CN103923974A - 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103923974A
CN103923974A CN201410041184.6A CN201410041184A CN103923974A CN 103923974 A CN103923974 A CN 103923974A CN 201410041184 A CN201410041184 A CN 201410041184A CN 103923974 A CN103923974 A CN 103923974A
Authority
CN
China
Prior art keywords
taqman probe
pcr
combined
primer
point mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410041184.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103923974B (zh
Inventor
王贻锘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI YONGTAI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
SHANGHAI YONGTAI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI YONGTAI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical SHANGHAI YONGTAI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201410041184.6A priority Critical patent/CN103923974B/zh
Publication of CN103923974A publication Critical patent/CN103923974A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103923974B publication Critical patent/CN103923974B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体为一种检测人表皮生长因子受体基因EGFR外显子20上T790M点突变的方法；以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条标记不同类型荧光的TaqMan探针对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型及其数量和比例。

Description

一种检测EGFR基因外显子20 T790M点突变的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子20上T790M点突变的方法。 
背景技术
随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。 
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。 
EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21～24编码C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21。 
外显子20上的T790M突变是目前较为认可的耐药机制之一，通常是替代的点突变，2669位点上的C突变为T。 
目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下： 
Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA 链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2－3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。 
ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。 
ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。 
上述现有技术存在以下问题： 
1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。 
2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。 
3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。 
目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR扩增引物、TaqMan探针及试剂盒和检测方法。 
数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 
本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条不同的TaqMan探针（标记不同类型荧光）对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型。 
一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR引物，其特征在于，为反向引物和正向引物； 
正向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）之一： 
F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’， 
F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 
F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’； 
反向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.6～10）之一： 
R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’， 
R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’， 
R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’， 
R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’， 
R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 
优选的，正向引物为SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID No.6～10之一的核苷酸序列。 
更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一： 
（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；或者， 
（2）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 
（3）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 
（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’；或者， 
（5）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 
一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM），或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM）以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针（PW）；两者均为为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且所含的荧光基团的种类不同。 
与突变型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.11～15）中的一种： 
PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’， 
PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 
PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’， 
PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’， 
PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’。 
优选的，所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.11～15中的一种。 
所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.16～20）中的一种： 
PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’， 
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’， 
PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’， 
PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’， 
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。 
优选的，所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.16～20中的一种。 
TaqMan探针的荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国Life Technologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国Life Technologies）。 
上述的TaqMan探针和PCR引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子20上T790M点突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。 
一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的试剂盒，含有以下物质中的至少一种： 
（1）前述的PCR引物； 
（2）前述的TaqMan探针。 
上述引物和探针是针对EGFR外显子20上L58R点突变设计优化的，这种试剂盒可基于数字PCR平台来检测EGFR外显子20上T790M点突变。 
本发明检测EGFR外显子20上T790M点突变的方法，步骤包括： 
1.将待测样品DNA模板、PCR引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针含量如下： 
a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL，优选为0.5ng/μL； 
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM，优选为600nM； 
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM，优选为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan 探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM，优选为300nM。 
其中PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）之一： 
F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’， 
F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 
F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’。 
反向PCR引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.5～10）之一： 
R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’， 
R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’， 
R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’， 
R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’， 
R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 
优选的，正向引物选自SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列，反向引物选自SEQ ID No.5～10之一的核苷酸序列； 
更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一： 
（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；或者， 
（2）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 
（3）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’ 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 
（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’；或者， 
（5）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 
Taqman探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM），或者包 括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM）以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针（PW）；两者均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，而且所含荧光基团的类型不同。 
与突变型DNA模板结合的Taqman探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.11～15）之一： 
PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’， 
PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 
PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’， 
PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’， 
PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’。 
其中与野生型DNA模板结合的Taqman探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.16～20）之一： 
PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’， 
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’， 
PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’， 
PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’， 
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。 
TaqMan探针上的荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国Life Technologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国Life Technologies）。 
优选的，与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.11～15中的一种，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.16～20中的一种。 
2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应，条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应； 
优选的PCR扩增条件为，93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。 
更优选的PCR扩增条件为，94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。 
优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。 
3.PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光类型判断待测样品中是否含有EGFR基因外显子20T790M点突变的DNA模板，还可确定其中EGFR基因外显子20T790M点突变的DNA模板的数量和含量。 
可用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。 
通过上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子20上T790M点突变。 
与现有技术比较，本发明的优点在于： 
1.结果判读方式：以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。 
2.结果描述的方式：以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量极低的情况下，定量分析的误差也很小。 
3.检测灵敏度（数值越小灵敏度越好）：以前技术方法的灵敏度一般在1％－50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，能达到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。 
附图说明
图1为实施例1中，不同含量突变样本的荧光检测结果。 
具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。 
所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)： 
（1）准备样品：含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子20上T790M点突变的突变阳性DNA以及野生型与突变DNA混合样本（其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/2500）。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。其中，突变DNA模板来源于携带EGFR外显子20上T790M点替换突变的细胞系（经PCR测序鉴定），其中突变的位点在EGFR外显子20上c.2369位（C变为T）。 
（2）室温融解PCR引物及对应TaqMan探针。 
正向和反向PCR引物的序列为： 
正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’ 
反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’ 
TaqMan探针的序列为： 
与野生型DNA结合的TaqMan探针PW1上连接的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB，其核苷酸部分序列为：PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’。 
与突变型DNA结合的TaqMan探针PM1上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB，其核苷酸部分序列为：PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’。 
（3）按照以下配比制备PCR反应液：2×数字PCR预混液（Biorad，#186-3022）与正向及反向PCR引物、与野生型DNA模板结合的TaqMan探针、与突变型DNA模板结合的TaqMan探针及与待检测DNA（10ng）混合，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配制成数字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分别为600nM，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针以及与突变型DNA模板结合的TaqMan探针分别为300nM。 
（4）配制好的20μL数字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板内，然后加入60μL液滴制作油到制作板用于制备PCR微反应液滴（QX200微滴发生器）。 
（5）将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。 
（6）将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应： 
94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。 
（7）PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪（QX200微滴荧光信号收集系统）中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号，用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，结果如图1。可进行定量分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。 
突变体与野生型的含量不同的样品检测结果中，突变阳性信号数（FAM）与总信号数（FAM和VIC）如下： 
1/1样品5365/10756，计算值突变/野生=0.995/1，误差0.5% 
1/100样品105/10564，计算值突变/野生=0.010/1 
1/1000样品21/19691，计算值突变/野生=0.00107/1，误差7% 
1/2500样品7/17523，计算值突变/野生=0.000399/1 
以上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子20上T790M点突变，检出限达到1/2500。 
使用以下各组之一的PCR引物时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。 
（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’ 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’ 
（2）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’ 
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’ 
（3）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’ 
反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’ 
（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 
反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 
使用的TaqMan探针的核苷酸部分改为以下各组序列之一时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。 
（1）PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’ 
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’； 
（2）PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’。 
对照例 
一、使用不同的使用PCR引物、TaqMan探针序列 
1、按照实施例1的方法，区别在于使用不同的PCR引物。 
正向和反向PCR引物的序列为（按荧光定量PCR技术设计）： 
F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’ 
R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’ 
在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。 
2、使用不同的TaqMan探针。 
TaqMan探针的序列为（按荧光定量PCR技术设计）： 
PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’ 
PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’ 
在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。突变样本含量为1/100的样品进行定量检测，误差为15%以上。 
二、使用不同浓度的PCR引物和探针 
1、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。 
2、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM，两种TaqMan探针的浓度分别为60nM，仅当突变 含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。 
三、使用荧光定量PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。 

Claims (11)

1.一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR引物，其特征在于，为正向引物和反向引物；
正向引物含有以下核苷酸序列之一：
F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’，
F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’，
F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’，
F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’，
F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’；
反向引物含有以下核苷酸序列之一：
R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’，
R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’，
R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’，
R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’，
R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。
2.权利要求1所述EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR引物，其特征在于，正向引物选自以下核苷酸序列之一：
F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’，
F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’，
F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’，
F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’，
F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’；
反向引物选自以下核苷酸序列之一：
R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’，
R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’，
R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’，
R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’，
R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。
3.权利要求1所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR引物，其特征在于，正向和反向引物选自以下各组核苷酸序列之一：
（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’，
反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’，或者
（2）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’，
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’，或者
（3）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’，
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’，或者
（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’
反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’，
（5）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’，
反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。
4.一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的TaqMan探针，其特征在于，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针；
所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且两者所含的荧光基团不同；
与突变型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种：
PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’，
PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’，
PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’，
PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’，
PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’；
所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种：
PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’，
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’，
PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’，
PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’，
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。
5.权利要求4所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的TaqMan探针，其特征在于，荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
6.权利要求4所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的TaqMan探针，其特征在于，所述与突变型野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种：
PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’，
PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’，
PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’，
PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’，
PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’；
所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种：
PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’，
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’，
PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’，
PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’，
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。
7.一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质中的至少一种：
（1）权利要求1、2或3任一项所述的PCR引物；
（2）权利要求4、5或6任一项所述的TaqMan探针。
8.一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）待测的DNA模板、权利要求1～3任一项所述PCR引物、权利要求4～6任一项的TaqMan探针与PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：
a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL；
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM；
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM；
（2）用数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
PCR扩增条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应；
（3）PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因外显子20T790M点突变的DNA模板及其数量和含量。
9.权利要求8所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的方法，其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：
a.DNA模板，含量为0.5ng/μL；
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为600nM；
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为300nM。
10.权利要求8所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。
11.权利要求8所述检测EGFR基因外显子20T790M点突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：4℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
CN201410041184.6A 2014-01-27 2014-01-27 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法 Active CN103923974B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410041184.6A CN103923974B (zh) 2014-01-27 2014-01-27 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410041184.6A CN103923974B (zh) 2014-01-27 2014-01-27 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103923974A true CN103923974A (zh) 2014-07-16
CN103923974B CN103923974B (zh) 2016-02-03

