CN103789446A - 焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法，涉及氯吡格雷。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述检测方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。主要通过检测影响氯吡格雷代谢导致个体疗效差异的最主要因素，即CYP2C19的重要基因多态性位点，具体为CYP2C19*2和CYP2C19*3，达到指导心脑血管疾病需要长期抗凝者根据个体基因类型合理选择氯吡格雷及其剂量进行治疗。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检验领域，涉及氯吡格雷，尤其是涉及一种焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂，化学成分为噻吩并吡啶，目前广泛应用于冠状动脉血管疾病、外周血管疾病和脑血管疾病，如急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症等，也用于心脏支架术后患者长期抗凝[1-3]。临床研究表明氯吡格雷疗效存在明显的个体差异，4％～30％的患者服用常规剂量的氯吡格雷不能有效抑制血小板聚集反应[4]。美国食品药品监督管理局（FDA）于2010年要求厂商在氯吡格雷说明书中使用黑框警告标示“氯吡格雷（波利维）对特殊基因体质的患者在正常用药剂量下可能无法达到预期的疗效”[5]。
氯吡格雷主要经细胞色素P450家族的第二亚家族成员CYP2C19酶代谢生成活性代谢产物后发挥抗血小板效应。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因，CYP2C19*2（rs4244285）和CYP2C19*3（rs4986893）突变导致酶活性降低或丧失，造成活性代谢产物生成减少甚至不能生成，导致氯吡格雷抵抗，抗凝无效[4,6]。常规剂量的氯吡格雷在CYP2C19慢代谢型患者体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。因此，美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需增加氯吡格雷的剂量，或考虑改变治疗方案。国内学者近期的研究也显示基因检测可以提高氯吡格雷在经皮冠状动脉介入手术的冠心病患者的疗效[7]。
临床上可用于对CYP2C19*2（rs4244285）和CYP2C19*3（rs4986893）多态性位点进行检测的方法包括Sanger测序法、基因芯片法和实时荧光定量PCR法（Taqman-MBG探针法）、限制性内切酶片段多态性分析（RFLP）、普通PCR联合电泳分析等多种检测方法，但是这些方法存在灵敏度不够、耗时、交叉污染和成本昂贵等问题。
焦磷酸测序技术是基于实时反应、边合成边测序的新型核酸序列分析技术，该技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行氯吡格雷个体化治疗剂量相关基因多态性检测试剂盒的开发和应用。
参考文献：
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3、De Caterina R,Husted S,Wallentin L,Andreotti F,Arnesen H,Bachmann F,Baigent C,Huber K,Jespersen J,Kristensen SD,Lip GY,Morais J,Rasmussen LH,Siegbahn A,Verheugt FW,Weitz JI;European Society of Cardiology Working Group on Thrombosis Task Force onAnticoagulants in Heart Disease.General mechanisms of coagulation and targets of anticoagulants(Section I).Position Paper of the ESC Working Group on Thrombosis--Task Force onAnticoagulants in Heart Disease.Thromb Haemost.2013;109(4):569-79.
