CN105838781A - ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法，及其在监控伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗慢性粒细胞白血病过程中的应用。本发明首先对慢性粒细胞白血病患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中ABL基因的耐药突变位点T315I，或PDGFRα基因的耐药突变位点T674I的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。

Description

ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆中ABL基因或PDGFRα基因位点突变的方法，及其在监控慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生继发性耐药等方面的应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增殖性疾病,以9号和22号染色体异位形成费城染色体(Ph)为特征，该异位形成一种新的BCR-ABL融合基因，此基因编码的融合型蛋白能导致髓系造血的异常克隆性增殖。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的出现是CML治疗史上的一座里程碑，目前TKI成为新诊断的CML慢性期(CML-CP)患者的标准治疗方案。

伊马替尼(imatinib)通过竞争性地与BCR-ABL激酶上的ATP结合位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断激酶自身磷酸化及底物磷酸化水平，从而特异性地抑制BCR-ABL阳性细胞增生并诱导其凋亡，是首个成功治疗靶向抑制BCR-ABL的TKI，目前已成为CML患者的一线治疗方案，取得了良好的疗效，已经在许多国家得到越来越广泛的应用。大多数CML慢性期患者对伊马替尼有着显著的血液学和细胞遗传学缓解。但随着伊马替尼广泛的应用，临床上出现的耐药病例逐渐增多。

绝大部分的伊马替尼耐药是由于BCR-ABL激酶位点突变造成的，该位点变异可能破坏伊马替尼和BCR-ABL的联系或者使激酶失去其非活性构象，进而导致下游有害的信号转导和细胞恶性克隆增生。突变主要分布在BCR-ABL激酶的如下4个簇：P-环簇、T315近侧簇、酶促反应簇和A-环簇，其中在P-环和T315I的突变作用最强，可完全阻断伊马替尼与ATP的结合。另外，BCR-ABL融合基因的扩增和过度表达导致酪氨酸激酶活性更强，使原有剂量的伊马替尼不足以控制。耐药可直接导致治疗失败，大大降低了伊马替尼的利用价值。因此，对于BCR-ABL激酶位点突变进行实时监测，能够有效地指导CML患者用药。然而传统的需要以肿瘤组织的基因组DNA为模板，这为患者在治疗过程中的多次检测和实时监控带来了困难。

血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。

研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。

然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、数字PCR)，仍难以准确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠癌患者中循环游离DNA的平均含量(4771ng/ml)与健康人的平均含量(0.85ng/ml)存在显著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原(CEA)的检测只有47％检测结果对诊断有意义。

因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。

综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关突变(如ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变)的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用非肿瘤组织(如血液或血浆样品)检测患者ABL基因T315I，或PDGFRα基因T674I突变的方法。

本发明的第一方面，提供了一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；

(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或PDGFRα基因。

在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRαT674I。

在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。

在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。

在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。

在另一优选例中，所述的预处理包括：

(a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管(如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝管))中；

(b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相(血浆)；

(c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提取DNA的检测样本。

在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：

(b-i)2000-5000rmp；

(b-ii)离心约1-15分钟；

(b-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。

在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：

(c-i)10000-15000rmp；

(c-ii)离心约5-30分钟；

(c-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。

在另一优选例中，在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50～100ng。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。

在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。

在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含ABL T315I或PDGFRα T674I突变位点的特异引物对。

在另一优选例中，所述的扩增引物对为用于扩增选自下组的位点的特异引物对：ABL T315I突变型、ABL T315I野生型、PDGFRα T674I突变型、PDGFRαT674I野生型。

在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述用于扩增PDGFRα T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

在另一优选例中，所述用于扩增、PDGFRα T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。

在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；

或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。

在另一优选例中，所述的ABL T315I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的ABL T315I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述的ABL T315I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的ABL T315I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的PDGFRα T674I突变型FAM探针的序列如SEQ IDNO:9所示。

