CN108251510A - 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108251510A
CN108251510A CN201810207137.2A CN201810207137A CN108251510A CN 108251510 A CN108251510 A CN 108251510A CN 201810207137 A CN201810207137 A CN 201810207137A CN 108251510 A CN108251510 A CN 108251510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
folic acid
detection
gene
mutation
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810207137.2A
Other languages
English (en)
Inventor
陈勇
田茹
田媛
李西兰
余占江
陈永强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
(beijing) Technology Co Ltd
Original Assignee
(beijing) Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (beijing) Technology Co Ltd filed Critical (beijing) Technology Co Ltd
Priority to CN201810207137.2A priority Critical patent/CN108251510A/zh
Publication of CN108251510A publication Critical patent/CN108251510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及叶酸代谢能力基因分型检测技术，具体涉及一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用，所述试剂盒包括针对MTHFR基因677C＞T突变、1298A＞C突变，以及MTRR基因66A＞G突变的特异性引物和特异性突变检测探针；RT‑PCR反应buffer；RT‑PCR反应Taq酶；灭菌纯水；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品以及分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。本发明对叶酸代谢能力相关基因突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合直接以全血作为检测样本，直接进行相关基因突变检测，不需提取基因组DNA模板。可以精准的对叶酸代谢能力进行判断，提供个体化叶酸服用和增补剂量，具有重要价值。

Description

一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及叶酸代谢能力基因分型检测技术，具体涉及一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
叶酸是一种从菠菜中发现的水溶性维生素，又称之为维生素B9。随后，科学家发现各种动植物类食品中均含有叶酸，这类叶酸被称之为天然叶酸。通过饮用食物，尤其是绿叶蔬菜类，人体可以获得叶酸的补充。除此之外，还可以通过服用合成的叶酸片，增补叶酸，其生物利用度更高，约为天然叶酸的一倍。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用，同时也是胎儿生长发育不可缺少的营养素。
我国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，我国每年约有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。科学研究已经表明，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。
同时由中华医学会心血管分会高血压学组与精准心血管病学学组以及中国医师协会高血压专业委员会三大组织联合发布的《H型高血压诊断与治疗专家共识》指出，叶酸缺乏和(或)同型半胱氨酸(Hcy)/叶酸代谢途径中关键酶的缺陷或基因突变是导致血Hcy水平升高的主要原因，Hcy≥10μmol/L是高血压重要的危险分层因素。共识还指出，叶酸代谢过程中的关键酶即亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的677TT基因型在中国人群中频率高于其他国家人群，该基因型在血压增高的同时会大大增加脑卒中发生的危险。
尽管目前的循证医学证据支持补充叶酸这样一种疾病预防策略，但在临床实践中，针对补充叶酸的方法、剂量、持续的时间、患者的随访等方面还存在很多困惑。叶酸代谢能力受遗传因素影响，目前已经得到证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢相关的基因主要是MTHFR和MTRR(甲硫氨酸合成酶还原酶)，不同的基因分型对应的叶酸补充剂量不一致，这导致个体化的补充叶酸成为预防策略的重中之重。
因此，高效、准确的检测判断叶酸代谢能力基因分型就显得极为重要，同时也成为指导个体化增补叶酸的关键。目前检测叶酸代谢能力相关基因突变的方法主要有测序法、基因芯片法、荧光PCR法、高分辨率熔解曲线法以及PCR-RFLP等，其中以荧光PCR法最为常用且具实用性。荧光PCR法又分为PCR-荧光染料法和PCR-荧光探针法，在实际应用中，PCR-荧光探针法的特异性高于PCR-荧光染料法，因此，PCR-荧光探针法更适合用于检测叶酸代谢能力基因分型。
但是，现有的技术中，荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因分型，需要提取血液基因组DNA作为模板，进行相应的检测，这一操作大大的增加了检验操作人员的工作量，且增加了检测成本和时间。另外，现有的荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因分型，多是针对每个位点设置一个检测管，如检测一个样本MTHFR基因677C>T突变、MTHFR基因1298A>C突变以及MTRR基因66A>G突变共三个位点，则需分别设置三个检测管，进行相应检测，操作费时费力，不利于临床大规模推广使用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的检测叶酸代谢能力基因分型，为个体化增补叶酸的指导奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对MTHFR、MTRR基因突变的特异性引物和特异性突变检测探针；RT-PCR反应buffer；RT-PCR反应Taq酶；ddH2O；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品；分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。
本发明中，首次公开通过PCR-荧光探针法技术直接利用全血样本检测叶酸代谢能力基因分型的试剂盒，通过独特设计的特异性引物序列和特异性突变检测探针，在RT-PCR反应buffer中加入BSA、Triton X-100以及明胶等辅料，实现在同一反应管中对同一全血样本的不同位点进行同时检测，排除全血中抑制PCR反应的因素，避免了DNA的提取步骤，降低了检测成本。
辅料明胶和BSA可以增加DNA聚合酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。BSA还能克服黑色素对PCR反应的抑制。Triton-100能够裂解全血样本中的细胞，释放DNA，同时，还能克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂对PCR反应的抑制作用。
优选地，所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列包含如SEQ IDNO.1-9所示的片段。
优选地，所述SEQ ID NO：1-3所示的序列是用于检测MTHFR基因677C>T突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述SEQ ID NO：4-6所示的序列是用于检测MTHFR基因1298A>C突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述SEQ ID NO：7-9所示的序列是用于检测MTRR基因66A>G突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列如下：
所述特异性突变检测探针设计方式为探针5’端碱基与待检测位点碱基重合，并人为修改探针5’端第二个或第三个位置的碱基，使其错配，提高检测特异性。
所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团；
优选的，所述MTHFR基因677C>T突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合FAM基团和TAMRA基团；
优选的，所述MTHFR基因1298A>C突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合HEX基团和BHQ1基团；
优选的，所述MTHFR基因66A>G突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合Cy5基团和BHQ2基团；
本发明中，独特设计的三种特异性突变检测探针上分别带有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团，三种探针混合在一个检测管中。在PCR反应过程中，基因位点若是野生型，则探针会特异性结合在待检测位点处，随着PCR反应的进行会释放出不同波长的荧光信号；基因位点若是纯合突变型，探针则无法特异性的结合在待检测位点处，随着PCR反应的进行，没有荧光信号的释放；基因位点若是杂合突变型，随着PCR反应的进行，会释放出不同波长的荧光信号，但荧光信号值弱于野生型。通过荧光定量PCR仪分别收集三种荧光信号的改变，转换成Ct值，即可判断出三种基因分型的突变结果，从而实现在单个反应管中完成叶酸代谢能力基因三个位点的基因分型检测。目前市面上的检测方法多是以同一种荧光发生基团和荧光淬灭基团标记所有的探针，通过不同的反应管区分不同的叶酸代谢能力基因分型，暂无在同一反应管中检测叶酸代谢能力不同位点的基因分型试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括：RT-PCR反应buffer、RT-PCR反应酶、ddH2O、阴性质控品、野生型质控品、突变型质控品。
优选的，所述RT-PCR反应buffer pH值为7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
所述RT-PCR反应酶由热启动Taq酶和dNTPs组成；
优选的，热启动Taq酶的用量为2～10U；dNTPs为2～5mmol/L。
所述阴性质控品为灭菌纯水。
所述野生型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点野生型DNA、MTHFR基因1298位点野生型DNA，以及MTRR基因66位点野生型DNA，使用终浓度为0.2mM。
所述突变型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点纯合突变型DNA、MTHFR基因1298位点纯合突变型DNA，以及MTRR基因66位点纯合突变型DNA，使用终浓度为0.2mM。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的试剂盒用于检测叶酸代谢能力基因分型的方法，包括以下步骤：
1)以2μL全血作为检测样本，不需要提取DNA模板；
2)取各组分混合，加入2μL全血样本，进行PCR扩增反应；
3)PCR扩增：条件为95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒(采集荧光)，42个循环；72℃延伸30秒；荧光通道1选择FAM通道，荧光通道2选择HEX通道、荧光通道3选择Cy5通道；