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发明内容
本发明的目的在于提供一种焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法。
所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒包括：
（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB等。
（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：
PCR引物1（Seq NO1）：
CYP2C19*2（rs4244285）上游引物5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
CYP2C19*2（rs4244285）下游引物5’-TTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCAC-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C19*3（rs4986893）上游引物5’-ACCCTGTGATCCCACTTTCAT-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C19*3（rs4986893）下游引物5’-ATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-3’；
其中PCR引物2和PCR引物3的5’端均进行生物素标记。
（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR MasterMix”，来自德国QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit试剂盒。具体成分主要包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution。
（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂，主要包括购自美国通用健康公司GE Healthcare的高性能链霉亲和素琼脂糖和购自德国QIAGEN公司的PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液。
（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：
测序引物1（Seq NO5）：
CYP2C19*2（rs4244285）测序引物5’-CCACTATCATTGATTATTTC-3’；
测序引物2（Seq NO6）：
CYP2C19*3（rs4986893）测序引物5’-AACTTGGCCTTACCTG-3’。
（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，购自德国QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物（焦磷酸测序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶）、底物复合物（腺苷-5’-磷酸硫酸酐）和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP（其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰）。
（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测方法，采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒，包括如下步骤：
（1）人类全血基因组DNA提取：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质。
（2）多重PCR扩增反应：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示。
表1 多重PCR扩增反应体系
表2 多重PCR扩增反应条件
（3）单链DNA样本分离和纯化：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70%乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本。
（4）焦磷酸测序与结果分析：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1和测序引物2中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMark Q24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和四种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行AQ模式进行结果分析。
本发明所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒整合从DNA提取到焦磷酸测序四个步骤的所有试剂成份，利于商品化生产和临床应用推广。PCR引物1～4和测序引物1～2为本发所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的关键成份，能够保证多重PCR反应时无交叉干扰，同时生成2种扩增产物，分别为CYP2C19*2基因型扩增产物179bp，CYP2C19*3基因型扩增产物250bp；测序能对CYP2C19*2（rs1799853）野生型序列（Seq NO7）CCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAA和突变型序列（Seq NO8）CCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAA和CYP2C19*3（rs1057910）野生型序列（Seq NO9）ACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATC和突变型序列（Seq NO10）ACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGAATC进行分析。本发明的实际用途就是应用到临床上指导合理选择氯吡格雷用于心脑血管疾病患者的长期抗凝，并且筛查和识别可能发生氯吡格雷抵抗需要增加剂量或联合治疗的患者。与现有方法相比较，多重PCR扩增核酸可达到降低实验成本的目的；焦磷酸测序技术应用于短序列已知突变位点的检测具有快速、准确、可高通量等优点。
