CN109266658B - 一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用 - Google Patents

一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，提供了一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用，所述特异基因为hypothetical protein，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，设计的PCR扩增引物对，上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；环介导等温扩增引物，外游引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，内游引物如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；利用上述引物，采用PCR或环介导等温扩增的方法检测鲍曼不动杆菌。本发明对环境样本检测准确、便捷，检测方法特异性好，灵敏度高。

Description

一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，属于条件致病菌。鲍曼不动杆菌属于不动杆菌属，且广泛分布于外界环境中，主要在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存，如浴盆、肥皂盒等处。该菌粘附力极强，极易于附着在人们生活的环境中。此外，鲍曼不动杆菌还存在于健康人皮肤(25％)、咽部(7％)，也存在于结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中。
2015年某研究团队在广州地铁7条线路上使用棉试纸法采集了320个样本，这些样本主要来自地铁内的自动售票机、上下扶梯、座椅、吊环、竖杆等乘客常触碰位置，通过分离培养和分子检测，检测出2.5％的样本含有超级细菌——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。这种较高的细菌检出率可能跟人的活动、动物、环境都有关系。该发现进一步增加了政府机构对公共环境卫生的重视程度，对相关公共基础设施的消毒越来越严格。
作为最常见的条件致病菌之一，鲍曼不动杆菌在环境中的存在情况也是一个我们值得重视的课题。目前常用的鲍曼不动杆菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一定的缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，操作繁琐，费时耗力；免疫学方法也存在着易污染，交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等缺点。随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序列，在此基础上建立了众多的检测技术。其中主要有核酸探针检测技术、实时荧光PCR检测技术、环介导等温扩增技术(LAMP)和PCR技术，这些方法因其特异性强、灵敏度高、省时等特点已越来越多的被应用于微生物鉴定中。但是用于对自然环境尤其是医院环境的检测和监测罕见报道。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用。
本发明利用生物信息学的方法寻找出鲍曼不动杆菌的特异基因，并针对该特异基因设计引物，以环境样本为对象，分别建立了PCR和LAMP两种鲍曼不动杆菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出鲍曼不动杆菌的目的。
本发明的技术方案：本发明提供了一种鲍曼不动杆菌的特异基因，所述特异基因为hypothetical protein，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供了一种用于PCR扩增前面所述鲍曼不动杆菌特异基因的引物对，所述引物对中，上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一套用于环介导等温扩增前面所述鲍曼不动杆菌特异基因的引物，所述外游引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述内游引物如SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示。
本发明还提供了一种用于检测前面所述的鲍曼不动杆菌的试剂盒，包含前面所述的任一组引物。
本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌的方法，
用前面所述的PCR扩增引物对对待测菌种基因组DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，PCR反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE Master Mix，包含DNApolymerase 1U,1.5mM MgCl2,200μM dNTP，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL；
反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌的方法，用前面所述的环介导等温扩增引物对待测菌种基因组DNA进行环介导等温扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系为：12.8U Bst 2.0 DNA Polmerase，0.14mM MgSO4，0.040mM dNTP，8μM内游引物，1μM外游引物，2.5μL10×Bio Labs Buffer，100ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL；反应过程为：65℃温育38min，80℃变性2min。
本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌的方法，采集环境样本，增菌培养后，用前面任一种方法进行检测，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，所述环境样本来源于自然环境。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过本地Blast比对和分析，获得鲍曼不动杆菌的特异基因；针对特异基因设计引物，该引物可以快速、简便、准确的检测鲍曼不动杆菌，对环境样本检测准确、便捷；本发明提供的检测方法特异性好，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明PCR鉴定体系的特异性检测结果，泳道1至泳道8的反应模板为鲍曼不动杆菌的基因组DNA，泳道9至泳道13依次为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌和阴性对照；
图2为本发明PCR鉴定体系中以质粒作为模板的灵敏度检测结果，泳道1到泳道9的反应模板质粒梯度稀释做模板，其浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101、100泳道，泳道10为去核酸酶水作为模板的阴性对照；
图3为本发明PCR鉴定体系中使用直接裂解法裂解后的菌液作为模板的灵敏度检测结果，泳道1到泳道8的反应模板质粒梯度稀释做模板，其浓度依次为107、106、105、104、103、102、101、100泳道，泳道9为去核酸酶水作为模板的阴性对照；
图4为本发明LAMP鉴定体系的特异性检测结果，泳道1至泳道8的反应模板为鲍曼不动杆菌的基因组DNA，泳道9至泳道13依次为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌和阴性对照；
图5为本发明LAMP鉴定体系中以质粒作为模板的灵敏度检测结果，泳道1到泳道9的反应模板质粒梯度稀释做模板，其浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101、100泳道，泳道10为去核酸酶水作为模板的阴性对照；
图6为本发明LAMP鉴定体系中使用直接裂解法裂解后的菌液作为模板的灵敏度检测结果，泳道1到泳道9的反应模板质粒梯度稀释做模板，其浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101、100泳道，泳道10为去核酸酶水作为模板的阴性对照。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。
一种鲍曼不动杆菌的特异基因，所述特异基因为hypothetical protein，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
一种用于PCR扩增前面所述鲍曼不动杆菌特异基因的引物对，所述引物对中，上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。
一套用于环介导等温扩增前面所述鲍曼不动杆菌特异基因的引物，所述外游引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述内游引物如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
一种用于检测前面所述的鲍曼不动杆菌的试剂盒，包含前面所述任一组的引物。
一种检测鲍曼不动杆菌的方法，用前面所述的PCR扩增引物对对待测菌种基因组DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，PCR反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE Master Mix，包含DNApolymerase 1U,1.5mM MgCl2,200μM dNTP，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL；
反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
一种检测鲍曼不动杆菌的方法，用前面所述的环介导等温扩增引物对待测菌种基因组DNA进行环介导等温扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系为：12.8U Bst 2.0 DNA Polmerase，0.14mM MgSO4，0.040mM dNTP，8μM内游引物，1μM外游引物，2.5μL10×Bio Labs Buffer，100ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL；反应过程为：65℃温育38min，80℃变性2min。
一种检测鲍曼不动杆菌的方法，采集环境样本，增菌培养后，用前面任一种方法进行检测，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌。
进一步的，所述环境样本来源于自然环境。
实施例1：特异性靶基因筛选及引物设计
1、本地BLAST分析
于NCBI下载非冗余核酸数据库(约60G)，构建靶数据库。从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载的鲍曼不动杆菌全基因组序列，作为检索数据。进行本地BLAST检索，获取得到菌种各序列片段与数据库比对结果。将检索结果利用自编软件进行筛选获得潜在的特异序列，并进行后续筛选。
2、特异性靶基因筛选
在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中使用在线BLAST功能，使用两种准则确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性。一为BLAST时排除鲍曼不动杆菌，结果显示无任何相似序列者或相似序列覆盖度小于30％为目的菌种特异基因；二为BLAST时选择在鲍曼不动杆菌内进行检索，结果返回大量相似序列者是目的菌种的不同菌株共有序列。结合两种准则，最终找出同时符合两种准则的目的基因。位于CP018677.1基因组中第2912288-2912548位核苷酸。
3、引物设计
本试验以基因hypothetical protein设计特异引物。特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具Primer Explorer V5 software
(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计完成，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于LAMP技术检测，其中外游引物可作为PCR反应的上、下游引物，用于鲍曼不动杆菌的鉴定。
实施例2：环境样本的采集及前处理
1、环境样本的采集
(1)以无菌生理盐水润湿无菌棉签，擦拭待检样本表面(3cm-5cm左右)，浸入装有1mL增菌培养基的无菌离心管中，轻轻搅动后，弃去棉签，将无菌离心管带回实验室进行实验。如为水体样本，直接以无菌吸头或吸管吸取水体，滴入装有1mL增菌培养基的无菌离心管中，进行增菌。
2、环境样本的预增菌培养
为提高检测率，进行预增菌培养。条件为37℃振荡培养箱中培养4小时，转速为120rpm。
3、细菌培养
取经过预增菌培养的培养液100μL加入至5mL含有LB培养基的玻璃试管中，37℃振荡培养箱中培养4小时，转速为120rpm。
实施例3：检测方法的建立
1、DNA的提取
(1)用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1)取2mL过夜培养的菌液，置于离心机中，使用12000rpm离心1.5min，弃上清。
2)接着加入500μL的细胞悬浮液到上一步的离心管中，吹打混匀溶液，放入提前加热好的水浴锅，37℃水浴60min。期间上下颠倒3-4次。12000rpm离心2min。
3)弃上清之后，于管正上方缓慢加入225μL缓冲液A，吹打混匀。
4)向管中加入10μLRNaseA溶液，振荡15s。
5)室温放置5min后，加入10μL蛋白酶K。
6)吹打混匀后，于离心管中加25μL裂解缓冲液S。
7)待吹打混匀后，于离心管正上方滴入250μL缓冲液B，旋涡振荡10s，放入提前加热好的水浴锅，70℃水浴加热10min。置于离心机中，使用12000rpm离心1min。
8)取上清到一干净的管中，于管正上方缓慢加入250μL无水乙醇，振荡15s，使溶液充分混匀，快速离心，将贴在管盖和管壁上的水珠离心至管底。
9)取上一步的溶液悬空缓慢加入到干净的吸附柱中，静置5min,使溶液中的核酸充分结合到吸附柱上,12000rpm离心30s，弃废液。
10)于吸附柱正上方缓慢加入500μL缓冲液C，静置2min,使缓冲液充分浸泡吸附柱,接着置于离心机中,12000rpm离心30s，弃废液。
11)于吸附柱正上方缓慢加入700μL加有无水乙醇的漂洗液W2，静置2min,使漂洗液充分浸泡吸附柱,接着置于离心机中,使用12000rpm离心30s，弃废液。
12)于吸附柱正上方缓慢加入500μL加有无水乙醇的漂洗液W2，接着置于离心机中,12000rpm高速离心30s，弃废液。然后12000rpm离心2min。将吸附柱置于无菌通风橱，放置10min。
13)待吸附柱上的漂洗液充分晾干后，将其放入新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入100μL洗脱缓冲液TE，该TE需要提前使用60℃加热，60℃处理过的TE能更好的溶解核酸，接着室温放置3min，置于离心机中,12000rpm离心1min，收集并低温保存含有基因组的溶液以备后续使用。
(2)使用化学试剂进行直接裂解以获得基因组，步骤如下：
1)加入2-10μL菌液到8μL溶液A(125mM NaOH,1mM EDTA,0.1％Tween 20)中，混匀后65℃温育10min。
2)加入8μL溶液B(125mM HCl,10mM TrisHCl)，混匀后，取其上清液即可作为PCR和LAMP反应的模板。
2、阳性质粒载体构建及获得
(1)靶序列PCR扩增
以鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，对特异基因进行PCR扩增，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。
(2)目的产物的回收
从脂糖凝胶中切下目的片段，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1)待琼脂糖凝胶电泳结束后，小心切下含目的片段的胶块。
2)待称取重量之后，置于离心管中并加入相对胶块质量2倍体积的溶胶液，置于提前加热好的水浴锅中，55℃水浴10min，在此过程中温和翻转离心管1-2次。
3)待胶块充分溶解之后，将其转入到吸附柱中，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。
4)接着于吸附柱正上方缓慢滴加700μL漂洗液W2，静置3-5min，待漂洗液充分浸泡吸附柱之后，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。
5)再次滴加500μL漂洗液W2，静置2min，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。
6)将只含吸附柱的离心管置于离心机中，再次使用12000rpm离心2min，使黏附在吸附柱上的漂洗液尽量被除去。接着将吸附柱置于无菌通风橱静置10min。
7)待吸附柱被彻底晾干之后，将其放入一个新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入40μL的洗脱缓冲液TE，静置4min，使TE充分溶解吸附柱上的核酸。置于离心机中并以12000rpm离心1min，收集并低温保存含有DNA的溶液以供后续实验使用。
(3)连接、转化及筛选
1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
①挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL LB培养基中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
②将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10min，使培养物冷却。
③于4℃下4100rpm离心10min，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽。
④每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀。
⑤于4℃下4100rpm离心10min，吸出上清液，并将管倒置l min以使残留的液体流尽。
⑥每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
2)连接到PMD19-T Simple
①在微量离心管中加入1μL Takara pMD19-T simple载体、4μL目的基因PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物。
②16℃连接反应过夜。
3)转化DH5α
①全量(10μL)加入至100μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30min。
②42℃加热90s后，再在冰中放置1min。
③加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60min。
④5000r离心3min后，吸取上清800μL舍弃，并将剩余的200μL菌液吹打混匀
⑤将混匀后的菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养箱中倒置培养16h以形成单菌落。
(4)阳性克隆的筛选
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，分别以M13F、M13R和特异性引物进行菌落PCR扩增。对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经PCR验证正确的阳性克隆送昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果与目的基因相符。
(5)阳性质粒提取
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行PCR扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经PCR确证的阳性克隆，接种于LB液体培养基，37℃，160rpm培养过夜。取每个菌株过夜培养液5mL，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，具体操作步骤如下：
1)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
3)向离心管中加入250μL溶液2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
4)向离心管中加入350μL溶液3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
5)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
6)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7)将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
8)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60μL洗脱
缓冲液TE，室温放置2min，12000rpm离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
(6)阳性质粒浓度测定
打开Thermo Scientific BioMate 3S紫外分光光度计，预热15min；选定Mode方式为dsDNA，将比色杯用超纯水反复洗几次后加入60μLTE缓冲液调零；将TE缓冲液完全吸出，然后加入待测样品(2μL样品加入58μLTE缓冲液)，选定稀释倍数为30倍进行测定，读取质粒DNA浓度。
(7)质粒数目换算及梯度稀释
阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒数目。质粒数目换算公式为
Figure GDA0003690657410000101
(注：X为质粒浓度ng/μL；Y为目的产物碱基对数；NA为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)。取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释到底。
3、菌落计数
(1)菌液的培养
配制LB固体培养基，用高压蒸汽灭菌锅灭菌121℃，20min。将在-80℃冰箱中保藏的菌种接种于新鲜的MH液体培养基，37℃震荡培养12小时。
(2)稀释平板计数法计数及其步骤
1)熔化培养基，2)倒平皿，3)梯度稀释法稀释原菌样品，4)涂平皿：
选取1/106,1/107,1/108三个稀释度计数，每皿取菌液0.1ml，用玻璃涂布棒涂布均匀，每个稀释度做一个重复，5)37℃倒置培养2天，6)计数：
每ml原菌样品中微生物的活细胞数(菌落形成数，CFU＝(同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数)/原菌样品体积(mL)。
4、建立PCR鉴定体系
(1)PCR条件优化
