CN106244708A - 定性检测cyp2d6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒 - Google Patents

定性检测cyp2d6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物，正向扩增引物及反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记；本发明还涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序试剂盒。所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液1、PCR反应液2、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

Description

定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
背景技术
细胞色素P450 2D6(Cytochrome P450 2D6，CYP2D6)是CYP酶系中一种非常重要的药物代谢酶。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，在人类又可分成5个亚家族，编号为A～E。CYP2D位于第22号染色体上，由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同组成，其中CYP2D7P和CYP2D8P是假基因，不表达。CYP2D6作为一个完整的功能基因，包含9个外显子和8个内含子，总长7kb左右。CYP2D6是最早发现的具有基因多态性的P450酶，目前，已发现CYP2D6有70多种突变基因，其中，超过15个译成密码后是无活性或非酶，另外一些分别译成活性减少、“正常”或活性增强的酶。CYP2D6基因的主要突变方式是单个碱基的缺失或替换引起读码框架移位，或是大片段基因的丢失。CYP2D6酶主要分布于人体肝脏中，占肝脏酶总量的2％～9％，但却参与20％～30％临床常用药物的代谢，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、抗肿瘤药物等。
CYP2D6的基因突变类型较多，其中CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人中都有发现，CYP2D6*2和*17主要存在于非洲人中，而在亚洲人群中的突变类型主要是CYP2D6*10。与野生型CYP2D6相比，*10主要是外显子1C188→T转换，造成Pro(脯氨酸)34→Ser(丝氨酸)取代，导致编码的酶不稳定，降低CYP2D6的酶活性。按基因型可将CYP2D6*10分为：在外显子1第188位点上携带两个有活性等位基因的野生型纯合子C/C(CYP2D6*1/*1)，携带两个导致酶活性降低的等位基因的突变纯合子T/T(CYP2D6*10/*10)和只含一个正常等位基因的杂合子C/T(CYP2D6*1/*10)。另一个亚洲人常见单核苷酸多态是CYP2D6外显子9G4268→C颠换，造成了Ser(丝氨酸)486→Thr(苏氨酸)取代，导致表达的酶活性降低。
他莫昔芬是乳腺癌内分泌治疗应用最为广泛的药物。4-羟-N-去甲基他莫昔芬是他莫昔芬代谢的主要活性物质，能抑制激素依赖的乳腺癌细胞的扩散，其生成主要依赖于CYP2D6的酶活性。多项研究表明其中CYP2D6*10/*10基因型导致酶活性下降或者抑制酶活性，从而影响他莫昔芬的代谢，进而导致他莫昔芬的治疗疗效的差异。研究显示，CYP2D6*10/*10基因型携带患者对他莫西芬的治疗不敏感。
β受体阻断药是临床常用的一线抗高血压药物，其代表药物有美托洛尔(Metoprolol)、普萘洛尔(Propranolol)、卡维地洛(Carvedilol)。普罗帕酮(Propafenone)为广谱高效膜抑制性抗心律失常药，具有膜稳定作用及竞争性β受体阻滞作用。这些药物大约70-80％在人体内经CYP2D6代谢。研究发现，不同个体中药物的血药浓度最多可相差20倍，因此CYP2D6的基因多态性从这些药的药代动力学和药效动力学上影响其毒副反应的发生。研究表明，在相同剂量条件下，PM(中国人群主要为CYP2D6*10/*10)患者的美托洛尔口服清除率比EM(CYP2D6*1/*1)患者低40％，代谢减慢，CYP2D6所介导代谢的美托洛尔的血药浓度比EM患者高2～3倍，更易出现心率减慢、传导阻滞、血压降低、心力衰竭加重、外周血管痉挛导致的四肢冰冷或脉搏不能触及、雷诺现象。如不根据基因型调整剂量，突变纯合子患者可能发生严重的毒副反应。也有研究表明，CYP2D6基因型在普罗帕酮血浆浓度和效应中起着重要作用。450mg/d剂量组中具有CYP2D6*10突变纯合子的病人，普罗帕酮血浆峰浓度约为野生基因型的2倍，而且室性早搏(VPC)抑制率也增加一倍。
美国食品药品监督管理局(FDA)建议：在使用心血管类药物如美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛和普罗帕酮之前需要对患者的CYP2D6基因进行检测。
精神分裂症(Schizophrenia)是常见的精神疾病之一，发病率为1％左右。目前广泛应用的抗精神病药物包括传统抗精神分裂症药物如氟哌啶醇、奋乃静等以及非典型抗精神分裂症药物如氯氮平、利培酮、阿立哌唑等。临床治疗中，发现同样剂量下用药有相当一部分病人在服药后发生椎体外系副反应、粒细胞缺乏症或体重增加等副作用。研究表明，氟哌啶醇、阿立哌唑、利培酮、奋乃静、硫利达嗪、氯氮平、伊潘立酮、匹莫齐特等均由CYP2D6代谢，其副反应均与此酶活性有关，而CYP2D6酶活性受其编码基因的基因型影响。Kirchheiner等进行了荟萃分析，揭示了大约50％的常用抗精神病药物的剂量取决于CYP2D6基因型。在一项研究中对100名住院患者连续进行CYP2D6表型的测定并给药，在接受CYP2D6底物药物治疗的患者中具有PM表型的患者人群中不良反应的发生率最高。而且在一项有关美国精神病治疗的研究中显示，CYP2D6多态性对患者的治疗费用有很大的影响。因此，对于接受单一或多重由CYP2D6代谢的药物进行治疗的患者来说，基因型测定可以帮助临床医生在已知待选药物的代谢的基础上进行适当的选择，从而避免不良的药物—药物相互作用。通过恰当的剂量调节来防止不良反应的发生，更好地进行个体化药物治疗。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP2D6基因分型的产品。
目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有“金标准”之称的PCR-直接测序法对CYP2D6基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10％的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
发明内容
为了解决上述方法检测CYP2D6基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本发明提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
本发明提供了一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物对包括：
(1)对于CYP2D6C188T等位基因，
扩增引物为：
CYP2D6C188T正向扩增引物：
5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’(SEQ ID NO.1)；
CYP2D6C188T反向扩增引物：