Family

ID=51142369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410041184.6A Active CN103923974B (zh) 2014-01-27 2014-01-27 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103923974B (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624309A (zh) * 2016-02-23 2016-06-01 深圳华大基因研究院 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒
CN105838778A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法
CN105838780A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法
CN105838779A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药的方法
CN105838777A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海张江转化医学研发中心有限公司 ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法
CN105838781A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法
CN105986017A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒
CN109355360A (zh) * 2018-11-20 2019-02-19 元码基因科技（北京）股份有限公司 用于检测egfr突变的组合物、试剂盒和方法
CN109402261A (zh) * 2018-11-30 2019-03-01 广东腾飞基因科技股份有限公司 一种用于检测egfr基因突变的试剂盒
CN111206100A (zh) * 2020-02-28 2020-05-29 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种检测egfr基因t790m位点突变的试剂盒和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101041850A (zh) * 2006-03-20 2007-09-26 吕成伟 一种人类表皮生长因子受体（egfr）基因外显子20的t790m突变快速检测方法和试剂盒
CN101506385A (zh) * 2006-07-20 2009-08-12 潘盖伊生物技术有限公司 检测血液样品中egfr突变的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101041850A (zh) * 2006-03-20 2007-09-26 吕成伟 一种人类表皮生长因子受体（egfr）基因外显子20的t790m突变快速检测方法和试剂盒
CN101506385A (zh) * 2006-07-20 2009-08-12 潘盖伊生物技术有限公司 检测血液样品中egfr突变的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YING WANG: "Epidermal growth factor receptor exon 20 mutation increased in post-chemotherapy patients with non-small cell lung cancer detected with patients blood samples", 《TRANSL ONCOL》, vol. 6, no. 4, 1 August 2013 (2013-08-01) *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838778A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法
CN105838780A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法
CN105838779A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药的方法
CN105838777A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海张江转化医学研发中心有限公司 ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法
CN105838781A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法
CN105986017A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒
CN105624309A (zh) * 2016-02-23 2016-06-01 深圳华大基因研究院 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒
CN109355360A (zh) * 2018-11-20 2019-02-19 元码基因科技（北京）股份有限公司 用于检测egfr突变的组合物、试剂盒和方法
CN109402261A (zh) * 2018-11-30 2019-03-01 广东腾飞基因科技股份有限公司 一种用于检测egfr基因突变的试剂盒
CN111206100A (zh) * 2020-02-28 2020-05-29 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种检测egfr基因t790m位点突变的试剂盒和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103923974B (zh) 2016-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103923974B (zh) 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN103923975B (zh) 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN103911427A (zh) 一种基于数字pcr平台检测基因点突变的方法和试剂盒
CN103923973A (zh) 一种基于数字pcr平台检测基因缺失突变的方法和试剂盒
CN110964814B (zh) 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
JP2013530727A (ja) 差次的に提示される胎児のゲノム領域もしくは母親のゲノム領域の同定およびそれらの使用
BR112017025430B1 (pt) Método, uso de um produto, produto de programa de computador e sistema
JP2018530347A (ja) インサイチュ増幅により無細胞核酸分子を調製する方法
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN108676872B (zh) 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用
CN103740843A (zh) 一种检测egfr基因外显子21l858r点突变的试剂盒和方法
WO2020191521A1 (zh) 核酸序列、rna目标区域测序文库的构建方法及应用
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN105705655A (zh) 用于对nras和braf核酸进行多重分析的组合物及方法
CN110863053A (zh) 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
KR102112951B1 (ko) 암의 진단을 위한 ngs 방법
US20120108445A1 (en) Vegf and vegfr1 gene expression useful for cancer prognosis
KR20170051747A (ko) 피부 주름 발생 민감도 진단용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
CN109593856A (zh) 一种检测kras基因外显子2密码子12/13突变的试剂盒及其制备方法
WO2019084998A1 (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN103789436B (zh) 一种基于人工修饰引物的定量突变检测系统
CN103421883B (zh) 一种ret融合基因的筛查方法
CN114599801A (zh) 用于测试肺癌风险的试剂盒和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant