CN113913547A - 一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒。本发明方法基于特异性引物和探针，通过定量数字PCR技术检测烟曲霉唑类耐药基因cyp51a基因的启动子区域的特征性重复序列，以鉴别出烟曲霉唑类耐药株。本发明试剂盒包括反应液以及芯片；反应液配制为：10uL2.0dPCRMix，1uL特异性引物F，1uL特异性引物R，0.5uL探针PB1，05uL探针PB2，2uLDNA样本，无菌水定量至201uL；将设定体积反应液均匀分散至芯片中，该芯片在扩增仪中按程序扩增；该扩增程序为：95℃10min循环1次，95℃、15S、54℃、40s循环45次，20℃退火；扩增后的芯片在芯片阅读仪中进行阅读分析，以判断扩增结果是否为阳性。本发明对烟曲霉唑类药物耐药性的检测准确率高，而且还可以检出其耐药机制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒。
背景技术
循证医学证据表明，早期确诊和及时治疗是控制曲霉侵袭性感染的关键，早期诊断和治疗对疾病的预后具有极大益处。为开展及时迅速的治疗，对烟曲霉药物敏感性的检测成为临床干预的一个关键。然而，传统的耐药检查具有速度慢、耗时长以及专业技术要求复杂等缺点，很难满足实际临床需求，也无法在基层医院开展。
耐药性分子诊断依赖关键耐药相关基因的多样性(突变)检测，使用实时PCR和测序等技术直接对病原体基因组实现检测，具有快速敏感准确等优点，目前已经在乙型肝炎和艾滋病等病毒性感染症的药物治疗中取得了广泛的应用。在乙型肝炎上，针对一线抗病毒药物拉米夫定的rtM204V/I(YMDD变异)耐药基因型的检测已经非常成熟，并有荧光定量PCR诊断试剂盒上市；此外，阿德福韦酯耐药突变rtA181V+rtN236T突变在临床上的研究也比较充分。在艾滋病耐药检测中，由于一线治疗药物比较多，因此耐药基因多样性情况更为复杂。虽然理论上艾滋病耐药同样存在表型检测和基因型检测两种方法，但因操作复杂性和技术要求及耗时，临床上仍然以基因型检测为手段。由于艾滋病耐药涉及的常用药物包括齐多夫定、拉米夫定等六种，且每种药物均已发现多个耐药突变位点，故临床上多采用巢式PCR结合产物直接测序的方法进行分析，并在此基础上发展出一套较为成熟的耐药性突变计分方法，对临床治疗具有很好的指导作用。
国际学界虽然已经有一些针对曲霉的唑类耐药性研究，但是基本停留在基础研究和流行病学调查上。针对耐药性进行检测的技术研发仍非常初步，仍未有成熟的检测试剂盒和耐药检测技术临床指南及计分方法。考虑到最近20年曲霉(尤其是烟曲霉)感染中针对唑类药物的耐药发展非常迅速，临床上非常需要快速准确及时地检测耐药菌株，以采取针对性的治疗。
传统检测方法为真菌培养，在烟曲霉真菌培养过程中分别加入三种主要唑类药物(伊曲康唑，泊沙康唑，伏立康唑)，观察培养结果以鉴别烟曲霉耐药性，该方法虽然具有准确性好的特点，但是缺点是速度慢、技术复杂，需要专业人员操作。
为了更快速更准确的检测烟曲霉临床株唑类耐药突变，本发明在多次实验和比较的基础上决定使用定量数字PCR技术，研制检测试剂盒。定量数字PCR技术被称为第三代PCR技术，是一种全新的核酸分子绝对定量技术。它的原理是将样本分甑到大里的微小反应单元中，每个反应单元包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，然后将这些微反应单元进行PCR扩增，扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算出原始样本中目标基因的浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒，旨在传统真菌培养检测方法所存在的速度慢、技术复杂等问题。
本发明是这样实现的，一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法，该方法基于特异性引物和探针，通过定量数字PCR技术检测烟曲霉唑类耐药基因cyp51a基因的启动子区域的特征性重复序列，以鉴别出烟曲霉唑类耐药株。
优选地，所述特异性引物为：
特异性引物F:5’-GCAGCACCACTTCAGAGTTGTC-3’；
特异性引物R:5’-GTATGGTATGCTGGAACTACACC-3’；
所述探针为：
探针PB1:FAM-CTGAGCCGAATGAATCACGCGGTC-BHQ1；
探针PB2：VIC-CCGAATGAAAGTTGCCTAATTAC-BHQ1。
优选地，所述定量数字PCR技术具体为：将设定体积反应液均匀分散至芯片中，该芯片在扩增仪中按程序扩增；其中，该扩增程序为：95℃10min循环1次，95℃、15S、54℃、40s循环45次，20℃退火；扩增后的芯片在芯片阅读仪中进行阅读分析，以判断扩增结果是否为阳性；其中，
所述反应液配制为：10uL 2.0dPCR Mix，1uL特异性引物F，1uL特异性引物R，0.5uL探针PB1，05uL探针PB2，2uL DNA样本，无菌水定量至201uL。
本发明进一步公开了一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的试剂盒，该试剂盒包括反应液以及芯片；其中，
所述反应液配制为：10uL 2.0dPCR Mix，1uL特异性引物F，1uL特异性引物R，0.5uL探针PB1，05uL探针PB2，2uL DNA样本，无菌水定量至201uL；
将设定体积反应液均匀分散至芯片中，该芯片在扩增仪中按程序扩增；其中，该扩增程序为：95℃10min循环1次，95℃、15S、54℃、40s循环45次，20℃退火；扩增后的芯片在芯片阅读仪中进行阅读分析，以判断扩增结果是否为阳性。
优选地，所述特异性引物为：
特异性引物F:5’-GCAGCACCACTTCAGAGTTGTC-3’；
特异性引物R:5’-GTATGGTATGCTGGAACTACACC-3’。
优选地，所述探针为：
探针PB1:FAM-CTGAGCCGAATGAATCACGCGGTC-BHQ1；
探针PB2：VIC-CCGAATGAAAGTTGCCTAATTAC-BHQ1。
本发明克服现有技术的不足，提供一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒。本发明基于特异性引物和探针，使用定量数字PCR技术，检测烟曲霉唑类耐药基因cyp51a基因的启动子区域的特征性重复序列，从而鉴别发现烟曲霉唑类耐药株。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明对烟曲霉唑类药物耐药性的检测准确率高，可以发现临床90％的烟曲霉唑类耐药突变；
(2)本发明以本技术领域人员所熟知的数字PCR或者定量PCR技术为基础，只要熟悉实验室检验技术人员均可以操作，操作更加简单方便快捷，相比于常规检测方法所需的7～9天的耐药培养检测周期而言，本发明将耐药检测时间缩短到了3小时内；
(3)本发明不仅能检出唑类耐药，而且可以检出耐药机制(即基因型)。
附图说明
图1是定量数字PCR扩增点状图；
图2是标本2327号非耐药菌数字PCR检测结果；
图3是标本2357号耐药菌数字PCR检测结果；
图4是标本2359号非耐药菌数字PCR检测结果；
图5是标本2360号耐药菌数字PCR检测结果；
图6是标本2370号非耐药菌数字PCR检测结果；
图7是标本2391号耐药菌数字PCR检测结果；
图8是标本2419号耐药菌数字PCR检测结果；
图9是标本2500号耐药菌数字PCR检测结果；
图10是标本2512号耐药菌数字PCR检测结果；
图11是标本4134号耐药菌数字PCR检测结果；
图12是标本4136号非耐药菌数字PCR检测结果；
图13是标本4138号非耐药菌数字PCR检测结果；
图14是qPCR扩增曲线图(仪器为宏石SLAN96)；
图15是定量PCR结果的Ct值总结图；其中，Ct值小于等于30为阳性结果，Ct值大于30或NoCt(Ct值未测得)为阴性结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
数字PCR技术被称为第三代PCR技术，是一种全新的核酸分子绝对定量技术，它的原理是将样本分配到大量的微小反应单元中，每个反应单元包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子；然后将这些微反应单元进行PCR扩增；扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算出原始样本中目标基因的浓度。
一、材料、试剂与仪器
1、主要材料与试剂
| 试剂/耗材 | 生产商 | 编号 |
| DigitalPCRChip | 臻准生物科技(上海)有限公司 | CICH200A |
| MasterMix | 臻准生物科技(上海)有限公司 | LSCK200A |
| RNA-freewater | 捷瑞生物 | |
| 引物探针 | 南京光之森生物科技有限公司 | |
| DNA样本 | 南京光之森生物科技有限公司 |
2、主要仪器、耗材
3、样品信息
| 实验编号 | 样本处理 |
| 2327 | 原样稀释100倍 |
| 2357 | 原样稀释100倍 |
| 2359 | 原样稀释100倍 |
| 2360 | 原样稀释100倍 |
| 2370 | 原样稀释10倍 |
| 2391 | 原样稀释100倍 |
| 2419 | 原样稀释100倍 |
| 2500 | 原样稀释100倍 |
| 2512 | 原样稀释100倍 |
| 4134 | 原样稀释100倍 |
| 4136 | 原样稀释100倍 |
| 4138 | 原样稀释100 |
二、实验步骤
1、烟曲霉培养及鉴定
将阳性标本转种于沙氏葡萄糖琼脂培养基,置于25℃温箱培养。根据菌落的颜色、形态、生长速度以及显微镜下特点进行菌种初步鉴定。然后通过B-tubulin测序确认为烟曲霉。
2、烟曲霉药敏试验
参照美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)M38-A2标准，采用微量液基稀释法对菌株进行伊曲康唑和伏立康唑的药物敏感性测试，筛选出耐药株后再测定该菌对泊沙康唑的敏感性。药敏板放置在37℃培养48小时后观察结果。最小抑菌浓度(MIC)定义为肉眼直接观察到的无真菌生长的最低药物浓度。质控菌株为AF293。
由于CLSI的M38-A2中尚未制定曲霉属药物敏感性的判读折点，判断耐药标准为ITZ>2mg/L；VRC>2mg/L；PosA>0.25mg/L。
3、定量数字PCR
(1)引物
特异引物F:5’-GCAGCACCACTTCAGAGTTGTC-3’；
特异引物R:5’-GTATGGTATGCTGGAACTACACC-3’；
探针PB1:FAM-CTGAGCCGAATGAATCACGCGGTC-BHQ1；
探针PB2：VIC-CCGAATGAAAGTTGCCTAATTAC-BHQ1；
4、反应体系配置
cd-PCR&q-PCR反应体系配制
| 反应成分 | 体积(uL) |
| 2.0dPCRMix/qPCRMix | 10 |
| F | 1 |
| R | 1 |
| PB1 | 0.5 |
| PB2 | 0.5 |
| DNA样本 | 2 |
| H<sub>2</sub>O | 5 |
| 总体积 | 20 |
5、微滴制备使用臻准生物数字PCR系统中的全自动上样仪AccuONE-L100将15uLPCR反应液均匀分散至芯片中。
6、扩增
将芯片放置于扩增仪中，按以下程序进行扩增：
7、芯片阅读
将扩增后的芯片放置于臻准生物AccuONE-R200芯片阅读仪中，进行芯片阅读分析。
三、实验结果
1、数字PCR扩增点状图，如图1所示。
2、数字PCR拷贝数结果
将扩增后的芯片放置于AccuONE-R200芯片阅读仪中，进行芯片阅读分析，结果如下表所示：
3、芯片详细结果
如图2～13、图14以及图15所示。图2中，FAM耐药突变检测信号阴性(单线和单峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2327号为非耐药烟曲霉。图3中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2357号为唑类耐药烟曲霉。图4中，FAM耐药突变检测信号阴性(单线和单峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本232759号为非耐药烟曲霉。图5中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2360号为唑类耐药烟曲霉。图6中，FAM耐药突变检测信号阴性(单线和单峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2370号为非耐药烟曲霉。图7中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2391号为唑类耐药烟曲霉。图8中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2419号为唑类耐药烟曲霉。图9中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2500号为唑类耐药烟曲霉。图10中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本2512号为唑类耐药烟曲霉。图11中，FAM耐药突变检测信号样，阳性(双线和双峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本4134号为唑类耐药烟曲霉。图12中，FAM耐药突变检测信号阴性(单线和单峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本4136号为非耐药烟曲霉。图13中，FAM耐药突变检测信号阴性(单线和单峰)，VIC烟曲霉菌种内参检测信号阳性(双线和双峰)，判读结果标本4138号为非耐药烟曲霉。图14中，所有标本内参探针检测信号均为阳性(中间的浅色曲线，曲线起峰)；而耐药菌标本的耐药突变探针检测信号均为阳性(上方的深色曲线，曲线起峰)，同时，非耐药菌标本的耐药突变探针检测信号均为阴性(下方的深色曲线，曲线不起峰)。图15中，深灰色为FAM通道是突变探针的检测通道，检测是否存在唑类耐药突变。浅灰色为VIC通道，是菌种内参探针的检测通道，检测是否成功采集到了曲霉菌。
