CN102912013A

CN102912013A - 定性检测细胞色素氧化酶cyp2c19基因分型的测序引物对及其试剂盒

Info

Publication number: CN102912013A
Application number: CN201210348050XA
Authority: CN
Inventors: 周姗
Original assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Current assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明提供一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反应液、PCR扩增引物、焦磷酸测序引物、以及阳性对照品；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。

Description

定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测常用药物代谢的细胞色素氧化酶CYP2C19基因的两个位点的基因分型的测序引物对及其试剂盒，即CYP2C19*2（681G/A）与CYP2C19*3（636G/A）两个位点的基因分型。

背景技术

细胞色素P450（CytochromeP450，CYP450）是由一组结构和功能相关的超家族基因（Superfamily gene）编码的同工酶，在人类身体中，其主要存在于肝细胞微粒中。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族，它们代谢约20%目前临床使用的药物。其中CYP2C19（S-美芬妥英羟化酶）是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全长1940，含有9个外显子，编码区为1473bp。其编码的蛋白S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床药物，如氯吡格雷、美芬妥英、奥美拉唑、普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。

研究表明很多药物代谢表型的差异源于CYP2C19基因突变，中国人常见的两种单核苷酸突变为CYP2C19*2型和CYP2C19*3型，分别为CYP2C19基因的第5外显子G681A和第4外显子G636A的突变。其中CYP2C19*2型G681A点突变产生了一个异常的拼接位点，使外显子5＇端的前40bp核苷酸发生缺失，改变了随后mRNA的阅读框，从而使蛋白的合成过早终止，使其合成的S-美芬妥英羟化酶缺乏血红素结合位点，使其失去活性。CYP2C19*3型G636A点突变使编码色氨酸密码子变为终止子，也导致蛋白合成提前终止，使合成的酶缺乏血红素及底物结合区而失去活性。这些点突变引起了S-美芬妥英羟化酶的活性和下降，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药品不良反应。

根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据对药物代谢能力分为三大类：药物强代谢型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19杂合型代表的是中间代谢型（IM），弱代谢型(PM)为突变型纯合子。CYP2C19*2在中国人中发生率是30％，CYP2C19*3是5％，而这两种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型（PM）。

CYP2C19基因型与肿瘤发病危险性：

CYP2C19基因的遗传多态性与多种肿瘤癌症的发生有关。研究结果表明，CYP2C19可能参与食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即CYP2C19基因的突变将增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌的危险性。因此，对人群中CYP2C19基因进行分型检测，能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及早期癌变预警提供重要的理论依据，有助于肿瘤癌症的前期预防。

CYP2C19基因主要影响的几种药物代谢有：

氯吡格雷：氯吡格雷为噻吩并吡啶衍生物，是一类新型的抗血小板药物，氯吡格雷本身无治疗效应，它由细胞色素P450氧化生成活性代谢产物（一种硫醇衍生物）而发挥作用。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因。CYP2C19基因的突变降低了氯吡格雷抗血小板聚集的疗效，并呈现出基因剂量效应。

美芬妥英：美芬妥英是临床常用广谱抗癫痫药，其血药浓度、疗效和不良反应存在显著个体差异，主要与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中CYP2C19基因多态性可引起不同个体服用美芬妥英后出现特异性的药理及毒理作用，造成药物治疗效果的差异。

奥美拉唑：奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂（PPI）之一，能抑制胃酸分泌，但长期大剂量使用将增加患者骨折的危险。在CYP2C19强代谢型人群中，奥美拉唑80%都是由CYP2C19代谢。故此，CYP2C19基因突变型人群使用奥美拉唑的疗效显著低于CYP2C19基因野生型人群。

CYP2C19基因参与的药物代谢还包括普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等，患者对这些药物的敏感性、耐药性以及不良反应状况都与患者本身CYP2C19基因多态性相关。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有重要的临床意义。

目前医院用于CYP2C19基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法,但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。

焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的

目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行CYP2C19的基因多态性检测的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序引物对，所述引物对为如下引物：

CYP2C19*2正向扩增引物：5′-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3′（SEQ ID NO.1）；

CYP2C19*2反向扩增引物：5′-CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC-3′（SEQ ID NO.2）

CYP2C19*2测序引物：5′-AAGTAATTTGTTATGGGTTC-3′（SEQ IDNO.3）

CYP2C19*3正向扩增引物：5′-GCAATGTGATCTGCTCCATTATTT-3′（SEQ ID NO.4）

CYP2C19*3反向扩增引物：5′-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTG-3′（SEQID NO.5）

CYP2C19*3测序引物：5′-TTGTAAGCACCCCCT-3′（SEQ ID NO.6）

其中，CYP2C19*2正向扩增引物（SEQ ID NO.1）和CYP2C19*3（SEQ IDNO.5）反向扩增引物的5′端分别进行生物素标记。

一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO.2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO.4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO.1所示的正向扩增引物，SEQ IDNO.5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。

