、アッセイの第１のステップは、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が７５％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む６４個マーカーのセットを使用することになる（５つのグループでカバーされている；図１Ｈを参照）。これらのマーカーは多くのがんに広く見出されるので、結果としての陽性マーカーは最も可能性の高い原発組織を特定するために第２のステップでどのグループを評価すべきかを指し示さない場合がある。それを行うための一アプローチは、第１の戦略を続けること、すなわち、各腫瘍種類に対して感度５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む９６個マーカーのセットを使用して、最も可能性の高い原発組織を決定することであろう（感度６６％については、図１Ｋおよび１Ｌを参照）。別のアプローチは、代替的な技術を使用して原発組織を特定すること、例えば、９６以上の領域の標的付けバイサルファイト配列決定を行ってメチル化パターンを決定し、異なるがんの種類の予測されるメチル化パターンと比較し、その後適切な画像診断を行うことであろう。
第１の戦略（図１Ｅを参照）に戻ると、ＴＣＧＡデータベースの綿密な評価により、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む９６個マーカーのセットに使用するための基準に適合する汎腫瘍マーカーが明らかになる。これらの汎腫瘍マーカーには、がん特異的なマイクロＲＮＡマーカー、がん特異的なｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカー、がん特異的なエクソン転写産物、腫瘍関連抗原、がんタンパク質マーカー、固形腫瘍により血液中に分泌されることができるタンパク質マーカー、共通変異、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである、内部に主要なＣｐＧ部位がある染色体領域またはサブ領域、ならびに固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位および隣接ＣｐＧ部位が含まれるが、これらに限定されない。
前記マーカーを検出するための方法は、本出願に前述されており、これらのマーカーは、下に、および添付の図面に列挙されている。
ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して導出される血液ベースの固形腫瘍に特異的なマイクロＲＮＡマーカーには、以下のマーカーが含まれるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）；ｈｓａ－ｍｉｒ－２１、ＭＩＲ２１；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８２、ＭＩＲ１８２；ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４、ＭＩＲ４５４；ｈｓａ－ｍｉｒ－９６、ＭＩＲ９６；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８３、ＭＩＲ１８３；ｈｓａ－ｍｉｒ－５４９、ＭＩＲ５４９；ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ａ、ＭＩＲ３０１Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｆ－１、ＭＩＲ５４８Ｆ１；ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ｂ、ＭＩＲ３０１Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－１０３－１、ＭＩＲ１０３１；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８ａ、ＭＩＲ１８Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－１４７ｂ、ＭＩＲ１４７Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２６、ＭＩＲ４３２６；ｈｓａ－ｍｉｒ－５７３、ＭＩＲ５７３。これらのマーカーは、血液中のエクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体の中、または他の保護された状態で存在し得る。
図３９は、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのトランスクリプトームデータセットを生成するためにＧＥＮＣＯＤＥアノテーションと整列させた、様々な公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｏｎ ＳＴ ＣＥＬデータの解析を通して導出された、血液ベースの固形腫瘍特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーのリストを提供する。これらのデータセット（様々ながんの種類、ならびに正常組織、および末梢血）にわたって比較解析を行い、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーリストを生成した。かかるｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、血液中のエクソソームまたは他の保護された状態で濃縮され得る。
加えて、図４０は、血液中のエクソソーム、腫瘍関連小胞、または他の保護された状態で濃縮され得る血液ベースの固形腫瘍特異的エクソン転写産物のリストを提供する。過剰発現されたがん遺伝子転写産物、または変異がん遺伝子の転写産物は、がんの拡散を駆動し得るので、エクソソームに濃縮され得る。
図４１は、がんタンパク質マーカーのリストを提供する。これらは、固形腫瘍から生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定されたもので、血液中のエクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで特定され得る。
固形腫瘍によって血液中に分泌されることができるタンパク質マーカーとしては、以下が含まれるが、これらに限定されない：（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）；特性不明のタンパク質Ｃ１９ｏｒｆ４８、Ｑ６ＲＵＩ８；タンパク質ＦＡＭ７２Ｂ、Ｑ８６Ｘ６０；タンパク質ＦＡＭ７２Ｄ、Ｑ６Ｌ９Ｔ８；ヒドロキシアシルグルタチオン加水分解酵素様タンパク質、Ｑ６ＰＩＩ５；推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ５、Ｑ９６Ｐ１１；ＲＮＡ偽ウリジル酸シンターゼドメイン含有タンパク質１、Ｑ９ＵＪＪ７；コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質１、Ｑ９６ＣＧ８；インターロイキン１１、Ｐ２０８０９；ストロメリシン２、Ｐ０９２３８；マトリックスメタロプロテイナーゼ－９、Ｐ１４７８０；ポドカン様タンパク質１、Ｑ６ＰＥＺ８；推定ペプチドＹＹ－２、Ｑ９ＮＲＩ６；オステオポンチン、Ｐ１０４５１；スルフヒドリルオキシダーゼ２、Ｑ６ＺＲＰ７；グリピカン－２、Ｑ８Ｎ１５８；マクロファージ遊走阻害因子、Ｐ１４１７４；ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼＡ、Ｐ６２９３７；およびカルレティキュリン、Ｐ２７７９７。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較分析を行い、続いて追加のバイオインフォマティクスフィルタリングを行い、翻訳されたタンパク質が細胞から分泌される可能性を予測する（Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ： ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ”， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７ （２０１２）。
固形腫瘍において一般に見出される変異は、がんの血漿ベースのマーカーとして使用される場合があり、それらは、ＣＯＳＭＩＣおよび／またはＴＣＧＡデータセットから入手可能である：ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）、ＫＲＡＳ（Ｋ－Ｒａｓ）。転移性疾患を有する患者からの血漿中の変異を特定する初期の研究により、患者のみならず、年齢マッチ対象においても平均で５個の変異があることが明らかになった。２Ｍｂ、５０８遺伝子パネルおよび６０，０００倍を超える深度の配列決定を使用するフォローアップ研究により、がんを有しない個体からの白血球の９３．６パーセントおよびがんを有する個体の白血球の９９．１パーセントに変異が出現したことが示された（その全体で参照により本明細書に組み入れられる、Ｒａｚａｖｉ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ （ｃｆＤＮＡ） Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ Ｔｅｓｔｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５（１５）：１１５２６－１１５２６ （２０１７）； Ｒａｚａｖｉ， ｅｔ ａｌ．， “Ｈｉｇｈ－ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖａｒｉａｎｔｓ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｄｅｃ；２５（１２）：１９２８－１９３７ （２０１９））。加齢関連クローン性造血として知られるこの現象は、白血球で変異が蓄積し、次いで、クローン増殖を起こすことに起因する。血漿中の変異のマーカーをスクリーニングする場合、推定上の陽性変異は組織内部（おそらく腫瘍に対応する）に起因し、クローン性造血が原因ではないことを検証するために、常に同じ個体由来のＷＢＣ ＤＮＡのアリコートを配列決定することが重要である。
血液中には存在しないが、５０％の感度で固形腫瘍型に平均的に存在するメチル化マーカーのＴＣＧＡデータベースの詳細な解析は、３つの一般的なカテゴリーのクラスターを示す：（ｉ）大腸がん、および関連ＧＩがん（胃がんおよび食道がん）に存在するマーカー、（ｉｉ）大腸がん、および関連ＧＩがん（胃がんおよび食道がん）、および他の腫瘍に存在するマーカー、ならびに（ｉｉｉ）他の腫瘍に存在するが、大腸がんにはほとんど存在しないマーカー。第２に、いくつかの腫瘍型については、第２群（乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん）など、その群に固有のマーカーを容易に特定することができたが、肺がんまたは膵臓がんなどの他の腫瘍型については、その群に固有のメチル化マーカーを特定することは困難であった。したがって、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が５０％の少なくとも３６個のマーカーの基準を満たす９６個のマーカーのセットを構築するために、最初の４８個のマーカーは、第２群腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、第３群腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、第４群腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、および第５群腫瘍で強く表された約１２個のマーカーからなる。残りの４８個のマーカーは、第１群および第２群の腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、第１群および第３群の腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、第１群および第４群の腫瘍で強く表された約１２個のマーカー、ならびに第１群および第５群の腫瘍で強く表された約１２個のマーカーからなる。
図４２は、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、固形腫瘍の存在を特定するために使用され得る。図５７は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、固形腫瘍の存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位とその隣接部位、およびＣＲＣが低い～ない代替マーカーが含まれる。代替マーカーはＣＲＣで高く、他のがんでは、高いかまたは高くない場合がある。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替メチル化マーカーのプライマーセットは、仮想実験セクションの表４０に列挙される。
表３９は、男女両方の原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーションを提供する。上記のように９６個のマーカーのセットを構築し、ＴＣＧＡおよびＧＥＯのデータベースで、がん患者の各々の中の陽性試料の割合を評価した。分析された各がんの患者総数は、以下のとおりである：第１群（大腸がん：ＣＲＣ－ＰＴ＝３９５、胃がん：ＳＴ－Ｐｔ＝２６０、食道がん：ＥＳ－Ｐｔ＝１８５）、第２群（乳がん：ＢＲ－Ｐｔ＝６６８、子宮内膜がん：ＥＮＤ－Ｐｔ＝４３１、卵巣がん：ＯＶ－Ｐｔ＝７９、子宮頸がん：ＣＥＲＶ－Ｐｔ＝３０７、子宮がん：ＵＴＣＳ－Ｐｔ＝５７）、第３群（肺腺がん：ＬＵＡＤ＝４５０、肺扁平上皮がん：ＬＵＳＣ＝３７２、頭頸部がん：ＨＮＳＣ－Ｐｔ＝５２８）、第４群（前立腺がん、ＰＲＯＳ－Ｐｔ＝１９２、膀胱がん：ＢＬＡＤ－Ｐｔ＝４１２）、および第５群（肝臓がん：ＬＩＶ－Ｐｔ＝３７７、膵臓がん：ＰＡＮＣ－Ｐｔ＝１８４、ならびに膀胱がん：ＢＩＬＥ－Ｐｔ＝３６）。列は、各々のマーカーに対して陽性の患者の割合（％）の合計を、使用されたマーカーの総数で割った値を反映する。すべてのがんの最初の行では、９６個のマーカーになる。したがって、平均で、選択された９６個のマーカーのうち、平均感度スコアの数は、以下のとおりである：第１群（大腸がん＝４４、胃がん＝４５、食道がん＝４０）、第２群（乳がん＝３８、子宮内膜がん＝４０、卵巣がん＝２２、子宮頸がん＝３９、子宮がん＝３３）、第３群（肺腺がん＝３１、肺扁平上皮がん＝３１、頭頸部がん＝３３）、第４群（前立腺がん＝４５、膀胱がん＝３６）、および第５群（肝臓がん＝３８、膵臓がん＝２７、胆嚢がん＝４７）。これは、平均感度が５０％を有するマーカー当量の以下の数（＝９６×スコア／５０）に変換される：第１群（大腸がん＝８５マーカー当量、胃がん＝８６マーカー当量、食道がん＝７８マーカー当量）、第２群（乳がん＝７４マーカー当量、子宮内膜がん＝７６マーカー当量、卵巣がん＝４２マーカー当量、子宮頸がん＝７５マーカー当量、子宮がん＝６４マーカー当量）、第３群（肺腺がん＝６０マーカー当量、肺扁平上皮がん＝５９マーカー当量、頭頸部がん＝６４マーカー当量）、第４群（前立腺がん＝８６マーカー当量、膀胱がん＝７０マーカー当量）、および第５群（肝臓がん＝７４マーカー当量、膵臓がん＝５１マーカー当量、胆嚢がん＝９１マーカー当量）。したがって、がんは、異なるがんの種類に対して、４２～９１マーカー当量の範囲でよく表されており、平均感度が５０％の３６個のマーカーの最小値をはるかに上回っていた。
（表３９）両性の原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
上記の数は、平均感度が６６％のマーカー当量の以下の数（＝９６×スコア／６６）に変換される：第１群（大腸がん＝６５マーカー当量、胃がん＝６５マーカー当量、食道がん＝５９マーカー当量）、第２群（乳がん＝５６マーカー当量、子宮内膜がん＝５８マーカー当量、卵巣がん＝３２マーカー当量、子宮頸がん＝５７マーカー当量、子宮がん＝４８マーカー当量）、第３群（肺腺がん＝４５マーカー当量、肺扁平上皮がん＝４５マーカー当量、頭頸部がん＝４８マーカー当量）、第４群（前立腺がん＝６５マーカー当量、膀胱がん＝５３マーカー当量）、および第５群（肝臓がん＝５６マーカー当量、膵臓がん＝３９マーカー当量、胆嚢がん＝６９マーカー当量）。したがって、がんは、様々ながんの種類に対して、３２～６９マーカー当量の範囲でよく表されており、３２である卵巣がんを除いて、他のがんの種類は、平均感度が６６％の３６個のマーカーの最小値を上回っている。
次いで、最も一般的なマーカーが最初に列挙されるように、上述のマーカーを、上記のがんの種類の各々に対して並べ替えた。例えば、ＣＲＣでは、９６個のマーカーのうち、５４個のマーカーが５５を超えるスコアを与え（すなわち、３９５人の患者の５５％を超えるスコアで陽性であった）、９個のマーカーが２５～５４のスコアを与えた（すなわち、３９５人の患者の２５％～５４％で陽性であった）。合計３０個のマーカーに対して、上位のセットの半分および下位のセットの３分の１を、「ＣＲＣ１」および「ＣＲＣ２」と名付けた２つのマーカー検査セットに分配した（表４１の行２および３）。これらのマーカーセットは、陽性の可能性があるマーカーの半分がアッセイで検出される場合、理想的な結果を反映するであろう。これは、早期腫瘍では血漿中のマーカー分子の数が少ない可能性を考慮しておらず、したがって、このシミュレーションにおいて、陽性マーカーの実際の数は、理想的な結果よりも少ない。各々のがんの陽性患者の割合を記録し、次いで、そのがんの種類に使用されるマーカーの総数で割った。予想されたように、所与の腫瘍型のマーカーを選択する場合、これらのマーカーは、平均よりも高いスコア（すなわち、未選択の９６個のマーカーに対する４４のスコアと比較して、選択された３０個のマーカーの２つのセットの各々で、ＣＲＣに対して６６のスコア）を与えるべきである。これらのマーカーは、表４１にわたって対角線を形成し、太字および薄い灰色の背景で強調表示されている。
各列について、そのがんの種類の陽性マーカーの数と同じ範囲またはそれよりも高いマーカーセットも、薄い灰色の背景で示されている。例えば、大腸がん、胃がんまたは食道がんを有する患者は、胃がんを有する潜在的陽性としてスコア付けされる。これは、これらの３つのがんのマーカーが重複している（それらはすべて第１群のビンである）ため、理にかなっている。これらは、第１群マーカー上のアッセイのステップ２において識別することができ、これらのマーカーは、がんの種類により特異的であり、最も可能性の高いがんの種類を引き出す。ＳＴ－Ｐｔ列の評価は、２つのＬＵＡＤ、ＢＬＡＤ、および両方のＰＡＮＣのうちの１つについてのシミュレーションが、胃がんと解釈され得るスコアをもたらしたことを示している。したがって、第１のステップは、アッセイの第２のステップにおいて、検査すべき群を常に特定できるわけではない。しかし、曖昧性のほとんどは、グループメンバー（すなわち、第２群）内にある。これは、マーカーが、第２のステップで検査するグループを選択する能力を最大化するために選択されたため、理にかなっている。
表４０および４１は、表３９のシミュレーションにおける前述の結果を用い、その性別での所与のがんの種類の発生率（％）で乗算し（それぞれ、表３７および３８を参照）、結果を同じ桁（１０倍）に調整する。この概念は、低いスコアの高発生率のがん（例えば、ＣＲＣ）が、より高いスコアの低発生率のがん（例えば、肺扁平上皮がん）のより一般的な原発組織であり得ることを、医師が考慮するためのものである。表４０および４１は、対角線上にない灰色で強調表示されたセルの数によって示されるように、原発組織の特定における曖昧性のレベルが、男性患者間よりも女性患者間で高いことを示す。すべての場合で、医師は、患者を確認用の画像診断に送る前に、分子データだけでなく、喫煙歴などのすべてのデータを組み込んで、最も可能性の高い原発組織を決定する必要がある。
（表４０）男性のがんの原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
（表４１）女性のがんの原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
表４２、４３、および４４は、表３９、４０、および４１のシミュレーションにおける前述の結果を用い、パーセンテージ（＝がん型特異的なシミュレーションのスコア／その種類のすべてのがんのスコア－１）を用いることによって、ニュートラルな結果からの偏差（％）を決定する。したがって、各々のこれらのテーブルの最初の行は、０％でなければならない。再び、対角線にわたるパーセンテージよりも高い、または同じ範囲のパーセンテージは、薄い灰色で強調表示されている。このセットのマーカーを選択することは、食道がんまたは胆嚢がんを原発組織として識別するのに理想的ではない場合があるが、それでもそれらは、ステップ２のアッセイのどの群を検査すべきか、医師に指針を与えるのにかなり有益である。この単純なスコアリングは、前述の９６個のマーカーセットを使用する臨床試料を用いた結果のデータベースに基づくＡＩアプローチを使用することによって増強され得る。
（表４２）両性の原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、ニュートラルな結果からの偏差（％）を示す、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
（表４３）男性のがんの原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、ニュートラルな結果からの偏差（％）を示す、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
（表４４）女性のがんの原発組織について最も可能性の高い群を特定するための、ニュートラルな結果からの偏差（％）を示す、平均感度が５０％の９６個のマーカーのアッセイのシミュレーション
アッセイの第２のステップについて、以下の群のうちの１つ、２つ、またはそれ以上を検査する。６４個のマーカーのセットを有する各群は、平均で、感度が５０％の少なくとも３６個のマーカーを含み、以下の群の上記１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする：第１群（大腸がん、胃がん、および食道がん）、第２群（乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん）、第３群（肺がん、および頭頸部がん）、第４群（前立腺がんおよび膀胱がん）、および第５群（肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん）。これらの群特異的およびがん型特異的マーカーには、がん特異的マイクロＲＮＡマーカー、がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカー、がん特異的エキソン転写産物、腫瘍関連抗原、がんタンパク質マーカー、固形腫瘍によって血液中に分泌され得るタンパク質マーカー、共通の変異、固形腫瘍および組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位、固形腫瘍および組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位である染色体領域またはサブ領域、ならびに固形腫瘍および組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位および隣接するＣｐＧ部位が含まれるが、これらに限定されない。当該マーカーを検出するための方法は、本願の上記で説明されており、これらのマーカーを列挙している図面は、各群について以下に説明されている。
第１群（大腸がん、胃がん、および食道がん）：第１群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの大腸がん、胃がん、および食道がん特異的マイクロＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－６２４，ＭＩＲ６２４。このｍｉＲＮＡは、ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して特定され、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中の他の保護された状態に存在し得る。
第１群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの大腸がん、胃がん、および食道がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８）］，ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ：ＬＩＮＣ０１５５８，ｃｈｒ６：１６７７８４５３７－１６７７９６８５９，ＥＮＳＧ０００００１４６５２１．８。このｎｃＲＮＡは、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡトランスクリプトームデータセットを生成するためのＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに整列させた、様々な公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｏｎ ＳＴ ＣＥＬデータの比較解析を通して特定された。かかるｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、エクソソームまたは血液中の他の保護された状態で濃縮され得る。
加えて、図４４は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、または血液中の他の保護された状態で濃縮され得る、血液ベースの大腸がん、胃がん、および食道がん特異的エキソン転写産物のリストを提供する。
第１群を他の群から識別するために使用され得る、大腸がん、胃がん、および食道がん特異的がんタンパク質をコードするマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＥＬＥ，１ｑ２２－ｑ２５，セレクチンＥ，Ｐ１６５８１、ＯＴＵＤ４，４ｑ３１．２１，ＯＴＵドメイン含有４，Ｑ０１８０４、ＢＰＩ，２０ｑ１１．２３，殺菌性／透過性増強タンパク質，Ｐ１７２１３、ＡＳＢ４，７ｑ２１－ｑ２２，アンキリンリピートおよびＳＯＣＳボックス含有４，Ｑ９Ｙ５７４、Ｃ６ｏｒｆ１２３，６ｑ２７，染色体６オープンリーディングフレーム１２３，Ｑ９Ｙ６Ｚ２、ＫＰＮＡ３，１３ｑ１４．３，カリオフェリンα３（インポーチンα４），Ｏ００５０５、およびＮＵＰ９８，１１ｐ１５，ヌクレオポリン９８ｋＤａ，Ｐ５２９４８、（大腸がん、胃がん、および食道がんから生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定されたもので、エクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで血液中で特定され得る）。
大腸がん、胃がん、および食道がんによって血液中に分泌され得、第１群を他の群から識別するために使用され得るタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：殺菌性・透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ ５７），Ｐ１７２１。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較解析を行い、続いて追加のバイオインフォマティクスフィルターを行い、翻訳されたタンパク質が細胞から分泌される可能性を予測する（Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，”Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７（２０１２）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。
大腸がん、胃がん、および食道がんにおける変異の分布は、公開されているＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的なものは、以下のとおりである：ＡＰＣ（ＡＰＣ、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ１（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン１）、ＤＮＡＨ１１（ダイニン軸糸重鎖１１）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＦＡＴ３（ＦＡＴ非定型カドヘリン３）、ＦＡＴ４（ＦＡＴ非定型カドヘリン４）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ３（ＧＬＩファミリー亜鉛フィンガー３）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＯＢＳＣＮ（オブスキュリン、細胞骨格カルモジュリンおよびタイチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（ピッコロ、シナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、およびＵＮＣ１３Ｃ（ｕｎｃ－１３ホモログＣ）。
図４５は、大腸がん、胃がん、および食道がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、大腸がん、胃がん、および食道がんの存在を特定するために使用され得る。図４６は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、大腸がん、胃がん、および食道がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、大腸がん、胃がん、および食道がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位、およびＣＲＣが高い代替マーカーが含まれる。代替マーカーは、ＣＲＣで低い～ないが、胃がんおよび／または食道がんでは高い。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替メチル化マーカーのプライマーセットは、仮想実験セクションの表４７に列挙されている。平均感度が５０％のこれらの６４個のマーカーを選択することで、第１群について以下のスコアを得た：（大腸がん＝４８、胃がん＝５１、食道がん＝４３）。これらは、平均感度が５０％の以下のマーカー当量数（＝６４×スコア／５０）に変換される：（大腸がん＝６２マーカー当量、胃がん＝６５マーカー当量、食道がん＝５５マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに上回った。平均感度が６６％のマーカー当量（＝６４×スコア／６６）：（大腸がん＝４７マーカー当量、胃がん＝５０マーカー当量、食道がん＝４２マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに上回った。
第２群（乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん）：第２群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん特異的マイクロＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６５，ＭＩＲ１２６５。このマーカーは、ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して特定され、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中の他の保護された状態に存在し得る。
グループ２を他のグループから識別するために使用され得る、血液ベースの乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん特異的エクソン転写産物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（エクソン位置、遺伝子）；ｃｈｒ２：１７９２０９０１３－１７９２０９０８７：＋、ＯＳＢＰＬ６；ｃｈｒ２：１７９２５１７８８－１７９２５１８６６：＋、ＯＳＢＰＬ６；およびｃｈｒ２：１７９２５３７３６－１７９２５３８８０：＋、ＯＳＢＰＬ６。これらは、血液中のエクソソーム、腫瘍関連小胞、または他の保護された状態で濃縮され得る。
グループ２を他のグループから識別するために使用され得る、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんタンパク質マーカーから生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定された乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＲＳＰＯ２、８ｑ２３．１、Ｒ－スポンジン２、Ｑ６ＵＸＸ９；ＫＬＣ４、６ｐ２１．１、キネシン軽鎖４、Ｑ９ＮＳＫ０；ＧＬＲＸ、５ｑ１４、グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ）、Ｐ３５７５４。これらのマーカーは、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんから生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定され得、これらは、血液中のエクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで特定され得る。
第２群を他の群から識別するために使用され得、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんによって血液中に分泌され得るタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：Ｒ－スポンジン－２（蓋板特異的スポンジン－２）（ｈＲｓｐｏ２），Ｑ６ＵＸＸ９。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較解析を行い、続いて、追加のバイオインフォマティクスフィルター（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，”Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７（２０１２））を行って、翻訳されたタンパク質が細胞によって分泌される可能性を予測した。
乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がんの変異の分布は、公開されているＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的な２０個の変異遺伝子は、以下のとおりである：ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）、およびＴＴＮ（タイチン）。
図４７は、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんの存在を特定するために使用され得る。図４８は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位、ならびに乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんを識別するために使用され得る代替マーカーが含まれている。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替メチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の仮想実験セクションの表４８に列挙されている。平均感度が５０％のこれらの６４個のマーカーを選択することで、第２群について以下のスコアを得た：（乳がん＝３６、子宮内膜がん＝４９、卵巣がん＝３２、子宮頸がん＝３３、子宮がん＝４７）。これらは、平均感度が５０％の以下のマーカー当量数（＝６４×スコア／５０）に変換される：（乳がん＝４７マーカー当量、子宮内膜がん＝６３マーカー当量、卵巣がん＝４１マーカー当量、子宮頸がん＝４２マーカー当量、子宮がん＝６１マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに上回った。平均感度が６６％のマーカー当量（＝６４×スコア／６６）；（乳がん＝３５マーカー当量、子宮内膜がん＝４８マーカー当量、卵巣がん＝３１マーカー当量、子宮頸がん＝３２マーカー当量、子宮がん＝４６マーカー当量）。したがって、３個のマーカーは平均以下であり、２個のマーカーは、平均の３６マーカー当量の最小値を上回っている。しかしながら、かかるスコアは、異なるマーカーの選択によって改善され得る。
第３群（肺腺がん、肺扁平上皮がん、および頭頸部がん）：第３群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの肺がん、頭部がん、および頸部がん特異的マイクロＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－２８，ＭＩＲ２８。このマーカーは、ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して特定され、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中の他の保護された状態に存在し得る。
第３群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの肺がん、頭部がん、および頸部がん特異的エキソン転写産物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（エキソン位置，遺伝子）ｃｈｒ２：ｃｈｒ１：９３３０７７２１－９３３０９７５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１２７４０－９３３１２９１６：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１６４０５－９３３１６５１２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ８：２２２７２２９３－２２２７２４１５：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ１４：３９５０９９３６－３９５１００９１：－，ＳＥＣ２３Ａ、ｃｈｒ１４：３９５１１９９０－３９５１２０７６：－，ＳＥＣ２３Ａ（エクソソーム、腫瘍関連小胞、または血液中の他の保護された状態で濃縮され得る）。
第３群を他の群から識別するために使用され得る、肺がん、頭部がん、および頸部がんタンパク質をコードするマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＴＲＮ３，１４ｑ１３－ｑ２１，ストリアチン，カルモジュリン結合タンパク質３，Ｑ１３０３３、ＬＲＲＣ１７，７ｑ２２．１，ロイシンリッチリピート含有１７，Ｑ８Ｎ６Ｙ２、ＦＡＭ６９Ａ，１ｐ２２，配列類似性を有するファミリー６９，メンバーＡ，Ｑ５Ｔ７Ｍ９、ＡＴＦ２，２ｑ３２，活性化転写因子２，Ｐ１５３３６、ＢＨＭＴ，５ｑ１４．１，ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ，Ｑ９３０８８、ＯＤＺ３／ＴＥＮＭ３，４ｑ３４．３－ｑ３５．１，テニューリン膜貫通タンパク質３，Ｑ９Ｐ２７３、ＺＦＨＸ４，８ｑ２１．１１，亜鉛フィンガーホメオボックス４，Ｑ８６ＵＰ３。これらのマーカーは、肺がん、頭部がん、および頸部がんから生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定され得、エクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで血液中で特定され得る。
肺がん、頭部がん、および頸部がんによって血液中に分泌され得、第３群を他の群から識別するために使用され得るタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）；ロイシンリッチリピート含有タンパク質１７（ｐ３７ＮＢ），Ｑ８Ｎ６Ｙ２。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較解析を行い、続いて追加のバイオインフォマティクスフィルターを行い、翻訳されたタンパク質が細胞から分泌される可能性を予測する（Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，”Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７（２０１２）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。
肺がん、頭部がん、および頸部がんにおける変異の分布は、公開されているＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的なものは、以下のとおりである：ＣＳＭＤ３（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン３）、ＤＮＡＨ５（ダイニン軸糸重鎖５）、ＦＡＴ１（ＦＡＴ非定型カドヘリン１）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＰＣＬＯ（ピッコロシナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ１Ｌ１（ＰＫＨＤ１様１）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＵＳＨ２Ａ（アッシャリン）、およびＸＩＲＰ２（ｘｉｎアクチン結合リピート含有２）。
図４９は、肺がん、頭部がん、および頸部がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肺がん、頭部がん、および頸部がんの存在を特定するために使用され得る。図５０は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、肺がん、頭部がん、および頸部がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肺がん、頭部がん、および頸部がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれ、肺がん、頭部がん、および頸部がんを識別するために使用され得る。これらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、仮想実験セクションの表４９に列挙されている。平均感度が５０％のこれらの６４個のマーカーを選択することで、第３群について以下のスコアを得た：（肺腺がん＝４１、肺扁平上皮がん＝４９、頭頸部がん＝５３）。これは、平均感度が５０％の以下のマーカー当量数（＝６４×スコア／５０）に変換される：（肺腺がん＝５２マーカー当量、肺扁平上皮がん＝６２マーカー当量、頭頸部がん＝６７マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに上回った。平均感度が６６％のマーカー当量（＝６４×スコア／６６）：（肺腺がん＝４０マーカー当量、肺扁平上皮がん＝４７マーカー当量、頭頸部がん＝５１マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに上回った。
第４群（前立腺がんおよび膀胱がん）：第４群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースまたは尿ベースの前立腺がんおよび膀胱がん特異的マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－４９１，ＭＩＲ４９１、ｈｓａ－ｍｉｒ－１４６８，ＭＩＲ１４６８。これらのマーカーは、ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して特定され、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中もしくは尿中の他の保護された状態に存在し得る。
第４群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースまたは尿ベースの前立腺がんおよび膀胱がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８），ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ００７３８３．３，ｃｈｒ２：２０６０８４６０５－２０６０８６５６４，ＥＮＳＧ０００００２２７９４６．１、ＬＩＮＣ００３２４，ｃｈｒ１７：８２２０６４２－８２２４０４３，ＥＮＳＧ０００００１７８９７７．３。これらのマーカーは、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡトランスクリプトームデータセットを生成するためのＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに整列させた、様々な公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｏｎ ＳＴ ＣＥＬデータの比較解析を通して特定された。かかるｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、エクソソームまたは血液中もしくは尿中の他の保護された状態で濃縮され得る。
第４群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースまたは尿ベースの前立腺がんおよび膀胱がん特異的エキソン転写産物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（エキソン位置，遺伝子）：ｃｈｒ２１：４５５５５９４２－４５５５６０５５：＋，Ｃ２１ｏｒｆ３３（エクソソーム、腫瘍関連小胞、または血液中もしくは尿中の他の保護された状態で濃縮され得る）。
第４群を他の群から識別するために使用され得る、前立腺がんおよび膀胱がんタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＰＭＭ１，２２ｑ１３，ホスホマンノムターゼ１，Ｑ９２８７１。このマーカーは、肺がん、頭部がん、および頸部がんから生じるｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定され得、エクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内もしくは尿内の遊離状態のいずれかで血液中で特定され得る。