本发明主要通过检测影响氯吡格雷代谢导致个体疗效差异的最主要因素，即CYP2C19的重要基因多态性位点，具体为CYP2C19*2和CYP2C19*3，达到指导心脑血管疾病需要长期抗凝者根据个体基因类型合理选择氯吡格雷及其剂量进行治疗。
附图说明
图1为本发明所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒实施例的结构组成示意图。
图2为本发明CYP2C19*2基因型扩增产物熔解曲线图。
图3为本发明CYP2C19*3基因型扩增产物熔解曲线图。
图4为本发明CYP2C19*2（rs4244285）野生型焦磷酸测序结果图。
图5为本发明CYP2C19*2（rs4244285）突变杂合子焦磷酸测序结果图。
图6为本发明CYP2C19*3（rs4986893）野生型焦磷酸测序结果图。
图7为本发明CYP2C19*3（rs4986893）突变杂合子焦磷酸测序结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
参见图1，本发明所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒实施例设有盒体1、全血基因组DNA提取试剂2、多重PCR扩增引物3、多重PCR扩增反应试剂4、单链DNA分离和纯化试剂5、焦磷酸测序引物6、焦磷酸测序试剂7，全血基因组DNA提取试剂2、多重PCR扩增引物3、多重PCR扩增反应试剂4、单链DNA分离和纯化试剂5、焦磷酸测序引物6、焦磷酸测序试剂7设在盒体1内。
实施例1
试剂盒关键的引物成分和序列如下：
PCR引物1（Seq NO1）：
CYP2C19*2（rs4244285）上游引物5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
CYP2C19*2（rs4244285）下游引物5’-TTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCAC-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C19*3（rs4986893）上游引物5’-ACCCTGTGATCCCACTTTCAT-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C19*3（rs4986893）下游引物5’-ATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-3’。
测序引物1（Seq NO5）：
CYP2C19*2（rs4244285）测序引物5’-CCACTATCATTGATTATTTC-3’；
测序引物2（Seq NO6）：
CYP2C19*3（rs4986893）测序引物5’-AACTTGGCCTTACCTG-3’。
取心脏支架术后拟选择氯吡格雷作为长期抗凝治疗的患者A外周静脉血2mL，应用本发明试剂盒和方法进行氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测。
1、人类全血基因组DNA提取：使用本发明焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的全血基因组DNA提取试剂。
1.1试剂配置：在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上标签。
1.2提取步骤：
1)取200μL全血样本加入1.5mL离心管中,加入20μL蛋白酶K，混匀。
2)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，若溶液未变清亮，应延长裂解时间直至溶液清亮为止。
3)加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀。
4)将上一步所得溶液和絮状沉淀转入吸附柱CB3中，吸附柱CB3放入收集管中，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)重复步骤6)。
8)12,000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
9)将吸附柱CB3转入1.5mL离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加100μL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12,000r/min离心2min。
10）将离心洗脱后的溶液再次加入吸附柱CB3，室温放置5min，12,000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、多重PCR扩增反应
2.1试剂准备：从-20℃冰箱中取出本发明焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的多重PCR扩增试剂及多重PCR引物，待其自然解冻后即可使用。
2.2扩增系统构建：
1)每份样本需要加入的试剂如下，将配置好的总反应体系分装到各PCR反应管中，再分别加入DNA模版，具体见表3。
表3 多重PCR扩增体系
2)将加好的PCR扩增体系放入博日GenePro TC-E-48D基因扩增仪，旋紧盖子，使用表4程序进行扩增：
表4 多重PCR扩增反应条件
多重PCR反应体系得到CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型扩增产物，扩增产物熔解曲线分析结果如图2和3，两个目的扩增片段的熔解曲线分析峰单一，表示多重PCR反应体系和条件达到实验预期，多重PCR扩增反应后得到两个较纯的目的扩增产物。
3、单链DNA样本分离和纯化：使用本发明焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂。