5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’(SEQ ID NO.2)；
CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’(SEQ ID NO.3)；
其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；
(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，
扩增引物为：
CYP2D6G4268C正向扩增引物：
5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’(SEQ ID NO.4)；
CYP2D6G4268C反向扩增引物：
5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’(SEQ ID NO.5)；
CYP2D6G4268C测序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’(SEQ ID NO.6)；
其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。
本发明还提供了一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序试剂盒，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述试剂盒包括：
(1)对于CYP2D6C188T等位基因，
CYP2D6C188T正向扩增引物：
5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；
PCR反应液1，所述PCR反应液1含有CYP2D6C188T反向扩增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；
CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；
其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；
(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，
CYP2D6G4268C正向扩增引物：
5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；
PCR反应液2，所述PCR反应液2含有CYP2D6G4268C反向扩增引物：5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’；
CYP2D6G4268C测序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’；
其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：
CYP2D6C188T阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的CYP2D6C188T野生纯合子质粒；
SEQ ID NO.8：
5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGT-3’；
CYP2D6C188T阳性对照品2，其为所述CYP2D6C188T野生纯合子质粒与插有SEQ IDNO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
CYP2D6C188T阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突变纯合子质粒；
SEQ ID NO.9：
5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGG AGGT-3’；
CYP2D6G4268C阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C野生纯合子质粒；
SEQ ID NO.10：
5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCC TGCTCCCTAGCCAG-3’；
CYP2D6G4268C阳性对照品2，其为所述CYP2D6G4268C野生纯合子质粒与插有SEQID NO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
CYP2D6G4268C阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突变纯合子质粒；
SEQ ID NO.11：
5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGACCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCC TGCTCCCTAG CCAG-3’；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述CYP2D6C188T阳性对照品2中所述CYP2D6C188T突变纯合子质粒和所述CYP2D6C188T野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述CYP2D6G4268C阳性对照品2中所述CYP2D6G4268C突变纯合子质粒和所述CYP2D6G4268C野生纯合子质粒的数量比为1:1。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品(control oligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQ ID NO.7)；所述空白对照品为超纯水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。
所述的PCR反应液1和PCR反应液2中其他组分为常规的10xPCR Buffer、dNTPS和H2O，各组分按常规体积比配置(10x PCRBuffer、dNTPs、H2O和反应液中引物的体积比为5:3:37.5:1)。
所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测CYP2D6基因分型的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明提供的定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP2D6基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP2D6基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析及临床检验；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测CYP2D6基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。
附图说明
图1为临床样品CYP2D6C188T野生型的焦磷酸测序图；
图2为临床样品CYP2D6C188T突变杂合型的焦磷酸测序图；
图3为临床样品CYP2D6C188T突变纯合型的焦磷酸测序图；
图4为临床CYP2D6C188T空白对照品的焦磷酸测序图；
图5至图7为CYP2D6C188T多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图5和图6的测序结果不准确，图7的测序结果真实可靠。
图8为临床样品CYP2D6G4268C野生型的焦磷酸测序图；
图9为临床样品CYP2D6G4268C突变杂合型的焦磷酸测序图；
图10为临床样品CYP2D6G4268C突变纯合型的焦磷酸测序图；
图11为临床CYP2D6G4268C空白对照品的焦磷酸测序图；
图12至图14为CYP2D6G4268C多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图12和图13的测序结果不准确，图14的测序结果真实可靠。
图15为临床质控品control oligo的焦磷酸测序图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人CYP2D6基因的多态性位点CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C等位基因，选择特异的突变位点，使用PyroMark Assay Design2.0软件，设计引物；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的5’端进行生物素标记。
表1.突变位点与类型
Mutation Base change
CYP2D6C188T ACGCTAC[C/T]CACCAG
CYP2D6G4268C CTGGTGA[C/G]CCCATCC
扩增序列如表2：
表2.特异性扩增引物及引物序列
二、对照品选择
使用人工合成的一段寡聚核苷酸链TAYGGTTTGCA control oligo为质控品；DNase/RNase-Free水为空白对照品。
三、PCR反应液组成
表3.PCR反应液1组成
原料名称 体积(μL)
10x PCR Buffer 5
dNTP 3
CYP2D6 C188T反向扩增引物 1
H2O 37.5
总体积 46.5μL
表4.PCR反应液2组成
原料名称 体积(μL)
10x PCR Buffer 5
dNTP 3
CYP2D6 G4268C反向扩增引物 1
H2O 37.5
总体积 46.5μL
由于针对两个检测位点进行扩增，所以有2种不同的PCR反应液，分别对CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C位点进行检测。
实施例2：试剂盒的使用
一、样品检测
溶解引物干粉(引物溶解后有效期为1个月)。按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。
CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C体系各主要成分分别如下：
表5.CYP2D6C188T体系各主要成分
表6.CYP2D6G4268C体系各主要成分
该体系反应程序如下：
表7.PCR反应程序
扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。
二、焦磷酸测序
按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的MIX中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。质控品control oligo自带测序引物，最终浓度为0.2μM。
三、结果判断
质控品碱基检出率为100％；空白对照品检出率为0。
四、质控标准
各类对照质控品判断结果如下表：
表8.质控品标准检测结果
对照品 标准检验结果
1 质控品 峰高峰型正常、序列准确
2 空白对照品 碱基检出率为0
五、结果报告：
结果如图1、图2、图3、图8、图9及图10所示，样品结果的判断标准如下：
表9.报告样品检测结果
图1及图8分别显示的是临床样品检测结果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的野生型，图2及图9分别显示的是临床样品检测结果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突变杂合型，图3及图10分别显示的是临床样品检测结果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突变纯合型，图4、图11及图15分别显示的是临床检测结果中CYP2D6C188T空白对照品、CYP2D6G4268C空白对照品及质控品control oligo的焦磷酸测序图。图5至图7为CYP2D6C188T多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图5和图6的测序结果不准确，图7的测序结果真实可靠。图12至图14为CYP2D6G4268C多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图12和图13的测序结果不准确，图14的测序结果真实可靠。
本发明提供的定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位点时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位点时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析及临床检验；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位点时，可以更好的确保检测结果的准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长沙三济生物科技有限公司
<120> 定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒
<130> 2016
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgtgatag tggccatctt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgaagcagt atggtgtgtt ct 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcagggggc ctggt 15
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catggtgtct ttgctttcct 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcacagcac aaagctcat 19
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcatagggg gatgg 15
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tayggtttgc a 11
<210> 8
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgcccctggc cgtgatagtg gccatcttcc tgctcctggt ggacctgatg caccggcgcc 60
aacgctgggc tgcacgctac ccaccaggcc ccctgccact gcccgggctg ggcaacctgc 120
tgcatgtgga cttccagaac acaccatact gcttcgacca ggtgagggag gaggt 175
<210> 9
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcccctggc cgtgatagtg gccatcttcc tgctcctggt ggacctgatg caccggcgcc 60
aacgctgggc tgcacgctac tcaccaggcc ccctgccact gcccgggctg ggcaacctgc 120
tgcatgtgga cttccagaac acaccatact gcttcgacca ggtgagggag gaggt 175
<210> 10
<211> 275
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtcttgcag gggtatcacc caggagccag gctcactgac gcccctcccc tccccacagg 60
ccgccgtgca tgcctcgggg agcccctggc ccgcatggag ctcttcctct tcttcacctc 120
cctgctgcag cacttcagct tctcggtgcc cactggacag ccccggccca gccaccatgg 180
tgtctttgct ttcctggtga gcccatcccc ctatgagctt tgtgctgtgc cccgctagaa 240
tggggtacct agtccccagc ctgctcccta gccag 275
<210> 11
<211> 275
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agtcttgcag gggtatcacc caggagccag gctcactgac gcccctcccc tccccacagg 60
ccgccgtgca tgcctcgggg agcccctggc ccgcatggag ctcttcctct tcttcacctc 120
cctgctgcag cacttcagct tctcggtgcc cactggacag ccccggccca gccaccatgg 180
tgtctttgct ttcctggtga ccccatcccc ctatgagctt tgtgctgtgc cccgctagaa 240
tggggtacct agtccccagc ctgctcccta gccag 275

Claims (7)

1.一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物对包括：
(1)对于CYP2D6C188T等位基因，
扩增引物为：
CYP2D6C188T正向扩增引物：
5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；
CYP2D6C188T反向扩增引物：
5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；
CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；
其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；
(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，
扩增引物为：
CYP2D6G4268C正向扩增引物：
5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；
CYP2D6G4268C反向扩增引物：
5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’；
CYP2D6G4268C测序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’；
其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。
2.一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述试剂盒包括：
(1)对于CYP2D6C188T等位基因，
CYP2D6C188T正向扩增引物：
5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；
PCR反应液1，所述PCR反应液1含有CYP2D6C188T反向扩增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；
CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；
其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；
(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，
CYP2D6G4268C正向扩增引物：
5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；
PCR反应液2，所述PCR反应液2含有CYP2D6G4268C反向扩增引物：5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’；
CYP2D6G4268C测序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’；
其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
CYP2D6C188T阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的CYP2D6C188T野生纯合子质粒；
CYP2D6C188T阳性对照品2，其为所述CYP2D6C188T野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
CYP2D6C188T阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突变纯合子质粒；
CYP2D6G4268C阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C野生纯合子质粒；
CYP2D6G4268C阳性对照品2，其为所述CYP2D6G4268C野生纯合子质粒与插有SEQ IDNO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
CYP2D6G4268C阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突变纯合子质粒；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6C188T阳性对照品2中所述CYP2D6C188T突变纯合子质粒和所述CYP2D6C188T野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述CYP2D6G4268C阳性对照品2中所述CYP2D6G4268C突变纯合子质粒和所述CYP2D6G4268C野生纯合子质粒的数量比为1:1。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：质控品和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为超纯水。
7.权利要求1所述的引物对在制备用于检测CYP2D6基因分型的试剂中的应用。
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