前立腺がんおよび膀胱がんにおける変異の分布は、公開ＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的なものは、ＢＡＧＥ２（ＢＡＧＥファミリーメンバー２）、ＤＮＭ１Ｐ４７（ダイナミン１偽遺伝子４７）、ＦＲＧ１ＢＰ（領域遺伝子１ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＲＰ１１－１５６Ｐ１．３、ＴＴＮ（タイチン）、およびＴＵＢＢ８Ｐ７（チューブリンβ８クラスＶＩＩＩ偽遺伝子７）である。
図５１は、前立腺がんおよび膀胱がん特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。ｃｆＤＮＡ、エクソソーム内のＤＮＡ、または血液内もしくは尿内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、前立腺がんおよび膀胱がんの存在を特定するために使用され得る。図５２は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、前立腺がんおよび膀胱がん特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内もしくは尿内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、前立腺がんおよび膀胱がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれ、前立腺がんおよび膀胱がんを識別するために使用され得る。これらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、仮想実験セクションの表５０に列挙されている。平均感度が５０％のこれらの４８個のマーカーを選択することで、第４群について以下のスコアを得た：（前立腺がん＝４８、膀胱がん＝２２）。これは、平均感度が５０％の以下のマーカー当量数（＝４８×スコア／５０）に変換される：（前立腺がん＝４６マーカー当量、膀胱がん＝２１マーカー当量）。したがって、膀胱は、平均の３６マーカー当量の最小値を下回った。同様に、平均感度が６６％のマーカー当量（＝４８×スコア／６０）；（前立腺がん＝３５マーカー当量、膀胱がん＝１６マーカー当量）。したがって、膀胱がんは、平均の３６マーカー当量の最小値をはるかに下回った。しかし、異なるマーカーの選択は、例えば、マーカーを４８個から６４個に増やすことによって、前立腺がんおよび膀胱がんの両方に陽性であったマーカーを含めることによって、この状況を是正するであろう。マーカーは、尿試料からの偽陽性結果を最小限に抑えるために、正常な前立腺、膀胱、または腎臓の組織でメチル化されていないものに限定された。
第５群（肝臓がん、膵臓がん、胆嚢がん）：第５群を他の群から識別するために使用され得る、血液ベースの肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん特異的マイクロＲＮＡマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－１３２，ＭＩＲ１３２。このマーカーは、ＴＣＧＡマイクロＲＮＡデータセットの解析を通して特定され、エクソソーム、腫瘍関連小胞、アルゴノート複合体、または血液中の他の保護された状態に存在し得る。
図５３は、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのトランスクリプトームデータセットを生成するためにＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに整列させた、様々な公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｏｎ ＳＴ ＣＥＬデータの解析を通して導出された、血液ベースの肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡマーカーのリストを提供する。かかるｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、エクソソームまたは血液中の他の保護された状態で濃縮され得る。
加えて、図５４は、エクソソーム、腫瘍関連小胞、または血液中の他の保護された状態で濃縮され得る、血液ベースの肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん特異的エキソン転写産物のリストを提供する。
図５５は、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんのタンパク質マーカーのリストを提供する。肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんから生じるがんｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を介して特定されたもので、エクソソーム、他の保護された状態、腫瘍関連小胞の中、または血漿内の遊離状態のいずれかで血液中で特定され得る。
肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんによって血液中に分泌され得、第５群を他の群から識別するために使用され得るタンパク質マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン），Ｐ０６３９６、プロニューレグリン－２，Ｏ１４５１１、ＣＤ５９糖タンパク質（１Ｆ５抗原）（２０ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－２０）（ＨＲＦ２０）（ＭＡＣ－抑制タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ４３抗原）（膜侵襲複合体抑制因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害剤）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ５９），Ｐ１３９８７、および分岐プロテインキナーゼ２Ｂ（自閉症関連タンパク質１で欠損），Ｑ９Ｈ７Ｙ０。様々なＴＣＧＡデータセット（腫瘍、正常）にわたって比較解析を行い、続いて追加のバイオインフォマティクスフィルターを行い、翻訳されたタンパク質が細胞から分泌される可能性を予測する（Ｍｅｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，”Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：１－７（２０１２）、その全体が、参照により本明細書に援用される）。
肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんにおける変異の分布は、公開されているＣＯＳＭＩＣデータベースで入手可能であり、最も一般的なものは、以下のとおりである：ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＭＵＣ４（ムチン４、細胞表面結合）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、およびＴＴＮ（タイチン）。
図５６は、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がん特異的なマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんの存在を特定するために使用され得る。図５７は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、ｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または血液内の他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位、ならびに肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんを識別するために使用され得る代替マーカーが含まれている。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替メチル化マーカーのプライマーセットは、仮想実験セクションの表５１に列挙される。平均感度が５０％のこれらの６４個のマーカーを選択することで、第５群について以下のスコアを得た：（肝臓がん＝５７、膵臓がん＝３０、胆嚢がん＝６０）。これは、平均感度が５０％の以下のマーカー当量数（＝６４×スコア／５０）に変換される：（肝臓がん＝７３マーカー当量、膵臓がん＝３８マーカー当量、胆嚢がん＝７７マーカー当量）。したがって、すべてが、平均の３６マーカー当量の最小値を上回った。平均感度が６６％のマーカー当量（＝６４×スコア／６６）：（肝臓がん＝５６マーカー当量、膵臓がん＝２９マーカー当量、胆嚢がん＝５８マーカー当量）。したがって、肝臓および胆嚢は、平均の３６マーカー当量の最小値を上回り、一方、膵臓は、平均以下であった。
さて、第１のステップが、グループに関係なくできるだけ多くのがんをカバーするマーカーであって、それでも全部で５つのグループのがんをカバーするために十分なほど多様であるマーカーを特定することである戦略に戻り（図１Ｇ、１Ｈ、１Ｋおよび１Ｌ）、目標が、早期がんの高感度検出を行うことであることを考慮する。その検出では、アッセイの第１のステップは、前述の１６種類の固形腫瘍（５つのグループにおいてカバーされる）の各々をカバーする、感度７５％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む６４個マーカーのセットを使用するであろう。
血液中に存在しないが、感度７５％で多くの固形腫瘍種類に平均して存在するメチル化マーカーのＴＣＧＡデータベースの奥深い解析により、膵臓がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、および卵巣がんのマーカーの不足が示される。結果的に、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする、感度が７５％で少なくとも３６個のマーカーという基準を満たした６４個マーカーのセットを集めるために、マーカーの焦点は、以下の平均感度スコアを用いて、最初にそれらのがんをカバーすること、および他のがんについても同様によく表されたマーカーを選ぶことにより他のがんについての数を増やすことに合わせた：グループ１（結腸直腸がん＝７５、胃がん＝６８、食道がん＝７２）；グループ２（乳がん＝６６、子宮内膜がん＝７３、卵巣がん＝５４、子宮頸がん＝７３、子宮がん＝６７）；グループ３（肺腺がん＝５４、肺扁平上皮がん＝５８、頭頸部がん＝６４）；グループ４（前立腺がん＝７２、膀胱がん＝６３）；およびグループ５（肝臓がん＝５３、膵臓がん＝４５、胆嚢がん＝６８）。これは、平均感度７５％で以下のマーカー当量数（＝６４×スコア／７５）に変換される；（結腸直腸がん＝６４マーカー当量；胃がん＝５８マーカー当量；食道がん＝６１マーカー当量）；グループ２（乳がん＝５７マーカー当量；子宮内膜がん＝６２マーカー当量；卵巣がん＝４６マーカー当量；子宮頸がん＝６２マーカー当量；子宮がん＝５７マーカー当量）；グループ３（肺腺がん＝４６マーカー当量；肺扁平上皮がん＝４９マーカー当量；頭頸部がん＝５４マーカー当量）；グループ４（前立腺がん＝６１マーカー当量；膀胱がん＝５３マーカー当量）；およびグループ５（肝臓がん＝４５マーカー当量；膵臓がん＝３９マーカー当量；胆嚢がん＝５８マーカー当量）。したがって、がんは、異なるがんの種類に対して、３９～６４マーカー当量の範囲でよく表されており、すべては平均感度が７５％で３６個のマーカーの最低値を上回っていた。
図５８は、固形腫瘍のマーカーおよび組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、固形腫瘍の存在を特定するために使用され得る。図５９は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、固形腫瘍のマーカーおよび組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、固形腫瘍の存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位、およびその隣接部位、ならびに好ましい代替マーカー、および複数のがんで高いさらなる代替マーカーが含まれる。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替的なメチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号のその予言的実験セクションの表５２に列挙されている。患者が内部に隠れた早期がんを有する場合、これらのプライマーは、特定の種類の原発組織を特定するためでなく、単に合理的な感度および特異度で決定するために設計されている（下記を参照）。５個以上のマーカーが陽性の患者は、最も可能性の高い原発組織を決定するために、次いで、さらなる検査に自動的に供される。前述のように、一アプローチは、既述のマーカーのセットを用いて続けること、すなわち、各腫瘍型に対して感度５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む９６個マーカーのセットを使用することである（図１Ｇまたは１Ｈ）。別のアプローチは、感度５０％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む９６個マーカーのセットを用いて開始し、次いで、ステップ２で、そのグループに存在し得る前述の種類の固形腫瘍の各々をカバーする感度７５％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む、１～２セットの４８個グループ特異的マーカーを用いて続けることであろう（図１Ｆ）。陽性であるマーカーをスコアリングし、被験グループ内の各々のがん種類に対して予測された陽性と比較することにより、医師は、最も可能性の高い原発組織を特定し、その後、患者を適切な画像診断に送ることができる。
図１Ｆのアッセイの第２のステップについて、以下のグループのうちの１～２つが検査される。各グループは、前述の１６種類の固形腫瘍の各々をカバーする感度７５％で少なくとも３６個のマーカーを平均で含む４８個マーカーのセットを有する。これらの高パーセンテージヒットマーカーはまた、治療有効性および再発のモニタリングに理想的に適合する（下記を参照）。腫瘍は、以下のグループ内にあった：グループ１（結腸直腸がん、胃がん、および食道がん）；グループ２（乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がん）；グループ３（肺がんおよび頭頸部がん）；グループ４（前立腺がんおよび膀胱がん）；およびグループ５（肝臓がん、膵臓がん、または胆嚢がん）。これらのグループ特異的マーカーおよびがんの種類特異的マーカーには、がん特異的マイクロＲＮＡマーカー、がん特異的ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのマーカー、がん特異的エクソン転写産物、腫瘍関連抗原、がんタンパク質マーカー、固形腫瘍により血液中に分泌されることができるタンパク質マーカー、共通変異、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位、固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位が内部にある染色体領域またはサブ領域、ならびに固形腫瘍マーカーおよび組織特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位および隣接ＣｐＧ部位が含まれるが、それに限定されるわけではない。前記マーカーを検出するための方法は、本出願に前述されており、下のグループごとにこれらのマーカーを列挙している図が記載されている。
図６０は、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんのマーカーならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これらは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんの存在を特定するために使用され得る。図６１は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんのマーカーならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、好ましい主要なＣｐＧ部位、およびその隣接部位、ならびに結腸直腸がん、胃がんおよび食道がんで高い代替マーカーが含まれる。これらの好ましいメチル化マーカーおよび代替的なメチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号のその予言的実験セクションの表５３に列挙されている。これらのマーカーのうち平均感度７５％の４８個を選択することで、グループ１について以下のスコアを得た：（結腸直腸がん＝８７、胃がん＝７２、食道がん＝７５）。これは、平均感度７５％の以下の数のマーカー当量（＝４８×スコア／７５）に変換される；（結腸直腸がん＝５６マーカー当量；胃がん＝４６マーカー当量；食道がん＝４８マーカー当量）。したがって、すべてが平均３６マーカー当量の最低値を十分に上回っていた。
図６２は、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんのマーカーならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんの存在を特定するために使用され得る。図６３は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんのマーカーならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんを識別するために使用され得る、好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれる。これらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、予言的な実験セクションの表５４に列挙されている。これらのマーカーのうち平均感度が７５％の４８個を選択することで、グループ２について以下のスコアを得た：（乳がん＝７０、子宮内膜がん＝８５、卵巣がん＝７０、子宮頸がん＝７５、子宮がん＝８３）。これは、平均感度が７５％の以下のマーカー当量数（＝４８×スコア／７５）に変換される；（乳がん＝４５マーカー当量；子宮内膜がん＝５４マーカー当量；卵巣がん＝４５マーカー当量；子宮頸がん＝４８マーカー当量；子宮がん＝５３マーカー当量）。したがって、すべてが平均３６マーカー当量の最低値を十分に上回っていた。
図６４は、肺がんおよび頭頸部がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肺がんおよび頭頸部がんの存在を特定するために使用され得る。図６５は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、肺がんおよび頭頸部がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肺および頭頸部の存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、肺がんおよび頭頸部がんを識別するために使用され得る好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれる。これらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、予言的な実験セクションの表５５に列挙されている。これらのマーカーのうち平均感度７５％の４８個を選択することで、グループ３について以下のスコアを得た：（肺腺がん＝６２、肺扁平上皮がん＝６７、頭頸部がん＝６９）。これは、平均感度が７５％の以下のマーカー当量数（＝４８×スコア／７５）に変換される；（肺腺がん＝３９マーカー当量；肺扁平上皮がん＝４３マーカー当量；頭頸部がん＝４４マーカー当量）。したがって、すべてが平均３６マーカー当量の最低値を十分に上回っていた。
図６６は、前立腺がんおよび膀胱がん特異的マーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これらは、血液内または尿内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、前立腺がんおよび膀胱がんの存在を特定するために使用され得る。図６７は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、前立腺がんおよび膀胱がん特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内または尿内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、前立腺および膀胱の存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、前立腺がんおよび膀胱がんを識別するために使用され得る好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれる。血液試料からの前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんについてのこれらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、予言的な実験セクションの表５６Ａに列挙される。尿試料からの前立腺がんおよび膀胱がんについてのこれらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の、その予言的な実験セクションの表５６Ｂに列挙されている。腎臓特異的メチル化マーカーの大部分は正常腎臓組織中に見出され、したがってこれらは、尿検査での使用に適さないであろう。これらのマーカーのうち平均感度が７５％の４８個を選択することで、グループ４について以下のスコアを得た：（前立腺がん＝７０、膀胱がん＝６６）。これは、平均感度が７５％の以下のマーカー当量数（＝４８×スコア／７５）に変換される；（前立腺がん＝４５マーカー当量；膀胱がん＝４２マーカー当量）。したがって、平均３６マーカー当量の最低値を十分に上回った。
図６８は、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位のリストを提供する。これらは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肺がんおよび頭頸部がんの存在を特定するために使用され得る。図６９は、染色体領域またはサブ領域のリストを提供する。その中には、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんのマーカー、ならびに組織特異的なマーカーである主要なＣｐＧ部位があり、これらのマーカーは、血液内のｃｆＤＮＡ、またはエクソソーム内のＤＮＡ、または他の保護された状態（ＣＴＣ内など）のＤＮＡから、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんの存在を特定するために使用され得る。これらのリストには、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんを識別するために使用され得る好ましい主要なＣｐＧ部位およびその隣接部位が含まれる。これらの好ましいメチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号のその予言的な実験セクションの表５７に列挙される。これらのマーカーのうち平均感度が７５％の６４個を選択することで、グループ５について以下のスコアを得た：（肝臓がん＝６８、膵臓がん＝５８、胆嚢がん＝７４）。これは、平均感度が７５％の以下のマーカー当量数（＝４８×スコア／７５）に変換される；（肝臓がん＝４３マーカー当量；膵臓がん＝３７マーカー当量；胆嚢がん＝４８マーカー当量）。したがって、すべてが平均３６マーカー当量の最低値を上回った。
平均感度が７５％の前述のマーカーはまた、黒色腫の再発をモニタリングするために使用され得る。例示的な好ましいメチル化マーカーおよび代替のメチル化マーカーのプライマーセットは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号のその予言的な実験セクションの表５８に列挙されている。
米国で結腸直腸がん（両性）または卵巣がんのいずれかを検出するための異なる汎腫瘍検査を互いに比較するとどうなるであろうか？下の例示的な実施例について：（１）各がんで＞３６個のマーカー／グループが陽性である、平均感度が５０％の９６個マーカーの汎腫瘍検査。結腸直腸がん＝８４マーカー当量；卵巣がん＝４２マーカー当量。マーカーの偽陽性率が３％で、結腸直腸がんについて４８個のマーカーで計算されるのに対し、卵巣がんについて３６個のマーカーで計算され、最低５個の陽性でステップ２または画像診断に送る。（２）各がんで＞３６個のマーカー／グループが陽性である、平均感度が７５％の６４個マーカーの汎腫瘍検査。結腸直腸がん＝６４マーカー当量；卵巣がん＝４６マーカー当量。マーカーの偽陽性率が３％で、結腸直腸がんについて４８個のマーカーで計算されるのに対し、卵巣がんについて３６個のマーカーで計算され、最低５個の陽性でステップ２に送る。（３）各がんで＞３６個のマーカー／グループが陽性である、平均感度が５０％の６４個マーカーのグループ特異的ステップ。結腸直腸がん＝６１マーカー当量；卵巣がん＝４１マーカー当量。マーカーの偽陽性率が３％で、結腸直腸がんについて４８個のマーカーで計算されるのに対し、卵巣がんについて３６個のマーカーで計算され、最低５個の陽性で画像診断に送る。（４）各がんで＞３６個のマーカー／グループが陽性である、平均感度が７５％の４８個マーカーのグループ特異的ステップ。結腸直腸がん＝５６マーカー当量；卵巣がん＝４５マーカー当量。マーカーの偽陽性率が３％で、結腸直腸がんについて４８個のマーカーで計算されるのに対し、卵巣がんについては３６個のマーカーで計算され、最低５個の陽性で画像診断に送る。
９６個の汎腫瘍マーカーを使用して早期大腸がんを発見する最初の戦略を検討する（図１Ｃ）。血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化分子を予想して、計算が行われる。上記のように、大腸がんの例、特に、変異負荷が低いマイクロサテライト安定性腫瘍（ＭＳＳ）の例では、これらの計算が、ＮＧＳ配列決定のみに依存する場合（血液中に１つの変異を有する１５０分子を仮定する）、推定７８％の早期大腸がんが見逃されることになる。再び、これらの数字を概観すると、米国では、２０１８年に、約１３５，０００例の大腸がんの新規症例が診断され、そのうちの約６０％が後期がん（すなわち、ステージＩＩＩおよびＩＶ）である。米国では５０歳以上の約１億７００万人が大腸がんの検査を受けるべきである。隠れたがん（すなわち、ステージＩ）を有する個体（その中には検査に不従順な個体もある）の数は予測できないが、この計算の目的のために、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全体的な特異性が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳以上の全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．６％の感度で、すなわち、ステージＩの大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する合計４０，５００人のうち）約２８，９９８人の個体を含むことになる。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とする平均感度が５０％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価され、次いで、２ステップ検査で、大腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）７１．６％×７１．６％＝５１．２％＝２０，７６２人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異性では、２回目の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２０，７６２／（１８８，７４８＋２０，７６２）＝９．９％であり、言い換えると、検査で陽性であった１０人のうち１人が、実際にステージＩの大腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんの特定においても成功する必要がある。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中に陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）のＣＲＣが陽性マーカーあたり少なくとも３００個のメチル化分子を有し、さらにより高いステージを有することを期待して行われる。また、検査が繰り返し使用されるにつれて、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、ステージＩのがんを有する４０，５００人、ステージＩＩのがんを有する４０，５００人、および後期がんを有する残りの５４，０００人（＝米国で年間に特定された大腸がんの総数１３５，０００人）を推定値とした。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供されている。ステージＩＩのがんの場合、９０．１％が、第１のステップで特定され、そのうち、９０．１％×９０．１％＝８１．０％＝３２，８７７人のステージＩＩの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．３％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．３％×９９．３％＝９８．６％＝５３，２４６人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、大腸がんを有する１３５，０００人のうち、合計で、２０，７６２＋３２，８７７＋５３，２４６＝１０６，８８５人の個体が、７９％の全体的な感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１０６，８８５／（１８８，７４８＋１０６，８８５）＝３６．１％であり、言い換えると、検査で陽性であった３人のうち１人が、実際に大腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、５３，６３９／８１，０００、すなわち６６％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期大腸がんを発見するために、この戦略（図１Ｅ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度５０％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩ＆ＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも３００個のメチル化分子を有すると仮定する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とし、全体的な特異性が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳以上の全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．１％の感度で、ステージＩの大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する４０，５００人のうち）約３６，４９０人の個体を含むことになる。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、ステージＩの大腸がんを有する（ステージＩの大腸がんを有する４０，５００人のうち）９０．１％×９０．１％＝８１．２％＝３２，８７７人の個体を特定するであろう。９５．８％の特異性では、２回目の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３２，８７７／（１８８，７４８＋３２，８７７）＝１４．８％であろう。言い換えると、検査で陽性であった６．７人のうち１人が実際にステージＩの大腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんの特定においても成功する必要がある。また、検査が繰り返し使用されるにつれて、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、米国では年間、推定でステージＩのがんを有する４０，５００人、ステージＩＩのがんを有する４０，５００人、および後期がんを有する５４，０００人（合計で１３５，０００人の大腸がんを有する個体）が特定されるであろう。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供されている。ステージＩＩのがんの場合、９０．１％が、第１のステップで特定され、そのうち、９７．２％×９７．２％＝９４．５％＝３８，２６３人の第２のステップで検証される。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．３％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．３％×９９．３％＝９８．６％＝５３，２４６人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、大腸がんを有する１３５，０００人のうち、合計で、３２，８７７＋３８，２６３＋５３，２４６＝１２４，３８６人の個体が、９２．１％の全体的な感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２４，３８６／（１８８，７４８＋１２４，３８６）＝３９．７％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に大腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７１，１０４／８１，０００、すなわち８７．７％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの発見するために、この戦略（図１Ｃ）を使用することで、これらの結果はどのように変わるだろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化分子を仮定する。ＮＧＳ配列決定のみに依存する場合（血液中に１つの変異を有する１５０分子を仮定する）、推定７８％の早期卵巣がんが見逃されるであろう。再び、これらの数字を概観すると、米国では、２０１８年に、約２２，０００例の卵巣がんの新規症例が診断され、そのうちの約８５％が後期がん（すなわち、ステージＩＩＩおよびＩＶ）であった。米国では、５０～７９歳の約５４００万人の女性が、卵巣がんの検査を受けるべきである。隠れたがん（すなわち、ステージＩ）を有する個体の数は予測できないが、この計算の目的のために、ステージが均等に分割されていると仮定する。したがって、ステージＩの卵巣がんを有する個体の数は、約５，５００人である。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とし、全体的な特異性が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国の５０～７９歳のすべての女性５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、４６．８％の感度で、すなわち、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約２，５７４人の個体を含むことになる。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）４６．８％×４６．８％＝２１．９％＝１，２０４人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異性では、２回目の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、１，２０４／（４，３７４＋１，２０４）＝２１．６％であろう。すなわち、検査で陽性であった４．６人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんの特定においても成功する必要がある。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが、血液中に陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも３００個のメチル化分子を有すると仮定する。検査が繰り返し使用されるにつれて、より多くのがんが検出されるという考え方と一致させ、すべての４つのステージが５，５００人であるとすると、米国では年間、推定で５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供されている。ステージＩＩのがんの場合、７１．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、７１．５％×７１．５％＝５１．１％＝２，８１０人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×９４．５％＝８９．３％＝９，８２３人の後期の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、１，２０４＋２，８１０＋９，８２３＝１３，８３７人の個体が、６２．９％の全体的な感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１３，８３７／（１３，８３７＋４，３７４）＝７６．０％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の４人のうち３人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、４，０１４／１１，０００人、すなわち３６．５％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんを発見するために、この戦略（図１Ｃ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度５０％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩ＆ＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも３００個のメチル化分子を有すると仮定する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とし、全体的な特異性が９９．１％である場合、第１のステップは、卵巣がんを有する（米国の５０～７９歳のすべての女性５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．５％の感度で、すなわち、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約３，９３２人の個体を含むことになる。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、少なくとも５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）７１．５％×７１．５％＝５１．１％＝２，８１０人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異性では、２回目の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２，８１０／（４，３７４＋２，８１０）＝３９．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんの特定においても成功する必要がある。検査が繰り返し使用されるにつれて、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供されている。ステージＩＩのがんの場合、８４．４％が、第１のステップで特定され、そのうち、８４．４％×８４．４％＝７１．２％＝３，９１６人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×９４．５％＝８９．３％＝９，８２３人の後期の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、２，８１０＋３，９１６＋９，８２３＝１６，５４９人の個体が、７５．２％の全体的な感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１６，５４９／（１６，５４９＋４，３７４）＝７９．０％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人に４人が実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、６，００６／１１，０００人、すなわち５４．６％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんを検出する９６個の汎腫瘍マーカーを使用する第２の戦略を検討する（図１Ｆ）。計算は、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有することを予想して行われる。以前と同様に、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳超の全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．６％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約２８，９９８人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする平均感度が７５％の４８個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価される。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）７１．６％×９４．５％＝６７．６％＝２７，４０３人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２７，４０３／（１８８，７４８＋２７，４０３）＝１２．６％である。言い換えると、検査で陽性であった８人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有し、さらにより高いステージを有することを予想して行われる。また、検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、ステージＩのがんを有する４０，５００人、ステージＩＩのがんを有する４０，５００人、および後期がんを有する残りの５４，０００人（＝米国で年間に特定された結腸直腸がんを有する個体の総数＝１３５，０００人）を推定値とした。早期がんの偽陽性率は、上記の計算ですでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９０．１％が、第１のステップで特定され、そのうち、９０．１％×９９．２％＝８９．３％＝３６，１９８人のステージＩＩのがんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．３％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．３％×９９．９％＝９９．２％＝５３，５６８人の後期がんの個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数２７，４０３人＋３６，１９８人＋５３，５６８人＝１１７，１６９人の個体が、８７％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１１７，１６９／（１８８，７４８＋１１７，１６９）＝３８．３％となり、言い換えると、陽性と判定された２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の率４０％と比較して、６３，６０１／８１，０００、すなわち７８．５％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんの検出のためにこの戦略（図１Ｆ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度５０％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．１％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３６，４９０人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９０．１％×９９．２％＝８９．４％＝３６，１９８人の個体を特定するであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３６，１９８／（１８８，７４８＋３６，１９８）＝１６．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった６．２人のうち１人が実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有し、４０，５００人がステージＩＩのがんを有し、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９７．２％が第１のステップで特定され、そのうち、９７．２％×９９．９％＝９７．１％＝３９，３２５人のステージＩＩのがんを有する個体が第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．３％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．３％×９９．９％＝９９．２％＝５３，５６８人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３６，１９８＋３９，３２５＋５３，５６８＝１２９，０９１人の個体が、９５．６％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２９，０９１／（１８８，７４８＋１２９，０９１）＝４０．６％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７５，５２３／８１，０００、すなわち９３．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために、第２の戦略（図１Ｆ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想する。再び、ステージＩの卵巣がんを有する個体が約５，５００人と仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、４６．８％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約２，５７４人の個体を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）４６．８％×８０．３％＝３７．６％＝２，０６８人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２，０６８／（４，３７４＋２，０６８）＝３２．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった３．１人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想して行われる。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、７１．５％が第１のステップで特定され、そのうち、７１．５％×９４．５％＝６７．６％＝３，７１８人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×９９．７％＝９４．２％＝１０，３６３人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、総数２，０６８＋３，７１８＋１０，３６３＝１６，１４９人の個体が、７３．１％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１６，１４９／（１６，１４９＋４，３７４）＝７８．７％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、５，７８６／１１，０００人、すなわち５２．６％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のためにこの戦略（図１Ｆ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度５０％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．５％の感度でステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約３，９３２人の個体を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）７１．５％×９４．５％＝６７．６％＝３，７１８人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３，７１８／（４，３７４＋３，７１８）＝４５．９％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．２人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、８４．４％が、第１のステップで特定され、そのうち、８４．４％×９８．３％＝８２．９％＝４，５５９人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×９９．７％＝９４．２％＝１０，３６３人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、総数３，７１８＋４，５５９＋１０，３６３＝１８，６４０人の個体が、８４．７％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１８，６４０／（１８，６４０＋４，３７４）＝８１．０％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性５人に４人が実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、８，２７７／１１，０００人、すなわち７５．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