进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA（SEQ ID NO.7）（control oligo）和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。

进一步地，所述试剂盒还包括CYP2C19*2阳性对照品1，CYP2C19*2阳性对照品2，CYP2C19*2阳性对照品3；CYP2C19*3阳性对照品1，CYP2C19*3阳性对照品2，CYP2C19*3阳性对照品3；

所述CYP2C19*2阳性对照品1为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的CYP2C19*2野生纯合子质粒；所述CYP2C19*2阳性对照品2为插有SEQ IDNO.9所示核苷酸序列的CYP2C19*2突变纯合子质粒；CYP2C19*2阳性对照品3为由所述CYP2C19*2突变纯合子质粒和所述CYP2C19*2野生纯合子质粒组成的CYP2C19*2质粒混合物；

所述CYP2C19*3阳性对照品1为插有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的CYP2C19*3野生纯合子质粒；CYP2C19*3阳性对照品2为插有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的CYP2C19*3突变纯合子质粒；CYP2C19*3阳性对照品3为由所述CYP2C19*3突变纯合子质粒和所述CYP2C19*3野生纯合子质粒组成的CYP2C19*3质粒混合物；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述CYP2C19*2质粒混合物中CYP2C19*2突变纯合子质粒和所述CYP2C19*2野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述CYP2C19*3质粒混合物中CYP2C19*3突变纯合子质粒和所述CYP2C19*3野生纯合子质粒的数量比为1:1。

所述的PCR反应液1和PCR反应液2中其他组分为常规的10 x PCR Buffer、dNTP和H₂O，各组分按常规体积比配置（10 x PCR Buffer、dNTP、H₂O和反应液中引物的体积比为5:3:37.5:1）。

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。

本发明的优点及有益效果：

1）本发明提供的定量检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序试剂盒定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观。

2）本发明提供的定量检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性高；

3）本发明提供的定量检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；

4）本发明提供的定量检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；

5）本发明提供的定量检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。

6）本发明的试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，能更好的确保检测结果的准确性。

由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CYP2C19基因分型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。

附图说明

图1为临床样本CYP2C19*2突变型纯合子的焦磷酸测序图；

图2为临床样本CYP2C19*2突变杂合型的焦磷酸测序图；

图3为临床样本CYP2C19*2野生型的焦磷酸测序图。

图4为临床样本CYP2C19*3野生型的焦磷酸测序图。

图5为临床样本CYP2C19*3突变杂合型的焦磷酸测序图。

图6为临床质控品control oligo的焦磷酸测序结果图；

图7为临床空白对照的焦磷酸测序结果图；

图8为多组设计引物的凝胶电泳图；图中①、②表明非特异性条带，③表明特异性和片段大小均比较合适，④表明目的带片段大小不对。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物的设计与合成

研究表明目前针对CYP2C19基因多态性主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3两种基因多态性，CYP2C19*2基因突变主要发生在第5号外显子第681核苷酸上G突变成A，CYP2C19*3型基因突变主要发生在第4号外显子第636核苷酸上G突变成A,。使用PyroMark Assay Design2.0软件，根据这两个突变位点（表1）设计并确定了PCR扩增引物和焦磷酸测序引物（表2），试剂盒中最主要的影响试剂盒的准确性的就是引物，包括扩增引物和测序引物，在设计的初期，我们设计了多组引物进行比较（见图7）；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中CYP2C19*2正向扩增引物（SEQ ID NO.1）和CYP2C19*3（SEQ ID NO:5）反向扩增引物的5′端分别进行生物素标记。

表1.突变位点与类型

Mutation	Base change
		Ex5 681	G>A
Ex4 636	G>A

表2.特异性扩增引物与测序引物序列

2．对照品选择

使用人工合成的一段寡聚核苷酸链control oligo为质控品SEQ ID NO:7（TAYGGTTTGCA）；DNAase RNA-free水为空白对照；阳性对照品为本公司自制。

4．PCR反应液组成

表3.PCR反应液1组成

原料名称	体积（μL）
		10 xPCRBuffer	5
dNTP	3
		CYP2C19*2反向扩增引物	1
H2O	38.5
		总体积	47.5μL

表4.PCR反应液2组成

原料名称	体积（μL）
		10 xPCRBuffer	5
dNTP	3
		CYP2C19*3正向扩增引物	1
H2O	38.5
		总体积	47.5μL

本试剂盒提供PCR反应液，用于细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型检测。

实施例2：试剂盒的使用

1．样本扩增

分别取空白对照、阳性对照和样本DNA，作为PCR反应模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、特异性PCR扩增引物1或2、及PCR反应液1或2中，组成PCR反应体系，进行PCR扩增。

