CN110923298A

CN110923298A - 用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110923298A
Application number: CN201911371391.7A
Authority: CN
Inventors: 朱留伟; 董德坤; 夏江
Original assignee: Pilot Gene Technology (hangzhou) Co Ltd
Current assignee: Pilot Gene Technology (hangzhou) Co Ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110923298B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法。首先，本发明公开了一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物系统的试剂盒，以及使用该引物系统或试剂盒进行耐药基因检测的方法。本发明公开的试剂盒支持高通量、快速、准确及超高灵敏度地检测6个细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。

Description

用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法。

背景技术

全国细菌耐药监测网的统计显示，在耐药细菌中，革兰氏阴性菌占70％左右，其中以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为多，且多重耐药情况严重；革兰氏阳性菌占30％左右，其中，葡萄球菌属占到2/3，而金黄色葡萄球菌几乎占葡萄球菌属的一半，肠球菌属占革兰氏阳性菌的1/4左右，并以粪肠球菌和屎肠球菌为主。细菌耐药性(Antimicrobial Resistance))又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性，当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。

近几十年来，随着感染性疾病的增多，伴随广谱抗生素的广泛或不合理使用，细菌的耐药情况变得日益严重，甚至产生细菌的多重耐药。感染性疾病难以控制、易复发、术后感染率高、昂贵抗菌药物使用量增加等后果日益凸显。因此对这些病原菌快速检测确定其耐药性，不仅在指导临床合理选用抗菌药有重要价值，也为预防和控制耐药细菌感染和传播提供依据，为耐药疫情监控和监测检验提供了可靠的技术手段，具有重要的现实意义。

传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，需要先从标本中培养分离到病原菌，然后测定细菌的药物敏感性，基本以表型检测为主。其测定过程复杂，耗时长。目前，临床上也有应用全自动微生物鉴定及药敏分析系统来做耐药检测，但同样需要经历培养、分离提纯、鉴定三个步骤，最顺利的情况也需要72小时才能提供药敏结果，且难以对自身生长缓慢、生长条件苛刻的细菌进行检测。此外，血清免疫学方法也可用于细菌的耐药性检测，但其假阳性率和假阴性率高，重复性差，效能也不高。鉴于临床治疗的需要，医生往往先根据流行病学资料、临床症状、体征及影像学特征等，估计可能的病原体及药敏情况，经验性应用覆盖可能病原体的抗菌药物或者相对广谱的抗菌药物，待培养结果出来后，再对抗菌药物进行调整。综上所述，上述检测方法需要时间长，方法操作烦琐、报告结果慢、通量低，且往往先鉴定出菌种，才能相应的进行药敏等后续试验，严重限制了临床医师为患者及时有效地选择敏感抗菌药物，尤其不利于重症感染性疾病的及时治疗，而且很可能存在抗生素滥用的问题，助长了耐药菌的产生。因此开发快速高通量的分子诊断技术检测，协助快速诊断的方法，指导及时准确用药是必需和紧迫的。

近年来PCR已经成为细菌耐药基因检测的常见方法，广泛应用于耐药基因的检测，弥补了药敏试验的不足，而常规PCR技术或qPCR检测技术往往只限制于单一耐药基因的的检测，要对细菌众多的耐药基因进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。

数字PCR技术是在qPCR技术上发展起来的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏度最高的核酸检测技术。利用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用，可以同时对多个目标片段进行检测。本专利发明了一种利用多色多重数字PCR平台同时检测多种耐药基因的试剂盒与方法。

发明内容

本发明提供的试剂盒可以在单一反应中高通量、快速、准确及超高灵敏度地检测6个细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括：

用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、SEQ IDN0：2和SEQ ID N0：3所示；

用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、SEQ IDN0：5和SEQ ID N0：6所示；

用于检测vanA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7、SEQ IDN0：8和SEQ ID N0：9所示；

用于检测vanB基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：10、SEQ IDN0：11和SEQ ID N0：12所示；

用于检测vanM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13、SEQ IDN0：14和SEQ ID N0：15所示；

用于检测OXA-48-like基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：16、SEQ ID N0：17和SEQ ID N0：18所示；

用于检测blaNDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：19、SEQ IDN0：20和SEQ ID N0：21所示；

用于检测mcr-1基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：22、SEQ IDN0：23和SEQ ID N0：24所示。

应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。

其中，blaKPC基因为碳青霉烯酶基因；mecA基因为耐甲氧西林葡萄球菌携带的耐药基因；van基因为万古霉素耐药基因型，van A/B/M为其中的3种基因；OXA型基因为碳青酶烯酶基因型，OXA-48-like为其中的一种基因；blaNDM基因为肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药基因；mcr-1基因为多黏菌素耐药基因。

本发明第二个方面公开了上述的引物探针系统制备的用于同时检测多种耐药基因的产品。

进一步的，所述产品为试剂盒。

更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。

本发明还公开了一种同时检测多种耐药基因的方法，所述方法使用上述的引物系统或上述的产品进行检测。

进一步的，基于多重数字PCR平台进行检测。

术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。

进一步的，上述方法包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)配置数字PCR反应液；

(3)制备液滴芯片；

(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。

需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不限于如上描述的方案。

进一步的，检测样品为阳性细菌培养物或感染患者血浆样品。通过常规试剂盒提取临床样品血浆中的游离核酸，并用液滴数字PCR系统进行检测。

进一步的，所述扩增程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15秒，60℃退火60秒，循环40次。

本发明还公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床领域中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

1.本发明试剂盒除了适用于细菌培养物的常规多重耐药基因检测外，还可以无需培养直接检测感染患者血浆中的可培养菌或不可培养细菌的耐药基因。

2.本发明试剂盒利用多色多重的液滴数字PCR平台，通过合理的引物探针对组合设计与优化，实现单一反应体系中检测多个目标耐药基因。

3.本发明试剂盒可对超微量核酸样本实现定量检测功能，检测灵敏度可低至10拷贝以下，通过试剂盒中添加质控，极大地降低临床样本的假阴性结果出现。

4.该发明试剂盒在数字PCR平台既可以对多种耐药基因的定量检测，又可以通过定量检测实现病原菌耐药基因的动态监控功能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例首先采用QAIGEN-55114试剂盒提取血浆等临床样品游离核酸，接着用液滴多色数字PCR系统检测样品游离核酸中致病菌的耐药基因及其拷贝数。

一、实验材料：

1、样本要求：离心后分离的血浆(24h内使用的样本4℃保存，1个月内使用的样本-20℃保存，3个月使用的样本-80℃保存；血浆超过3个月不能用于提取cfDNA)。

2、仪器设备与耗材如表1所示：

表1仪器与设备表

3、其他试剂及耗材

3.1、试剂：无水乙醇、分析纯异丙醇等。

3.2、耗材：无RNase、无DNase、无菌、低吸附离心管等。

二、实验流程图：

医院取样及保存→血浆分离→血浆游离核酸提取→配置数字PCR反应液→液滴芯片生成→扩增→阅读→结果分析与报告输出。

三、实验步骤：

(一)血浆分离及游离核酸提取步骤

1、将临床全血样本(约10mL)1600g离心15min，取上层血浆于新的50mL离心管中，注意不要吸到下层的血液，每管5mL血浆(以下试剂加入量按5ml血浆计算，实际具体加入量视样品血浆量按比例调整)。

2、向分离出的血浆样品中加入500ul蛋白酶K和4mL的Buffer ACL以及1ul 1ug/ul的Carrier RNA，涡旋30s，将离心管置于60℃水浴锅孵育30min。

3、加入9mL Buffer ACB,涡旋30s，冰浴5min(此步沉降核酸，可适当延长)。

4、使用真空泵将所有样品过柱，关掉真空泵，释放压力为0Mbar(注意保证真空压力泵＞70Mbar，过柱结束后盖好盖子，避免滤膜过分干燥)；

5、打开盖子加入600ul Buffer ACW1，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；

6、加入750ul Buffer ACW2，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；

7、向加入750ul无水乙醇，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；

8、取下吸附柱放入2mL收集管，14,000rpm(20,000g)常温离心3min；

9、将吸附柱放入新的1.5mL离心管，开盖，干燥10min；

10、加入50ul RNase-free ddH2O(56℃预热)，56℃孵育5min；

11、14,000rpm(20,000g)常温离心1min；

12、将离心下来的溶液再次上柱，二次洗脱，56℃孵育5min，14,000rpm(20,000g)常温离心1min；

13、产物24h内进行下游实验，可2-8℃保存，长时间请-25℃～-15℃保存。

(二)数字PCR检测流程(配置数字PCR反应液、液滴芯片生成及扩增过程)

1、配制15ul的液滴PCR检测体系，具体体系配方分别见表2；

表2

组分	体积(μL)
		2x Taq Mix	7.5
Forward Primer(10μM)	0.6*n
		Reverse Primer(10μM)	0.6*n
Probe(10μM)	0.4*n
		核酸模板	1
总体积	超纯水补足至15微升

备注：表2中反应体系涉及多重反应，即引物、探针加入量由检测靶标而定，其中n代表多重组合的靶标个数，理论上每个位点对应一对引物探针对，n为正整数。

2、将血浆提取的游离核酸模板及内参模板加入到不同体系中并混匀，模板加入量为5ul，同时配制实验的阳性对照和阴性对照；

3、按照SOP流程将配制好的反应体系加入到液滴芯片加样孔中；将芯片放入样本制备仪，启动仪器生成液滴。

6、将芯片放入芯片扩增仪中；按照表3设置液滴芯片扩增程序，并运行；

表3反应体系扩增程序

(三)液滴芯片阅读、结果分析及报告流程

1、扩增结束后，将芯片架拿出放至数字PCR阅读仪的芯片放置台上，打开GenePMS软件，将芯片放置台的温度调至50℃，并设置软件相应参数；

2、芯片放置5分钟后，选择相应的荧光检测通道，开始芯片扫描并分析结果；

3、数据分析与报告输出。

其中本实施例涉及到的引物组合序列如表4所示。

表4引物探针组合序列

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 领航基因科技（杭州）有限公司

<120> 用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccttcatgc gctctatcg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttcagctc cagctcccag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacgttccg tctgga 16

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactacggta acattgatcg caac 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcattcctgg aataatgacg cta 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttccacata ccatcttc 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttccacata ccatcttc 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttttgccg tttcctgtat cc 22

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagcagagga gcgagg 16

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catggtctgc ttgtcatgaa aga 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggaaagcca cgtcaatacg 20

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agagaatacg aaactcg 17

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcagagattg ccaacaacat tga 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcatgttttc caaacgcca 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaaccaata tacatcggaa ta 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaatagct tgatcgccct 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtccatccca cttaaagact tggt 24

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

catccttaac cacgcccaa 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cccaatatta tgcacccggt c 21

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cacccgctca gcatcaatg 19

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgagcaccg catta 15

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaccatgctc caaaatgccc tac 23

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tacgcatgat aaacgctgcg ttta 24

<210> 24

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccgaccaagc cgagac 16

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccgcacacta agcacgaaga c 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

catcaagtag cgcaggatcg ta 22

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

accagacaac cgatagc 17

Claims

1.一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，其特征在于，包括：

用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示；

用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、SEQ ID N0：5和SEQ ID N0：6所示；

用于检测vanA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7、SEQ ID N0：8和SEQ ID N0：9所示；

用于检测vanB基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：10、SEQ ID N0：11和SEQ ID N0：12所示；

用于检测vanM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13、SEQ ID N0：14和SEQ ID N0：15所示；

用于检测OXA-48-like基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：16、SEQID N0：17和SEQ ID N0：18所示；

用于检测blaNDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：19、SEQ ID N0：20和SEQ ID N0：21所示；

用于检测mcr-1基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：22、SEQ ID N0：23和SEQ ID N0：24所示。

2.由权利要求1所述的引物探针系统制备的用于同时检测多种耐药基因的产品。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂。

5.一种同时检测多种耐药基因的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的引物探针系统或权利要求2-4所述的产品进行检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)配置数字PCR反应液；

(3)制备液滴芯片；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，检测样品为阳性细菌培养物或感染患者血浆样品。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15秒，60℃退火60秒，循环40次。

10.根据权利要求1所述的引物探针系统、权利要求2-4所述的产品或权利要求5-9所述的方法在临床领域中的应用。