CN111996239A

CN111996239A - 用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法

Info

Publication number: CN111996239A
Application number: CN201910448124.9A
Authority: CN
Inventors: 宋元林; 周建; 陈翠翠; 王葆青; 李华茵; 郭玮; 王蓓丽; 杨轶慧; 宋振云; 于秀艳; 曾宪航
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本发明提供了用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针、试剂盒，其中探针的序列如SEQ ID NO.:11所示，或者在序列SEQ ID NO.:11的两端有基团修饰。应用本发明的用于鲍曼不动杆菌检测的引物对和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

Description

用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。对常用抗生素的耐药率有逐年增加的趋势，并引起临床医生和微生物学者的严重关注。

因此，为了有效地检测鲍曼不动杆菌，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高、简单便捷的鲍曼不动杆菌检测方法。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种用于鲍曼不动杆菌检测的引物，该引物选自如：

SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对；

或SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物对；

或SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物对；

或SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物对；

或SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

其中，优选的引物选自如：

SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对；

或SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

进一步优选的引物选自如SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

具体的上述引物的序列见如下表1：

表1引物和探针序列

本发明还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，该探针的序列如SEQ IDNO.:11所示；

该探针的5’端和3’端还有基团修饰，用于荧光定量PCR检测；

具体的说，本发明的一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，其5’端由FAM修饰，3’端由MGB修饰，具体序列如下：

5’FAM-gaaggcggggacgacgtcaa-3’MGB

其中，FAM为荧光基团，MGB为淬灭基团；

本发明还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于鲍曼不动杆菌检测的引物(如表1所示)；和/或上述用于鲍曼不动杆菌检测的探针；

具体的探针为：5’FAM-gaaggcggggacgacgtcaa-3’MGB；

进一步的，所述试剂盒中还有标准品对照；

进一步的，所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTP、和/或Mg²⁺。

本发明还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取待检样本的DNA；

(2)使用上述用于鲍曼不动杆菌检测的引物和探针，进行荧光定量PCR检测。

本发明的引物在检测鲍曼不动杆菌DNA时能够同时具备高灵敏度和高特异性，从而能准确而灵敏地检测产品，例如环境样品、食品、保健品、化妆品中的鲍曼不动杆菌的含量，或者血液样本、组织样本中是否含有鲍曼不动杆菌，从而用于感染性疾病的诊断。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。

本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。探针可以处于液相中，也可以固定于固相上。

本发明中，鲍曼不动杆菌16srRNA引物探针设计的靶序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明的主要优点在于：

本发明提供的用于鲍曼不动杆菌检测的引物和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，不仅能检测是否感染鲍曼不动杆菌的定性检测，还能进行鲍曼不动杆菌的定量检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。在具体的实施例中，检测的灵敏度可以达到1fg/μL。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。

附图说明

图1：使用各引物对针对鲍曼不动杆菌特异性检测；

图2：使用引物对5针对鲍曼不动杆菌标准品的灵敏度检测结果。

(其中五条曲线从左到右，稀释度分别为1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000)

图3：临床样本中鲍曼不动杆菌的敏感性检测

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

1.样本处理试剂：(柱纯化回收)包括蛋白酶K 20mg/ml，溶菌酶(革兰氏阳性菌需添加)，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管，1.5ml离心管。

2.DNA检测体系：

2x Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg²⁺、本发明引物及探针等成分。

掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液

3.检测仪器：Roche 480Ⅱ。

4.实验操作及过程

4.1根据说明书进行基因组DNA提取纯化操作(试剂盒：广州美基生物MD5131-01)：

1)在1.5ml离心管中加入20μl Proteinase K(具体体积根据样本多少可调整)。

2)加入样本，加入200μl缓冲液GB，抽打混匀或振荡混匀。

3)将离心管置于56℃，直至组织完全消化。

4)每孔加入200μl无水乙醇，抽打混匀或振荡混匀，室温放置5分钟。

5)每孔加入15μl磁珠悬浮液B，抽打混匀或振荡混匀。

6)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。

7)将离心管从磁力架上取下，加入500μl缓冲液GD，抽打混匀或振荡混匀。

8)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。

9)将离心管从磁力架上取下，加入600μl漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀。

10)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；

11)重复操作步骤9、10，液体尽量去除干净。

12)离心管于磁力架上，室温晾干10-15分钟。

13)将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl洗脱液TB，抽打混匀振荡混匀，置于56℃，孵育10分钟。

14)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。

4.2荧光定量PCR检测

1)根据引物探针浓度(2OD)，加入适量ddH2O,稀释至100uM；

2)将引物、探针稀释至10*工作液浓度(工作液浓度：引物0.3-1uM，探针0.05-0.2uM)；

3)PCR反应体系

4)PCR反应条件

根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中鲍曼不动杆菌DNA的量。

实施例1特异性检测

针对鲍曼不动杆菌的16srRNA靶序列(SEQ ID NO.:12)，设计五对引物和一个探针(引物和探针的序列见表1)，将设计的引物和探针交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Master Mix购自Roche公司。实验仪器包括：实时荧光定量PCR扩增仪(RocheⅡ)离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。

实时荧光PCR检测：

分别使用设计的引物和探针进行检测、实时荧光PCR检测体系的方法和条件如上所述。

取鲍曼不动杆菌标准菌株(购自广东微生物研究所，菌株编号ATCC19606)作为研究对象，细菌培养后按照上述核酸提取方法分别提取细菌DNA，核酸定量后取等量DNA样本，进行种属特异性16srRNA检测。

引物对1、引物对2、引物对3、引物对5均能有显著的扩增曲线，其中引物对1、引物对5能够较早起峰，引物对2、引物3较晚起峰，显示引物对1、引物对5能较好的检测鲍曼不动杆菌(参见图1)。

实施例2灵敏度检测

针对鲍曼不动杆菌标准菌株的引物对5的灵敏度检测：

提取鲍曼不动杆菌标准菌株的基因组DNA，提取后基因组DNA浓度调整至0.1ng/ul，然后进行梯度稀释检测(0.1ng/ul DNA,稀释度1/10/100/1000/10000/100000)。

表2：鲍曼不动杆菌探针检出灵敏度

上述结果说明，模板DNA浓度变化时，引物对5进行定量检测时，可以随稀释倍数的变化CT值呈现一定的线性关系，说明引物对5能准确反馈起始模板量(见图2)。

实施例3临床样本敏感性检测

选取10例疑似感染鲍曼不动杆菌(病人血液样本来自复旦大学附属中山医院呼吸病研究所)的临床血液样本，进行灵敏度检测：

用试剂盒(广州美基生物D3148-01)提取血液样本中的DNA，提取方法如下：

1)1.5ml离心管中加入25ul Qiagen蛋白酶；

2)加入200ul血清或者血浆；

3)加入200ul AL裂解buffer，涡旋15s；

4)56℃温预15min；

5)短暂离心后，加入250ul无水乙醇，涡旋15s，室温静置5min；

6)短暂离心后，将所有液体转入QIAamp MinElute column，6,000g，离心1min，弃滤液；

7)加入500ul AW1溶液，6,000g离心1min，弃滤液；

8)加入500ul AW2溶液，6,000g离心1min，弃滤液；

9)加入500ul无水乙醇，6,000g，离心1min，弃滤液；

10)换新的2ml离心管，20,000g，离心3min；

11)换新的2ml离心管，打开滤柱管盖，将滤膜晾干；

12)将滤柱转入1.5ml离心管，加入20ul AVE buffer，室温5min，20,000g离心1min；

将提取后的基因组DNA利用引物对5进行预扩增(KAPA2G Robust HotStartReadyMix PCR Kit)，

预扩增PCR条件如下：

PCR反应条件

根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中鲍曼不动杆菌DNA的量

表3：血液样本DNA探针检出敏感度

实验结果(见图3)

本实例中分别对特异性较好的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5结合探针进行了测试，实验结果表明：

引物对5的检测效果最好，检测灵敏度最高，最低可检测3.20copy/μL的目标序列，且没有非特异性的条带出现，对标准菌株和感染血液样本中的鲍曼不动杆菌基因组DNA均可检测。

实施例4标准菌株灵敏度检测

采用鲍曼不动杆菌标准株，浓度从0.1ng/μL，10倍梯度稀释至0.000001ng/μL,引物对5扩增CT值呈现出非常好的线性关系。感染血液样本DNA线性放大，与标准品(0.0001ng/μL)线性放大CT值接近，说明引物对5完全适合感染血液的检测。

引物对1能够检测到0.001ng/μL的目标序列。

引物对2对标准菌株能够检测到0.01ng/μL的目标序列，但是对血液样本的检测灵敏度仅能检测到相当于1000copy/μL的目标序列。

引物对3对标准菌株能够检测到0.01ng/μL的目标序列，但是对于血液样本的检测观察到非特异性条带出现，对结果的准确判断存在较大干扰。

引物对4对标准菌株不够敏感，起峰较晚，可信度差，不能作为特异性检测引物使用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。应当理解本发明不限于上述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本发明所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且是限制性的。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagctcgtgt cgtgagatgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtaagggcc atgatgactt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatacgtcc tacgggagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcctcctcct cgcttaaagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagctcgtgt cgtgagatgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagggccatg atgacttgac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggagaaagca ggggatcttc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctcctcct cgcttaaagt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagctcgtgt cgtgagatgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcatggagt cgagttgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggcgggg acgacgtcaa 20

<210> 12

<211> 1459

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)

<400> 12

aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgagcgggg gaaggtagct tgctaccgga 60

cctagcggcg gacgggtgag taatgcttag gaatctgcct attagtgggg gacaacatct 120

cgaaagggat gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggatc ttcggacctt 180

gcgctaatag atgagcctaa gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc 240

gacgatctgt agcgggtctg agaggatgat ccgccacact gggactgaga cacggcccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg ggggaaccct gatccagcca 360

tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg aggaggctac 420

tttagttaat acctagagat agtggacgtt actcgcagaa taagcaccgg ctaactctgt 480

gccagcagcc gcggtaatac agagggtgcg agcgttaatc ggatttactg ggcgtaaagc 540

gtgcgtaggc ggcttattaa gtcggatgtg aaatccccga gcttaacttg ggaattgcat 600

tcgatactgg tgagctagag tatgggagag gatggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa 660

tgcgtagaga tctggaggaa taccgatggc gaaggcagcc atctggccta atactgacgc 720

tgaggtacga aagcatgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 780

cgatgtctac tagccgttgg ggcctttgag gctttagtgg cgcagctaac gcgataagta 840

gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagacta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca 960

tactagaaac tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa tctagataca ggtgctgcat 1020

ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

ttccttactt gccagcattt cggatgggaa ctttaaggat actgccagtg acaaactgga 1140

ggaaggcggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta 1200

caatggtcgg tacaaagggt tgctacacag cgatgtgatg ctaatctcaa aaagccgatc 1260

gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagaatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380

gagtttgttg caccagaagt agctagccta actgcaaaga gggcggttac cacggtgtgg 1440

ccgatgactg gggtgaagt 1459

Claims

1.一种用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物选自如：

SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对；

或SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物对；

或SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物对；

或SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物对；

或SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

2.根据权利要求1所述的用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物选自如：

SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对；

或SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

3.根据权利要求1所述的用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物为SEQ IDNO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。

4.一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，其特征在于该探针的序列如SEQ ID NO.:11所示，或者在序列SEQ ID NO.:11的两端有基团修饰。

5.根据权利要求4所述的用于鲍曼不动杆菌检测的探针，其特征在于该探针的5’端由FAM修饰，3’端由MGB修饰。

6.一种用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的鲍曼不动杆菌检测的引物；和/或权利要求4或5任一项所述用于鲍曼不动杆菌检测的探针。

7.根据权利要求6所述的用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，其特征在于其中还有标准品对照。

8.根据权利要求6所述的用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，其特征在于其中还有Taq酶、dNTP、和/或Mg²⁺。

9.一种用于鲍曼不动杆菌检测的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)提取待检样本的DNA；

(2)使用权利要求1-3所述的用于鲍曼不动杆菌检测的引物和权利要求4或5所述的探针，进行荧光定量PCR检测。