对退火温度进行优化。退火温度为6个梯度，50、52、54、56、58、60℃.具体反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE Master Mix(包含DNApolymerase 1U,1.5mM MgCl2,200μM dNTP)，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL。
(2)在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
(3)特异性检测
收集鲍曼不动杆菌临床分离株162株，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌各一株，使用试剂盒提取该166株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测。由图1可知，本发明PCR鉴定体系对鲍曼不动杆菌具有高度特异性。
(4)灵敏度检测
1)鲍曼不动杆菌阳性质粒灵敏度
用上述稀释好的质粒作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5μL 2×TSINGKEMaster Mix(包含DNA polymerase 1U,1.5mM MgCl2,200μM dNTP)，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL。PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
由图2可知，本发明PCR鉴定体系对鲍曼不动杆菌具有高灵敏性特点，可在每反应一个拷贝质粒时扩增出阳性条带。
2)鲍曼不动杆菌菌液灵敏度
利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE Master Mix(包含DNA polymerase 1U,1.5mMMgCl2,200μM dNTP)，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL。PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
由图3可知，采用细菌作为模板时，本发明PCR鉴定体系对鲍曼不动杆菌同样具有高灵敏性特点，可在每反应1CFU时扩增出阳性条带。
5、建立LAMP鉴定体系
(1)LAMP反应
反应体系：12.8U Bst 2.0 DNA Polmerase，0.14mM MgSO4，0.040mM dNTP 8μM内游引物，1μM外游引物，2.5μL10×Bio Labs Buffer，100ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL。该反应使用PCR仪，其过程为：65℃温育38min，80℃变性2min。
(2)特异性检测
收集鲍曼不动杆菌临床分离株162株，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌各一株，使用试剂盒提取该166株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测。由图4可知，本发明LAMP鉴定体系对鲍曼不动杆菌具有高度特异性。
(3)灵敏度检测
利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行LAMP扩增反应。
由图5可知，采用阳性质粒作为模板时，本发明LAMP鉴定体系对鲍曼不动杆菌同样具有高灵敏性特点，可在每反应1拷贝时扩增出阳性条带。
由图6可知，采用细菌作为模板时，本发明LAMP鉴定体系对鲍曼不动杆菌同样具有高灵敏性特点，可在每反应10CFU时扩增出阳性条带。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用
<130> 2018.6.15
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Ordo artificialis)
<400> 1
ggatttttgg ttcaggcaat 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Ordo artificialis)
<400> 2
cccagtttcc tttcgtct 18
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成(Ordo artificialis)
<400> 3
cgataacttc ctctactgca ctctttttga taactctcca aaacaaactt ca 52
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成(Ordo artificialis)
<400> 4
ttagagataa accaaacggt cacgttttca taaatatcaa ctttttctcc acg 53
<210> 5
<211> 261
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 5
tcaaatacgt gcccagtttc ctttcgtctc ataaatatca actttttctc cacgtcctaa 60
cttgcctact acgtgaccgt ttggtttatc tctaatattt aaagaattag tgttaatata 120
ttttgattcg ataacttcct ctactgcact ctgtgcattt tctgaatctg aagtttgttt 180
tggagagtta tcattgcctg aaccaaaaat ccctaaagct actaatcctg cggcacccca 240
gcctaaagtt gattttttca t 261

Claims (2)

1.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含外游引物如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示，检测鲍曼不动杆菌的方法为
用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对对待测菌种基因组DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌；
PCR反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE Master Mix，包含DNA polymerase 1U,1.5mMMgCl2，200μM dNTP，10μM的外游引物，50ng基因组DNA，无菌水补至25μL；
反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
2.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含外游引物如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示，内游引物如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，检测鲍曼不动杆菌的方法为：用SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的引物对对待测菌种基因组DNA进行环介导等温扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现目的条带，则是鲍曼不动杆菌；没有目的条带，则不是鲍曼不动杆菌；
所述环介导等温扩增反应体系为：12.8U Bst 2.0DNA Polmerase，0.14mM MgSO4，0.040mM dNTP，8μM内游引物，1μM外游引物，2.5μL10×Bio Labs Buffer，100ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL；反应过程为：65℃温育38min，80℃变性2min。
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