最後に、６４個の汎腫瘍マーカーを使用して早期結腸直腸がんを検出する第３の戦略（図１Ｈ）を検討する。計算は、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有すると予想して行われる。上記のように、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９４．５％の感度でステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３８，２７２人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９４．５％×７１．６％＝６７．６％＝２７，４０３人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２７，４０３／（１８８，７４８＋２７，４０３）＝１２．６％であり、言い換えると、検査で陽性であった８人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有することを予想して行われる。また、検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９０．１％＝８９．３％＝３６，１９８人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．３％＝９９．２％＝５３，５６８人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数２７，４０３＋３６，１９８＋５３，５６８＝１１７，１６９人の個体が、８７％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１１７，１６９／（１８８，７４８＋１１７，１６９）＝３８．３％であり、言い換えると、検査で陽性であった５人のうち２人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、６３，６０１／８１，０００、すなわち７８．５％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんの検出のためにこの戦略（図１Ｈ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度７５％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９９．２％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約４０，１７６人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９９．２％×９０．１％＝８９．３％＝３６，１９８人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３６，１９８／（１８８，７４８＋３６，１９８）＝１６．１％であり、言い換えると、検査で陽性であった６．２人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有し、４０，５００人がステージＩＩのがんを有し、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９７．２％＝９７．１％＝３９，３２５人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．３％＝９９．２％＝５３，５６８人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３６，１９８＋３９，３２５＋５３，５６８＝１２９，０９１人の個体が、９５．６％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２９，０９１／（１８８，７４８＋１２９，０９１）＝４０．６％であり、言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７５，５２３／８１，０００、すなわち９３．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために、第３の戦略（図１Ｈ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想する。再び、ステージＩの卵巣がんを有する個体は、約４，５００になると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、８０．３％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約４，４１６人を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）８０．３％×４６．８％＝３７．６％＝２，０６８人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２，０６８／（４，３７４＋２，０６８）＝３２．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった３．１人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×７１．５％＝６７．６％＝３，７１８人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．７％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．７％×９４．５％＝９４．２％＝１０，３６３人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、合計２，０６８＋３，７１８＋１０，３６３＝１６，１４９人の個体が、７３．１％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１６，１４９／（１６，１４９＋４，３７４）＝７８．７％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、５，７８６／１１，０００人、すなわち５２．６％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために、この戦略（図１Ｈ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度７５％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、９４．５％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約５，１９７人を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が５０％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）９４．５％×７１．５％＝６７．６％＝３，７１８人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３，７１８／（４，３７４＋３，７１８）＝４５．９％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．２人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、８４．４％が、第１のステップで特定され、そのうち、９８．３％×８４．４％＝８２．９％＝４，５５９人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．７％×９４．５％＝９４．２％＝１０，３６３人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、合計３，７１８＋４，５５９＋１０，３６３＝１８，６４０人の個体が、８４．７％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１８，６４０／（１８，６４０＋４，３７４）＝８１．０％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、８，２７７／１１，０００人、すなわち７５．２％のこれらの早期がんを有する個体を特定するであろう。
上記の計算は、マーカーの少なくとも１つのセットを５０％の平均感度に限定すると仮定して行われた。５０％の平均感度が６６％の感度に改善された場合、結果はどれほど改善するであろうか？
９６個の汎腫瘍マーカーを使用して早期結腸直腸がんを検出する第１の戦略を検討する（図１Ｉ）。血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して、計算が行われる。上記のように、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．０％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３６，４５０人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。次いで、２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９０．０％×９０．０％＝８９．０％＝３２，８０５人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３２，８０５／（１８８，７４８＋３２，８０５）＝１４．８％であり、言い換えると、検査で陽性であった７人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有することを予想して行われる。また、検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９８．０％が、第１のステップで特定され、そのうち、９８．０％×９８．０％＝９６．０％＝３８，８９６人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．６％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．６％×９９．６％＝９９．２％＝５３，５６８人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３２，８０５＋３８，８９６＋５３，５６８＝１２５，２６９人の個体が、９２．７％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２５，２６９／（１８８，７４８＋１２５，２６９）＝３９．９％であり、言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７１，７０１／８１，０００、すなわち８８％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんの検出のために、この戦略（図１Ｉ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度６６％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率が３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９８．０％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３９，６９０人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９８．０％×９８．０％＝９６．０％＝３８，８９６人の個体を特定するであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３８，８９６／（１８８，７４８＋３８，８９６）＝１７．８１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった６人のうち１人が実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９８．０％が、第１のステップで特定され、そのうち、ステージＩＩのがんを有する９９．６％×９９．６％＝９９．２％＝４０，１７６人が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．９％＝９９．８％＝５３，５６８人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３８，８９６＋４０，１７６＋５３，８９２＝１３２，９６４人の個体が、９８．５％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１３２，９６４／（１８８，７４８＋１３２，９６４）＝４１．３％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７９，０７２／８１，０００、すなわち９７．６％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために第１の戦略（図１Ｉ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想する。再び、ステージが均等に分割されていると仮定すると、ステージＩの卵巣がんを有する個体は、約５，５００人になる。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．５％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約３，９３２人を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）７１．５％×７１．５％＝５１．１％＝２，８１０人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、２，８１０／（４，３７４＋２，８１０）＝３９．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想して行われる。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９０．０％が、第１のステップで特定され、そのうち、９０．０％×９０．０％＝８１．０％＝４，４８５人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９９．２％＝９８．４％＝１０，８２４人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、総数２，８１０＋４，４８５＋１０，８２４＝１８，１１９人の個体が、８２．４％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１８，１１９／（１８，１１９＋４，３７４）＝８０．５％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、７，２９５／１１，０００人、すなわち６６．３％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のためにこの戦略（図１Ｉ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度６６％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．０％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約４，９５０人を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）９０．０％×９０．０％＝８１．０％＝４，８９５人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、４，８９５／（４，３７４＋４，８９５）＝５２．８％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９６．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９６．２％×９６．２％＝９２．５％＝５，０８７人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９９．２％＝９８．４％＝１０，８２４人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、合計４，８９５＋５０８７＋１０，８２４＝２０，８０６人の個体が、９４．６％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、２０，８０６／（２０，８０６＋４，３７４）＝８７．４％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性８人のうち７人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、９，９８２／１１，０００人、すなわち９０．１％のこれらの早期がんを有する個体を特定するであろう。
９６個の汎腫瘍マーカーを使用して早期結腸直腸がんを検出する第２の戦略を検討する（図１Ｊ）。計算は、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想して行われる。上記のように、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える成人の総数１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．０％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３６，４５０人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９０．０％×９４．５％＝８５．０％＝３４，４４５人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３４，４４５／（１８８，７４８＋３４，４４５）＝１５．４％であり、言い換えると、検査で陽性であった６．５人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想して行われる。また、検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、ステージＩのがんを有する４０，５００人、ステージＩＩのがんを有する４０，５００人、および後期がんを有する残りの５４，０００人（＝米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人）と推定した。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９８．０％が、第１のステップで特定され、そのうち、９８．１％×９９．２％＝９７．３％＝３９，４１２人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．９％＝９９．８％＝５３，８９２人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３４，４４５＋３９，４１２＋５３，８９２＝１２７，７４９人の個体が、９４．６％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２７，７４９／（１８８，７４８＋１２７，７４９）＝４０．３％であり、言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７３，８５７／８１，０００、すなわち９１．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんの検出のためにこの戦略（図１Ｊ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度６６％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９８．０％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３９，６９０人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９８．０％×９９．２％＝９７．２％＝３９，３７２人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３９，３７２／（１８８，７４８＋３９，３７２）＝１７．２％であり、言い換えると、検査で陽性であった５．８人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９９．６％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．６％×９９．９％＝９９．５％＝４０，２９７人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．９％＝９９．８％＝５３，８９２人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３９，３７２＋４０，２９７＋５３，８９２＝１３３，５６１人の個体が、９８．９％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１３３，５６１／（１８８，７４８＋１３３，５６１）＝４１．４％であり、言い換えると、検査で陽性であった２．４人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７９，６９９／８１，０００、すなわち９８．４％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために第２の戦略（図１Ｊ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想する。再び、ステージＩの卵巣がんを有する個体が約５，５００人であると仮定する。個々のマーカー偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、７１．５％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約３，９３２人の個体を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）７１．５％×８０．３％＝５７．４％＝３，１５７人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３，１５７／（４，３７４＋３，１５７）＝４１．９％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．４人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが血液中に陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想して行われる。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９０．０％が、第１のステップで特定され、そのうち、９０．０％×９４．５％＝８５％＝４，６７５人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９９．７％＝９８．９％＝１０，８７９人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、総数３，１５７＋４，６７５＋１０，８７９＝１８，７１１人の個体が、８５．１％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１８，７１１／（１８，７１１＋４，３７４）＝８１．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、７，８３２／１１，０００人、すなわち７１．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のためにこの戦略（図１Ｆ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度６６％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、９０．０％の感度で、ステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約４，９５０人を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が７５％の４８個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）９０．０％×９４．５％＝８５％＝４，６７５人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、４，６７５／（４，３７４＋４，６７５）＝５１．６％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９６．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９６．２％×９８．３％＝９４．５％＝５，２０１人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９９．７％＝９８．９％＝１０，８７９人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、合計４，６７５＋５，２０１＋１０，８７９＝２０，７５５人の個体が、９４．３％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、２０，７５５／（２０，７５５＋４，３７４）＝８２．６％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、９，８７６／１１，０００人、すなわち８９．８％のこれらの早期がんを有する個体を特定するであろう。
最後に、６４個の汎腫瘍マーカーを使用して早期結腸直腸がんを検出する第３の戦略（図１Ｌ）を検討する。計算は、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有すると予想して行われる。上記のように、平均的な後期がんは、かつては平均的な早期がんであり、したがって、ステージＩのがんを有する個体が約４０，５００人であると仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９４．５％の感度でステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約３８，２７２人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査で、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９４．５％×９０．０％＝８５．０％＝３４，４４５人の個体が特定されるであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３４，４４５／（１８８，７４８＋３４，４４５）＝１５．４％であり、言い換えると、検査で陽性であった６．５人のうち１人が、実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩのＣＲＣが血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有することを予想して行われる。また、検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９９．２％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．２％×９８．１％＝９７．３％＝３９，４１２人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．９％＝９９．８％＝５３，８９２人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３４，４４５＋３９，４１２＋５３，８９２＝１２７，７４９人の個体が、９４．６％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１２７，７４９／（１８８，７４８＋１２７，７４９）＝４０．３％であり、言い換えると、検査で陽性であった２．５人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７３，８５７／８１，０００、すなわち９１．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期結腸直腸がんの検出のためにこの戦略（図１Ｌ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？マーカーの平均感度７５％を使用し、ステージＩのＣＲＣが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩのＣＲＣが陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率が３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９５．８％である場合、第１のステップは、（米国の５０歳を超える全成人１０７，０００，０００人のうち）４，４９４，０００人の個体を特定するであろう。これは、９９．２％の感度で、ステージＩの結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）約４０，１７６人の個体を含むであろう。しかし、これらの４，４９４，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の９６個のマーカー（ＣＲＣ用に４８個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、結腸直腸がんを有する（ステージＩのがんを有する４０，５００人のうち）９９．２％×９８．０％＝９７．２％＝３９，３７２人の個体を特定するであろう。９５．８％の特異度では、第２の検査は、４，４９４，０００×４．２％＝１８８，７４８の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３９，３７２／（１８８，７４８＋３９，３７２）＝１７．２％であろう。言い換えると、検査で陽性であった５．８人のうち１人が実際にステージＩの結腸直腸がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上のがんを特定する成功も含める必要があろう。検査が繰り返し使用されるので、早期ＣＲＣがより多く、後期ＣＲＣがより少なく検出されるという考え方と一致させるために、４０，５００人がステージＩのがんを有すると特定され、４０，５００人がステージＩＩのがんを有すると特定され、残りの５４，０００人が後期がんを有し、米国で年間に特定された結腸直腸がんの総数１３５，０００人になると推定する。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．６％＝９９．５％＝４０，２９７人のステージＩＩのがんを有する個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶのがんの場合、９９．９％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．９％×９９．９％＝９９．８％＝５３，８９２人の後期がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、結腸直腸がんを有する１３５，０００人のうち、総数３９，３７２＋４０，２９７＋５３，８９２＝１３３，５６１人の個体が、９８．９％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１３３，５６１／（１８８，７４８＋１３３，５６１）＝４１．４％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．４人のうち１人が、実際に結腸直腸がんを有するであろう。この検査は、現在の比率４０％と比較して、７９，６９９／８１，０００、すなわち９８．４％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のために第３の戦略（図１Ｌ）を使用すると、これらの結果はどのように変わるであろうか？血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を予想する。再び、ステージＩの卵巣がんを有する個体が約５，５００人と仮定する。個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、８０．３％の感度でステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約４，４１６人の個体を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する４，５００人のうち）８０．３％×７１．５％＝５７．４％＝３，１５７人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、３，１５７／（４，３７４＋３，１５７）＝４１．９％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２．４人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。この例を拡張するにあたり、計算は、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均１５０個のメチル化（またはヒドロキシメチル化）分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想して行われる。また、すべての４つのステージが５，５００人と仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定される。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９４．５％が、第１のステップで特定され、そのうち、９４．５％×９０．０％＝８５％＝４，６７５人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．７％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．７％×９９．２％＝９８．９％＝１０，８７９人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、３，１５７＋４，６７５＋１０，８７９＝１８，７１１人の個体が、８５．１％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、１８，７１１／（１８，７１１＋４，３７４）＝８１．１％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性の５人のうち４人が、実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、７，８３２／１１，０００人、すなわち７１．２％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
早期卵巣がんの検出のためにこの戦略（図１Ｆ）を使用すると、これらの結果は、どのように変わるであろうか？マーカーの平均感度７５％を使用し、ステージＩの卵巣がんが、血液中の陽性マーカーあたり平均２００個のメチル化分子を有し、ステージＩＩの卵巣がんが、陽性マーカーあたり平均２４０個のメチル化分子を有し、より高いステージ（ＩＩＩおよびＩＶ）が、陽性マーカーあたり少なくとも平均３００個のメチル化分子を有すると予想する。
個々のマーカーの偽陽性率を３％と仮定し、第１のステップで、平均感度が７５％の６４個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）を使用し、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とし、さらに、全特異度が９９．１％である場合、第１のステップは、（米国における年齢５０～７９歳の女性の総数５４，０００，０００人のうち）４８６，０００人の個体を特定するであろう。これは、９４．５％の感度でステージＩの卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）約５，１９７人の個体を含むであろう。しかし、これらの４８６，０００人の推定陽性者は、最低５個のマーカーが陽性であることを必要とする、平均感度が６６％の９６個のマーカー（卵巣がん用に３６個のマーカー）の第２のステップで評価されるであろう。２ステップ検査は、卵巣がんを有する（ステージＩの卵巣がんを有する５，５００人のうち）９４．５％×９０．０％＝８５％＝４，６７５人の個体を特定するであろう。９９．１％の特異度では、第２の検査は、４８６，０００×０．９％＝４，３７４の偽陽性も生成する。かかる検査の陽性予測値は、４，６７５／（４，３７４＋４，６７５）＝５１．６％であろう。言い換えると、検査で陽性であった２人のうち１人が実際にステージＩの卵巣がんを有するであろう。実際には、ステージ２以上の卵巣がんを特定する成功も含める必要があろう。また、すべての４つのステージが５，５００人であると仮定すると、米国では年間、総数５，５００×４＝２２，０００人の卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。上記の計算は、早期がんの偽陽性率をすでに提供した。ステージＩＩのがんの場合、９８．３％が、第１のステップで特定され、そのうち、９８．３％×９６．２％＝９４．５％＝５，２０１人のステージＩＩの卵巣がんの個体が、第２のステップで検証されるであろう。ステージＩＩＩおよびＩＶの卵巣がんの場合、９９．７％が、第１のステップで特定され、そのうち、９９．７％×９９．２％＝９８．９％＝１０，８７９人の後期卵巣がんを有する個体が特定されるであろう。これによって、卵巣がんを有する２２，０００人のうち、総数４，６７５＋５，２０１＋１０，８７９＝２０，７５５人の個体が、９４．３％の全感度で特定される。全体として、かかる検査の陽性予測値は、２０，７５５／（２０，７５５＋４，３７４）＝８２．６％であろう。言い換えると、検査で陽性であった女性５人に４人が実際に卵巣がんを有するであろう。この検査は、現在の比率１５％と比較して、９，８７６／１１，０００人、すなわち８９．８％の早期がんを有する個体を特定するであろう。
同様に治療をモニタリングするために使用するために、７５％の平均感度で４８個のマーカーの前述の５グループを設計した（図１Ｍを参照）。現在、がんが新たに診断されると、がん組織（または液体生検）が標的付け配列決定に供されて、変異または遺伝子再構成を特定し、これが、治療を誘導するために使用され得る。所与のがん（すなわち、グループ１の胃がん）について、４８マーカーグループ（１）パネルを用いてがん組織または液体生検が検査され得る。まず第一に、図１Ｆまたは１Ｊにおいて特定された２ステップスクリーニングを使用してがんが特定された場合、それらは、そのアッセイのステップ２で４８マーカーグループ特異的検査をすでに受けている。検査された４８個のマーカーのうち、平均で１２～２４個が陽性であろう。次いで、これらは治療有効性をモニタリングするために患者特異的検査で１つにまとめられる場合がある。かかる患者の血漿が、手術後および治療レジメン中に検査されるであろう。１２～２４個マーカーシグナルの喪失について血漿がモニタリングされるが、≧３個の陽性マーカーが陽性を維持する場合、これは、治療法を変えるように医師を導き得る。がんの種類および血漿に入る分子の個数に応じて、３個のマーカーが治療の有効性または失敗を８２．６％～９９．４％の精度で特定すると予測されるであろう。
再発のモニタリングに使用するためにも、４８個のマーカーの前述の５グループを設計した（図１Ｎを参照）。まず第一に、図１Ｆおよび１Ｊにおいて特定された２ステップスクリーニングを使用してがんが特定されており、かつ／または図１Ｍに記載されたようにモニタリングされた場合、患者は、平均で１２～２４個が陽性であろう４８マーカーグループ特異的検査をすでに受けているであろう。次いで、再発をモニタリングするための患者特異的検査ではこれらが１つにまとめられる場合がある。原発がんから回復したかかる患者の血漿が、１２～２４マーカーパネルからのマーカーの獲得についてモニタリングされるであろう。結果は以下のようにスコアリングされる：０～２個の陽性マーカーはがんがないと見なされ；≧３個の陽性マーカーは第２のステップに進むよう指示される。血漿は標的付け配列決定に供されて、変異または遺伝子再構成を特定し、これが、再発腫瘍の治療を誘導するために使用され得る。がんの種類および血漿に入る分子の個数に応じて、３個のマーカーが早期再発を８２．６％～９９．４％の精度で特定すると予測されるであろう。
各がんの生態は異なり、したがって、早期がんを検出する、治療をモニタリングする、および早期再発を検出するための、観察された感度および特異度は、本明細書に記載された理想的な計算よりも高いまたは低い場合がある。
（表４５）
実施例：がん関連メチル化マーカーのマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ検出
実施例１～２に関する一般的方法
６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆ．）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用してその濃度を測定した。
実施例１～２に関する一般的方法
６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆ．）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用してその濃度を測定した。
ヒト血液（バフィーコート）から単離された高分子量（＞５０ｋｂ）ゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してその濃度を同様に決定した。
ＱＩＡ ａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを製造元の説明書に従って使用して、血漿試料５ｍｌ（抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを添加）から無細胞ＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）を使用して定量化した。
ＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ ０．５～１．０μｇを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ トリス－酢酸、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．９、２５℃）を含有する反応溶液２０μｌ中１０ユニットの制限酵素Ｂｓｈ１２３６Ｉにより消化した。消化反応を３７℃で１時間実行し、続いて酵素を８０℃で２０分間不活性化した。あるいは、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波装置（Ｗｏｂｕｒｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して非ランダム超音波処理法により、ゲノムＤＮＡを断片化することができる。剪断後、結果として得られたＤＮＡ断片（長さは５０～１ｋｂ塩基対の範囲）の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステムで評価した。次いで、ＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）メチル化ＤＮＡ濃縮キットを製造元の説明書（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ； Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）に従って使用するメチル化特異的抗体によりメチル化ＣｐＧを含有するＤＮＡ断片を捕捉する濃縮ステップがこれに続く。
ＰＣＲプライマーおよびＬＤＲプローブ。様々なカテゴリーに使用するためのすべてのプライマーは、上記の表４６に列挙されている。プライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， Ｉｏｗａ）から購入する。結腸直腸がんを検出するための１ステップまたは２ステップアッセイに使用するための代替プライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表３９に列挙されている。平均感度が５０％の９６個マーカーアッセイのステップ１に使用するために設計されたプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表４０に列挙されている。平均感度が５０％の、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんを検出および特定するためのグループ１の６４個マーカーアッセイのステップ２に使用するために設計されたプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表４７に列挙されている。平均感度が５０％の、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんを検出および特定するためのグループ２の４８～６４個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表４８に列挙されている。平均感度が５０％の、肺腺がん、肺扁平上皮がん、および頭頸部がんを検出および特定するためのグループ３の４８～６４個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表４９に列挙されている。平均感度が５０％の、前立腺がんおよび膀胱がんを検出および特定するためのグループ４の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５０に列挙されている。平均感度が５０％の、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんを検出および特定するためのグループ５の４８～６４個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５１に列挙されている。平均感度が７５％の、固形腫瘍を検出するための４８～６４個マーカーアッセイのステップ１に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５２に列挙されている。平均感度が７５％の、結腸直腸がん、胃がん、および食道がんを検出および特定するためのグループ１の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５３に列挙されている。平均感度が７５％の、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、および子宮がんを検出および特定するためのグループ２の３２～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５４に列挙されている。平均感度が７５％の、肺腺がん、肺扁平上皮がん、および頭頸部がんを検出および特定するためのグループ３の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５５に列挙されている。平均感度が７５％の、血液試料から前立腺がん、膀胱がん、および腎臓がんを検出および特定するためのグループ４の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５６Ａに列挙されている。平均感度が７５％の、尿試料から前立腺がんおよび膀胱がんを検出および特定するためのグループ４の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５６Ｂに列挙されている。平均感度が７５％の、肝臓がん、膵臓がん、および胆嚢がんを検出および特定するためのグループ５の３６～４８個マーカーアッセイのステップ２に使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５７に列挙されている。平均感度が７５％の、黒色腫の再発を検出するためのグループ７の３６～４８個マーカーアッセイに使用するためのプライマーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６３／０１９，１４２号の表５８に列挙されている。
実施例１：結腸がん関連メチル化マーカー検出のための２０プレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲのユニバーサルプライマーベースのマルチプレックス増幅へのＴＥＴ２＿ＡＰＯＢＥＣ変換ＤＮＡテンプレートの使用
ＤＮＡの調製：６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ．）を使用して結腸がん細胞株のゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ．）を使用してその濃度を測定した。ヒト血液（バフィーコート）から単離された高分子量（＞５０ｋｂ）ゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ．）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してその濃度を同様に決定した。ＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ ０．５～１．０μｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波装置Ｅ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を使用して非ランダム超音波処理法により断片化した。剪断後、結果として得られたＤＮＡ断片（長さは５０～１ｋｂ塩基対の範囲）の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ， ＳＡｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）で評価した。
ＤＮＡの調製：６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ．）を使用して結腸がん細胞株のゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ．）を使用してその濃度を測定した。ヒト血液（バフィーコート）から単離された高分子量（＞５０ｋｂ）ゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ．）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してその濃度を同様に決定した。ＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ ０．５～１．０μｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波装置Ｅ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を使用して非ランダム超音波処理法により断片化した。剪断後、結果として得られたＤＮＡ断片（長さは５０～１ｋｂ塩基対の範囲）の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ， ＳＡｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）で評価した。
メチル化ＤＮＡの濃縮：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）メチル化ＤＮＡ濃縮キットを製造元（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）の説明書に従って使用して、メチル化ＣｐＧを含有するＤＮＡ断片をメチル化特異的抗体と結合させることによって捕捉した。メチル化ＣｐＧ部位を含有するＤＮＡ断片を、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含有する抗体と結合させることによって濃縮した。一連の洗浄ステップに続く磁気捕捉の後、濃縮されたメチル化ＤＮＡ試料を６５℃でのインキュベーションによって少量の水の中に溶出させた。
プライマーおよびプローブ：使用されるすべてのプライマーは、上記表４５に列挙されている。すべてのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）から購入した。線形増幅のためのプライマーとして使用されるＰＣＲ逆方向プライマーは、ユニバーサルプライマー配列を含む２３ｂｐ長テールを有する。線形増幅ステップの後、第１のＰＣＲステップで、ユニバーサルプライマーを添加して増幅を高めた。
ＤＮＡのＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣ変換：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓは、メチル化シトシンまたはヒドロキシメチル化シトシンの存在または非存在を決定するためのバイサルファイト変換ステップに相当するものを模倣するために２酵素プロトコルを開発した。このアプローチは、５ｍＣ（５－メチルシトシン）および５ｈｍＣ（５－ヒドロキシ－メチルシトシン）のカスケード反応を経由した５－カルボキシシトシンへの変換［すなわち、５－メチルシトシン（５ｍＣ）→５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）→５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）→５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）］のためにＴＥＴ２を使用し、したがって、ＡＰＯＢＥＣによる脱アミノから５ｍＣおよび５ｈｍＣを保護するが、非メチル化Ｃを保護しない（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｔｅｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗｉｔｈ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｐｒｏｄｕｃｔ： ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｋｉｔ Ｅ７１２０を参照）。下記の説明は、このプロトコルから直接コピーしたものである。
ステップ１、５－メチルシトシンの酸化：以下のように反応混合物を調製する：メチル化ＤＮＡ（濃縮または非濃縮）２８ｕｌ、ＴＥＴ２反応緩衝液１０ｕｌ、酸化補助液１ｕｌ、ＤＴＴ １ｕｌ、酸化増強剤１ｕｌ、ＴＥＴ２ ４ｕｌ。徹底的に混合した後、１２４９倍希釈した５００ｍＭ Ｆｅ（ＩＩ）溶液１ｕｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。反応物全体に停止試薬１ｕｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、反応を停止させる。
ステップ２、ＴＥＴ２変換ＤＮＡのクリーンアップ：再懸濁したＮＥＢＮｅｘｔ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ ９０μｌを各試料に添加する。卓上の試料を室温で少なくとも５分間インキュベートする。適切な磁気スタンドにチューブを置いて、ビーズを上清と分離する。５分後に（または溶液が透明になったとき）、上清を慎重に取り出し、捨てる。チューブが磁気スタンドに立っているときに、新鮮調製８０％エタノール２００μｌを使用して、ビーズを２回洗浄する。ビーズを風乾し、溶出緩衝液１７μｌを添加してビーズからＤＮＡを溶出させる。チューブを磁気スタンドに立てる。３分後に、上清１６μｌを新しいＰＣＲチューブに移す。
ステップ３、ホルムアミドを使用して酸化ＤＮＡを変性させる：酸化ＤＮＡ１６μｌにホルムアミド４μｌを添加する。予熱したサーマルサイクラー中、８５℃で１０分間インキュベートする。直ちに氷上に置く。
ステップ４、シトシンの脱アミノ：脱アミノ反応混合物（氷上で調製）は、変性ＤＮＡ２０μｌ、水６８ｕｌ、ＡＰＯＢＥＣ反応緩衝液１０ｕｌ、ＢＳＡ １ｕｌ、ＡＰＯＢＥＣ酵素１ｕｌを含有する。３７℃で３時間の後、サーマルサイクラー中４℃で混合物をインキュベートした。
ステップ５、脱アミノＤＮＡのクリーンアップ：再懸濁したＮＥＢＮｅｘｔ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ １００μｌを各脱アミノＤＮＡ試料に添加する。十分に混合する。卓上の試料を室温で少なくとも５分間インキュベートする。適切な磁気スタンドにチューブを立てて、ビーズを上清と分離する。５分後に（または溶液が透明になったとき）、上清を慎重に取り出し、捨てる。チューブが磁気スタンドに立っているときに、新鮮調製８０％エタノール２００μｌを使用して、ビーズを２回洗浄する。蓋が開いた状態でチューブを磁気スタンドに立てながらビーズを最大９０秒間風乾する。磁気スタンドからチューブを取り出す。溶出緩衝液５２μｌを添加することによってビーズからＤＮＡ標的を溶出させ、十分に混合する。チューブを磁気スタンドに立てる。３分後に、上清５０μｌを新しいＰＣＲチューブに移す。
線形増幅ステップ。反応体積２５μｌ中、５×Ｇｏｔａｑ Ｆｌｅｘｉ緩衝液（マグネシウムなし）５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）０．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、長い２３ｂｐユニバーサル配列テールを有する２０プレックス遺伝子特異的逆方向プライマー１．２５μｌ（各プライマーの濃度は条件Ａで１μＭであり、条件Ｂで０．５μＭである）、ｔｗｅｅｎ ２０（５％）０．５μｌ、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２ ０．９μｌ（ＩＤＴからのＲＮＡｓｅＨ２希釈緩衝液中に希釈）（ＩＤＴ）、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）と混合されたＫｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ０．５μｌ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）（５０Ｕ／μｌ Ｋｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １μｌをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １０μｌに添加することによって混合物を調製する）、およびＤＮＡテンプレート５．０μｌを混合することにより線形増幅ステップを行った。４つのテンプレートがある。テンプレートＡは、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣ脱アミノＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ １μｌであった。出発ＤＮＡ量は１μｇであり、これは超音波処理されたが、抗体法によりメチル化濃縮されなかったものである。テンプレートＢは、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣ脱アミノ正常ＤＮＡ １μｌであった。ＤＮＡ出発量は１μｇであり、これは超音波処理されたが、抗体法によりメチル化濃縮されなかったものである。テンプレートＣは、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣ脱アミノＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ １μｌであった。出発ＤＮＡ量は１μｇであり、これは超音波処理されたが、抗体法によりメチル化濃縮されなかったものである。テンプレートＤは、ＴＥＴ２－ＡＰＯＢＥＣ脱アミノ正常ＤＮＡ １μｌであった。ＤＮＡ出発量は１μｇであり、これは超音波処理されたが、抗体法によりメチル化濃縮されなかったものである。以下のプログラムを使用して、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）を用いた反応を行った：９４℃で２分、（９４℃で２０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で３０秒）を４０サイクル、ならびに最終的に４℃に維持。反応後、反応混合物にｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ０．５ｕｌを添加して、Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを阻害した。
ＰＣＲ反応。２つの１０ｕｌ部分に等しく分割された線形増幅産物を使用して各１０プレックスの２つのＰＣＲ反応を実行した。マルチプレックス反応は、マーカー特異的順方向プライマー、ユニバーサルプライマー（線形増幅プライマーの長テールと塩基対形成する）および他のＰＣＲ試薬を添加する２つの１０プレックス反応からなった。マグネシウム不含Ｇｏｔａｑ Ｆｌｅｘｉ緩衝液５×２μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．４μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、ｄＮＴＰ（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）０．４μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、ｔｗｅｅｎ２０（５％）０．２ｕｌ、各々条件Ａで０．５μＭ、および条件Ｂで０．２５μＭの、各々１０プレックスマーカー特異的順方向プライマーに対応する合計１μｌ、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ（１ｕ／μｌ）０．４μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２（ＩＤＴ）０．２９μＩ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）と混合されたＫｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １．６μｌ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）（５０Ｕ／μｌ Ｋｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １μｌを５Ｕ／μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １０μｌと添加することによって混合物を調製する）、および対応する線形増幅産物９μｌ、およびユニバーサルプライマー２０００（２０ｕＭ）１μｌを用いて調製された混合物２０μｌでＰＣＲ反応を行った。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）により以下のプログラムを使用してＰＣＲ反応を実行した：３７℃で１０分、（９４℃で２０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、ならびに最終的に４℃に維持。
ＬＤＲステップ。以下を混合することによって調製された混合物１０μｌ中でＬＤＲ反応を行った：ヌクレアーゼ不含水（ＩＤＴ）４．８２μｌ、１０×ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液１μｌ［１×緩衝液は、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆ．）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、５０ｍＭ ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）および２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）を含有する］、４０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）０．２５μｌ、５０ｍＭ ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）０．２μｌ、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２（ＩＤＴ）０．２５μｌ、各々５００ｎＭの対応する１０プレックス特異的ＬＤＲ上流プローブおよび下流プローブ ０．２μｌ、精製ＡＫ１６Ｄリガーゼ（０．８８μＭ）０．２８μｌ、および第２のステップからの対応するＰＣＲ増幅産物３μｌ。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）により以下のプログラムを使用してＬＤＲ反応を行った：（９４℃で１０秒および６０℃で４分）を２０サイクルに続いて、最終的に４℃に維持。
ｑＰＣＲステップ。ｑＰＣＲは、マーカーごとに実行されるユニプレックス反応である。以下を混合することによってｑＰＣＲステップを反応体積１０μｌで行った：ヌクレアーゼ不含水（ＩＤＴ）３μｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）からの２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｆａｓｔ Ａｍｐｌｉｔａｑ、ＵＤＧおよびｄＵＴＰ）５μｌ、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ順方向プライマーおよび逆方向プライマー（濃度は各プライマー５μＭ）０．５μｌ、５μＭ Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ０．５μｌ、およびＬＤＲ反応産物１μｌ。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）により密封されたＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ－９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ０．１ｍｌプレートを使用して、以下の設定でＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）からのＶｉｉＡ７リアルタイムサーマルサイクラー中でｑＰＣＲ反応を行う：高速ブロック、実験タイプとしての標準曲線、受動参照としてのＲＯＸ、定量化法としてのＣｔ（自動閾値、ただし、必要に応じて０．０５に調整）、レポーターとしてのＴＡＭＲＡ、およびクエンチャーとしてのＮＦＱ－ＭＧＢ。採用したプログラムは：５０℃で２分、ならびに（９５℃で１秒および６０℃で２０秒）を４５サイクルであった。結果を図７０Ａ～Ｂおよび７１Ａ～Ｂならびに下の表４６に示す。
（表４６）実施例１の各遺伝子（１～１０の遺伝子）についてのＣｔ値
（表４６続き）実施例１の各遺伝子（１１～２０の遺伝子）についてのＣｔ値
実施例２：長テールプライマーおよびユニバーサルプライマーを使用するバイサルファイト変換ＨＴ２９細胞株ＤＮＡにｅｘ－ＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲを使用した２０個ＣＲＣＭマーカーのマルチプレックス検出
６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ．）を使用して結腸がん細胞株のゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ．）を使用してその濃度を測定した。ヒト血液（バフィーコート）から単離された高分子量（＞５０ｋｂ）ゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ．）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してその濃度を同様に決定した。Ｃｏｖａｒｉｓ超音波装置Ｅ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を使用して、ＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ０．５～１．０μｇを非ランダム超音波処理法で断片化した。剪断後、結果として得られたＤＮＡ断片（長さは５０～１ｋｂ塩基対の範囲）の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）で評価した。
６０ｃｍ２培養皿内の、１０％ウシ胎仔血清を補充した４．５ｇ／ｌグルコース含有ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中にＨＴ－２９結腸腺がん細胞を播種し、５％ ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で維持した。細胞が８０～９０％集密に達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水中で洗浄し（×３）、細胞を遠心分離（５００×ｇ）によって収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ．）を使用して結腸がん細胞株のゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ．）を使用してその濃度を測定した。ヒト血液（バフィーコート）から単離された高分子量（＞５０ｋｂ）ゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ．）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してその濃度を同様に決定した。Ｃｏｖａｒｉｓ超音波装置Ｅ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を使用して、ＨＴ２９細胞株ゲノムＤＮＡ０．５～１．０μｇを非ランダム超音波処理法で断片化した。剪断後、結果として得られたＤＮＡ断片（長さは５０～１ｋｂ塩基対の範囲）の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）で評価した。
メチル化ＤＮＡの濃縮：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）メチル化ＤＮＡ濃縮キットを製造元の説明書（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）に従って使用して、メチル化ＣｐＧを含有するＤＮＡ断片をメチル化特異的抗体と結合させることによって捕捉した。メチル化ＣｐＧ部位を含有するＤＮＡ断片を、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含有する抗体と結合させることによって濃縮した。一連の洗浄ステップに続く磁気捕捉の後、濃縮されたメチル化ＤＮＡ試料を６５℃でのインキュベーションによって少量の水の中に溶出させた。
ＤＮＡのバイサルファイト変換：次いで、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ部門（Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）からのＣｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣｐＧバイサルファイト変換キットを使用してＤＮＡ中のシトシン塩基のバイサルファイト変換を実行した。変性試薬５μｌをメチル濃縮ゲノムＤＮＡ ４５μｌに添加し、続いて混合物を５０℃で１０分間インキュベートした。これに続いて、変換試薬１００μｌを添加し、サーマルサイクラー中、以下のプログラムでインキュベートした：６５℃３０分、９０℃３０秒、６５℃３０分、９０℃３０秒、６５℃３０分。結合カラム中、変換されたＤＮＡ混合物１５０μｌを結合緩衝液６００μｌと混合した。カラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、続いて通過液を捨てた。カラムを洗浄緩衝液６００μｌで洗浄した。脱スルホン化試薬２００μｌをカラムに添加し、続いて室温で１５分間インキュベートした。回転させた後、洗浄緩衝液４００μｌでカラムを再び洗浄した。次いで、溶出緩衝液５０μｌをカラムに添加して、結合しているＤＮＡを溶出させた。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｏｌｉ ＧｒｅｅｎおよびＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）の両方を用いて、ほぼ一本鎖のバイサルファイト変換ＤＮＡを定量化した。
プライマーおよびプローブ：使用されるすべてのプライマーは、上の表４５に列挙されている。すべてのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）から購入した。線形増幅のためのプライマーとして使用されるＰＣＲ逆方向プライマーは、ユニバーサルプライマー配列を含む２３ｂｐ長テールを有する。線形増幅ステップ後、第１のＰＣＲステップにおいて、ユニバーサルプライマーを添加して増幅を高めた。
線形増幅ステップ。反応体積２５μｌ中、以下を混合することにより線形増幅ステップを行った：５×Ｇｏｔａｑ Ｆｌｅｘｉ緩衝液（マグネシウムなし）５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、長２３ｂｐユニバーサル配列テールを有する２０プレックス遺伝子特異的逆方向プライマー１．２５μｌ（各プライマーの濃度は条件Ａで１μＭであり、条件Ｂで０．５μＭである）、ｔｗｅｅｎ ２０（５％）０．５μｌ、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２（ＩＤＴからのＲＮＡｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）０．９μｌ（ＩＤＴ）、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）と混合されたＫｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ０．５μｌ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）（５０Ｕ／μｌ Ｋｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １μｌをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １０μｌに添加することによって混合物を調製する）、およびＤＮＡテンプレート５．０μｌ。テンプレートは、２００ＧＥのＨＴ２９ ＤＮＡおよび７，５００ＧＥ（ＧＥ：ゲノム当量）のＲｏｃｈｅ ＤＮＡを含有するＤＮＡ混合物５μｌであった。ＤＮＡはメチル化特異的に濃縮され、バイサルファイト反応により変換される。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）中で以下のプログラムを使用して反応を行った：９４℃で２分、（９４℃で２０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で３０秒）を４０サイクル、および最終的に４℃に維持。反応後、反応混合物中にｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ０．５ｕｌを添加してＫｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを阻害した。
ＰＣＲ反応。２つの１０ｕｌ部分に等しく分割された線形増幅産物を使用して各１０プレックスの２つのＰＣＲ反応を実行した。マルチプレックス反応は、マーカー特異的順方向プライマー、ユニバーサルプライマー（線形増幅プライマーの長テールと塩基対形成する）および他のＰＣＲ試薬を添加する２つの１０プレックス反応からなった。
マグネシウム不含Ｇｏｔａｑ Ｆｌｅｘｉ緩衝液５×２μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．４μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、ｄＮＴＰ（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰを有する）０．４μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、ｔｗｅｅｎ２０（５％）０．２μｌ、各々が１０プレックスマーカー特異的順方向プライマーに対応する合計１μｌ（条件Ａで各々０．５μＭ、および条件Ｂで０．２５μＭ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ（１ｕ／μｌ）０．４μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２（ＩＤＴ） ０．２９μＩ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）と混合されたＫｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １．６μｌ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）（混合物は５０Ｕ／μｌ Ｋｌｅｎｔａｑｌポリメラーゼ １μｌおよび５Ｕ／μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １０μｌを添加することによって調製される）、および対応する線形増幅産物９μｌ、およびユニバーサルプライマー２０００（２０ｕＭ）１μｌを用いて調製された混合物２０μｌ中でＰＣＲ反応を行った。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）中、以下のプログラムを使用してＰＣＲ反応を実行した：３７℃で１０分、（９４℃で２０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、ならびに最終的に４℃に維持。
ＬＤＲステップ。以下を混合することによって調製された混合物１０μｌ中でＬＤＲ反応を行った：ヌクレアーゼ不含水（ＩＤＴ）４．８２μｌ、１０×ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液１μｌ［１×緩衝液は、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆ．）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、５０ｍＭ ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）および２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）を含有する］、４０ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）０．２５μｌ、５０ｍＭ ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）０．２μｌ、２０ｍＵ／μｌ ＲＮＡｓｅＨ２（ＩＤＴ）０．２５μｌ、各々５００ｎＭの対応する１０プレックス特異的ＬＤＲ上流プローブおよび下流プローブ０．２μｌ、精製ＡＫ１６Ｄリガーゼ（０．８８μＭ）０．２８μｌ、および第２のステップからの対応するＰＣＲ増幅産物３μｌ。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）により以下のプログラムを使用してＬＤＲ反応を行った：（９４℃で１０秒および６０℃で４分）を２０サイクルに続いて、最終的に４℃に維持。
ｑＰＣＲステップ。ｑＰＣＲは、マーカーごとに実行されるユニプレックス反応である。以下を混合することによってｑＰＣＲステップを反応体積１０μｌで行った：ヌクレアーゼ不含水（ＩＤＴ）３μｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）からの２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｆａｓｔ Ａｍｐｌｉｔａｑ、ＵＤＧおよびｄＵＴＰ）５μｌ、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ順方向プライマーおよび逆方向プライマー（濃度は各プライマー５μＭ）０．５μｌ、５μＭ Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ０．５μｌ、およびＬＤＲ反応産物１μｌ。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）により密封されたＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ－９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ０．１ｍｌプレートを使用して、以下の設定でＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）からのＶｉｉＡ７リアルタイムサーマルサイクラー中でｑＰＣＲ反応を行った：高速ブロック、実験タイプとしての標準曲線、受動参照としてのＲＯＸ、定量化法としてのＣｔ（自動閾値、ただし、必要に応じて０．０５に調整）、レポーターとしてのＴＡＭＲＡ、およびクエンチャーとしてのＮＦＱ－ＭＧＢ。採用したプログラムは：５０℃で２分、ならびに（９５℃で１秒および６０℃で２０秒）を４５サイクルであった。結果を図７２Ａ～Ｂおよび７３Ａ～Ｂならびに下の表４７に示す。
（表４７）実施例２における各遺伝子（遺伝子１～１０）のＣｔ値
（表４７続き）実施例２における各遺伝子（遺伝子１１～２０）のＣｔ値
本明細書では好ましい態様を示し、詳細に説明してきたが、本出願の精神から逸脱することなく、様々な変更、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらが添付の特許請求の範囲に定義される本出願の範囲内にあると見なされることは、当業者には明らかであろう。
本出願は、自動化しやすく、容易に入手可能な市販の計器上で作動するプロトコルを使用して、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲリードアウトを使用してがんのマーカー（例えば変異、発現、スプライスバリアント、転座、コピー数および／またはメチル化変化）を検出するためのロバストな手法を提供する。この手法は、検査装置のために統合され、好都合であるという利点を提供して、コスト削減、スケーラビリティならびにＣＬＩＡ準拠自動化設定における医療および検査室フローとの適合を可能にする。世界中で命が救われる恩恵は計り知れない価値を有するであろう。
[本発明1001]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、3'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）5'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、3'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている、段階；
1つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階；
ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成するために、該1つまたは複数のライゲーション反応混合物を1つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供して、それにより、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせる段階であって、各ライゲーション産物配列が、該5'プライマー特異的部分と、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該3'プライマー特異的部分とを含む、段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該ライゲーション産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該ライゲーション産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該ライゲーション産物配列と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
該1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された該ポリメラーゼ伸長産物の一部分に相補的である3'部分とを有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）5'プライマー特異的部分と、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの5'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分の相補物とを含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の三次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1003]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的である3'部分を有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分を有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1004]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、該1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）5'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1005]
損傷したＤＮＡ、脱塩基部位、酸化した塩基またはＤＮＡ中のニックを修復するために、試料をＤＮＡ修復酵素と接触させる段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
1つまたは複数の制限酵素反応混合物を形成するために、1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するための前記ブレンドの前に、またはそれと同時並行的に、試料を少なくとも第一のメチル化感受性酵素と接触させる段階
をさらに含み、
該第一のメチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つまたは複数の非メチル化残基を含有する試料中の核酸分子を切断し、それにより、前記検出が、標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の検出を含み、該親核酸分子が1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基をはじめから含有する、
本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
試料中のメチル化またはヒドロキシメチル化核酸を選択的に結合させ、富化するために、該試料を、固定化されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸結合タンパク質または抗体と接触させる段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
1つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは1つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ポリメラーゼ伸長を妨害する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーおよび／または二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、該プライマーの3'末端がポリメラーゼ伸長には不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含む3'部分を有し、
方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理中に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記伸長処理の前に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの自由な3'ＯＨ末端を解放する段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1010]
1つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な3'ＯＨ末端から2または3ヌクレオチド塩基の位置にある、本発明1009の方法。
[本発明1011]
切断可能なヌクレオチドが1つまたは複数のＲＮＡ塩基を含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端が、野生型核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ポリメラーゼ伸長には不適であるように、1つまたは複数のミスマッチ塩基を3'末端に含む、または1つまたは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を3'末端に含む、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする該野生型核酸配列またはその相補物配列中のヌクレオチド配列部分と同じであるヌクレオチド配列を有する部分を含むが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に対し1つまたは複数のヌクレオチド配列ミスマッチを有する、段階；ならびに
ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション反応の前に、該1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを試料または該試料からその後に製造される産物とブレンドする段階であって、前記ハイブリダイゼーション工程中、該1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが野生型核酸配列またはその相補物配列に優先的に塩基特異的な形でハイブリダイズして、それにより、プライマーまたはプローブが該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズする反応中にポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する、段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1013]
第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分を有し、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分を有し、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第三の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｄ）該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第四の二次オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1014]
第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーの5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；および
該1つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを、前記1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中にブレンドする段階
をさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1015]
ＤＮＡ修復酵素が10－11転座（ＴＥＴ2）ジオキシゲナーゼであり、ＤＮＡ脱アミノ化酵素がアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ）である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの第二のオリゴヌクレオチドプローブがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および3'プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
方法が、
1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供する間、該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを該ライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
1つの一次オリゴヌクレオチドプライマーまたは1つの二次オリゴヌクレオチドプライマーがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および他方の5'プライマー特異的部分の相補物ならびにそれらの相補物を含む伸長産物配列を形成し、
方法が、
1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
第一のポリメラーゼ連鎖反応後のポリメラーゼ連鎖反応サイクル中、該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブをライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、本発明1002～1004のいずれかの方法。
[本発明1018]
オリゴヌクレオチドプローブセットの一方または両方のオリゴヌクレオチドプローブが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは1つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該オリゴヌクレオチドプローブが、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ライゲーションを妨害する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
オリゴヌクレオチドプローブセットの第一のオリゴヌクレオチドプローブの3'部分が、3'末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションには不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含み、
方法が、
該プローブが一次伸長産物のその相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするとき、該第一のオリゴヌクレオチドプローブの該切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の3'ＯＨを解放する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
オリゴヌクレオチドプローブセットの1つまたは複数の第一のオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な3'ＯＨ末端から2または3ヌクレオチド塩基の位置にある、本発明1019の方法。
[本発明1021]
第二のオリゴヌクレオチドプローブが、第一のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と重複する同一のヌクレオチドをその5'末端に有し、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが一次伸長産物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置にハイブリダイズして接合部を形成すると、第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドが、該第一のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部にフラップを形成し、
方法が、
該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該5'末端のリン酸基を解放する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第三のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの間の接合部をもって互いに隣接して標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、該第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーションを可能にして、プローブセットの第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成するように構成されている、本発明1001の方法。
[本発明1023]
試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、セルフリー循環核酸、セルフリー循環腫瘍核酸、妊娠女性中のセルフリー循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料およびエクソソームからなる群より選択される、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を含む低存在量核酸分子である、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有する低存在量核酸分子が、特定され、該低存在量核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するが、該1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有しない、試料中の高存在量核酸分子から識別される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
1つまたは複数の低存在量標的ヌクレオチド配列のコピー数が、試料中の高存在量核酸分子のコピー数に対して定量化される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量化または列挙される、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1028]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、前記試料中または同一の後続工程を受ける他の試料中の他のヌクレオチド配列に対して定量化または列挙される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対コピー数が定量化または列挙される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記特定に基づいて疾患状態を診断または予後予測する段階
をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記特定に基づいて遺伝子型または疾患素因を識別する段階
をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1032]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、6～12のマーカー、12～24のマーカー、24～36のマーカー、36～48のマーカー、48～72のマーカー、72～96のマーカーまたは＞96のマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中の各マーカーが、以下の基準：
該疾患状態を有すると診断された個体からの疾患細胞または組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの正常な細胞または組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
該疾患状態を有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
6～12のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つもしくは3つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、12～24のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つもしくは5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つもしくは6つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含むマーカーセット中、最低4つ、5つ、6つ、7つもしくは8つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～72のマーカーを含むマーカーセット中、最低6つ、7つ、8つ、9つ、10、11もしくは12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、72～96のマーカーを含むマーカーセット中、最低7つ、8つ、9つ、10、11、12もしくは13のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、96～「ｎ」（「ｎ」＞168）のマーカーを含むマーカーセット中、最低8つ、9つ、10、11、12、13もしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、該疾患状態を有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1033]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で48～72のがんマーカー、全部で72～96のがんマーカーまたは全部で≧96のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／4超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で48～72のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で72～96のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で96～「ｎ」（「ｎ」＞96）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／18のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1034]
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、36～48のグループ特異的がんマーカー、48～64のグループ特異的がんマーカーまたは≧64のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／3超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
36～48のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～64のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、64～「ｎ」（「ｎ」＞64）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1036]
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんを含む消化器がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、6～12のマーカー、12～18のマーカー、18～24のマーカー、24～36のマーカー、36～48のマーカーまたは≧48のマーカーを含むセット中にあり、
各マーカーが、消化器がんに関する以下の基準：
消化器がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
消化器がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
6～12のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つ、3つもしくは4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、12～18のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つ、3つ、4つもしくは5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、18～24のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つもしくは6つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つ、6つ、7つもしくは8つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含むマーカーセット中、最低4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含むマーカーセット中、最低5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12もしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、消化器がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1038]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で36～48のがんマーカー、全部で48～64のがんマーカーまたは全部で≧64のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で36～48のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で48～64のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で64～「ｎ」（「ｎ」＞96）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1039]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
24～36のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1040]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の1つまたは複数の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測して、治療を誘導し、モニタリングする方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約1／4～約1／2またはより多くを有し、
その後の治療を誘導し、モニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされた特定されたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされた特定されたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、治療プロトコル中、マーカーシグナルの損失をモニタリングするために、該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
該治療プロトコルが施されたのち、12～24のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低3つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低4つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低5つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば、該マーカーの継続的存在が、がん治療法を変更する決定を導き得る、方法。
[本発明1041]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の1つまたは複数の固形組織がんの再発に関して疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約1／4～約1／2またはより多くを有し、
再発をモニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、マーカーシグナルのゲインをモニタリングするために、治療成功後の該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
治療プロトコルが施されたのち、12～24のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低3つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、24～36のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低4つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、36～48のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低5つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば、患者特異的マーカーセット中の再出現または上昇またはカットオフレベルを超える上昇が、がん治療法を再開する、または新たながん治療法へと変更する決定を導き得る、方法。
[本発明1042]
少なくとも2つの富化工程が、以下の工程：
エクソソームまたは細胞外小胞または他の保護された状態にあるマーカーを捕捉または分離する工程；血小板画分を捕捉または分離する工程；循環腫瘍細胞を捕捉または分離する工程；ＲＮＡ含有複合体を捕捉または分離する工程；ｃｆＤＮＡ－ヌクレオソームまたは差次的に修飾されたｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉または分離する工程；タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉または分離する工程；自己抗体を捕捉または分離する工程；サイトカインを捕捉または分離する工程；メチル化またはヒドロキシメチル化ｃｆＤＮＡを捕捉または分離する工程；磁気ビーズ上またはマイクロアレイ上、溶解状態の相補的捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによってマーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは増幅された相補物を捕捉または分離する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ2、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エクソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカーまたはコピー数変動マーカーを一次関数的または指数関数的に増幅する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ2、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列を含有する標的領域の増幅を抑制しながらも、変異マーカーまたはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されて変換されたＤＮＡメチル化マーカーを含有する1つまたは複数の標的領域を選択的に一次関数的または指数関数的に増幅する工程；酵素および配列依存的プロセスで3'－ＯＨ末端が解放された1つまたは複数のプライマーまたはプローブを優先的に伸長、ライゲーションまたは増幅する工程；標的特異的プライマーまたはプローブをＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズさせる該反応中、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する条件下、1つもしくは複数のミスマッチ塩基を3'末端に含む、または1つもしくは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を3'末端に含む1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイが、以下：
定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）；逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｑＰＣＲ法；デジタルＰＣＲ法（ｄＰＣＲ）；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｄＰＣＲ法；ライゲーション検出法；リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法；ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼ切断法；マイクロアレイハイブリダイゼーション法；ペプチドアレイ結合法；抗体アレイ法；質量分析法；液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）；毛管またはゲル電気泳動法；化学発光法；蛍光法；ＤＮＡ配列決定法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ＤＮＡ配列決定法；ＲＮＡ配列決定法；近接ライゲーション法；近接ＰＣＲ法；抗体－標的複合体を固定化することを含む方法；アプタマー－標的複合体を固定化することを含む方法；イムノアッセイ法；ウエスタンブロットアッセイを含む方法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイの1つまたは複数のカットオフレベルが、疾患個体からの試料と正常個体からの試料とを比較する1つまたは複数のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較または測定：
マーカーΔＣｔ値が＞2である；マーカーΔＣｔ値が＞4である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞1．5である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞3である；マーカー濃度の比が＞1．5である；マーカー濃度の比が＞3である；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞20％異なる；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞50％異なる；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの＞85％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％または＞98％である；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、＞1．03、＞1．28、＞1．65、＞1．75、＞1．88または＞2．05のｚスコアを有する、
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する2工程法であって、
潜在的に疾患状態の細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するエクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該疾患状態を有すると診断または予後予測される可能性が比較的高い個体を特定するために、第一の工程を、該生物学的試料に対し、＞80％の全感度および＞90％の全特異度または＞1．28の全Ｚスコアで適用する段階；ならびに
該疾患状態を有する個体を診断または予後予測するために、第二の工程を、該第一の工程で特定された個体からの生物学的試料に対し、＞95％の全特異度または＞1．65の全Ｚスコアで適用する段階
を含み、
該第一の工程の適用および／または第二の工程の適用が、本発明1032～1044のいずれかの方法を使用して実行される、方法。
[本発明1046]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図42または図58のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図43または図59のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1048]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－21、ＭＩＲ21；ｈｓａ－ｍｉｒ－182、ＭＩＲ182；ｈｓａ－ｍｉｒ－454、ＭＩＲ454；ｈｓａ－ｍｉｒ－96、ＭＩＲ96；ｈｓａ－ｍｉｒ－183、ＭＩＲ183；ｈｓａ－ｍｉｒ－549、ＭＩＲ549；ｈｓａ－ｍｉｒ－301ａ、ＭＩＲ301Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－548ｆ－1、ＭＩＲ548Ｆ1；ｈｓａ－ｍｉｒ－301ｂ、ＭＩＲ301Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－103－1、ＭＩＲ1031；ｈｓａ－ｍｉｒ－18ａ、ＭＩＲ18Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－147ｂ、ＭＩＲ147Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－4326、ＭＩＲ4326およびｈｓａ－ｍｉｒ－573、ＭＩＲ573からなる群より選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列または図39のリストから選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1049]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図40のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1050]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図41のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：特性不明のタンパク質Ｃ19ｏｒｆ48、Ｑ6ＲＵＩ8；タンパク質ＦＡＭ72Ｂ、Ｑ86Ｘ60；タンパク質ＦＡＭ72Ｄ、Ｑ6Ｌ9Ｔ8；ヒドロキシアシルグルタチオン加水分解酵素様タンパク質、Ｑ6ＰＩＩ5；推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ5、Ｑ96Ｐ11；ＲＮＡ偽ウリジル酸（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｅ）シンターゼドメイン含有タンパク質1、Ｑ9ＵＪＪ7；コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質1、Ｑ96ＣＧ8；インターロイキン－11、Ｐ20809；ストロメリシン－2、Ｐ09238；マトリックスメタロプロテイナーゼ－9、Ｐ14780；ポドカン様タンパク質1、Ｑ6ＰＥＺ8；推定ペプチドＹＹ－2、Ｑ9ＮＲＩ6；オステオポンチン、Ｐ10451；スルフヒドリルオキシダーゼ2、Ｑ6ＺＲＰ7；グリピカン－2、Ｑ8Ｎ158；マクロファージ遊走阻害因子、Ｐ14174；ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼＡ、Ｐ62937およびカルレティキュリン、Ｐ27797からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1051]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）、ＭＵＣ16（ムチン16）およびＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1052]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図28または図45または図60のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1053]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図29または図46または図61のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1054]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図23のリストもしくは（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－624、ＭＩＲ624の群から選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または図24のリストもしくは［Ｇｅｎｅ ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ38）］、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ： ＬＩＮＣ01558、ｃｈｒ6：167784537－167796859もしくはＥＮＳＧ00000146521．8の群から選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1055]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図25または図44のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1056]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図26もしくは図27のリストから、もしくは（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＥＬＥ、1ｑ22－ｑ25、セレクチンＥ、Ｐ16581；ＯＴＵＤ4、4ｑ31．21、ＯＴＵドメイン含有4、Ｑ01804；ＢＰＩ、20ｑ11．23、殺菌／透過性増加タンパク質、Ｐ17213；ＡＳＢ4、7ｑ21－ｑ22、アンキリンリピートおよびＳＯＣＳボックス含有4、Ｑ9Ｙ574；Ｃ6ｏｒｆ123、6ｑ27、染色体6オープンリーディングフレーム123、Ｑ9Ｙ6Ｚ2；ＫＰＮＡ3、13ｑ14．3、カリオフェリンα3（インポーチンα4）およびＯ00505；ＮＵＰ98、11ｐ15、ヌクレオポリン98ｋＤａ、Ｐ52948からなる群、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ57）もしくはＰ17213の群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1057]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＡＰＣ（ＷＮＴシグナル伝達経路のＡＰＣレギュレータ）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ1（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン1）、ＤＮＡＨ11（ダイニン軸糸重鎖11）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ400（Ｅ1Ａ結合タンパク質ｐ400）、ＦＡＴ3（ＦＡＴ非定型カドヘリン3）、ＦＡＴ4（ＦＡＴ非定型カドヘリン4）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ3（ＧＬＩファミリージンクフィンガー3）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ1Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質1Ｂ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＯＢＳＣＮ（オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ3ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－4，5－二リン酸3－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ2（リアノジン受容体2）、ＳＹＮＥ1（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質1）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）およびＵＮＣ13Ｃ（ｕｎｃ－13ホモログＣ）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1058]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図47または図62のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1059]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図48または図63のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1060]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ｈｓａ－ｍｉｒ－1265、ＭＩＲ1265から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1061]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ2：179209013－179209087：＋、ＯＳＢＰＬ6；ｃｈｒ2：179251788－179251866：＋、ＯＳＢＰＬ6およびｃｈｒ2：179253736－179253880：＋、ＯＳＢＰＬ6からなる群より選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1062]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＲＳＰＯ2、8ｑ23．1、Ｒ－スポンジン2、Ｑ6ＵＸＸ9；ＫＬＣ4、6ｐ21．1、キネシン軽鎖4、Ｑ9ＮＳＫ0；ＧＬＲＸ、5ｑ14、グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ）、Ｐ35754、および（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：Ｒ－スポンジン2（蓋板特異的スポンジン2）（ｈＲｓｐｏ2）もしくはＱ6ＵＸＸ9からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1063]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＰＩＫ3ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－4，5－二リン酸3－キナーゼ触媒サブユニットα）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1064]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図49または図64のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1065]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図50または図65のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1066]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－28、ＭＩＲ28から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1067]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ2： ｃｈｒ1：93307721－93309752：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93312740－93312916：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93316405－93316512：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93341853－93342152：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93426933－93427079：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ7：40221554－40221627：＋、Ｃ7ｏｒｆ10；ｃｈｒ7：40234539－40234659：＋、Ｃ7ｏｒｆ10；ｃｈｒ8：22265823－22266009：＋、ＳＬＣ39Ａ14；ｃｈｒ8：22272293－22272415：＋、ＳＬＣ39Ａ14；ｃｈｒ14：39509936－39510091：－、ＳＥＣ23Ａおよびｃｈｒ14：39511990－39512076：－、ＳＥＣ23Ａからなる群より選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1068]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＴＲＮ3、14ｑ13－ｑ21、ストリアチン、カルモジュリン結合タンパク質3、Ｑ13033；ＬＲＲＣ17、7ｑ22．1、ロイシンリッチリピート含有17、Ｑ8Ｎ6Ｙ2；ＦＡＭ69Ａ、1ｐ22、配列類似性69のファミリー、メンバーＡ、Ｑ5Ｔ7Ｍ9；ＡＴＦ2、2ｑ32、活性化転写因子2、Ｐ15336；ＢＨＭＴ、5ｑ14．1、ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ、Ｑ93088；ＯＤＺ3／ＴＥＮＭ3、4ｑ34．3－ｑ35．1、テニューリン膜貫通タンパク質3、Ｑ9Ｐ273；ＺＦＨＸ4、8ｑ21．11、ジンクフィンガーホメオボックス4、Ｑ86ＵＰ3または（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ロイシンリッチリピート含有タンパク質17（ｐ37ＮＢ）、Ｑ8Ｎ6Ｙ2からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1069]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＣＳＭＤ3（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン3）、ＤＮＡＨ5（ダイニン軸索重鎖5）、ＦＡＴ1（ＦＡＴ非定型カドヘリン1）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ1Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質1Ｂ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ1Ｌ1（ＰＫＨＤ1様1）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ2（リアノジン受容体2）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ1（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質1）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）、ＵＳＨ2Ａ（ウシェリン）およびＸＩＲＰ2（ｘｉｎアクチン結合リピート含有2）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1070]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図51または図66のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1071]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図52または図67のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1072]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図74のリストから選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－491、ＭＩＲ491；ｈｓａ－ｍｉｒ－1468、ＭＩＲ1468からなる群より選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列および［遺伝子ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ38）、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ007383．3、ｃｈｒ2：206084605－206086564、ＥＮＳＧ00000227946．1およびＬＩＮＣ00324、ｃｈｒ17：8220642－8224043、ＥＮＳＧ00000178977．3からなる群より選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1073]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ｃｈｒ21：45555942－45556055：＋、Ｃ21ｏｒｆ33から選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列（エクソン位置、遺伝子）を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1074]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または群：（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＰＭＭ1、22ｑ13、ホスホマンノムターゼ1、Ｑ92871から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1075]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＢＡＧＥ2（ＢＡＧＥファミリーメンバー2）、ＤＮＭ1Ｐ47（ダイナミン1偽遺伝子47）、ＦＲＧ1ＢＰ（領域遺伝子1ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＲＰ11－156Ｐ1．3、ＴＴＮ（チチン）およびＴＵＢＢ8Ｐ7（チューブリンβ8クラスＶＩＩＩ偽遺伝子7）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1076]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図56または図68のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1077]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図57または図69のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1078]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－132、ＭＩＲ132から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列、および図53のリストから選択される1つまたは複数のｌｎｃＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1079]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図54のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1080]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図55のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン）、Ｐ06396；プロニューレグリン－2、Ｏ14511；ＣＤ59糖タンパク質（1Ｆ5抗原）（20ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－20）（ＨＲＦ20）（ＭＡＣ阻害タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ43抗原）（膜侵襲複合体阻害因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害因子）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ59）、Ｐ13987および発散タンパク質キナーゼドメイン2Ｂ（自閉症関連タンパク質1で欠失）、Ｑ9Ｈ7Ｙ0からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1081]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＭＵＣ4（ムチン4、細胞表面関連）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1001]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、3'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）5'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、3'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている、段階；
1つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階；
ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成するために、該1つまたは複数のライゲーション反応混合物を1つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供して、それにより、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせる段階であって、各ライゲーション産物配列が、該5'プライマー特異的部分と、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該3'プライマー特異的部分とを含む、段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該ライゲーション産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該ライゲーション産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該ライゲーション産物配列と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
該1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された該ポリメラーゼ伸長産物の一部分に相補的である3'部分とを有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）5'プライマー特異的部分と、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの5'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分の相補物とを含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の三次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1003]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的である3'部分を有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分を有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1004]
試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる1つまたは複数の酵素を提供する段階；
1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）5'プライマー特異的部分と、該1つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）5'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む3'部分とを有する第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該1つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該1つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該3'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該1つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該1つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。
[本発明1005]
損傷したＤＮＡ、脱塩基部位、酸化した塩基またはＤＮＡ中のニックを修復するために、試料をＤＮＡ修復酵素と接触させる段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
1つまたは複数の制限酵素反応混合物を形成するために、1つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するための前記ブレンドの前に、またはそれと同時並行的に、試料を少なくとも第一のメチル化感受性酵素と接触させる段階
をさらに含み、
該第一のメチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つまたは複数の非メチル化残基を含有する試料中の核酸分子を切断し、それにより、前記検出が、標的ヌクレオチド配列を含有する1つまたは複数の親核酸分子の検出を含み、該親核酸分子が1つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基をはじめから含有する、
本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
試料中のメチル化またはヒドロキシメチル化核酸を選択的に結合させ、富化するために、該試料を、固定化されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸結合タンパク質または抗体と接触させる段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
1つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは1つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ポリメラーゼ伸長を妨害する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーおよび／または二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、該プライマーの3'末端がポリメラーゼ伸長には不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含む3'部分を有し、
方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理中に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記伸長処理の前に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの自由な3'ＯＨ末端を解放する段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1010]
1つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な3'ＯＨ末端から2または3ヌクレオチド塩基の位置にある、本発明1009の方法。
[本発明1011]
切断可能なヌクレオチドが1つまたは複数のＲＮＡ塩基を含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端が、野生型核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ポリメラーゼ伸長には不適であるように、1つまたは複数のミスマッチ塩基を3'末端に含む、または1つまたは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を3'末端に含む、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする該野生型核酸配列またはその相補物配列中のヌクレオチド配列部分と同じであるヌクレオチド配列を有する部分を含むが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に対し1つまたは複数のヌクレオチド配列ミスマッチを有する、段階；ならびに
ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション反応の前に、該1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを試料または該試料からその後に製造される産物とブレンドする段階であって、前記ハイブリダイゼーション工程中、該1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが野生型核酸配列またはその相補物配列に優先的に塩基特異的な形でハイブリダイズして、それにより、プライマーまたはプローブが該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズする反応中にポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する、段階
をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1013]
第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分を有し、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーが5'プライマー特異的部分を有し、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第三の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｄ）該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第四の二次オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1014]
第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーの5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；および
該1つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを、前記1つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中にブレンドする段階
をさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1015]
ＤＮＡ修復酵素が10－11転座（ＴＥＴ2）ジオキシゲナーゼであり、ＤＮＡ脱アミノ化酵素がアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ）である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの第二のオリゴヌクレオチドプローブがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および3'プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
方法が、
1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供する間、該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを該ライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
1つの一次オリゴヌクレオチドプライマーまたは1つの二次オリゴヌクレオチドプライマーがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および他方の5'プライマー特異的部分の相補物ならびにそれらの相補物を含む伸長産物配列を形成し、
方法が、
1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
第一のポリメラーゼ連鎖反応後のポリメラーゼ連鎖反応サイクル中、該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブをライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該1つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、本発明1002～1004のいずれかの方法。
[本発明1018]
オリゴヌクレオチドプローブセットの一方または両方のオリゴヌクレオチドプローブが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは1つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該オリゴヌクレオチドプローブが、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ライゲーションを妨害する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
オリゴヌクレオチドプローブセットの第一のオリゴヌクレオチドプローブの3'部分が、3'末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションには不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含み、
方法が、
該プローブが一次伸長産物のその相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするとき、該第一のオリゴヌクレオチドプローブの該切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の3'ＯＨを解放する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
オリゴヌクレオチドプローブセットの1つまたは複数の第一のオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な3'ＯＨ末端から2または3ヌクレオチド塩基の位置にある、本発明1019の方法。
[本発明1021]
第二のオリゴヌクレオチドプローブが、第一のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と重複する同一のヌクレオチドをその5'末端に有し、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが一次伸長産物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置にハイブリダイズして接合部を形成すると、第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドが、該第一のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部にフラップを形成し、
方法が、
該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該5'末端のリン酸基を解放する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第三のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの間の接合部をもって互いに隣接して標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、該第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーションを可能にして、プローブセットの第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成するように構成されている、本発明1001の方法。
[本発明1023]
試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、セルフリー循環核酸、セルフリー循環腫瘍核酸、妊娠女性中のセルフリー循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料およびエクソソームからなる群より選択される、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を含む低存在量核酸分子である、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有する低存在量核酸分子が、特定され、該低存在量核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するが、該1つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有しない、試料中の高存在量核酸分子から識別される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
1つまたは複数の低存在量標的ヌクレオチド配列のコピー数が、試料中の高存在量核酸分子のコピー数に対して定量化される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量化または列挙される、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1028]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、前記試料中または同一の後続工程を受ける他の試料中の他のヌクレオチド配列に対して定量化または列挙される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対コピー数が定量化または列挙される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記特定に基づいて疾患状態を診断または予後予測する段階
をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記特定に基づいて遺伝子型または疾患素因を識別する段階
をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1032]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、6～12のマーカー、12～24のマーカー、24～36のマーカー、36～48のマーカー、48～72のマーカー、72～96のマーカーまたは＞96のマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中の各マーカーが、以下の基準：
該疾患状態を有すると診断された個体からの疾患細胞または組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの正常な細胞または組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
該疾患状態を有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
6～12のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つもしくは3つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、12～24のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つもしくは5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つもしくは6つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含むマーカーセット中、最低4つ、5つ、6つ、7つもしくは8つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～72のマーカーを含むマーカーセット中、最低6つ、7つ、8つ、9つ、10、11もしくは12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、72～96のマーカーを含むマーカーセット中、最低7つ、8つ、9つ、10、11、12もしくは13のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、96～「ｎ」（「ｎ」＞168）のマーカーを含むマーカーセット中、最低8つ、9つ、10、11、12、13もしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、該疾患状態を有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1033]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で48～72のがんマーカー、全部で72～96のがんマーカーまたは全部で≧96のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／4超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で48～72のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で72～96のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で96～「ｎ」（「ｎ」＞96）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／18のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1034]
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、36～48のグループ特異的がんマーカー、48～64のグループ特異的がんマーカーまたは≧64のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／3超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞50％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
36～48のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～64のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、64～「ｎ」（「ｎ」＞64）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1036]
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞66％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんを含む消化器がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、6～12のマーカー、12～18のマーカー、18～24のマーカー、24～36のマーカー、36～48のマーカーまたは≧48のマーカーを含むセット中にあり、
各マーカーが、消化器がんに関する以下の基準：
消化器がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
消化器がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
6～12のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つ、3つもしくは4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、12～18のマーカーを含むマーカーセット中、最低2つ、3つ、4つもしくは5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、18～24のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つもしくは6つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含むマーカーセット中、最低3つ、4つ、5つ、6つ、7つもしくは8つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含むマーカーセット中、最低4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含むマーカーセット中、最低5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12もしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、消化器がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1038]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で36～48のがんマーカー、全部で48～64のがんマーカーまたは全部で≧64のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で36～48のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で48～64のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で64～「ｎ」（「ｎ」＞96）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／12のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1039]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
24～36のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低4つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低5つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。
[本発明1040]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の1つまたは複数の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測して、治療を誘導し、モニタリングする方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約1／4～約1／2またはより多くを有し、
その後の治療を誘導し、モニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされた特定されたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされた特定されたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、治療プロトコル中、マーカーシグナルの損失をモニタリングするために、該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
該治療プロトコルが施されたのち、12～24のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低3つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、24～36のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低4つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、36～48のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低5つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば、該マーカーの継続的存在が、がん治療法を変更する決定を導き得る、方法。
[本発明1041]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ1（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ2（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ3（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ4（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ5（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の1つまたは複数の固形組織がんの再発に関して疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、24～36のグループ特異的がんマーカー、36～48のグループ特異的がんマーカーまたは≧48のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で1／2超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞75％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞95％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞1．65のｚ値で存在する、
の任意の1つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも50％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも50％がそれぞれ1つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞1．65のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも50％が1つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を1つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも1つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
1つまたは複数の画分中の核酸分子を、5－メチル化および5－ヒドロキシメチル化シトシン残基を5－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが5－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、1つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの50％以上に関して少なくとも2つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約1／4～約1／2またはより多くを有し、
再発をモニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、マーカーシグナルのゲインをモニタリングするために、治療成功後の該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
治療プロトコルが施されたのち、12～24のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低3つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、24～36のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低4つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、36～48のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低5つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、48～「ｎ」（「ｎ」＞48）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低6つもしくは「ｎ」／8のマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば、患者特異的マーカーセット中の再出現または上昇またはカットオフレベルを超える上昇が、がん治療法を再開する、または新たながん治療法へと変更する決定を導き得る、方法。
[本発明1042]
少なくとも2つの富化工程が、以下の工程：
エクソソームまたは細胞外小胞または他の保護された状態にあるマーカーを捕捉または分離する工程；血小板画分を捕捉または分離する工程；循環腫瘍細胞を捕捉または分離する工程；ＲＮＡ含有複合体を捕捉または分離する工程；ｃｆＤＮＡ－ヌクレオソームまたは差次的に修飾されたｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉または分離する工程；タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉または分離する工程；自己抗体を捕捉または分離する工程；サイトカインを捕捉または分離する工程；メチル化またはヒドロキシメチル化ｃｆＤＮＡを捕捉または分離する工程；磁気ビーズ上またはマイクロアレイ上、溶解状態の相補的捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによってマーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは増幅された相補物を捕捉または分離する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ2、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エクソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカーまたはコピー数変動マーカーを一次関数的または指数関数的に増幅する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ2、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列を含有する標的領域の増幅を抑制しながらも、変異マーカーまたはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されて変換されたＤＮＡメチル化マーカーを含有する1つまたは複数の標的領域を選択的に一次関数的または指数関数的に増幅する工程；酵素および配列依存的プロセスで3'－ＯＨ末端が解放された1つまたは複数のプライマーまたはプローブを優先的に伸長、ライゲーションまたは増幅する工程；標的特異的プライマーまたはプローブをＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズさせる該反応中、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する条件下、1つもしくは複数のミスマッチ塩基を3'末端に含む、または1つもしくは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を3'末端に含む1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイが、以下：
定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）；逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｑＰＣＲ法；デジタルＰＣＲ法（ｄＰＣＲ）；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｄＰＣＲ法；ライゲーション検出法；リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法；ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼ切断法；マイクロアレイハイブリダイゼーション法；ペプチドアレイ結合法；抗体アレイ法；質量分析法；液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）；毛管またはゲル電気泳動法；化学発光法；蛍光法；ＤＮＡ配列決定法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ＤＮＡ配列決定法；ＲＮＡ配列決定法；近接ライゲーション法；近接ＰＣＲ法；抗体－標的複合体を固定化することを含む方法；アプタマー－標的複合体を固定化することを含む方法；イムノアッセイ法；ウエスタンブロットアッセイを含む方法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための1つまたは複数のアッセイの1つまたは複数のカットオフレベルが、疾患個体からの試料と正常個体からの試料とを比較する1つまたは複数のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較または測定：
マーカーΔＣｔ値が＞2である；マーカーΔＣｔ値が＞4である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞1．5である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞3である；マーカー濃度の比が＞1．5である；マーカー濃度の比が＞3である；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞20％異なる；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞50％異なる；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの＞85％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％または＞98％である；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、＞1．03、＞1．28、＞1．65、＞1．75、＞1．88または＞2．05のｚスコアを有する、
の1つまたは複数を含む、本発明1032～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する2工程法であって、
潜在的に疾患状態の細胞または組織および1つまたは複数の他の組織または細胞に由来するエクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該疾患状態を有すると診断または予後予測される可能性が比較的高い個体を特定するために、第一の工程を、該生物学的試料に対し、＞80％の全感度および＞90％の全特異度または＞1．28の全Ｚスコアで適用する段階；ならびに
該疾患状態を有する個体を診断または予後予測するために、第二の工程を、該第一の工程で特定された個体からの生物学的試料に対し、＞95％の全特異度または＞1．65の全Ｚスコアで適用する段階
を含み、
該第一の工程の適用および／または第二の工程の適用が、本発明1032～1044のいずれかの方法を使用して実行される、方法。
[本発明1046]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図42または図58のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図43または図59のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1048]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－21、ＭＩＲ21；ｈｓａ－ｍｉｒ－182、ＭＩＲ182；ｈｓａ－ｍｉｒ－454、ＭＩＲ454；ｈｓａ－ｍｉｒ－96、ＭＩＲ96；ｈｓａ－ｍｉｒ－183、ＭＩＲ183；ｈｓａ－ｍｉｒ－549、ＭＩＲ549；ｈｓａ－ｍｉｒ－301ａ、ＭＩＲ301Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－548ｆ－1、ＭＩＲ548Ｆ1；ｈｓａ－ｍｉｒ－301ｂ、ＭＩＲ301Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－103－1、ＭＩＲ1031；ｈｓａ－ｍｉｒ－18ａ、ＭＩＲ18Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－147ｂ、ＭＩＲ147Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－4326、ＭＩＲ4326およびｈｓａ－ｍｉｒ－573、ＭＩＲ573からなる群より選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列または図39のリストから選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1049]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図40のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1050]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図41のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：特性不明のタンパク質Ｃ19ｏｒｆ48、Ｑ6ＲＵＩ8；タンパク質ＦＡＭ72Ｂ、Ｑ86Ｘ60；タンパク質ＦＡＭ72Ｄ、Ｑ6Ｌ9Ｔ8；ヒドロキシアシルグルタチオン加水分解酵素様タンパク質、Ｑ6ＰＩＩ5；推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ5、Ｑ96Ｐ11；ＲＮＡ偽ウリジル酸（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｅ）シンターゼドメイン含有タンパク質1、Ｑ9ＵＪＪ7；コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質1、Ｑ96ＣＧ8；インターロイキン－11、Ｐ20809；ストロメリシン－2、Ｐ09238；マトリックスメタロプロテイナーゼ－9、Ｐ14780；ポドカン様タンパク質1、Ｑ6ＰＥＺ8；推定ペプチドＹＹ－2、Ｑ9ＮＲＩ6；オステオポンチン、Ｐ10451；スルフヒドリルオキシダーゼ2、Ｑ6ＺＲＰ7；グリピカン－2、Ｑ8Ｎ158；マクロファージ遊走阻害因子、Ｐ14174；ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼＡ、Ｐ62937およびカルレティキュリン、Ｐ27797からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1051]
疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）、ＭＵＣ16（ムチン16）およびＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1052]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図28または図45または図60のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1053]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図29または図46または図61のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1054]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図23のリストもしくは（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－624、ＭＩＲ624の群から選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または図24のリストもしくは［Ｇｅｎｅ ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ38）］、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ： ＬＩＮＣ01558、ｃｈｒ6：167784537－167796859もしくはＥＮＳＧ00000146521．8の群から選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1055]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図25または図44のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1056]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図26もしくは図27のリストから、もしくは（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＥＬＥ、1ｑ22－ｑ25、セレクチンＥ、Ｐ16581；ＯＴＵＤ4、4ｑ31．21、ＯＴＵドメイン含有4、Ｑ01804；ＢＰＩ、20ｑ11．23、殺菌／透過性増加タンパク質、Ｐ17213；ＡＳＢ4、7ｑ21－ｑ22、アンキリンリピートおよびＳＯＣＳボックス含有4、Ｑ9Ｙ574；Ｃ6ｏｒｆ123、6ｑ27、染色体6オープンリーディングフレーム123、Ｑ9Ｙ6Ｚ2；ＫＰＮＡ3、13ｑ14．3、カリオフェリンα3（インポーチンα4）およびＯ00505；ＮＵＰ98、11ｐ15、ヌクレオポリン98ｋＤａ、Ｐ52948からなる群、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ57）もしくはＰ17213の群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1057]
疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＡＰＣ（ＷＮＴシグナル伝達経路のＡＰＣレギュレータ）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ1（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン1）、ＤＮＡＨ11（ダイニン軸糸重鎖11）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ400（Ｅ1Ａ結合タンパク質ｐ400）、ＦＡＴ3（ＦＡＴ非定型カドヘリン3）、ＦＡＴ4（ＦＡＴ非定型カドヘリン4）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ3（ＧＬＩファミリージンクフィンガー3）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ1Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質1Ｂ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＯＢＳＣＮ（オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ3ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－4，5－二リン酸3－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ2（リアノジン受容体2）、ＳＹＮＥ1（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質1）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）およびＵＮＣ13Ｃ（ｕｎｃ－13ホモログＣ）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1058]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図47または図62のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1059]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図48または図63のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1060]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ｈｓａ－ｍｉｒ－1265、ＭＩＲ1265から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1061]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ2：179209013－179209087：＋、ＯＳＢＰＬ6；ｃｈｒ2：179251788－179251866：＋、ＯＳＢＰＬ6およびｃｈｒ2：179253736－179253880：＋、ＯＳＢＰＬ6からなる群より選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1062]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＲＳＰＯ2、8ｑ23．1、Ｒ－スポンジン2、Ｑ6ＵＸＸ9；ＫＬＣ4、6ｐ21．1、キネシン軽鎖4、Ｑ9ＮＳＫ0；ＧＬＲＸ、5ｑ14、グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ）、Ｐ35754、および（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：Ｒ－スポンジン2（蓋板特異的スポンジン2）（ｈＲｓｐｏ2）もしくはＱ6ＵＸＸ9からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1063]
疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＰＩＫ3ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－4，5－二リン酸3－キナーゼ触媒サブユニットα）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1064]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図49または図64のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1065]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図50または図65のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1066]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－28、ＭＩＲ28から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1067]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ2： ｃｈｒ1：93307721－93309752：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93312740－93312916：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93316405－93316512：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93341853－93342152：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ1：93426933－93427079：－、ＦＡＭ69Ａ；ｃｈｒ7：40221554－40221627：＋、Ｃ7ｏｒｆ10；ｃｈｒ7：40234539－40234659：＋、Ｃ7ｏｒｆ10；ｃｈｒ8：22265823－22266009：＋、ＳＬＣ39Ａ14；ｃｈｒ8：22272293－22272415：＋、ＳＬＣ39Ａ14；ｃｈｒ14：39509936－39510091：－、ＳＥＣ23Ａおよびｃｈｒ14：39511990－39512076：－、ＳＥＣ23Ａからなる群より選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1068]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＴＲＮ3、14ｑ13－ｑ21、ストリアチン、カルモジュリン結合タンパク質3、Ｑ13033；ＬＲＲＣ17、7ｑ22．1、ロイシンリッチリピート含有17、Ｑ8Ｎ6Ｙ2；ＦＡＭ69Ａ、1ｐ22、配列類似性69のファミリー、メンバーＡ、Ｑ5Ｔ7Ｍ9；ＡＴＦ2、2ｑ32、活性化転写因子2、Ｐ15336；ＢＨＭＴ、5ｑ14．1、ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ、Ｑ93088；ＯＤＺ3／ＴＥＮＭ3、4ｑ34．3－ｑ35．1、テニューリン膜貫通タンパク質3、Ｑ9Ｐ273；ＺＦＨＸ4、8ｑ21．11、ジンクフィンガーホメオボックス4、Ｑ86ＵＰ3または（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ロイシンリッチリピート含有タンパク質17（ｐ37ＮＢ）、Ｑ8Ｎ6Ｙ2からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1069]
疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＣＳＭＤ3（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン3）、ＤＮＡＨ5（ダイニン軸索重鎖5）、ＦＡＴ1（ＦＡＴ非定型カドヘリン1）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ1Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質1Ｂ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ1Ｌ1（ＰＫＨＤ1様1）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ2（リアノジン受容体2）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ1（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質1）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）、ＴＴＮ（チチン）、ＵＳＨ2Ａ（ウシェリン）およびＸＩＲＰ2（ｘｉｎアクチン結合リピート含有2）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1070]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図51または図66のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1071]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図52または図67のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1072]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図74のリストから選択される1つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－491、ＭＩＲ491；ｈｓａ－ｍｉｒ－1468、ＭＩＲ1468からなる群より選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列および［遺伝子ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ38）、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ007383．3、ｃｈｒ2：206084605－206086564、ＥＮＳＧ00000227946．1およびＬＩＮＣ00324、ｃｈｒ17：8220642－8224043、ＥＮＳＧ00000178977．3からなる群より選択される1つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1073]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ｃｈｒ21：45555942－45556055：＋、Ｃ21ｏｒｆ33から選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列（エクソン位置、遺伝子）を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1074]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または群：（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＰＭＭ1、22ｑ13、ホスホマンノムターゼ1、Ｑ92871から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1075]
疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＢＡＧＥ2（ＢＡＧＥファミリーメンバー2）、ＤＮＭ1Ｐ47（ダイナミン1偽遺伝子47）、ＦＲＧ1ＢＰ（領域遺伝子1ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＲＰ11－156Ｐ1．3、ＴＴＮ（チチン）およびＴＵＢＢ8Ｐ7（チューブリンβ8クラスＶＩＩＩ偽遺伝子7）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1076]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図56または図68のリストから選択される、ＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の1つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1077]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも50％がそれぞれ、図57または図69のリストから選択される、1つまたは複数の染色体サブ領域の1つまたは複数のメチル化残基を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1078]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－132、ＭＩＲ132から選択される1つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列、および図53のリストから選択される1つまたは複数のｌｎｃＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1079]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、図54のリストから選択される1つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1080]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、1つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図55のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン）、Ｐ06396；プロニューレグリン－2、Ｏ14511；ＣＤ59糖タンパク質（1Ｆ5抗原）（20ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－20）（ＨＲＦ20）（ＭＡＣ阻害タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ43抗原）（膜侵襲複合体阻害因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害因子）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ59）、Ｐ13987および発散タンパク質キナーゼドメイン2Ｂ（自閉症関連タンパク質1で欠失）、Ｑ9Ｈ7Ｙ0からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
[本発明1081]
疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の1つまたは複数のマーカーが、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ2カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ16（ムチン16、細胞表面関連）、ＭＵＣ4（ムチン4、細胞表面関連）、ＴＰ53（腫瘍タンパク質ｐ53）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における1つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、本発明1032～1045のいずれかの方法。
（表４５）
Claims (81)
- 試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階；
１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが５'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該プライマーセットの該１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５'プライマー特異的部分と、３'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）５'ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、３'プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の相補的ヌクレオチド配列に塩基特異的な形でハイブリダイズするように構成されている、段階；
１つまたは複数のライゲーション反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物をリガーゼおよび該１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階；
ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成するために、該１つまたは複数のライゲーション反応混合物を１つまたは複数のライゲーション反応サイクルに供して、それにより、該１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補的配列にハイブリダイズしたとき、いっしょにライゲーションさせる段階であって、各ライゲーション産物配列が、該５'プライマー特異的部分と、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該３'プライマー特異的部分とを含む、段階；
１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該ライゲーション産物配列の該５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該ライゲーション産物配列の該３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該ライゲーション産物配列と、該１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。 - 試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階；
該１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された該ポリメラーゼ伸長産物の一部分に相補的である３'部分とを有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列特異的または相補物配列特異的部分と、該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該５'プライマー特異的部分の相補物とを含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の該５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の三次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物配列の該３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該１つまたは複数の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。 - 試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階；
１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、該第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーが５'プライマー特異的部分をさらに含む、段階；
１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該プライマーセットの該１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的である３'部分を有する第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された第一のポリメラーゼ連鎖反応産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分を有する第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。 - 試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子を該試料中で特定するための方法であって、
他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つまたは複数の親核酸分子を含有する試料を提供する段階；
処理済み試料を製造するために、該試料中の該核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つまたは複数の酵素を提供する段階；
１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５'プライマー特異的部分と、該１つまたは複数の変換されたメチル化またはヒドロキシメチル化残基を含有する、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列に隣接する、該親核酸分子中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第一の一次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）５'プライマー特異的部分と、該第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む３'部分とを有する第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、該処理済み試料と、該１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該１つまたは複数の第一の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列の相補物を含む一次伸長産物を形成する段階；
１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該一次伸長産物を含む該１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物と、該１つまたは複数の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの該１つまたは複数の第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーと、該反応混合物中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、デオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された標的ヌクレオチド配列またはその相補物を含む第一のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；
１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第一の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物またはそれらの相補物の該３'プライマー特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、段階；
１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、該第一のポリメラーゼ連鎖反応産物と、該１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる該１つまたは複数の酵素と、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックスと、ＤＮＡポリメラーゼとをブレンドする段階；
該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化し、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行するのに好適な条件に供して、それにより、第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する段階；ならびに
該試料中の他の親核酸分子中のヌクレオチド配列とは１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基だけ異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の存在を特定するために、該１つまたは複数の第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の該第二のポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し、識別する段階
を含む、方法。 - 損傷したＤＮＡ、脱塩基部位、酸化した塩基またはＤＮＡ中のニックを修復するために、試料をＤＮＡ修復酵素と接触させる段階
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - １つまたは複数の制限酵素反応混合物を形成するために、１つまたは複数のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するための前記ブレンドの前に、またはそれと同時並行的に、試料を少なくとも第一のメチル化感受性酵素と接触させる段階
をさらに含み、
該第一のメチル化感受性酵素が、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つまたは複数の非メチル化残基を含有する試料中の核酸分子を切断し、それにより、前記検出が、標的ヌクレオチド配列を含有する１つまたは複数の親核酸分子の検出を含み、該親核酸分子が１つまたは複数のメチル化またはヒドロキシメチル化残基をはじめから含有する、
請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - 試料中のメチル化またはヒドロキシメチル化核酸を選択的に結合させ、富化するために、該試料を、固定化されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸結合タンパク質または抗体と接触させる段階
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - １つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ポリメラーゼ伸長を妨害する１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - 一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーおよび／または二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、該プライマーの３'末端がポリメラーゼ伸長には不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含む３'部分を有し、
方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理中に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記伸長処理の前に一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの自由な３'ＯＨ末端を解放する段階
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - １つまたは複数の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な３'ＯＨ末端から２または３ヌクレオチド塩基の位置にある、請求項９記載の方法。
- 切断可能なヌクレオチドが１つまたは複数のＲＮＡ塩基を含む、請求項９記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーの３'末端が、野生型核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ポリメラーゼ伸長には不適であるように、１つまたは複数のミスマッチ塩基を３'末端に含む、または１つまたは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を３'末端に含む、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが、該ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする該野生型核酸配列またはその相補物配列中のヌクレオチド配列部分と同じであるヌクレオチド配列を有する部分を含むが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化またはヒドロキシメチル化核酸配列もしくはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に対し１つまたは複数のヌクレオチド配列ミスマッチを有する、段階；ならびに
ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション反応の前に、該１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを試料または該試料からその後に製造される産物とブレンドする段階であって、前記ハイブリダイゼーション工程中、該１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが野生型核酸配列またはその相補物配列に優先的に塩基特異的な形でハイブリダイズして、それにより、プライマーまたはプローブが該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズする反応中にポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する、段階
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。 - 第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーが５'プライマー特異的部分を有し、第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーが５'プライマー特異的部分を有し、該１つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、該第一の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第三の二次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｄ）該第二の二次オリゴヌクレオチドプライマーの該５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第四の二次オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項３記載の方法。
- 第一または第二の一次オリゴヌクレオチドプライマーの５'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；および
該１つまたは複数の第三の一次オリゴヌクレオチドプライマーを、前記１つまたは複数の第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物中にブレンドする段階
をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。 - ＤＮＡ修復酵素が１０－１１転座（ＴＥＴ２）ジオキシゲナーゼであり、ＤＮＡ脱アミノ化酵素がアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ）である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブセットの第二のオリゴヌクレオチドプローブがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、５'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および３'プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
方法が、
１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
該第二のポリメラーゼ連鎖反応混合物を１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供する間、該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを該ライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。 - １つの一次オリゴヌクレオチドプライマーまたは１つの二次オリゴヌクレオチドプライマーがＵｎｉＴａｑ検出部分をさらに含み、それにより、５'プライマー特異的部分、標的特異的部分、該ＵｎｉＴａｑ検出部分および他方の５'プライマー特異的部分の相補物ならびにそれらの相補物を含む伸長産物配列を形成し、
方法が、
１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ＵｎｉＴａｑ検出プローブが相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズし、該検出プローブが、クエンチャー分子と、該クエンチャー分子から切り離された検出可能なラベルとを含む、段階；
該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブを１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；ならびに
第一のポリメラーゼ連鎖反応後のポリメラーゼ連鎖反応サイクル中、該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブをライゲーション産物配列またはその相補物上の相補的ＵｎｉＴａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に該クエンチャー分子および該検出可能なラベルが該１つまたは複数のＵｎｉＴａｑ検出プローブから切断され、前記検出が、切断された検出可能なラベルの検出を含む、段階
をさらに含む、請求項２～４のいずれか一項記載の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットの一方または両方のオリゴヌクレオチドプローブが、
標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズしたとき、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、該オリゴヌクレオチドプローブが、該ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化核酸配列またはその相補物配列中の対応するヌクレオチド配列部分に塩基特異的な形でハイブリダイズするときは、ライゲーションを妨害する１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列ミスマッチを有する、部分
を含む、請求項１記載の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットの第一のオリゴヌクレオチドプローブの３'部分が、３'末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションには不適であるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロッキング基とを含み、
方法が、
該プローブが一次伸長産物のその相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするとき、該第一のオリゴヌクレオチドプローブの該切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の３'ＯＨを解放する段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットの１つまたは複数の第一のオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸配列またはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル化もしくはヒドロキシメチル化核酸配列またはその相補物配列とは異なる配列を含み、その違いが、解放された自由な３'ＯＨ末端から２または３ヌクレオチド塩基の位置にある、請求項１９記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプローブが、第一のオリゴヌクレオチドプローブの３'末端と重複する同一のヌクレオチドをその５'末端に有し、プローブセットの該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブが一次伸長産物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置にハイブリダイズして接合部を形成すると、第二のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドが、該第一のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部にフラップを形成し、
方法が、
該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを、５'ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断して、それにより、前記ライゲーションの前に該第二のオリゴヌクレオチドプローブの該５'末端のリン酸基を解放する段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。 - １つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第三のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの間の接合部をもって互いに隣接して標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、該第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーションを可能にして、プローブセットの第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成するように構成されている、請求項１記載の方法。