CYP2C19*2体系各主要成分如下：

CYP2C19*3体系各主要成分如下：

2．PCR反应程序

设置好PCR反应程序，将反应管放入荧光PCR仪（ABI7500）开始扩增，反应程序如下：

表5.PCR反应程序

检测位点一（CYP2C19*2）退火温度设置为61℃，检测位点二（CYP2C19*3）退火温度设置为59℃。

1.焦磷酸测序

①PCR扩增产物预处理

分别取PCR扩增产物20μL，加入含Binding Buffer 40μL、水18μL及2μLBeads的体系中，按照QIAGEN PyroMark Q24测序仪的标准操作规程开机，对产物进行预处理。

②产物检测

分别添加Annealing Buffer 24μL、测序引物1.2μL到PyroMark Q24板上。质控品Control Oligo为自带测序引物，加Annealing buffer 25μL到PyroMarkQ24板上。

③运行程序

在QIAGEN PyroMark Q24测序仪上按下表选择对应的工作模式，输入待检序列，在USB存储器上选择运行程序运行。

表4.工作模式及待检序列

4．结果判断

仪器软件自动给出频率分析结果；

CYP2C19*2的DNA测序峰值图中，G的频率≧90%，A的频率≦10%，即认为CYP2C19*2野生型；30%≦G的频率≦70%，30%≦A的频率≦70%，即认为CYP2C19*2突变杂合型；A的频率≧90%，G的频率≦10%，即认为CYP2C19*2突变纯合型；

CYP2C19*3的DNA测序峰值图中，G的频率≧90%，A的频率≦10%，即认为CYP2C19*3野生型；30%≦G的频率≦70%，30%≦A的频率≦70%，即认为CYP2C19*3突变杂合型；A的频率≧90%，G的频率≦10%，即认为CYP2C19*3突变纯合型；

5．质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表5.质控品标准检测结果

	质控品	检出率
			1	空白对照	0
2	质控品	100%

6.结果报告：

结果如图1、图2、图3、图4所示，样本结果的判断标准如下：

表6.报告样本检测结果

	样本检测结果	报告结果
			1	C:0%T:100%	CYP2C19*2突变纯合型
2	C:43%T:57%	CYP2C19*2突变杂合型
			3	C:95%T:5%	CYP2C19*2野生型
4	C:2%T:98%	CYP2C19*3野生型
			5	C:58%T:42%	CYP2C19*3突变杂合型

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙三济生物科技有限公司

<120> 定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

ccagagcttg gcatattgta tcta 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

cgcaagcagt cacataacta agc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aagtaatttg ttatgggttc 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gcaatgtgat ctgctccatt attt 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

gcaaaaaact tggccttacc tg 22

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

ttgtaagcac cccct 15

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tayggtttgc a 11

<210> 8

<211> 289

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

ccagagcttg gcatattgta tctatacctt tattaaatgc ttttaattta ataaattatt 60

gttttctctt agatatgcaa taattttccc actatcattg attatttccc gggaacccat 120

aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa 180

caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa 240

atggagaagg taaaatgtta acaaaagctt agttatgtga ctgcttgcg 289

<210> 9

<211> 289

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

ccagagcttg gcatattgta tctatacctt tattaaatgc ttttaattta ataaattatt 60

gttttctctt agatatgcaa taattttccc actatcattg attatttccc aggaacccat 120

aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa 180

caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa 240

atggagaagg taaaatgtta acaaaagctt agttatgtga ctgcttgcg 289

<210> 10

<211> 138

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

gcaatgtgat ctgctccatt attttccaga aacgtttcga ttataaagat cagcaatttc 60

ttaacttgat ggaaaaattg aatgaaaaca tcaggattgt aagcaccccc tggatccagg 120

taaggccaag ttttttgc 138

<210> 11

<211> 138

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

gcaatgtgat ctgctccatt attttccaga aacgtttcga ttataaagat cagcaatttc 60

ttaacttgat ggaaaaattg aatgaaaaca tcaggattgt aagcaccccc tgaatccagg 120

taaggccaag ttttttgc 138

Claims

1.一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQID NO.1和SEQ ID NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。

2.一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO.2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO.4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO.1所示的正向扩增引物，SEQ ID NO.5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEQ ID NO.7所示的质控品和空白对照品。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CYP2C19*2阳性对照品1，CYP2C19*2阳性对照品2，CYP2C19*2阳性对照品3；CYP2C19*3阳性对照品1，CYP2C19*3阳性对照品2，CYP2C19*3阳性对照品3；

所述CYP2C19*2阳性对照品1为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的CYP2C19*2野生纯合子质粒；所述CYP2C19*2阳性对照品2为插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的CYP2C19*2突变纯合子质粒；CYP2C19*2阳性对照品3为由所述CYP2C19*2突变纯合子质粒和所述CYP2C19*2野生纯合子质粒组成的CYP2C19*2质粒混合物；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19*2质粒混合物中CYP2C19*2突变纯合子质粒和所述CYP2C19*2野生纯合子质粒的数量比为1:1。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19*3质粒混合物中CYP2C19*3突变纯合子质粒和所述CYP2C19*3野生纯合子质粒的数量比为1:1。