4)检测结果判定：PCR结果判定通过各检测通道Ct值确定，阴性质控品通道的Ct值>36，野生型和杂合突变型质控品的Ct值≤36的检测结果视为有效；样本检测结果Ct值≤24，基因分型结果为野生型；样本检测结果24＜Ct值≤36，基因分型结果为杂合突变型；样本检测结果Ct值>36，基因分型结果为纯合突变型。
优选地，步骤(1)所述的待测样品为外周静脉血、指尖血或足跟血的任意一种或至少两种的混合物。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或第二方面所述的方法用于检测叶酸代谢能力基因分型的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明试剂盒采用PCR-荧光探针法技术检测叶酸代谢能力基因是否发生突变，不仅具有很好的准确性和特异性，而且还减少了检测的操作步骤，提高了检测效率；
(2)本发明试剂盒将独特设计的特异性引物和特异性突变检测探针，BSA、TritonX-100、明胶等辅料进行整合，制备的叶酸代谢能力基因分型检测试剂组合，相比于目前国内外市场上的其他基因突变检测试剂或试剂盒，能直接对全血样本进行检测，排除全血中抑制PCR反应的因素，无需提取DNA模板作为检测样本，降低了检验成本；
(3)本发明试剂盒优化了特异性突变检测探针的设计方法，单管即可实现同一样本叶酸代谢能力三个位点的基因分型检测，缩短了检测的步骤和时间，操作简便，检测结果具有更好的特异性和准确性；
(4)本发明试剂盒对叶酸代谢能力相关基因突变的检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从全血等样本中检测叶酸代谢能力相关基因的突变，可以实时、无创的对患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的临床价值。
附图说明
图1本发明叶酸代谢能力野生型、杂合突变型扩增曲线图；
图2本发明叶酸代谢能力基因分型不同buffer组扩增对比图；
图3本发明叶酸代谢能力基因分型全血检测与DNA模板检测对比图；
图4本发明叶酸代谢能力基因分型野生型、杂合突变型以及纯合突变型Ct值阈值。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1叶酸代谢能力基因分型检测试剂盒的制备
PCR试剂：终浓度0.1M Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的MgCl2、0.6mg/mL的BSA、1％的明胶、0.5％的Triton X-100和0.5mmol/L的KCl混合液，按1mL/支分装储存。5U Taq DNA聚合酶、2.5mmol/L dNTPs的混合液，按0.3mL/支分装储存。ddH2O，按1mL/支分装储存。
特异性引物和特异性突变检测探针：所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1-9，用于PCR反应，按0.25mL/支分装。
阴性质控品，灭菌的纯化水。
野生型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点野生型DNA、MTHFR基因1298位点野生型DNA，以及MTRR基因66位点野生型DNA，使用终浓度为0.2mM，按0.1mL/支分装储存。
突变型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点纯合突变型DNA、MTHFR基因1298位点纯合突变型DNA，以及MTRR基因66位点纯合突变型DNA，使用终浓度为0.2mM，按0.1mL/支分装储存。
将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
实施例2叶酸代谢能力基因分型检测
所述方法包括如下步骤：
1)取2.5μL特异性引物和特异性突变检测探针，10μL RT-PCR反应buffer，2.5μLRT-PCR反应酶以及8μL ddH2O，在冰上混合振荡均匀；并设立常规RT-PCR反应buffer对照组；
2)分别取2μL全血样本、阴性质控品、野生型质控品或杂合突变型质控品，加入步骤1)中的反应管，其中野生型质控品与纯合突变型质控品等量混合成杂合突变型质控品；并提取实验组样本血液基因组DNA模板，用于对照实验；
3)设置PCR反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒，42个循环；72℃延伸30秒；
4)将反应管放入荧光定量PCR仪内，点击“开始”，进行检测；
5)将PCR反应结果导出，用于分析。
实施例3检测结果判读
如图1所示，阴性质控品未出现扩增，无Ct值，表明实验操作未出现污染；野生型和杂合型质控品有扩增，Ct值＜36，表明实验结果可信。
如图2所示，常规RT-PCR反应buffer对照组中，全血样本没有明显扩增，表明对全血抑制剂没有去抑制效果。
由图3可以看出，全血样本组与基因组DNA模板对照组检测结果Ct值相关性良好，R2＝0.9775；显著性分析结果显示P＜0.05，差异性不显著，表明全血直接PCR检测叶酸代谢能力基因分型结果准确可靠。
由图4可以看出，样品的Ct值≤24，表示叶酸代谢能力基因分型为野生型；24＜Ct值≤36，表示叶酸代谢能力基因分型为杂合型；Ct值>36，表示叶酸代谢能力基因分型为纯合突变型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及叶酸代谢能力基因分型检测技术，具体涉及一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
叶酸是一种从菠菜中发现的水溶性维生素，又称之为维生素B9。随后，科学家发现各种动植物类食品中均含有叶酸，这类叶酸被称之为天然叶酸。通过饮用食物，尤其是绿叶蔬菜类，人体可以获得叶酸的补充。除此之外，还可以通过服用合成的叶酸片，增补叶酸，其生物利用度更高，约为天然叶酸的一倍。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用，同时也是胎儿生长发育不可缺少的营养素。
我国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，我国每年约有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。科学研究已经表明，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。
同时由中华医学会心血管分会高血压学组与精准心血管病学学组以及中国医师协会高血压专业委员会三大组织联合发布的《H型高血压诊断与治疗专家共识》指出，叶酸缺乏和(或)同型半胱氨酸(Hcy)/叶酸代谢途径中关键酶的缺陷或基因突变是导致血Hcy水平升高的主要原因，Hcy≥10μmol/L是高血压重要的危险分层因素。共识还指出，叶酸代谢过程中的关键酶即亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的677TT基因型在中国人群中频率高于其他国家人群，该基因型在血压增高的同时会大大增加脑卒中发生的危险。
尽管目前的循证医学证据支持补充叶酸这样一种疾病预防策略，但在临床实践中，针对补充叶酸的方法、剂量、持续的时间、患者的随访等方面还存在很多困惑。叶酸代谢能力受遗传因素影响，目前已经得到证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢相关的基因主要是MTHFR和MTRR(甲硫氨酸合成酶还原酶)，不同的基因分型对应的叶酸补充剂量不一致，这导致个体化的补充叶酸成为预防策略的重中之重。
因此，高效、准确的检测判断叶酸代谢能力基因分型就显得极为重要，同时也成为指导个体化增补叶酸的关键。目前检测叶酸代谢能力相关基因突变的方法主要有测序法、基因芯片法、荧光PCR法、高分辨率熔解曲线法以及PCR-RFLP等，其中以荧光PCR法最为常用且具实用性。荧光PCR法又分为PCR-荧光染料法和PCR-荧光探针法，在实际应用中，PCR-荧光探针法的特异性高于PCR-荧光染料法，因此，PCR-荧光探针法更适合用于检测叶酸代谢能力基因分型。
但是，现有的技术中，荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因分型，需要提取血液基因组DNA作为模板，进行相应的检测，这一操作大大的增加了检验操作人员的工作量，且增加了检测成本和时间。另外，现有的荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因分型，多是针对每个位点设置一个检测管，如检测一个样本MTHFR基因677C>T突变、MTHFR基因1298A>C突变以及MTRR基因66A>G突变共三个位点，则需分别设置三个检测管，进行相应检测，操作费时费力，不利于临床大规模推广使用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的检测叶酸代谢能力基因分型，为个体化增补叶酸的指导奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对MTHFR、MTRR基因突变的特异性引物和特异性突变检测探针；RT-PCR反应buffer；RT-PCR反应Taq酶；ddH2O；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品；分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。
本发明中，首次公开通过PCR-荧光探针法技术直接利用全血样本检测叶酸代谢能力基因分型的试剂盒，通过独特设计的特异性引物序列和特异性突变检测探针，在RT-PCR反应buffer中加入BSA、Triton X-100以及明胶等辅料，实现在同一反应管中对同一全血样本的不同位点进行同时检测，排除全血中抑制PCR反应的因素，避免了DNA的提取步骤，降低了检测成本。
辅料明胶和BSA可以增加DNA聚合酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。BSA还能克服黑色素对PCR反应的抑制。Triton-100能够裂解全血样本中的细胞，释放DNA，同时，还能克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂对PCR反应的抑制作用。
优选地，所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列包含如SEQ IDNO.1-9所示的片段。
优选地，所述SEQ ID NO：1-3所示的序列是用于检测MTHFR基因677C>T突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述SEQ ID NO：4-6所示的序列是用于检测MTHFR基因1298A>C突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述SEQ ID NO：7-9所示的序列是用于检测MTRR基因66A>G突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列如下：
所述特异性突变检测探针设计方式为探针5’端碱基与待检测位点碱基重合，并人为修改探针5’端第二个或第三个位置的碱基，使其错配，提高检测特异性。
所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团；
优选的，所述MTHFR基因677C>T突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合FAM基团和TAMRA基团；
优选的，所述MTHFR基因1298A>C突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合HEX基团和BHQ1基团；
优选的，所述MTHFR基因66A>G突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合Cy5基团和BHQ2基团；
本发明中，独特设计的三种特异性突变检测探针上分别带有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团，三种探针混合在一个检测管中。在PCR反应过程中，基因位点若是野生型，则探针会特异性结合在待检测位点处，随着PCR反应的进行会释放出不同波长的荧光信号；基因位点若是纯合突变型，探针则无法特异性的结合在待检测位点处，随着PCR反应的进行，没有荧光信号的释放；基因位点若是杂合突变型，随着PCR反应的进行，会释放出不同波长的荧光信号，但荧光信号值弱于野生型。通过荧光定量PCR仪分别收集三种荧光信号的改变，转换成Ct值，即可判断出三种基因分型的突变结果，从而实现在单个反应管中完成叶酸代谢能力基因三个位点的基因分型检测。目前市面上的检测方法多是以同一种荧光发生基团和荧光淬灭基团标记所有的探针，通过不同的反应管区分不同的叶酸代谢能力基因分型，暂无在同一反应管中检测叶酸代谢能力不同位点的基因分型试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括：RT-PCR反应buffer、RT-PCR反应酶、ddH2O、阴性质控品、野生型质控品、突变型质控品。