- 試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、セルフリー循環核酸、セルフリー循環腫瘍核酸、妊娠女性中のセルフリー循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料およびエクソソームからなる群より選択される、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。
- １つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、１つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を含む低存在量核酸分子である、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。
- １つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有する低存在量核酸分子が、特定され、該低存在量核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するが、該１つもしくは複数のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、代替スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入またはゲノムレベルでの他の再編成および／またはメチル化もしくはヒドロキシメチル化ヌクレオチド塩基を有しない、試料中の高存在量核酸分子から識別される、請求項２４記載の方法。
- １つまたは複数の低存在量標的ヌクレオチド配列のコピー数が、試料中の高存在量核酸分子のコピー数に対して定量化される、請求項２５記載の方法。
- １つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量化または列挙される、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。
- １つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、前記試料中または同一の後続工程を受ける他の試料中の他のヌクレオチド配列に対して定量化または列挙される、請求項２７記載の方法。
- １つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対コピー数が定量化または列挙される、請求項２８記載の方法。
- 前記特定に基づいて疾患状態を診断または予後予測する段階
をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。 - 前記特定に基づいて遺伝子型または疾患素因を識別する段階
をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカー、４８～７２のマーカー、７２～９６のマーカーまたは＞９６のマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中の各マーカーが、以下の基準：
該疾患状態を有すると診断された個体からの疾患細胞または組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの正常な細胞または組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
該疾患状態を有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
該疾患状態を有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
該疾患状態を有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化もしくはヒドロキシメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つもしくは３つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つもしくは５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つもしくは６つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～７２のマーカーを含むマーカーセット中、最低６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１もしくは１２のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、７２～９６のマーカーを含むマーカーセット中、最低７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、９６～「ｎ」（「ｎ」＞１６８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低８つ、９つ、１０、１１、１２、１３もしくは「ｎ」／１２のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、該疾患状態を有すると診断または予後予測される、方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で４８～７２のがんマーカー、全部で７２～９６のがんマーカーまたは全部で≧９６のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／４超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で４８～７２のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で７２～９６のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で９６～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／１８のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。 - 所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択される、請求項３３記載の方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、３６～４８のグループ特異的がんマーカー、４８～６４のグループ特異的がんマーカーまたは≧６４のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／３超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞５０％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～６４のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、６４～「ｎ」（「ｎ」＞６４）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／１２のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。 - 所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞６６％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択される、請求項３５記載の方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんを含む消化器がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、６～１２のマーカー、１２～１８のマーカー、１８～２４のマーカー、２４～３６のマーカー、３６～４８のマーカーまたは≧４８のマーカーを含むセット中にあり、
各マーカーが、消化器がんに関する以下の基準：
消化器がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
消化器がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
消化器がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
消化器がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
６～１２のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つもしくは４つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、１２～１８のマーカーを含むマーカーセット中、最低２つ、３つ、４つもしくは５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、１８～２４のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つもしくは６つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含むマーカーセット中、最低３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含むマーカーセット中、最低４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくは１０のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含むマーカーセット中、最低５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは「ｎ」／１２のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、消化器がんを有すると診断または予後予測される、方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、全部で３６～４８のがんマーカー、全部で４８～６４のがんマーカーまたは全部で≧６４のがんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、検査される前述の主要ながんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
全部で３６～４８のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で４８～６４のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、全部で６４～「ｎ」（「ｎ」＞９６）のがんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／１２のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測し、最も可能性が高い特定の原発組織を特定する方法であって、
該複数のマーカーが、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
２４～３６のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低４つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低５つのマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のグループ特異的がんマーカーを含むマーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／８のマーカーが存在するか、カットオフレベルよりも上であるならば、個体が、固形組織がんを有すると診断または予後予測される、方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの疾患状態を診断または予後予測して、治療を誘導し、モニタリングする方法であって、
該複数のマーカーが、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、
その後の治療を誘導し、モニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされた特定されたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされた特定されたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、治療プロトコル中、マーカーシグナルの損失をモニタリングするために、該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
該治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／８のマーカーが依然として存在するか、依然としてカットオフレベルよりも上であるならば、該マーカーの継続的存在が、がん治療法を変更する決定を導き得る、方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、以下のグループ：グループ１（結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん）；グループ２（乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫）；グループ３（肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん）；グループ４（前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん）および／またはグループ５（肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がん）の１つまたは複数の固形組織がんの再発に関して疾患状態を診断または予後予測する方法であって、
該複数のマーカーが、２４～３６のグループ特異的がんマーカー、３６～４８のグループ特異的がんマーカーまたは≧４８のグループ特異的がんマーカーを含むセット中にあり、
所与のセット中のそのようなマーカーの平均で１／２超が、そのグループ内の検査される前述のがんそれぞれをカバーし、
所与の固形組織がんのための所与のセット中の各マーカーが、その固形組織がんに関する以下の基準：
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの所与のがん組織の生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの正常組織の生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞７５％において存在する、またはカットオフレベルよりも上である；
その所与の固形組織がんを有しない個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料の＞９５％において存在しない、またはカットオフレベルよりも下である；
所与の固形組織がんを有すると診断された個体からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料において＞１．６５のｚ値で存在する、
の任意の１つまたは複数を有することによって選択され、
所与の固形組織がんを有すると診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物またはそれらの画分を含む生物学的試料中、セット中の該マーカーの少なくとも５０％がそれぞれ１つもしくは複数のメチル化残基を含み、および／または、存在する、もしくはカットオフレベルよりも上である、もしくは＞１．６５のｚ値で存在するセット中の該マーカーの少なくとも５０％が１つもしくは複数のメチル化残基を含み、
方法が、
該細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該試料を１つまたは複数の画分へと分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、またはセルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、段階；
１つまたは複数の画分中の核酸分子を、５－メチル化および５－ヒドロキシメチル化シトシン残基を５－カルボキシシトシン残基に変換するのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ修復酵素による処理に供し、次いで、非メチル化シトシンをデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換するが５－カルボキシシトシン残基はデオキシウラシル（ｄＵ）残基へと変換しないのに好適な条件下、１つまたは複数のＤＮＡ脱アミノ化酵素による処理に供する段階；
該分画工程中に、および／または核酸増幅工程を実行することにより、疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの５０％以上に関して少なくとも２つの富化工程を実行する段階；ならびに
該複数のがん特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイを実行して、それにより、該試料中のそれらの存在またはレベルを特定する段階
を含み、
所与の組織特異的がんを有する個体が、平均で、検査されたマーカーセット中で存在する、またはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの約１／４～約１／２またはより多くを有し、
再発をモニタリングするために、該検査されたマーカーセット中で存在するとスコアリングされたマーカーまたはカットオフレベルよりも上であるとスコアリングされたマーカーの一部または全部が「患者特異的マーカーセット」と見なされ、マーカーシグナルのゲインをモニタリングするために、治療成功後の該個体からのその後の生物学的試料に対して再検査され、
治療プロトコルが施されたのち、１２～２４のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低３つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、２４～３６のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低４つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、３６～４８のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低５つのマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば；または、４８～「ｎ」（「ｎ」＞４８）のマーカーを含む患者特異的マーカーセット中、最低６つもしくは「ｎ」／８のマーカーが再出現するか、カットオフレベルよりも上昇するならば、患者特異的マーカーセット中の再出現または上昇またはカットオフレベルを超える上昇が、がん治療法を再開する、または新たながん治療法へと変更する決定を導き得る、方法。 - 少なくとも２つの富化工程が、以下の工程：
エクソソームまたは細胞外小胞または他の保護された状態にあるマーカーを捕捉または分離する工程；血小板画分を捕捉または分離する工程；循環腫瘍細胞を捕捉または分離する工程；ＲＮＡ含有複合体を捕捉または分離する工程；ｃｆＤＮＡ－ヌクレオソームまたは差次的に修飾されたｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉または分離する工程；タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉または分離する工程；自己抗体を捕捉または分離する工程；サイトカインを捕捉または分離する工程；メチル化またはヒドロキシメチル化ｃｆＤＮＡを捕捉または分離する工程；磁気ビーズ上またはマイクロアレイ上、溶解状態の相補的捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによってマーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは増幅された相補物を捕捉または分離する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡおよびｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エクソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカーまたはコピー数変動マーカーを一次関数的または指数関数的に増幅する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ脱アミノ化酵素、ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼまたはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されたメチル特異的ライゲーション反応ならびに／またはライゲーション反応により、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列を含有する標的領域の増幅を抑制しながらも、変異マーカーまたはＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理されて変換されたＤＮＡメチル化マーカーを含有する１つまたは複数の標的領域を選択的に一次関数的または指数関数的に増幅する工程；酵素および配列依存的プロセスで３'－ＯＨ末端が解放された１つまたは複数のプライマーまたはプローブを優先的に伸長、ライゲーションまたは増幅する工程；標的特異的プライマーまたはプローブをＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素で処理された非メチル化配列またはその相補物配列に塩基特異的な形でハイブリダイズさせる該反応中、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する条件下、１つもしくは複数のミスマッチ塩基を３'末端に含む、または１つもしくは複数のヌクレオチド類似体およびブロッキング基を３'末端に含む１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程
の１つまたは複数を含む、請求項３２～４１のいずれか一項記載の方法。 - 複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイが、以下：
定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）；逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｑＰＣＲ法；デジタルＰＣＲ法（ｄＰＣＲ）；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ｄＰＣＲ法；ライゲーション検出法；リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法；ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼ切断法；マイクロアレイハイブリダイゼーション法；ペプチドアレイ結合法；抗体アレイ法；質量分析法；液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）；毛管またはゲル電気泳動法；化学発光法；蛍光法；ＤＮＡ配列決定法；ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ脱アミノ化酵素処理ＤＮＡ配列決定法；ＲＮＡ配列決定法；近接ライゲーション法；近接ＰＣＲ法；抗体－標的複合体を固定化することを含む方法；アプタマー－標的複合体を固定化することを含む方法；イムノアッセイ法；ウエスタンブロットアッセイを含む方法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法；高スループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法
の１つまたは複数を含む、請求項３２～４２のいずれか一項記載の方法。 - 複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーを検出し、識別するための１つまたは複数のアッセイの１つまたは複数のカットオフレベルが、疾患個体からの試料と正常個体からの試料とを比較する１つまたは複数のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較または測定：
マーカーΔＣｔ値が＞２である；マーカーΔＣｔ値が＞４である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞１．５である；検出されたマーカー特異的シグナルの比が＞３である；マーカー濃度の比が＞１．５である；マーカー濃度の比が＞３である；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞２０％異なる；列挙されたマーカー特異的シグナルが＞５０％異なる；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％または＞９８％である；所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、＞１．０３、＞１．２８、＞１．６５、＞１．７５、＞１．８８または＞２．０５のｚスコアを有する、
の１つまたは複数を含む、請求項３２～４３のいずれか一項記載の方法。 - 個体の生物学的試料中の複数の疾患特異的および／または細胞／組織特異的ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質マーカーの存在またはレベルの特定に基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予後予測する２工程法であって、
潜在的に疾患状態の細胞または組織および１つまたは複数の他の組織または細胞に由来するエクソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、セルフリーＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む生物学的試料を取得する段階であって、該生物学的試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物およびそれらの画分からなる群より選択される、段階；
該疾患状態を有すると診断または予後予測される可能性が比較的高い個体を特定するために、第一の工程を、該生物学的試料に対し、＞８０％の全感度および＞９０％の全特異度または＞１．２８の全Ｚスコアで適用する段階；ならびに
該疾患状態を有する個体を診断または予後予測するために、第二の工程を、該第一の工程で特定された個体からの生物学的試料に対し、＞９５％の全特異度または＞１．６５の全Ｚスコアで適用する段階
を含み、
該第一の工程の適用および／または第二の工程の適用が、請求項３２～４４のいずれか一項記載の方法を使用して実行される、方法。 - 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図４２または図５８のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図４３または図５９のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－２１、ＭＩＲ２１；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８２、ＭＩＲ１８２；ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４、ＭＩＲ４５４；ｈｓａ－ｍｉｒ－９６、ＭＩＲ９６；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８３、ＭＩＲ１８３；ｈｓａ－ｍｉｒ－５４９、ＭＩＲ５４９；ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ａ、ＭＩＲ３０１Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｆ－１、ＭＩＲ５４８Ｆ１；ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ｂ、ＭＩＲ３０１Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－１０３－１、ＭＩＲ１０３１；ｈｓａ－ｍｉｒ－１８ａ、ＭＩＲ１８Ａ；ｈｓａ－ｍｉｒ－１４７ｂ、ＭＩＲ１４７Ｂ；ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２６、ＭＩＲ４３２６およびｈｓａ－ｍｉｒ－５７３、ＭＩＲ５７３からなる群より選択される１つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列または図３９のリストから選択される１つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、図４０のリストから選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図４１のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：特性不明のタンパク質Ｃ１９ｏｒｆ４８、Ｑ６ＲＵＩ８；タンパク質ＦＡＭ７２Ｂ、Ｑ８６Ｘ６０；タンパク質ＦＡＭ７２Ｄ、Ｑ６Ｌ９Ｔ８；ヒドロキシアシルグルタチオン加水分解酵素様タンパク質、Ｑ６ＰＩＩ５；推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ５、Ｑ９６Ｐ１１；ＲＮＡ偽ウリジル酸（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｅ）シンターゼドメイン含有タンパク質１、Ｑ９ＵＪＪ７；コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質１、Ｑ９６ＣＧ８；インターロイキン－１１、Ｐ２０８０９；ストロメリシン－２、Ｐ０９２３８；マトリックスメタロプロテイナーゼ－９、Ｐ１４７８０；ポドカン様タンパク質１、Ｑ６ＰＥＺ８；推定ペプチドＹＹ－２、Ｑ９ＮＲＩ６；オステオポンチン、Ｐ１０４５１；スルフヒドリルオキシダーゼ２、Ｑ６ＺＲＰ７；グリピカン－２、Ｑ８Ｎ１５８；マクロファージ遊走阻害因子、Ｐ１４１７４；ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼＡ、Ｐ６２９３７およびカルレティキュリン、Ｐ２７７９７からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が、結腸直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がん、子宮がん肉腫、肺腺がん、肺扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺腺がん、浸潤性尿路上皮膀胱がん、肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんを含む固形組織がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（チチン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）およびＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図２８または図４５または図６０のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図２９または図４６または図６１のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、図２３のリストもしくは（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－６２４、ＭＩＲ６２４の群から選択される１つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または図２４のリストもしくは［Ｇｅｎｅ ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ３８）］、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ： ＬＩＮＣ０１５５８、ｃｈｒ６：１６７７８４５３７－１６７７９６８５９もしくはＥＮＳＧ０００００１４６５２１．８の群から選択される１つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、図２５または図４４のリストから選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図２６もしくは図２７のリストから、もしくは（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＥＬＥ、１ｑ２２－ｑ２５、セレクチンＥ、Ｐ１６５８１；ＯＴＵＤ４、４ｑ３１．２１、ＯＴＵドメイン含有４、Ｑ０１８０４；ＢＰＩ、２０ｑ１１．２３、殺菌／透過性増加タンパク質、Ｐ１７２１３；ＡＳＢ４、７ｑ２１－ｑ２２、アンキリンリピートおよびＳＯＣＳボックス含有４、Ｑ９Ｙ５７４；Ｃ６ｏｒｆ１２３、６ｑ２７、染色体６オープンリーディングフレーム１２３、Ｑ９Ｙ６Ｚ２；ＫＰＮＡ３、１３ｑ１４．３、カリオフェリンα３（インポーチンα４）およびＯ００５０５；ＮＵＰ９８、１１ｐ１５、ヌクレオポリン９８ｋＤａ、Ｐ５２９４８からなる群、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ５７）もしくはＰ１７２１３の群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がんまたは食道がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＡＰＣ（ＷＮＴシグナル伝達経路のＡＰＣレギュレータ）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ１（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン１）、ＤＮＡＨ１１（ダイニン軸糸重鎖１１）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＦＡＴ３（ＦＡＴ非定型カドヘリン３）、ＦＡＴ４（ＦＡＴ非定型カドヘリン４）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ３（ＧＬＩファミリージンクフィンガー３）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面関連）、ＯＢＳＣＮ（オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（チチン）およびＵＮＣ１３Ｃ（ｕｎｃ－１３ホモログＣ）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図４７または図６２のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図４８または図６３のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６５、ＭＩＲ１２６５から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ２：１７９２０９０１３－１７９２０９０８７：＋、ＯＳＢＰＬ６；ｃｈｒ２：１７９２５１７８８－１７９２５１８６６：＋、ＯＳＢＰＬ６およびｃｈｒ２：１７９２５３７３６－１７９２５３８８０：＋、ＯＳＢＰＬ６からなる群より選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＲＳＰＯ２、８ｑ２３．１、Ｒ－スポンジン２、Ｑ６ＵＸＸ９；ＫＬＣ４、６ｐ２１．１、キネシン軽鎖４、Ｑ９ＮＳＫ０；ＧＬＲＸ、５ｑ１４、グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ）、Ｐ３５７５４、および（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：Ｒ－スポンジン２（蓋板特異的スポンジン２）（ｈＲｓｐｏ２）もしくはＱ６ＵＸＸ９からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が乳房小葉・乳管がん、子宮体部子宮内膜がん、卵巣漿液性嚢胞腺がん、子宮頸部扁平上皮がん・腺がんまたは子宮がん肉腫であり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図４９または図６４のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図５０または図６５のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－２８、ＭＩＲ２８から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、（エクソン位置、遺伝子）：ｃｈｒ２： ｃｈｒ１：９３３０７７２１－９３３０９７５２：－、ＦＡＭ６９Ａ；ｃｈｒ１：９３３１２７４０－９３３１２９１６：－、ＦＡＭ６９Ａ；ｃｈｒ１：９３３１６４０５－９３３１６５１２：－、ＦＡＭ６９Ａ；ｃｈｒ１：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－、ＦＡＭ６９Ａ；ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－、ＦＡＭ６９Ａ；ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋、Ｃ７ｏｒｆ１０；ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋、Ｃ７ｏｒｆ１０；ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋、ＳＬＣ３９Ａ１４；ｃｈｒ８：２２２７２２９３－２２２７２４１５：＋、ＳＬＣ３９Ａ１４；ｃｈｒ１４：３９５０９９３６－３９５１００９１：－、ＳＥＣ２３Ａおよびｃｈｒ１４：３９５１１９９０－３９５１２０７６：－、ＳＥＣ２３Ａからなる群より選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＳＴＲＮ３、１４ｑ１３－ｑ２１、ストリアチン、カルモジュリン結合タンパク質３、Ｑ１３０３３；ＬＲＲＣ１７、７ｑ２２．１、ロイシンリッチリピート含有１７、Ｑ８Ｎ６Ｙ２；ＦＡＭ６９Ａ、１ｐ２２、配列類似性６９のファミリー、メンバーＡ、Ｑ５Ｔ７Ｍ９；ＡＴＦ２、２ｑ３２、活性化転写因子２、Ｐ１５３３６；ＢＨＭＴ、５ｑ１４．１、ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ、Ｑ９３０８８；ＯＤＺ３／ＴＥＮＭ３、４ｑ３４．３－ｑ３５．１、テニューリン膜貫通タンパク質３、Ｑ９Ｐ２７３；ＺＦＨＸ４、８ｑ２１．１１、ジンクフィンガーホメオボックス４、Ｑ８６ＵＰ３または（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ロイシンリッチリピート含有タンパク質１７（ｐ３７ＮＢ）、Ｑ８Ｎ６Ｙ２からなる群より選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肺腺がん、肺扁平上皮がんまたは頭頸部扁平上皮がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＣＳＭＤ３（ＣＵＢおよびＳｕｓｈｉ複数ドメイン３）、ＤＮＡＨ５（ダイニン軸索重鎖５）、ＦＡＴ１（ＦＡＴ非定型カドヘリン１）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面関連）、ＰＣＬＯ（Ｐｉｃｃｏｌｏプレシナプス細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ１Ｌ１（ＰＫＨＤ１様１）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核エンベロープタンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（チチン）、ＵＳＨ２Ａ（ウシェリン）およびＸＩＲＰ２（ｘｉｎアクチン結合リピート含有２）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図５１または図６６のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図５２または図６７のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、図７４のリストから選択される１つもしくは複数のｍｉＲＮＡ配列、または（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－４９１、ＭＩＲ４９１；ｈｓａ－ｍｉｒ－１４６８、ＭＩＲ１４６８からなる群より選択される１つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列および［遺伝子ＩＤ、座標（ＧＲＣｈ３８）、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ００７３８３．３、ｃｈｒ２：２０６０８４６０５－２０６０８６５６４、ＥＮＳＧ０００００２２７９４６．１およびＬＩＮＣ００３２４、ｃｈｒ１７：８２２０６４２－８２２４０４３、ＥＮＳＧ０００００１７８９７７．３からなる群より選択される１つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ｃｈｒ２１：４５５５５９４２－４５５５６０５５：＋、Ｃ２１ｏｒｆ３３から選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列（エクソン位置、遺伝子）を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または群：（遺伝子シンボル、染色体バンド、遺伝子タイトル、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ＰＭＭ１、２２ｑ１３、ホスホマンノムターゼ１、Ｑ９２８７１から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が前立腺腺がんまたは浸潤性尿路上皮膀胱がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＢＡＧＥ２（ＢＡＧＥファミリーメンバー２）、ＤＮＭ１Ｐ４７（ダイナミン１偽遺伝子４７）、ＦＲＧ１ＢＰ（領域遺伝子１ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＲＰ１１－１５６Ｐ１．３、ＴＴＮ（チチン）およびＴＵＢＢ８Ｐ７（チューブリンβ８クラスＶＩＩＩ偽遺伝子７）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図５６または図６８のリストから選択される、ＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基、またはＣｐＧ配列の１つもしくは複数のメチル化シトシン残基の相補物を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中のマーカーの少なくとも５０％がそれぞれ、図５７または図６９のリストから選択される、１つまたは複数の染色体サブ領域の１つまたは複数のメチル化残基を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－１３２、ＭＩＲ１３２から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列、および図５３のリストから選択される１つまたは複数のｌｎｃＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、図５４のリストから選択される１つまたは複数のエクソンＲＮＡ配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、１つもしくは複数のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、または図５５のリストから、もしくは（タンパク質名、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン）、Ｐ０６３９６；プロニューレグリン－２、Ｏ１４５１１；ＣＤ５９糖タンパク質（１Ｆ５抗原）（２０ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－２０）（ＨＲＦ２０）（ＭＡＣ阻害タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ４３抗原）（膜侵襲複合体阻害因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害因子）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ５９）、Ｐ１３９８７および発散タンパク質キナーゼドメイン２Ｂ（自閉症関連タンパク質１で欠失）、Ｑ９Ｈ７Ｙ０からなる群から選択されるタンパク質産物に対する自己抗体を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
- 疾患状態が肝細胞がん、膵管腺がんまたは胆嚢腺がんであり、セット中の１つまたは複数のマーカーが、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面関連）、ＭＵＣ４（ムチン４、細胞表面関連）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）およびＴＴＮ（チチン）からなる群より選択される遺伝子における１つまたは複数の変異、挿入、欠失、コピー数変化または発現変化を含む、請求項３２～４５のいずれか一項記載の方法。
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