CN104498592A - 人cyp3a5基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人CYP3A5基因检测方法，包括提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光量；所述核酸扩增体系至少分别包含CYP3A5基因CYP3A5*1和CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物。本发明还公开了上述人CYP3A5基因检测试剂盒，包括分别装有反应液、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，分隔并集中包装这些离心管的试剂盒。本发明试剂盒可广泛应用于人CYP3A5基因检测，指导临床上他克莫司药物的使用，减少不良反应的发生和避免药物资源的浪费，降低排异反应。

Description

人CYP3A5基因检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种临床上用于他克莫司药物用药指导的人CYP3A5基因检测方法及其试剂盒，特别是涉及采用实时定量荧光聚合酶链反应技术对人CYP3A5基因进行检测。

背景技术

肾移植已成为终末期肾衰竭有效临床治疗手段。肾移植手术技术已日臻完善，移植器官及移植受者的长期存活及存活质量已成为广泛关注的问题。其中重要的问题之一就是抗排斥反应制定合理的免疫抑制方案。肾移植术后免疫抑制治疗方案基本上是以钙调蛋白抑制剂为主的三联药物治疗，国内外大量临床实践证明以他克莫司为基础的联合用药可取得较为理想的抗排异效果，因此，他克莫司有非常明显的优越性，临床应用日益广泛，不仅在器官移植领域，在其它免疫系统疾病领域的应用也日益增加诸如：类风湿性关节炎，狼疮性肾炎，异位性皮炎，重症肌无力等…。近年来虽然有一些新型免疫抑制剂问世，但他克莫司仍然为主要的基础免疫抑制剂。在临床治疗中，病人对相同的药物反应不完全相同，甚至大相径庭，以前认为是个体差异所致。研究表明，这些差异主要是由于药物相关基因变异，即单核苷酸多态性(SNP)引起的。事实上，不同个体的表型差异主要在于SNP，由于SNP改变了个体对药物的代谢，因而决定某种药物是否对个体有效，是否会引起不良反应，这对于临床医生按个体化用药有重要的意义。

目前临床实践中仍采用结合临床并通过监测全血药物的谷浓度来调整本品口服的最佳用药剂量。采用这种给药方式，临床医生需要多次调整，才能找到每例患者的合适剂量，而以药物基因组学为基础的靶向治疗则不同，医生可以通过对患者的遗传学状况进行分析后，一开始就可以制订出最佳药物剂量。

他克莫司主要在肝脏代谢，细胞色素P450(CYP)是他克莫司的主要代谢酶。CYP3A亚家族是药物代谢反应中最主要的限速酶。包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。已有研究证明CYP3A4和CYP3A5是他克莫司生物转化的主要代谢酶。已经证实的CYP3A4*1B多态性影响CYP3A4酶的表达，CYP3A4*1B多态性发生在46-66％的非洲黑人，4％的高加索人，但亚洲人为0％。在CYP3A5上已经发现有几个单核苷酸多态性(SNPs)，其中一部分可以影响CYP3A5酶的表达和功能。

CYP3A5基因对他克莫司代谢的影响是通过基因表达的产物CYP3A5酶的活性来调节的，CYP3A5*3纯合子患者的总CYP3A5mRNA水平比野生型CYP3A5*1等位基因携带者显著少，CYP3A5酶表达量明显下降。研究表明，他克莫司的代谢是受CYP3A5基因调控，CYP3A5是他克莫司的代谢酶。含有CYP3A5*3等位基因的患者按常规剂量给药，则其血药浓度较CYPSA5野生型患者的血药浓度高。因此对含CYP3A5*3等位基因的患者在应用他克莫司时应较常规减少用药剂量并注意副作用的发生。而对CYP3A5*1野生型的肾移植患者应适当增加服药次数以降低排异反应。目前，一般采用直接测序或定性PCR技术检测CYP3A5基因多态性，其检测的灵敏度和特异性均不高，且耗时耗力，所以不利于预测药物疗效及指导药物的选择性用药。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人CYP3A5基因检测试剂盒，以及采用该试剂盒特异性检测CYP3A5*1、CYP3A5*3基因多态性的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的一个目的是提供一种人CYP3A5基因检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

(2)通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

(3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

(4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量；

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物；

所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。

作为一种优选方案，所述：

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATT TACCTG CCT TC-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGG GAAGAG ATA T-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATT TACCTG CCT TC-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGG GAAGAG ATA C-3′；

所述两条寡核苷酸探针分别为：

5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。

可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的FAM或HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联的作为荧光淬灭基团的TAMRA或BHQ。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然后使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针的纯度。

所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。

所述待测样品是指需要检测其中人CYP3A5基因多态性的临床血液样本。

所述靶多核苷酸来自人血液全基因组DNA。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(4)中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。

使用磁珠法或DNA柱回收法(可购买市售DNA提取试剂盒)从得自受试者的血液样本中提取基因组DNA，然后将提取合格的DNA产物用于后续的PCR扩增。

在含有CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物，荧光探针，DNA模板(PCR扩增靶序列)，dNTPs(10mM)，耐热DNA聚合酶，Mg²⁺，PCR缓冲液和水的反应体系中，使用ABI7500、Roche Light Cycler 480、Mx3000P等其它结构类似的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是：96℃预变性3分钟，95℃30秒→65℃45秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。

1.无效结果判定：与存在于体系中的寡核苷酸荧光探针相关的扩增曲线不呈现“S”型或Ct值空白又或Ct值＞30的样本，报告为无效；

2.阳性结果判定：满足与体系中的寡核苷酸探针相关的扩增曲线呈现“S”型且同体系中探针的CT值＜30的样本，报告为阳性；

3.阴性结果判定：属于无效结果和阳性结果判定以外的情况则报告为阴性；

可利用已知为CYP3A5基因CYP3A5*1多态性和CYP3A5*3多态性的样本与待检样本同批次进行PCR扩增反应，在获得相应的CT值后，利用双△Ct法，将标准品扩增体系中与探针相关的扩增曲线的CT值，与待检样本扩增体系中探针的扩增曲线的CT值进行比较分析，从而判断待检样本。

本发明的另一个目的是提供一种用于上述人CYP3A5基因检测的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有反应液、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：

反应液由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物，寡核苷酸探针；

EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；

标准液1：野生型YP3A5*1基因组DNA；

标准液2：突变型YP3A5*3基因组DNA。

与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时荧光定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应进行的过程中随时监测扩增产物的产生，从而极大的提高了定量检测的准确性和精密度。实时荧光定量PCR(Taqman探针法)在PCR的扩增中，同时加入了引物和在5’末端和3’末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，探针序列保持完整，荧光发生基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故没有荧光信号的产生，而当探针与靶序列能够互补结合时，在PCR扩增进行的过程中，DNA聚合酶在引导DNA序列复制的同时其5’-3’端外切酶活性将切断荧光探针，导致荧光发生基团与荧光淬灭基团的分离，从而荧光检测系统可以接收并记录荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光信号的产生，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步，故可以实时地监测整个PCR反应过程，并可借助标准曲线或表达量恒定的内对照产物对未知的靶多核苷酸进行绝对或相对的定量分析。

本发明将人CYP3A5基因的DNA序列与其它与之有着高度同源性的等位基因型的DNA序列进行了同源性比较和分析，特别设计适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的人CYP3A5基因实时定量检测，极大的简化了人CYP3A5基因检测的操作步骤，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，降低了模板使用量。实验证明，本发明对人CYP3A5基因检测的准确度在99.5％以上。

值得特别说明的是，我们使用了已知为人CYP3A5基因野生型YP3A5*1和突变型YP3A5*3的血样标准品，作为检测体系中的阳性对照。标准品的存在，使完成人CYP3A5基因型检测的同时，进一步提高了待检样本人CYP3A5野生型和突变型判断的准确度。

本发明将Taqman PCR技术应用于人CYP3A5基因的检测，使Taqman PCR的技术优点(灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量)在人CYP3A5基因检测中得到完美继承的同时对人CYP3A5基因的野生型和突变型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人CYP3A5基因的检测，指导临床上他克莫司药物的使用，减少不良反应的发生和避免药物资源的浪费，降低排异反应。

具体实施方式

下面给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。

实施例1：

人CYP3A5基因检测试剂盒及其使用。

(1)制备包括下列组成成份的试剂盒：反应液1(650μl/管)1管、EZ Taq酶混合液(150μl/管)1管、标准液1(30μl/管)、标准液2(30μl/管)；

反应液由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物，寡核苷酸探针；

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATT TACCTG CCT TC-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGG GAAGAG ATA T-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATT TACCTG CCT TC-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGG GAAGAG ATA C-3′；

所述两条寡核苷酸探针分别为：

5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。

EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；

标准液1：野生型YP3A5*1基因组DNA；

标准液2：突变型YP3A5*3基因组DNA。

(2)样本采集、运送和保存：用一次性真空采血器，无菌操作，取待检个体血液样本，做好标示后将获取的血液样本置于低温冰箱(-70℃或-20℃)中冷冻保存。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。

(3)检验步骤和结果分析：

将待检测血样取300μl，用柱回收法提取血液样本中的DNA，用分光光度计或类似的仪器确认提取的DNA的质量(OD260/280在1.8-2.0之间)，将提取的每份待检样本DNA和标准品DNA分别置于PCR反应管，每孔2μl。然后，在加入同一DNA样本的孔中加入PCR反应液15μl，再在加入3μl的酶混合液。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪上，选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)收集特异扩增信号；选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC,Quencher:none)检测内标；参比荧光(PassiveReference)设置为none；设置Sample Volume为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。本试剂盒所使用的反应条件是：96℃预变性3分钟，95℃30秒→65℃45秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。

反应结束后保存检测数据文件，点选仪器的数据分析选项后可查看各个PCR反应体系的结果，如PCR扩增曲线，待检样本和标准样本的CT值等，具体PCR扩增反应条件、标准品和样品的检测结果见表1～表3。

表1PCR扩增反应条件

表2阳性标准品和阴性标准品中CYP3A5基因

目标序列和内对照序列扩增结果

“/”表示没有Ct值，体系中没有目标或内标基因的扩增。根据判定规则，阳性标准品和阴性标准品的检测结果符合预期，扩增结果有效。

表3阳性样本、阴性样本和无效样本中CYP3A5基因

目标序列和内对照序列扩增结果

根据判定规则，阳性标准品和阴性标准品的检测结果符合预期，扩增结果有效。

实施例2：使用本发明的试剂盒检测30例临床血液样本的结果与分析

采用单盲实验法，从来自重庆市血液中心的500例血液样本中选择30例用本发明的试剂盒进行试验，应用PCR-SBT方法对30例临床血液样本的CYP3A5基因进行复检，结果表明阳性与阴性符合率均为100％，本试剂盒检验结果准确。Positive Control与Negative Control结果符合预期表明本次试验结果有效。

Claims (5)

1.一种人CYP3A5基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

(2)通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

(3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

(4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量；

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物；所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATTTAC CTG CCT TC-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGGGAA GAG ATA T-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATTTAC CTG CCT TC-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGGGAA GAG ATA C-3′；

所述两条寡核苷酸探针分别为：

5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。

5.一种用于人CYP3A5基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)分别装有反应液、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：

反应液由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物，寡核苷酸探针；

EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；

标准液1：野生型YP3A5*1基因组DNA；

标准液2：突变型YP3A5*3基因组DNA；

所述CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATTTAC CTG CCT TC-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGGGAA GAG ATA T-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATTTAC CTG CCT TC-3′；

所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGGGAA GAG ATA C-3′；

所述寡核苷酸探针分别为：

5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。