在另一优选例中，所述的PDGFRα T674I突变型FAM探针的序列如SEQ IDNO:13所示。

在另一优选例中，所述的PDGFRα T674I野生型HEX探针的序列如SEQ IDNO:10所示。

在另一优选例中，所述的PDGFRα T674I野生型HEX探针的序列如SEQ IDNO:14所示。

在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，ABL T315I或PDGFRα T674I的特异引物对(9μM)及探针(5μM)各2μl。

在另一优选例中，所述的样本来自于慢性粒细胞白血病患者。

在另一优选例中，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：

(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

在另一优选例中，蛋白酶K的加入量为200μg/100微升检测样本。

在另一优选例中，(2a)中还包括：在消化结束后，对蛋白酶K进行灭活。

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。

在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量为20-100ng/微升；和/或所述含洗脱DNA的洗脱液的体积为20-100微升。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的大小为100-250bp，更佳地为150-200bp。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。

在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。

在另一优选例中，所述的洗脱包括：AVE洗脱。

在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。

本发明的第二方面，提供了一种基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法，

其中，所述的突变位点包括ABL T315I，或PDGFRα T674I。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。

在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。

在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示。

在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；

或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；

或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。

本发明的第三方面，提供了一种基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法；

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；

其中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示，或所述引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；

或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRα T674I。

在另一优选例中，所述的第一容器内还含有用于特异性扩增野生型位点的特异引物对，且所述的引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；或所述的引物对的序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；

或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面或本发明第三方面所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗的试剂盒。

在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括慢性粒细胞白血病患者。

在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。

在另一优选例中，所述是检测包括在给予伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼之前、之中、或之后进行检测。

本发明的第五方面，提供了一种肿瘤患者伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性的检测方法，所述方法包括步骤：用如本发明第一方面所述的方法进行基因耐药突变位点检测；和

若检测结果为阳性，则判定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼敏感；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRα T674I。

在另一优选例中，所述的肿瘤为慢性粒细胞白血病。

在另一优选例中，所述的肿瘤患者伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性为伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发性耐药。

本发明的第六方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，包括步骤：

(a)用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；

(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象再次进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRα T674I。

在另一优选例中，在步骤(b)中还包括：记录首次检测到ABL T315I，或PDGFRα T674I突变阳性的时间。

在另一优选例中，所述的治疗周期为3-6周。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果显示。图中蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中图1A显示了PDGFRα(T674I)突变阳性的检测结果，图(1B)显示了ABL(T315I)突变阳性的检测结果，图(1C)显示了PDGFRα(T674I)突变阴性的检测结果，图1D显示了ABL(T315I)突变阴性的检测结果。

图2是ddPCR仪微滴数目结果显示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了PDGFRα(T674I)突变阳性的检测结果，图2B显示了ABL(T315I)突变阳性的检测结果，图2C显示了PDGFRα(T674I)突变阴性的检测结果，图2D显示了ABL(T315I)突变阴性的检测结果。

图3为实施例中的血浆游离DNA跑胶图。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，通过对于大量方法和试剂的筛选，意外地发现，通过改进的血浆样本制备和添加特定的富集剂(如RNA carrier)，并结合微滴式数字PCR技术和高特异性的引物序列和探针序列，居然可以用外周血浆样本高效地提取到的肿瘤相关性的DNA分子，从而高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中ABL基因T315I，或PDGFRα基因T674I突变，从而可辅助判断患者是否对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生耐药。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“肿瘤相关突变”指与肿瘤的发生、进展、治疗、和/或预后相关的基因突变，尤其是与肿瘤治疗的耐药性相关的DNA突变。

如本文所用，术语“本发明突变”、“本发明的耐药性突变”可互换使用，指ABL和PDGFRα基因突变，即ABL蛋白的T315I突变(在蛋白质水平，ABL蛋白第315号氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I))以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变(基因水平)，或PDGFRα蛋白的T674I突变(在蛋白质水平，PDGFRα蛋白第674号氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I))以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变(基因水平)。研究表明，通过检测上述两种突变位点的突变情况，对于肿瘤患者是否采用或继续采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗，有指导作用；优选地，在本发明中，当上述两个突变位点均为阴性时，表示患者未对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生耐药；当上述两个突变位点中的一个或两个为阳性时，表示患者已对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生耐药。