3.1PyroMark Q24真空工作站测试试验：在使用PyroMark Q24真空工作站之前，进行如下测试试验，以检查过滤探针是否正常工作：
1)添加100μL高纯度水到八联管中。
2)用70mL高纯度水注满试剂槽。
3)启动真空泵。
4)打开真空开关，在真空制备装置中施加真空。
5)将过滤探针降至试剂槽中。保持位置不变约20s。确保水被转移至废物容器中，即已施加了真空。如不能转移，检查管路连接。
6)将过滤探针降至八联管中，检查所有管是否均一地被抽水，且于10s内排空。
7)如果10s后八联管未排空，从第一步开始重复。若功能验证失败两次，需更换过滤探针。
3.2微珠固定PCR产物：将生物素标记的PCR产物固定到高性能链霉亲和素琼脂糖上。
1)轻摇高性能链霉亲和素琼脂糖，直至获得均质溶液。
2)在一个试管中混合高性能链霉亲和素琼脂糖（2μL/样品）与结合缓冲液（40μL/样品）。然后添加高纯度水23μL。
3)将制备好的溶液添加至八联管中，每个样品65μL。
4)根据孔板设置，添加15μL生物素标记的PCR产物至相应的八联管中。
5)密封八联管，确保无泄漏。
6)使用振荡器（1400r/min）振荡10min，让高性能链霉亲和素琼脂糖与生物素标记的PCR产物结合完全。
3.3分离DNA单链并将样本释放到PyroMark Q24孔板中
1)确保PyroMark Q24真空工作站正确和牢固地装配。电源接头应当至于容易触及的地方，以备能迅速将真空泵从电源断开。
2)在试剂槽中添加如下物质：
EtOH槽加入50mL70%乙醇溶液；
DS槽加入40mL PyroMark变性溶液；
WB槽加入50mL1xPyroMark洗脱缓冲液；
H2O槽1加入50mL高纯度水；
H2O槽2加入70mL高纯度水。
3)打开真空泵。
4)打开真空开关，在真空装置中施加真空。
5)降下探针至高纯度水（试剂槽5），清洗过滤探针。用70mL高纯度水冲洗探针。确保水被转移至废液容器。
6)关闭真空装置上的真空开关，并将其置于静止位置。
7)用70mL高纯度水重新填充试剂槽5。
8)使用PyroMark退火缓冲液分别稀释测序引物1和测序引物2至0.3μmol/L。添加25μL稀释好的测序引物至待使用的PyroMark Q24孔板的每个反应孔中。
9)固定后，立即将八联管与PyroMark Q24孔板放置到工作台上。确保孔板位置与装载样本时的位置一致。
10)打开真空开关，在真空装置中施加真空。
11)小心降下过滤探针至八联管中，以捕获含有固定模板的微珠。保持探针位置15s。小心取出真空装置。
12)确保所有八联管中的液体被吸出且所有微珠已被捕获到过滤探针顶端。
13)将真空装置移至含有70%乙醇的EtOH槽中冲洗过滤探针5s。
14)将真空装置移至含有PyroMark变性溶液的DS槽中冲洗过滤探针5s。
15)将真空装置移至含有1xPyroMark洗脱缓冲液的WB槽中冲洗过滤探针10s。
16)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。
17)握持真空装置到PyroMark Q24孔板上时，应关闭装置上的真空开关。
18)通过左右轻摇真空装置，释放微珠至含待测引物的孔板中。
19)在真空开关关闭时，将真空装置转移至含高纯度水的H2O槽1中并振荡10s。
20)放下探针至含高纯度水的H2O槽2中并施加真空，清洗探针。用70mL高纯度水冲洗过滤探针。
21)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。
22)关闭真空装置上的真空开关，并将其置于静止位。
23)如果一次制备超过一块孔板，重新填充试剂槽并从第8步开始重复。
24)关闭真空泵。
25)在工作结束时，应当丢弃液体废弃物和任何剩余溶液。同时检查PyroMark Q24真空工作站有无灰尘和泄漏。
3.4测序引物退火
1)使用PyroMark Q24孔板底座与一个加热模块来加热含有样本的PyroMark Q24孔板至80℃持续2min。
2)从孔板座上取下孔板，使样本在室温（15～25℃）下冷却至少5min。此时孔板方可在PyroMark Q24仪器中进行处理。
4、焦磷酸测序与结果分析：使用本发明焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的焦磷酸测序试剂和焦磷酸测序引物。
4.1试剂的准备
1)打开试剂盒并取出酶复合物和底物复合物冻干粉的小瓶，用高纯度水按试剂瓶的标示体积溶解酶和底物。
2)根据PyroMark Q24软件计算所得的试剂体积向PyroMark Q24试剂仓中相应位置分别加入酶复合物、底物复合物和α-硫代脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸。
4.2在PyroMark Q24仪器上运行测序程序
4.2.1启动仪器
1)在打开仪器开关之前，确保电源插头连接到适当接地的并有正确电压和频率的电源插座上，并且电源插头容易触及，已被迅速将仪器从电源断开之需。
2)打开仪器开关。电源开关位于仪器背面。
4.2.2装载试剂仓和孔板：
1)当仪器待机时，打开仪器盖。
2)打开试剂仓活门并插入填充好试剂的试剂仓，标签向外。先完全推入试剂仓后再将其下压。
3)确保试剂仓适当插入，试剂仓前面的线保持可见，然后关闭活门。
4)打开孔板座架，并将孔板放置在仪器内的加热模块上。
5)关闭孔板座架和仪器盖。
4.2.3选择运行文件并启动运行
1)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。
2)使用▲和▼屏幕按钮，在主菜单中选择“Run（运行）”并按“OK”。
3)使用▲和▼屏幕按钮选择运行文件。要浏览文件夹的内容，选择文件夹并按“Select（选择）”。要返回前一视图，按“Back（后退）”。
4)选择运行文件时，按“Select（选择）”启动运行。
4.2.4监测运行
当分配器压力、混合器速度、加热模块温度、处理仓盖子以及冷却液达到预设水平，仪器将开始分配试剂。
4.2.5运行后
1)当仪器确认运行文件已经保存至U盘，按“Close（关闭）”。
2)取出U盘。
3)打开仪器盖。
4)打开试剂仓的活门，提起并拉出试剂仓。
5)关闭活门。
6)打开孔板座架，从加热快上取下孔板。
7)关闭孔板座架和仪器盖。
8)废弃孔板。
9)清洁试剂仓。
A清除试剂仓中剩余的任何溶液
B采用高纯度水冲洗试剂仓的隔室4次。