4、结论
由上述数字PCR拷贝数结果可以看出，烟曲霉耐药株2357、2360、2391、2419、2500、2512、4134表现为阳性，其他为阴性。从荧光PCR与定量数字PCR结果看，二者结果完全一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 刘沐桑
郑楠
<120> 一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcaccac ttcagagttg tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtatggtatg ctggaactac acc 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgagccgaa tgaatcacgc ggtc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgaatgaaa gttgcctaat tac 23
Claims (6)
1.一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法，其特征在于，该方法基于特异性引物和探针，通过定量数字PCR技术检测烟曲霉唑类耐药基因cyp51a基因的启动子区域的特征性重复序列，以鉴别出烟曲霉唑类耐药株。
2.如权利要求1所述的快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法，其特征在于，所述特异性引物为：
特异性引物F:5’-GCAGCACCACTTCAGAGTTGTC-3’；
特异性引物R:5’-GTATGGTATGCTGGAACTACACC-3’；
所述探针为：
探针PB1:FAM-CTGAGCCGAATGAATCACGCGGTC-BHQ1；
探针PB2：VIC-CCGAATGAAAGTTGCCTAATTAC-BHQ1。
3.如权利要求1所述的快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的方法，其特征在于，所述定量数字PCR技术具体为：将设定体积反应液均匀分散至芯片中，该芯片在扩增仪中按程序扩增；其中，该扩增程序为：95℃10min循环1次，95℃、15S、54℃、40s循环45次，20℃退火；扩增后的芯片在芯片阅读仪中进行阅读分析，以判断扩增结果是否为阳性；其中，
所述反应液配制为：10uL 2.0dPCR Mix，1uL特异性引物F，1uL特异性引物R，0.5uL探针PB1，05uL探针PB2，2uL DNA样本，无菌水定量至201uL。
4.一种快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括反应液以及芯片；其中，
所述反应液配制为：10uL 2.0dPCR Mix，1uL特异性引物F，1uL特异性引物R，0.5uL探针PB1，05uL探针PB2，2uL DNA样本，无菌水定量至201uL；
将设定体积反应液均匀分散至芯片中，该芯片在扩增仪中按程序扩增；其中，该扩增程序为：95℃10min循环1次，95℃、15S、54℃、40s循环45次，20℃退火；扩增后的芯片在芯片阅读仪中进行阅读分析，以判断扩增结果是否为阳性。
5.如权利要求4所述的快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为：
特异性引物F:5’-GCAGCACCACTTCAGAGTTGTC-3’；
特异性引物R:5’-GTATGGTATGCTGGAACTACACC-3’。
6.权利要求4所述的快速检测烟曲霉唑类药物耐药性的试剂盒，其特征在于，所述探针为：
探针PB1:FAM-CTGAGCCGAATGAATCACGCGGTC-BHQ1；
探针PB2：VIC-CCGAATGAAAGTTGCCTAATTAC-BHQ1。
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