如本文所用，术语“非肿瘤组织”指与肿瘤组织不同的组织。在本发明中，对于实体瘤而言，血液和血浆可视为“非肿瘤组织”。

如本文所用，术语“RNA Carrier”为一种市售的、用于协助分离RNA的试剂。其成分为ployG偶联到DNAmate一种高分子化合物。研究表明，RNACarrier能特异吸附低浓度RNA，并且有助于减少提取过程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier对于常规双链DNA的提取无促进作用。

本发明的目的是提供一种利用ddPCR技术检测血浆中基因位点突变从而监测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法。

本发明的另一个目的是实时监控服药靶向药物后ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变的突变率，确保在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变。

本发明的最终目的是通过ddPCR技术，定期检测患者血浆中ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变的突变情况，以此来判定患者是否已产生继发性耐药，有效的指导患者进行下一步的治疗。

外周血样本中提取DNA模板

由于外周血样本中可用于有效检测肿瘤相关性的DNA的量非常少，因此需通过一定的富集手段对外周血游离DNA进行富集，以得到能够用于检测量的DNA。

本发明中，优选的DNA的抽提方法如下：

(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。

在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

完成上述抽提后，所得到的的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量通常为20-100ng/微升，所述含洗脱DNA的洗脱液的体积通常为20-100微升。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的平均大小通常为≤313bp(即基本由游离DNA组成)，较佳地为100-250bp，更佳地为150-200bp。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。

在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。

在另一优选例中，所述的洗脱为AVE洗脱，优选为干燥后直接用AVE洗脱。

在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。

慢性粒细胞白血病相关基因耐药突变位点的检测

数字PCR(digital PCR，dPCR)技术被称为“第三代PCR”技术，是一项检测和定量核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计数，以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统(droplet digitalPCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目，特别适合拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。

在本发明中，优选的DNA模板是用外周血分离的血浆提取的，较佳地，在提取DNA模板前，将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆。

优选的本发明实施例中，DNA模板的提取方法如下：

(i)抽提血浆中的游离DNA；

(ii)对样本进行裂解、富集、过柱洗脱和AVE洗脱，得到待扩增的DNA模板；

任选地，所述方法还包括步骤：(iii)测试所述DNA模板的片段大小。

本申请的PCR方法中，所使用的引物对为包含ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点的特异引物。在本发明的一个优选实施例中，当待检测的位点为ABL基因T315I时，所述的特异引物具有如SEQ ID NO:3，GAGCCCCCGTTCTATATC和SEQ ID NO:4，TGAGTGGCCATGTACAGC所示的序列，或具有如SEQ ID NO:7，TTGTTGGCAGGGGTCT和SEQ ID NO:8，TTGCACTCCCTCAGGTAGT所示的序列。

在本发明的另一个优选实施例中，当待检测的位点为PDGFRα基因T674I时，所述的特异引物具有如SEQ ID NO:11，ATCTCCTAACGGCTTTTG和SEQID NO:12，CAGGAAGCTATCCCTATTCT所示的序列，或具有如SEQ ID NO:15，CGGCTTTTGTCCCCATA和SEQ ID NO:16，GCTCAGGAAGCTATCCCTA所示的序列。

本申请的PCR方法中，还包括使用一条或多条用于检测突变型的突变型特异探针，和一条或多条用于检测野生型的野生型特异探针。优选地，突变型探针类型为FAM探针，而野生型探针类型为HEX探针，反之亦可。在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1(Probe-FAM:CATCATTGAGTTCATGACCTACGGG)或SEQ ID NO:5(Probe-FAM:GCCCCCGTTCTATATCATCATTGAG)所示；所述的野生型探针的序列如SEQID NO:2(Probe-HEX:CATCACTGAGTTCATGACCTACGGG)或SEQ ID NO:6(Probe-HEX:GCCCCCGTTCTATATCATCACTGAG)所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9(Probe-FAM:GGCCCCATTTACATCATCATAGAGT)或SEQ ID NO:13(Probe-FAM:TAGGCCCCATTTACATCATCATAGA)所示；所述的野生型探针的序列如SEQID NO:10(Probe-HEX:GGCCCCATTTACATCATCACAGAGT)或SEQ ID NO:14(Probe-HEX:TAGGCCCCATTTACATCATCACAGA)所示。

在本发明的一个优选例中，所述的微滴式数字PCR的反应液首先通过QX100微滴发生器生成纳升级别的油包水的液滴，然后再进行PCR反应，最后将PCR板转移到QX100微滴分析仪对所有样品孔进行荧光检测。

在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应所使用的反应体系每20μl组成如下：待测肿瘤组织DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I的特异引物及探针各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应的反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

本发明的一个优选实施例中，检测ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果如图1所示，图中，蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中，图1A显示了PDGFRα T674I突变阳性的检测结果，图1B显示了ABL T315I突变阳性的检测结果，图1C显示了PDGFRα T674I突变阴性的检测结果，图1D显示了ABL T315I突变阴性的检测结果。

本发明的一个优选实施例中的ddPCR仪微滴数目检测结果如图2所显示。图中，深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了PDGFRα T674I突变阳性的检测结果，图2B显示了ABL T315I突变阳性的检测结果；图2C显示了PDGFRα T674I突变阴性的检测结果，图2D显示了ABL T315I突变阴性的检测结果。

伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性判断

检测病人伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性相关基因位点是否突变成为实时监测能否持续使用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的必要前提条件。

由于ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变阳性与患者(优选为慢性粒细胞白血病患者)伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性相关，因此，本发明的检测方法可以用于辅助判断患者是否对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生耐药。

数字PCR(digital PCR，dPCR)检测技术灵敏度(可达0.001％)，远高于目前基于ARMS的检测技术或基于高分辨率溶解曲线HRM的检测技术，非常适合在体液中检测含量极低的肿瘤游离DNA。

微滴式数字PCR系统(droplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，最后通过泊松分布概率密度函数计算，无需做到每个微滴内不含靶分子或仅含1个靶分子也能实现准确定量。由于数字PCR降低了对反应扩增效率的要求，采取终点法判读的方法，因此特别适合检测稀有突变、拷贝数变异和基因相对表达等方面的检测。本申请利用ddPCR技术检测接受伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗的慢性粒细胞白血病患者外周血浆中ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点的突变情况，根据检测结果判定患者是否对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药，并推测患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生继发耐药的时间，为调整慢性粒细胞白血病患者治疗方案提供指导。

在本发明的优选实施例中，取患者外周血样本并提取基因组DNA，以待测外周血浆基因组DNA为模板，利用上述方法对ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点进行检测，然后根据检测到ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点突变阳性的时间确定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼产生耐药的时间。

由于本发明方法可以采用较易采样的外周血样本进行检测，因此，所述的检测可以多次进行，从而在患者的治疗过程中实时监控。

本发明方法既可以在用药前对患者的耐药性进行判断，也可以在用药过程中或之后判断患者是否已经产生耐药性，从而为后续治疗提供指导。在本发明的优选实施例中，所述的慢性粒细胞白血病患者可以是尚未使用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗的慢性粒细胞白血病患者，也可以是已经开始使用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗的患者。

在本发明的一个优选例中，在每个治疗周期前后，取慢性粒细胞白血病患者外周血样本，分离血浆并提取基因组DNA，以待测外周血浆基因组DNA为模板，利用ddPCR技术对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性相关位点(ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I)进行检测，然后根据检测到ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点突变的阳性或阴性，确定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼是否产生耐药。

具体地，所述的判断检测方法如下：

提取慢性粒细胞白血病患者外周血浆基因组DNA；

以待测外周血浆基因组DNA为模板，用ABL T315I或PDGFRα T674I的特异探针进行ddPCR扩增；

根据ddPCR对目的基因位点突变情况的检测结果，分析患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的耐药情况；

根据患者出现ABL T315I或PDGFRα T674I突变阳性或阴性，确定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼是否产生耐药。

在本发明的一个优选实施例中，利用ddPCR技术通过检测外周血浆中基因突变以监控慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药的方法包括如下步骤：

(1)提取慢性粒细胞白血病患者外周血浆基因组DNA。

(2)配制反应体系：

a.探针及引物设计：本发明采用常规的Taqman探针法进行设计，对ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点分别设计了野生型和突变型的探针，FAM荧光通道标记突变型，HEX荧光通道标记野生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。

b.20μl PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点野生型和突变型的探针引物(已混合配制好)各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

(3)制备微滴：

在DG8^TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。

(4)PCR扩增：

将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

(5)微滴检测：

PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-Rad LaboratoriesUSA)上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。

(6)结果分析：

实验中检测ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点，分别有1对共用的PCR扩增引物和2对分别标记野生型和突变型的荧光探针。在野生型片段有扩增(在HEX荧光信号区域有微滴分布)的前提下存在突变型片段的扩增(在FAM荧光信号区域有微滴分布)，则判断该基因有突变；反之则无。

检测结果ABL基因T315I和PDGFRα基因T674I突变阴性，则患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼敏感；ABL基因T315I或PDGFRα基因T674I突变位点突变阳性，则患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

(1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度(0.001％)(即可以从10万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，仅需使用100ng的DNA模板即可完成检测。

(2)本发明的检测方法仅需使用检测对象的外周血浆游离DNA即可完成检测，无需采集肿瘤组织进行检测，操作简便，无创，可重复进行。

(3)使用本发明方法，可以准确地检测出慢性粒细胞白血病耐药性相关突变，且仅需使用外周血样本即可完成检测。

(4)本发明方法可以用于在患者用药治疗的过程中，定期从患者的血浆中抽提DNA以检测血浆中游离DNA突变，从而在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变，可作为后续治疗的辅助判断手段。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法 血浆样本中游离DNA的提取

血浆分离方法如下：

将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆。

提取DNA的过程如下：

a、裂解

加入Proteinase K，使其终浓度为2mg/1ml血浆，在60℃的条件下裂解去除蛋白质从而将游离DNA释放出来。与此同时，加入ACL(carrier RNA)试剂，使DNase和RNase失活，并使得游离核酸完全从结合的蛋白上释放出来。

b、过柱纯化

在裂解好的血浆中加入ACB溶液(QIAGEN公司)，使其终浓度为1.8ml/1ml血浆，冰浴5min后，用硅胶柱进行过柱纯化。

c、洗脱

过柱之后，加入相应的洗脱液对柱子进行洗涤，最后加入无水乙醇沉淀DNA分子。

d、溶解

在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE进行溶解，室温放置一段时间后,进行离心处理，得到纯化的基因组DNA。

e、对提取得到的血浆游离DNA进行质检，首先用Nanodrop检测其浓度，正常情况下2ml血浆可抽提出30～50ng/ul的血浆游离DNA。之后通过Agilentbioanalysis 2100检测其片段大小，以确定其为血浆游离DNA(<300bp)。图3为Agilent bioanalysis 2100质检图，横坐标为Marker大小(其中35bp和≈10000bp峰为外加标记物)，纵坐标为峰值强度，抽提得到的血浆游离DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。

各实施例中，所使用的引物对与探针序列如下所示：

ABL(T315I)

Probe-FAM:CATCATTGAGTTCATGACCTACGGG

Probe-HEX:CATCACTGAGTTCATGACCTACGGG

F:GAGCCCCCGTTCTATATC

R:TGAGTGGCCATGTACAGC

PDGFRα(T674I)

Probe-FAM:GGCCCCATTTACATCATCATAGAGT

Probe-HEX:GGCCCCATTTACATCATCACAGAGT

F:ATCTCCTAACGGCTTTTG

R:CAGGAAGCTATCCCTATTCT

实施例1 通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和PDGFRα基因突变从而监测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药

(1)某慢性粒细胞白血病患者开始进行伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗前，抽取患者外周血4mL，分离得到血浆，利用“QIAamp Circulating Nucleic AcidKit”对血浆中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗脱以及最后AVE洗脱获得高浓度/高纯度的DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大小(<313bp)，以保证抽提质量。

(2)反应体系配制

a.探针及引物设计：本发明采用常规的Taqman探针法进行设计，对ABL基因和PDGFRα基因目的片段分别设计了野生型和突变型的探针，FAM荧光通道标记突变型，HEX荧光通道标记野生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。

b.20μl PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，ABL基因T315I位点野生型和突变型的探针引物和PDGFR α基因T674I位点野生型和突变型的探针和引物(已混合配制好)各2μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

(3)制备微滴

在DG8^TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。

(4)PCR扩增

将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

(5)微滴检测

PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-Rad LaboratoriesUSA)上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。

(6)结果分析

检测结果如下表所述：

根据以上数据分析发现，该样本的PDGFRα(T674I)和ABL(T315I)未发生突变，提示患者目前尚未产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期(每3-6周)进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，及时指导患者进一步的用药治疗。

图1C、D和图2C、D为实施例1的检测结果图，图1C和图2C均显示PDGFRα(T674I)基因在检测出野生型的背景下未检测出突变型，说明检测结果为突变阴性。图1D和图2D均显示ABL(T315I)基因在检测出野生型的背景下未检测出突变型，说明检测结果为突变阴性。

根据以上数据分析发现，该样本的PDGFRα(T674I)和ABL(T315I)未发生突变，提示患者目前尚未产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期(每3-6周)进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，及时指导患者进一步的用药治疗。

实施例2 通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和PDGFRα基因突变从而监测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药

(1)实施例1的患者经过开始进行伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗6个月后，用如实施例1相同的方法采集其外周血，分离血浆，提取基因组DNA并进行PCR扩增。检测结果如下表所述：

根据以上数据分析发现，该样本的PDGFRα(T674I)和ABL(T315I)未发生突变，提示患者目前尚未产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期(每3-6周)进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，及时指导患者进一步的用药治疗。

实施例3 通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和PDGFRα基因突变从而监测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药

(1)实施例1的患者经过开始进行伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗12个月后，用如实施例1相同的方法采集其外周血，分离血浆，提取基因组DNA并进行PCR扩增。

(2)结果分析：

图1A、B和图2A、B为实施例3的检测结果图。图1(A)和图2(A)中，PDGFRα(T674I)均检测出了突变型和野生型。图1(B)和图2(B)中，ABL(T315I)均检测出了突变型和野生型，说明PDGFRα(T674I)和ABL(T315I)均出现突变阳性。

检测结果如下表所述：

根据以上数据分析发现，该样本的PDGFR α(T674I)基因发生了突变，突变率为2.76％，ABL(T315I)基因发生了突变，突变率为6.11％，由于该位点突变易产生对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的继发性耐药，因此提示患者可能产生伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发性耐药，应及时更换治疗方案。

根据以上数据分析发现，该慢性粒细胞白血病患者外周血浆游离DNA中ABL(T315I)或PDGFRα(T674I)突变阳性，患者已出现伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药。产生耐药的时间是在开始伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗第6个月到12个月之间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；

(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或PDGFRα基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于慢性粒细胞白血病患者。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：

(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

5.一种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法，

其中，所述的突变位点包括ABL T315I，或PDGFRαT674I。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。

7.一种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法；

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；

其中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示，或所述引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；

或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示，且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRαT674I。

8.一种如权利要求5或7所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗的试剂盒。

9.一种肿瘤患者伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药性的检测方法，其特征在于，包括步骤：用如权利要求1-4任一所述的方法进行基因耐药突变位点检测；和

若检测结果为阳性，则判定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼敏感；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRαT674I。

10.一种肿瘤患者治疗方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用如权利要求1所述的方法，对所述对象进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；

(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如权利要求1所述的方法，对所述对象再次进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼进行治疗；

且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或PDGFRαT674I。