C使用高纯度水喷洒针头外部。
D试剂仓用高纯度水彻底填充隔室淋洗针头。握持试剂仓在试剂槽或烧杯上方，同是用一根手指紧紧地按压在每一个隔室顶部（佩戴无粉手套）。
E检查针头是否洁净。水束将直接从每个针头的顶端射来。若针头阻塞，如果针头阻塞，则用高纯度水充填隔室，然后将试剂仓浸没在有足够高纯度水的烧杯中，覆盖针头。将试剂仓放置于烧杯中1h，清洗，并重复D。
F检查水束是否直接从针头方向射出。若其成角度流出，用水重新充填隔室并重复。若其仍然成角度流出，则废弃试剂仓。
G当所有针头都经过淋洗和测试后，倒掉水，将试剂仓侧过来放在无粉纸上晾干。
H试剂仓晾干后，将其保存在无尘的地方。
4.2.6分析运行
1)将运行文件从U盘移至运行PyroMark Q24软件的计算机中。
2)双击打开快捷浏览器中的运行文件。若包括了几种检测类型，选择打开的对话框中的分析模式。
3)在“Overview（概述）”标签中，采用当前分析模式的有效分析设置来分析所有反应孔或一组反应孔。
4)要在模式间切换，则在工具栏中选择“AQ”、“CpG”或“SQA”。
患者A检测结果如图4，CYP2C19*2为G/G基因型，和图6，CYP2C19*3为G/G基因型，即该患者CYP2C19*2和CYP2C19*3均为野生型，该患者按正常剂量服用氯吡格雷可达到较好治疗效果。
实施例2
取心脏支架术后拟选择氯吡格雷作为长期抗凝治疗的患者B外周静脉血2mL，应用本发明试剂盒和检测方法进行氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测。所有操作均同实施例1，该患者结果如图5（CYP2C19*2为G/A基因型）和图7（CYP2C19*3为G/A基因型），即该患者CYP2C19*2和CYP2C19*3均为突变杂合型，该患者按如果选择氯吡格雷长期抗凝治疗需要加大剂量或同时加服另一种抗凝药以达到较好治疗效果。
实施例3
表5 7例心脏支架术后长期服用氯吡格雷患者检测结果
7例心脏支架术后拟选择氯吡格雷作为长期抗凝治疗的患者，应用本发明试剂盒和检测方法进行氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测。所有操作均同实施例1，检测结果如表5。
Claims (2)
1.焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；
（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：
PCR引物1（Seq NO1）：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
CYP2C19*2（rs4244285）下游引物5’-TTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCAC-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C19*3（rs4986893）上游引物5’-ACCCTGTGATCCCACTTTCAT-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C19*3（rs4986893）下游引物5’-ATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-3’；
其中PCR引物2和PCR引物3的5’端均进行生物素标记；
（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR MasterMix”，具体成分包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution；
（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂，包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液；
（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：
测序引物1（Seq NO5）：
CYP2C19*2（rs4244285）测序引物5’-CCACTATCATTGATTATTTC-3’；
测序引物2（Seq NO6）：
CYP2C19*3（rs4986893）测序引物5’-AACTTGGCCTTACCTG-3’；
（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐；
（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
2.焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测方法，其特征在于采用如权利要求1所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒，包括如下步骤：
（1）人类全血基因组DNA提取：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质；
（2）多重PCR扩增反应：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示；
表1 多重PCR扩增反应体系
表2 多重PCR扩增反应条件
（3）单链DNA样本分离和纯化：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70%乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本；
（4）焦磷酸测序与结果分析：采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1和测序引物2中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMark Q24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和四种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行AQ模式进行结果分析。
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