优选的，所述RT-PCR反应buffer pH值为7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
所述RT-PCR反应酶由热启动Taq酶和dNTPs组成；
优选的，热启动Taq酶的用量为2～10U；dNTPs为2～5mmol/L。
所述阴性质控品为灭菌纯水。
所述野生型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点野生型DNA、MTHFR基因1298位点野生型DNA，以及MTRR基因66位点野生型DNA，使用终浓度为0.2mM。
所述突变型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点纯合突变型DNA、MTHFR基因1298位点纯合突变型DNA，以及MTRR基因66位点纯合突变型DNA，使用终浓度为0.2mM。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的试剂盒用于检测叶酸代谢能力基因分型的方法，包括以下步骤：
1)以2μL全血作为检测样本，不需要提取DNA模板；
2)取各组分混合，加入2μL全血样本，进行PCR扩增反应；
3)PCR扩增：条件为95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒(采集荧光)，42个循环；72℃延伸30秒；荧光通道1选择FAM通道，荧光通道2选择HEX通道、荧光通道3选择Cy5通道；
4)检测结果判定：PCR结果判定通过各检测通道Ct值确定，阴性质控品通道的Ct值>36，野生型和杂合突变型质控品的Ct值≤36的检测结果视为有效；样本检测结果Ct值≤24，基因分型结果为野生型；样本检测结果24＜Ct值≤36，基因分型结果为杂合突变型；样本检测结果Ct值>36，基因分型结果为纯合突变型。
优选地，步骤(1)所述的待测样品为外周静脉血、指尖血或足跟血的任意一种或至少两种的混合物。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或第二方面所述的方法用于检测叶酸代谢能力基因分型的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明试剂盒采用PCR-荧光探针法技术检测叶酸代谢能力基因是否发生突变，不仅具有很好的准确性和特异性，而且还减少了检测的操作步骤，提高了检测效率；
(2)本发明试剂盒将独特设计的特异性引物和特异性突变检测探针，BSA、TritonX-100、明胶等辅料进行整合，制备的叶酸代谢能力基因分型检测试剂组合，相比于目前国内外市场上的其他基因突变检测试剂或试剂盒，能直接对全血样本进行检测，排除全血中抑制PCR反应的因素，无需提取DNA模板作为检测样本，降低了检验成本；
(3)本发明试剂盒优化了特异性突变检测探针的设计方法，单管即可实现同一样本叶酸代谢能力三个位点的基因分型检测，缩短了检测的步骤和时间，操作简便，检测结果具有更好的特异性和准确性；
(4)本发明试剂盒对叶酸代谢能力相关基因突变的检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从全血等样本中检测叶酸代谢能力相关基因的突变，可以实时、无创的对患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的临床价值。
附图说明
图1本发明叶酸代谢能力野生型、杂合突变型扩增曲线图；
图2本发明叶酸代谢能力基因分型不同buffer组扩增对比图；
图3本发明叶酸代谢能力基因分型全血检测与DNA模板检测对比图；
图4本发明叶酸代谢能力基因分型野生型、杂合突变型以及纯合突变型Ct值阈值。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1叶酸代谢能力基因分型检测试剂盒的制备
PCR试剂：终浓度0.1M Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的MgCl2、0.6mg/mL的BSA、1％的明胶、0.5％的Triton X-100和0.5mmol/L的KCl混合液，按1mL/支分装储存。5U Taq DNA聚合酶、2.5mmol/L dNTPs的混合液，按0.3mL/支分装储存。ddH2O，按1mL/支分装储存。
特异性引物和特异性突变检测探针：所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1-9，用于PCR反应，按0.25mL/支分装。
阴性质控品，灭菌的纯化水。
野生型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点野生型DNA、MTHFR基因1298位点野生型DNA，以及MTRR基因66位点野生型DNA，使用终浓度为0.2mM，按0.1mL/支分装储存。
突变型质控品，人工合成的MTHFR基因677位点纯合突变型DNA、MTHFR基因1298位点纯合突变型DNA，以及MTRR基因66位点纯合突变型DNA，使用终浓度为0.2mM，按0.1mL/支分装储存。
将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
实施例2叶酸代谢能力基因分型检测
所述方法包括如下步骤：
1)取2.5μL特异性引物和特异性突变检测探针，10μL RT-PCR反应buffer，2.5μLRT-PCR反应酶以及8μL ddH2O，在冰上混合振荡均匀；并设立常规RT-PCR反应buffer对照组；
2)分别取2μL全血样本、阴性质控品、野生型质控品或杂合突变型质控品，加入步骤1)中的反应管，其中野生型质控品与纯合突变型质控品等量混合成杂合突变型质控品；并提取实验组样本血液基因组DNA模板，用于对照实验；
3)设置PCR反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒，42个循环；72℃延伸30秒；
4)将反应管放入荧光定量PCR仪内，点击“开始”，进行检测；
5)将PCR反应结果导出，用于分析。
实施例3检测结果判读
如图1所示，阴性质控品未出现扩增，无Ct值，表明实验操作未出现污染；野生型和杂合型质控品有扩增，Ct值＜36，表明实验结果可信。
如图2所示，常规RT-PCR反应buffer对照组中，全血样本没有明显扩增，表明对全血抑制剂没有去抑制效果。
由图3可以看出，全血样本组与基因组DNA模板对照组检测结果Ct值相关性良好，R2＝0.9775；显著性分析结果显示P＜0.05，差异性不显著，表明全血直接PCR检测叶酸代谢能力基因分型结果准确可靠。
由图4可以看出，样品的Ct值≤24，表示叶酸代谢能力基因分型为野生型；24＜Ct值≤36，表示叶酸代谢能力基因分型为杂合型；Ct值>36，表示叶酸代谢能力基因分型为纯合突变型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 普迈德（北京）科技有限公司
<120> 一种精准检测ALDH2基因多态性的试剂盒及其应用
<130> 2017
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 1
ggagcccagt cacccttt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 2
ccaacagacc ccaatccc 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 3
ctgcaggcat acactgaagt gaa 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 4
ctgcaggcat acactaaagt gaa 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 5
ctgcaggcat acacttaagt gaa 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 6
ctgcaggcat acactcaagt gaa 23

Claims (19)

1.一种检测叶酸代谢能力基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对MTHFR基因677 C＞T突变、1298A＞C突变，以及MTRR基因66A＞G突变的特异性引物和特异性突变检测探针；RT-PCR反应buffer缓冲液；RT-PCR反应Taq酶；灭菌纯水；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品；分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应buffer缓冲液pH值为7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1-9所示的片段。
4.根据权利要求书3所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO：1-3所示的序列是用于检测MTHFR基因677 C＞T突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
5.根据权利要求书3所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO：4-6所示的序列是用于检测MTHFR基因1298A＞C突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
6.根据权利要求书3所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO：7-9所示的序列是用于检测MTRR基因66A＞G突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
7.根据权利要求1-6之一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性突变检测探针设计方式为探针5’端碱基与待检测位点碱基重合，并人为修改探针5’端第二个或第三个位置的碱基，使其错配。
8.根据权利要求1-6之一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因677C＞T突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合FAM基团和TAMRA基团。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因1298A＞C突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合HEX基团和BHQ1基团。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因66A＞G突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合Cy5基团和BHQ2基团。
12.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述引物浓度均为0.1～0.5μmol/L，探针浓度均为0.1～0.25μmol/L。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应酶由热启动Taq酶和dNTPs组成。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，热启动Taq酶的用量为2～10U；dNTPs为2～5mmol/L。
15.根据权利要求1-6、9-14之一所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为灭菌纯水；所述野生型质控品，为人工合成的MTHFR基因677位点野生型DNA、MTHFR基因1298位点野生型DNA，以及MTRR基因66位点野生型DNA，使用终浓度为0.2mM；所述突变型质控品，为人工合成的MTHFR基因677位点纯合突变型DNA、MTHFR基因1298位点纯合突变型DNA，以及MTRR基因66位点纯合突变型DNA，使用终浓度为0.2mM。
16.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应buffer缓冲液pH值为7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成；所述特异性引物和特异性突变检测探针为SEQ ID NO.1-9所示的片段；所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团；所述RT-PCR反应酶由热启动Taq酶和dNTPs组成，热启动Taq酶的用量为2～10U；dNTPs为2～5mmol/L。
17.一种利用权力要求16所述试剂盒检测叶酸代谢能力基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以2μL全血作为检测样本；
2)取各组分混合，加入2μL全血样本，进行PCR扩增反应；
3)PCR扩增：条件为95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒(采集荧光)，42个循环；72℃延伸30秒；荧光通道1选择FAM通道，荧光通道2选择HEX通道、荧光通道3选择Cy5通道。
4)检测结果判定：PCR结果判定通过各检测通道Ct值确定，阴性质控品通道的Ct值＞36，野生型和杂合突变型质控品的Ct值≤36的检测结果视为有效；样本检测结果Ct值≤24，基因分型结果为野生型；样本检测结果24＜Ct值≤36，基因分型结果为杂合突变型；样本检测结果Ct值＞36，基因分型结果为纯合突变型。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的待测样品为外周静脉血、指尖血或足跟血的任意一种或至少两种的混合物。
19.一种用于RT-PCR反应buffer缓冲液，其特征在于，所述缓冲液pH值为7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
CN201810207137.2A 2018-03-13 2018-03-13 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用 Pending CN108251510A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810207137.2A CN108251510A (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810207137.2A CN108251510A (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108251510A true CN108251510A (zh) 2018-07-06

Family

ID=62746009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810207137.2A Pending CN108251510A (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108251510A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055512A (zh) * 2018-10-07 2018-12-21 浙江数问生物技术有限公司 一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法
CN109234375A (zh) * 2018-08-13 2019-01-18 武汉千麦医学检验所有限公司 一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法
CN109234374A (zh) * 2018-08-13 2019-01-18 武汉千麦医学检验所有限公司 一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒
CN109504754A (zh) * 2018-11-21 2019-03-22 长沙金域医学检验所有限公司 一种检测叶酸代谢能力的方法
CN111118138A (zh) * 2019-12-13 2020-05-08 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN111172253A (zh) * 2020-02-25 2020-05-19 上海未凡生物科技有限公司 一种一管式检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒和方法
CN111187828A (zh) * 2020-02-11 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
WO2021042884A1 (zh) * 2019-09-02 2021-03-11 珠海赛乐奇生物技术股份有限公司 用于检测叶酸基因多态性的探针、基因芯片及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110212460A1 (en) * 2002-02-22 2011-09-01 Hogan Kirk J Assay for nitrous oxide neurologic syndrome
CN104293916A (zh) * 2014-09-12 2015-01-21 广东华美众源生物科技有限公司 一种g6pd缺乏症基因检测试剂盒
CN106957903A (zh) * 2016-11-01 2017-07-18 上海泽因生物科技有限公司 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110212460A1 (en) * 2002-02-22 2011-09-01 Hogan Kirk J Assay for nitrous oxide neurologic syndrome
CN104293916A (zh) * 2014-09-12 2015-01-21 广东华美众源生物科技有限公司 一种g6pd缺乏症基因检测试剂盒
CN106957903A (zh) * 2016-11-01 2017-07-18 上海泽因生物科技有限公司 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENNIS Y. WANG等: "Developmental validation of the AmpFSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification Kit: an established multiplex assay with improved performance", 《JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES》 *
周国华等: "《SNP检测技术与个体化药物治疗》", 28 February 2015, 苏州大学出版社 *
曹墨菊等: "《植物生物技术概论》", 31 October 2014, 中国农业大学出版社 *
赵兴春等: "荧光STR直接复合扩增试剂缓冲体系的研制", 《中国法医学杂志》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234375A (zh) * 2018-08-13 2019-01-18 武汉千麦医学检验所有限公司 一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法
CN109234374A (zh) * 2018-08-13 2019-01-18 武汉千麦医学检验所有限公司 一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒
CN109055512A (zh) * 2018-10-07 2018-12-21 浙江数问生物技术有限公司 一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法
CN109504754A (zh) * 2018-11-21 2019-03-22 长沙金域医学检验所有限公司 一种检测叶酸代谢能力的方法
WO2021042884A1 (zh) * 2019-09-02 2021-03-11 珠海赛乐奇生物技术股份有限公司 用于检测叶酸基因多态性的探针、基因芯片及试剂盒
CN111118138A (zh) * 2019-12-13 2020-05-08 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN111187828A (zh) * 2020-02-11 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
CN111187828B (zh) * 2020-02-11 2023-09-15 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
CN111172253A (zh) * 2020-02-25 2020-05-19 上海未凡生物科技有限公司 一种一管式检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108251510A (zh) 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用
CN105463122B (zh) 一种mthfr、mtrr和rfc1基因多态性检测引物组合物、试剂盒及其应用
CN103849681B (zh) 一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN104232781B (zh) 一种检测HLA‑B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法
ES2705573T3 (es) Procedimientos y composiciones para detectar mutaciones en el gen EZH2 humano
CN107058538B (zh) 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用
CN110129430A (zh) 一种用于高血压患者用药的检测试剂盒及检测方法
CN103923974A (zh) 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN105296637A (zh) 检测白血病相关融合基因的引物、探针及试剂盒
CN107523635A (zh) 一种tgfbi基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法
TWI694152B (zh) 用於檢測肝癌的基因標誌物及其用途
CN111118138A (zh) 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN110408685A (zh) 用于检测人mthfr基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN102732633B (zh) 人idh基因突变的检测引物和试剂盒
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN104830852A (zh) 一种检测hla-b*15:02等位基因的多重实时荧光pcr方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN104293932A (zh) 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法
CN103074438B (zh) 一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
WO2020134950A1 (zh) 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒
CN106636365B (zh) 用于检测agtr1基因的a1166c多态性位点的核酸、试剂盒及方法
CN103060315B (zh) 一种预测前列腺癌易感性的检测试剂盒和方法
CN104531866B (zh) 用于结肠直肠癌中使用的生物标志物
CN106755525A (zh) 一种检测mthfr基因突变的探针及其应用和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination