KR20190134202A

KR20190134202A - 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 mlpa 프로브 및 그 용도

Info

Publication number: KR20190134202A
Application number: KR1020180059545A
Authority: KR
Inventors: 정연준; 이동건; 정보람; 박철민
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2019-12-04
Also published as: WO2019225791A1

Abstract

본 발명은 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브; 이를 포함하는 조성물; 키트 및 이를 이용하여 패혈증 환자혈액에서 주요 그람 음성균을 다중 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 상기 그람 음성균 검출용 프로브, 조성물, 키트 및 이를 이용한 주요 그람 음성균의 검출 방법은 혼성화 시간을 최적화하여 종래 검출시간보다 검출시간을 단축되고, 그람 음성균의 특이적 서열을 예비 증폭함으로써 검출의 민감도를 상승시켜, 환자의 혈액에서 채취한 무세포 DNA 시료에서도 숙주 게놈 DNA와의 비특이적인 반응 없이 그람 음성균의 존재, 종류 및 약물 내성을 고민감도로 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

Description

패혈증-유발 그람 음성균 검출용 MLPA 프로브 및 그 용도{MLPA probe for detection of sepsis-causing Gram-negative pathogens and uses thereof}

본 발명은 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 및 이를 이용하여 패혈증 환자혈액에서 주요 그람 음성균을 다중 검출하는 방법에 관한 것이다.

패혈증(Sepsis)은 집중 치료를 받는 환자의 6-30 %에서 발생하는 생명을 위협하는 질환이다^[1]. 패혈증은 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇼크(septic shock), 또는 합병증으로서 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능장애가 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfuntion syndrome, MODS)으로 발전하게 되고 사망까지 이르게 되는 매우 치명적인 질환이다. 그러므로 패혈증의 정확한 진단을 위해서는 혈액이나 감염 부위로부터 원인 미생물을 정확하게 분리해 내는 것이 매우 중요하다.

패혈증은 여러 가지 미생물로 인해 나타나는데, 진균이나 바이러스 등에 의해서도 일어나지만 대부분의 원인 미생물은 세균이다. 그람 음성균은 심한 패혈증을 일으키는 가장 일반적인 유기체이며^[2,3] 높은 이환율(morbidity)과 사망률(mortality)을 초래한다^[4,5]. 패혈증의 30-60％와 패혈성 쇼크의 60-80％의 환자가 혈액 배양시에 3 분의 2 정도는 그람 음성균이고 10-20％가 그람양성균이다. 그람 음성균과 그람양성균은 세포벽 구조가 다름에 따라 면역 활성이 차이가 나게 되고, 이에 따른 항생제 처방이 다르게 되므로 일차적으로 그람 음성균과 그람양성균을 구분하는 것이 중요하고, 나아가서는 감염된 균종을 정확하게 동정하는 것이 패혈증의 조기치료에서 가장 주요한 문제이다.

한편, 대부분의 패혈증-유발 그람 음성균은 항생제 내성을 보였으며 특히 ESBL (extended-spectrum-β-lactamases) 생성 박테리아가 급속하게 보급되었다. 부적절한 초기 항생제 치료는 입원 기간을 연장시키고 사망률을 증가시킬 수 있기 때문에 패혈증 환자의 혈액으로부터 박테리아 병원균을 조기에 정확하게 검출하는 것과 약제내성을 판단하는 것은 임상 결과를 증진하는데 중요하다^[6-8].

그러나 기존의 세포 배양에 기초한 방법은 약물내성 병원균을 식별하기 위해 상대적으로 많은 시간이 소요되고, 전체적인 검출 시간이 길어진다는 단점이 있다. 이러한 방법을 대신하기 위해, PCR을 사용하는 분자 생물학적 진단 방법이 두 가지가 있다. 하나는 다중 증폭(Multiplex PCR) 이고, 또 다른 하나는 실시간 유전자 증폭(real-time PCR)이다^[9,10]. 두 가지 기술 모두 장단점이 있다. 다중 증폭(Multiplex PCR)은 같은 검체에서 다수의 병원균을 검출할 수 있어, 다중의 후보 병원균의 효과적인 스크리닝을 가능케 한다. 그러나 다중 검출은 여러 종류의 프라이머 세트가 genomic DNA에 붙어 비특이적 혼성화를 형성하여 검출하려고 하는 증폭산물 외의 다른 산물들을 증폭시켜 결과 분석에 오류를 나타낼 수 있다. 따라서 실시간 유전자 증폭(real-time PCR)보다는 특이도가 낮다. 실시간 유전자 증폭(real-time PCR)은 상대적으로 정확한 결과를 제공하지만, 제한된 다중 검출 기능을 가지고 있다.

MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)는 DNA의 특정 염기서열만을 검출하는 방법으로 높은 특이도를 가지고 한 번의 실험으로 변이체의 다중 검출이 가능한 분자 생물학적 진단방법이다. MLPA에 있어서는 타겟 시료에 혼성 결합하는 서열과 프라이머 서열을 포함하는 2개의 프로브를 사용한다. 상기 2개의 프로브가 각각 타겟 유전자와 혼성 결합하고, 혼성 결합한 2개의 프로브 사이가 라이게이션(ligation)되어 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하여야만 이후 증폭 반응에서 2개의 프로브 각각이 포함하는 프라이머에 의해 프로브 어셈블리를 주형으로 한 증폭 반응이 가능해진다. 따라서, 프로브가 타겟 유전자에 혼성 결합하고 라이게이션되어 얻어진 프로브 어셈블리의 양에 따라 증폭량 및 이에 대한 검출량이 달라지므로 특정 유전자를 검출할 수 있게 되는 것이다. 기존의 MLPA의 경우 CE(capillary electrophoresis)를 사용하여 검출하기 때문에, 검출을 위한 프로브 디자인 과정에서 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인한 스터퍼 서열(stuffer sequence)이 존재한다. 스터퍼 서열이란 단순히 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인된 서열로써, 다른 프로브의 혼성화 서열(hybridization sequence), 다른 프로브의 스터퍼 서열 또는 DNA의 다른 염기서열과 결합을 하지 않는 염기서열이다. 하지만 이 스터퍼 서열의 경우 위에서 설명한 바와 같이 다른 염기서열과 어떠한 상호작용도 없어야 하므로 그 디자인 자체가 매우 어렵다는 단점을 가진다. 또한, 스터퍼 서열을 위한 염기서열을 디자인하더라도 최대 400nt정도의 길이를 가지는 스터퍼 서열로 인해 프로브 간의 길이 차이가 증가하게 되고, 이로 인하여 전체 산물의 증폭 효율이 달라져 정확한 검출이 어렵다는 단점을 가지게 된다.

이러한 단점을 해결하기 위해 본 발명자들은 선행 연구에서 스터퍼 서열이 없는 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA (multiplex-ligation-dependent probe amplification)와 SSCP (single-strand conformation polymorphism)에 기반한 모세관 전기 영동 (CE)의 원리를 통합하여 유전자 표적의 다중 검출을 위한 새로운 도구를 개발하였다(한국등록특허 제10-1513276호). 길이의 차이가 없는 스터퍼 프리 MLPA 프로브를 사용하면 일정한 증폭효율을 가지게 됨으로써 정확한 검출이 가능하게 된다는 장점이 있다.

현재, 그람 음성균의 검출과 관련하여 다양한 신속 진단 제품이 상용화되어 있지만, PCR에 기반한 분석은 시료의 품질에 큰 영향을 받아 위음성 및 위양성률이 높고, 내성분석이 불가능하거나 내성 분석 보다는 동정에 초점이 맞춰지고 있어 패혈증의 조기 발견과 치료를 위해 높은 민감도와 다중 검출 특이성을 가지고 신속 진단이 가능한 검출 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 상기와 같은 문제점들을 보완하고자 본 발명에서는 정확하고 신속하게 패혈증-유발 그람 음성균을 검출할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그람 음성균의 다중 분석이 용이할 뿐 아니라 대표적인 약물내성도 검출이 가능한 프로브를 개발하게 되었다.

따라서, 상기와 같은 문제점들을 보완하고자 연구를 수행하던 중, 본 발명자들은 패혈증을 유발하는 그람 음성균을 다중 진단하고 대표적인 약물내성을 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트를 설계한 후, 스터퍼 프리 MLPA-CE-SSCP 기술을 기반으로 패혈증 환자혈액에서 신속하고 정확하게 패혈증 원인균과 약물내성 여부를 판별할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 본 발명의 목적은, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트; 이를 포함하는 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트를 이용하여 패혈증-유발 그람 음성균을 동시검출 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 패혈증-유발 그람 음성균의 동시검출 방법을 이용하여 패혈증 치료를 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정방향 프라이머 결합 영역, 및 표적 서열의 제1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LPO(left probe oligonucleotide); 및

상기 표적 서열의 상기 제1 영역과 연속으로 연결된 제2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RPO(right probe oligonucleotide);로 구성되고,

상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열 번호 1 및 서열번호 2인 제1 프로브, 서열번호 3 및 서열번호 4인 제2 프로브, 서열번호 5 및 서열번호 6인 제3 프로브, 서열번호 7 및 서열번호 8인 제4 프로브 및 서열번호 9 및 서열번호 10인 제5 프로브로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 포함하는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물을 포함하는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 시료를 예비 증폭시키는 단계(S1); 예비 증폭된 시료를 제1항의 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트와 접촉시켜 혼성화시키는 단계(S2); 상기 시료와 혼성화된 프로브를 라이게이션(ligation)하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성시키는 단계(S3); 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계(S4); 상기 증폭 산물을 분리 및 검출하는 단계(S5); 상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 패혈증-유발 그람 음성균이 존재하는 것으로 판단하는 단계(S6)를 포함하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법을 이용하여, 패혈증 치료를 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 의한 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브에 의하면 패혈증의 주요 원인이 되는 5종 그람 음성균 및 주요한 약물내성에 대하여 간섭 현상 없이 높은 검출특이도로 다중 검출할 수 있는 우수한 효과가 있다.

또한, 본 발명의 프로브 및 검출방법에 의하면 패혈증-유발 그람 음성균의 특이적 서열을 예비 증폭함으로써 검출의 민감도를 상승시킬 수 있고, 혼성화 시간을 최적화하여 종래 검출시간보다 검출 시간이 단축되어 패혈증을 초기에 진단하여 치료방법을 정확하게 제시할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 검출 시스템에 의하면 감염된 병원체 DNA의 양이 숙주 게놈 DNA의 양보다 상대적으로 적은 발열 환자 혈액의 혈장에서 추출한 무세포 DNA 시료에서도 숙주 게놈 DNA와의 비특이적인 반응 없이 그람 음성균의 존재, 종류 및 약물 내성을 고민감도로 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

도 1a는 본 발명에 의한 스터퍼 프리 MLPA-CE-SSCP 분석법을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 1b는 본 발명에 의한 스터퍼 서열을 가지지 않는 MLPA 프로브의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 제작한 프로브 세트가 ROX 500 크기 표준과 비교하여 상대적 이동 시간을 기준으로 식별된 특정 대상 피크를 나타내는 것을 확인한 것이다.
도 3은 5 종의 그람 음성균을 검출하기 위하여 6 개의 유전자를 목표로 하는 스터퍼 프리 MLPA 프로브를 개발하기 위한 전략으로 (A) 시겔라 (UidA 피크에만 해당), (B) 대장균 (uidA 및 lacY 피크), (C) A. baumannii (ompA 피크), (D) P. aeruginosa (ecfX 피크), (E) K. pneumoniae (phoE 피크), (F) ESBL 생성 대장균 (uidA, lacY 및 CTX-M 그룹 1 피크)을 검출한 결과이다.
도 4는 5종 병원균의 게놈 DNA의 혼합물을 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP를 이용하여 다중 검출한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의하여 임상에서 분리한 68종의 병원균을 본 발명의 프로브를 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP를 이용하여 검출한 결과이다.
도 6은 균주에서 분리된 게놈 DNA의 농도를 단계별로 희석한 후 MLPA 및 CE-SSCP를 이용하여 본 발명의 프로브의 검출 한계를 확인한 것으로, (A)는 예비 증폭 단계가 없는 경우이고, (B)는 예비 증폭 수행 후의 결과이다.
도 7은 총 반응시간을 최소화 하기 위하여, 혼성화 시간을 12시간부터 1시간까지 점차적으로 줄이면서 최적의 혼성화 시간을 확인한 결과이다.
도 8은 패혈증 환자 혈액의 혈장에서 얻은 무세포 DNA를 MLPA 및 CE-SSCP 분석한 결과로, (A)는 A. baumannii (106, 104, 102 CFU / mL)를 5ml 혈액과 혼합하고 혈장을 분리 하였을 때, 검출 한계를 나타낸 것이고, (B)는 7 명의 발열 환자의 혈액 샘플 검사 결과, 많은 양의 숙주 게놈 DNA와 비특이적 반응없이 병원균이 명확하게 검출된 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 MLPA(Multiplex ligation dependant probe amplification)에 의하여 패혈증을 유발하는 그람 음성균의 존재 유무, 종류 및 약물 내성을 판단하는데 사용되는 그람 음성균 서열에 상보적으로 결합하고 증폭되는 프로브를 제공한다.

본 발명에서 "프로브"란 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 이후 증폭, 분리 및 검출에 의하여 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 다. 본 발명에 있어서, "프로브" 는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

하기 도 1은 본 발명에 의한 스터퍼 서열을 가지지 않는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브의 구조를 나타낸 도면으로, 본 발명의 그람 음성균 검출용 프로브는 LHO 프로브와 RHO 프로브로 구성되며, 상기 LHO(left hybridization oligonucleotide)는 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역과 그 업스트림에(upstream)에 연결된 정방향 프라이머 결합 영역으로 구성되고, 상기 RHO(right hybridization oligonucleotide)는 표적 서열의 시료의 상기 제 1 영역과 연속적으로 연결되는 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(Right Hybridization Sequence)와 그 다운스트림(downstream)에 연결된 역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된다.

이 때, 상기 제 1 영역은 본 발명의 서열목록 13 내지 18에 나타나 있는 표적 서열에 있어서 LHS가 특이적으로 혼성화하는 일련의 염기서열로 정의될 수 있다. 제 2 영역에 대한 정의 또한 RHS가 특이적으로 혼성화하는 일련의 염기서열로 정의될 수 있으며, 상기 제 1 영역에 연속적으로 연결된 서열로 정의될 수 있다.

상기 LHS 의 LHO(left hybridization oligonucleotide)와 RHS 의 RHO(right hybridization oligonucleotide)가 각각 표적 서열의 제 1 혼성화 영역과 제 2 혼성화 영역에 특이적으로 혼성화하며, 이 때, LHO (left hybridization oligonucleotide)와 RHO(right hybridization oligonucleotide)가 시료의 정확한 위치에 혼성화가 이루어지면 연결 효소인 라이게이즈(ligase)에 의해 LHO 의 말단과 RHO의 말단이 서로 연결되어 (정방향 프라이머 결합 영역-LHO-RHO-역방향 프라이머 결합 영역)으로 구성되는 프로브 어셈블리(probe assembly)가 형성된다.

이와 같이 프로브 어셈블리가 형성된 이후에는 상기 LHO(left hybridization oligonucleotide) 프로브와 RHO(right hybridization oligonucleotide) 프로브가 각각 포함하고 있던 정방향 프라이머 결합 영역 및 역방향 프라이머 결합 영역에 특이적인 프라이머가 결합되고, 이에 의하여 상기 프로브 어셈블리를 주형으로 하여증폭되게 된다.

이에 비해 프로브 어셈블리가 형성되지 못하는 경우, 프로브 어셈블리의 증폭이 전혀 불가능하게 되므로 결과적으로 혼성화 정도에 따라 프로브 어셈블리의 증폭되는 정도가 달라지게 되며, 결과적으로 상기 프로브가 특이적으로 혼성화하는 유전자의 검출이 가능하게 된다. 이때 상기 프로브 어셈블리를 주형으로 증폭시키기 위해서는 PCR, MPCR, Real time RT-PCR 등 당업계에 알려진 방법들을 적용하는 것이 가능하다.

상기 정방향 프라이머 결합 영역과 역방향 프라이머 결합 영역은 타겟 서열인 패혈증-유발 그람 음성균의 특이적 서열에 결합하지 않도록 디자인되지만, 특별히 제한되지 않고 일반적으로 PCR 증폭시 사용되는 프라이머를 사용할 수 있고, 공통 프라이머 서열을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 검출하고자 하는 유전자 시료의 증폭에 사용되는 시발체를 의미한다. 또한, 본 발명의 '공통 프라이머'는 본 발명의 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브에 연결되어 상기 프로브의 증폭 반응에 사용되는 프라이머이다.

본 발명의 공통 프라이머의 길이는 10 내지 40개의 염기로 설계될 수 있으며, 바람직하게는 15 내지 30개의 염기로 설계될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 19 내지 23개의 염기로 설계될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다 또한 상기 프라이머 또는 시발체는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로, 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태 일 수 있다.본 발명의 프라이머 또는 시발체는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수있다 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 공통 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer)로 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3', 역방향 프라이머(reverse primer)로 5'-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3' 의 염기서열로 이루어질 수 있다. 이와 같이 본 발명의 공통 프라이머를 사용하게 되면, 한 세트의 공통 프라이머 만으로도 여러 종류의 프로브에 적용시킬 수 있어 더욱 신속하게 다중 증폭 반응을 수행할 수 있다.

본 발명의 그람 음성균 검출용 프로브는 상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열번호 1 및 서열번호 2인 제1 프로브, 서열번호 3 및 서열번호 4인 제2 프로브, 서열번호 5 및 서열번호 6인 제3 프로브, 서열번호 7 및 서열번호 8인 제4 프로브 및 서열번호 9 및 서열번호 10인 제5 프로브로 이루어진 그룹에서 선택된 프로브일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 LHS(left hybridization sequence) 및 RHS(right hybridization sequence)가 각각 서열번호 1 및 서열번호 2인 제1 프로브는 대장균(Escherichia. coli)의 유전자 lacY의 서열번호 13에 특이적으로 혼성 결합하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4인 제2 프로브는 대장균(Escherichia. coli) 및 이질균(Shigella spp)의 유전자 uidA의 서열번호 14에 특이적으로 혼성 결합하고, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6인 제3 프로브는 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 유전자 ompA의 서열 번호 15에 특이적으로 혼성 결합하고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8인 제4 프로브는 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae)의 유전자 phoE의 서열 번호 16에 특이적으로 혼성 결합하고, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10인 제5 프로브는 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)의 유전자 ecfX의 서열 번호 17에 특이적으로 혼성 결합한다.

본원 발명에 있어서, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브는 먼저 대장균(Escherichia. coli), 이질균(Shigella spp), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae) 및 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa) 유전자를 확보하고, 각각의 변종에 있어서 공통되는 부분의 유전자 서열을 확정한다. 이후 이와 같이 식중독균의 유전자 서열 중 프로브 어셈블리의 결합 서열로 결정된 서열을 LHS 와 RHS 로 포함하는 LHO, RHO 프로브로 나누어 디자인 하였다. 이때, 본원 발명에 있어서, 스터퍼 서열을 가지지 않는 식중독균 검출용 프로브 LHS, RHS 및 이들이 라이게이션된 프로브 어셈블리를 디자인하기 위해 다음과 같은 조건을 검토하였다.

가장 먼저 서열의 길이를 고려하였다. 프로브 및 프로브 어셈블리의 길이는 필요에 따라 길어질 수 있지만, 길이가 너무 길면 특이성이 증가하는 것이 아니라 잘못된 혼성화가 증가하여 특이성이 저하할 가능성이 커진다.

다음으로 결합능을 고려하였다. 프로브와 표적 서열 사이의 결합능은 프로브 디자인에 가장 기본적인 요소의 하나이다. DNA와 DNA의 특이적 결합은 뉴클레오티드의 A, G, C, T의 특이적 결합에 의한 것으로 필연적으로 A,T 가 많은 프로브의 결합능력은 G, C 가 많은 프로브의 결합능력보다 약하다. DNA는 조건에 따라 특이성이 저하하여 미스매치(mismatch)가 발생하더라도 결합하는 경우(위양성)가 있기 때문에 특이적인 결합능이 중요하다.

올리고뉴클레오티드의 결합능은 일반적으로 Tm 으로 나타낼 수 있다. Tm은 올리고뉴클레오티드와 DNA가 혼성화되어진 것에 열을 가함으로서 혼성화가 해리되어 50% 올리오뉴클레오티드로 혼성화되고 나머지 50%의 DNA가 해리될 때의 온도를 말한다. 따라서 Tm의 조절로 결합능을 설정한다.

세번째로 이차구조를 고려하였다. 올리고뉴클레오티드는 프로브 간에 혼성화할 가능성이 크기 때문에 각 서열의 G값을 설정하였다.

마지막으로 특이성을 검토하였다. 프로브 염기서열의 특이성을 살피기 위해 상동성(homology)을 검색하였다. 그러나 상동성은 유전자 염기서열의 유사도를 살펴보는 것이 목적이므로 상동성과 올리고뉴클레오티드의 결합능에는 차이가 있다. 이 때문에 Tm 값 외에 어라인먼트 스코어(Alignment score)도 설정하였다.

본 발명의 그람 음성균 검출용 프로브는 또한, 상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열번호 11 및 서열번호 12인 제6 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 각각 서열번호 11 및 서열번호 12인 제6 프로브는 ESBL-생성 균주의 유전자 CTX-M group 1의 서열 번호 18에 특이적으로 혼성 결합할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제1 프로브 내지 제6 프로브 중 2종 내지 6종을 동시에 사용하는 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트를 포함한다.

본 발명에서는 상기 5개의 병원균과 특이적으로 결합하는 12가지 프로브를 사용하여 복수개의 그람 음성균에 의한 검출 여부를 한 번에 실행하는 것으로 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 프로브 내지 제12 프로브를 모두 동시에 사용하는 경우에도 각각의 그람 음성균을 동시에 검출하는 것이 가능하다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 포함하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물을 제공한다.

상기 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물은 상기 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브와 공통 프라이머 이외에도, dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염을 포함할 수 있다

다른 측면에서, 본 발명은 상기 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물을 포함하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 키트를 제공한다.

상기 본 발명의 키트는 상술한 패혈증-유발 그람 음성균 이외에도 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 사용하고, MLPA (Mutiplex ligation dependant probe amplification)에 의하여 혼성, 증폭된 후, 증폭된 그람 음성균 유전자를 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 검출하는, 패혈증-유발 그람 음성균을 검출하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 패혈증-유발 그람 음성균의 검출방법은 하기 단계를 포함한다:

시료를 예비 증폭시키는 단계(S1);

예비 증폭된 시료를 제1항의 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트와 접촉시켜 혼성화시키는 단계(S2);

상기 시료와 혼성화된 프로브를 라이게이션(ligation)하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성시키는 단계(S3);

상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계(S4);

상기 증폭 산물을 분리 및 검출하는 단계(S5);

상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 패혈증-유발 그람 음성균이 존재하는 것으로 판단하는 단계(S6).

본 발명에서 용어, "시료"는 검출하고자 하는 유전자 부위를 포함하는 유전자 시료를 말한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류 (예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다.

상기 단계(S1)의 시료를 예비 증폭시키는 단계에서는 제1 프라이머 세트 내지 제6 프라이머 세트를 이용하여 시료 내의 균주의 표적 서열의 제1 영역 및 상기 제1 영역과 연속으로 연결된 제2 영역을 증폭시키는 것을 특징으로 한다. 예비 증폭 단계를 통해 검출 시스템의 민감도와 속도를 향상시킬 수 있다.

상기 단계(S2)에서, 상기 시료의 표적 서열 제1 영역과 상기 LPO 프로브의 LHS가 혼성화되고, 상기 시료의 표적 서열 제2 영역과 상기 RPO 프로브의 RHS 가 혼성화되고, 상기 단계(S2)에서 혼성화는 3시간 내지 20시간이 소요될 수 있다.

상기 단계(S3)에서, 상기 시료의 제 1 영역과 혼성 결합된 LPO의 LHS의 말단과 상기 시료의 제2 영역과 혼성 결합된 RPO의 RHS의 말단을 라이게이션(ligation)하여 정방향 프라이머 결합 영역-LHS-RHS-역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성할 수 있다.

상기 라이게이션 반응에서 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 없는 중합 효소(polymerase)를 사용할 수 있다. 본 발명의 그람 음성균 검출용 프로브들이 주형(template) 내 돌연변이 유전자가 존재하는 타깃 부분에 공백을 형성하며 혼성화 되기 때문에, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 없는 중합 효소(polymerase)를 사용하게 되면 프로브 간의 공백이 채워지게 된다. 또한, 상기 라이게이션 반응에서 닉(nick)을 결합하기 위한 연결효소를 사용하면 프로브 간 공백을 채운 후 형성된 닉(nick)을 결합할 수 있다.

또한 상기와 같은 라이게이션 반응을 이용하면, 매우 근접하게 위치한 highly polymorphic region 에 대하여 프로브들이 경쟁적인 혼성화에 의해 발생시키는 오류를 최소화하고 더욱 정확하고 효율적인 패혈증-유발 그람 음성균의 동시진단이 가능하게 된다.

상기 단계(S4)는, 상기 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 LPO(left probe oligonucleotide)가 포함하는 정방향 프라이머 결합 영역, 및 RPO(right probe oligonucleotide)가 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역에 상보적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)가 PCR 증폭시키는 단계이다.

상기 단계(S4)에 PCR 방법은 중합효소 연쇄반응으로 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다 또한, 이에 제한하지 않고 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction;LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법으로 대체할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법인 PCR 방법을 사용하였다.

상기 단계(S5)는, 프로브 어셈블리를 주형으로 하여 증폭된 PCR 산물을 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 및 검출하는 방법이다.

상기 모세관 전기영동 기반 단일쇄형태다형성 분석을 사용한 분리 방법은 기존의 LDR 기법이나 MLPA 검출방법과는 상이하고 해상도가 더욱 향상된 방법으로, 각 프로브의 단일염기서열이 비변성(non-denaturing) 조건에서 가지게 되는 3차원 구조의 차이에 의해 CE안에서 검출되는 방법이다 이 3차원 구조는 염기서열의 차이에 의해 결정되기 때문에 염기서열에 따른 분리검출 방법이라 할 수 있다. 따라서 본 발명의 라이게이션 반응을 통해 생성된 패혈증 유발 그람 음성균 검출용 프로브 또는 이들의 증폭 산물이 그들의 염기서열에 따라 고유한 2차 구조를 형성할 수 있다. 본 발명에 있어서, MLPA (Mutiplex ligation dependant probe amplification)에 의하여 프로브 어셈블리를 주형으로 증폭된 증폭 산물을, 종래의 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis)을 사용하여 분리, 검출하는 방법 대신 단일쇄 형태변환 다형성(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)을 이용하여 분리, 검출하기 때문에 스터퍼(stuffer) 염기서열이 포함되지 않고, 프로브의 길이가 동일하더라도 식중독균 유전자를 검출하는 것이 가능하게 된다.

단일쇄 형태변환 다형성(SSCP)은 DNA 뉴클레오티드 서열의 변화가 단일쇄 DNA의 구조적 접힘의 변화를 일으키고, 전기영동시 이동거리에 차이가 생기는 원리, 즉, DNA를 구성하는 염기들(A,T,C,G)이 전기에 끌려가는 정도가 다름을 이용한다. 방법적으로는 ds-DNA를 고온에서 열변성시키면 변성되어 ss-DNA로 변하게 되며 이를 급냉시키면 초기 상태의 ds-DNA로 돌아가지 못하고 ss-DNA 자체 내에서 염기 배열에 따라 서로 다른 특유의 유전자 입체구조를 형성하게 된다. 이러한 다양한 입체구조를 가진 유전자 조각들을 전기영동을 하게 되면 유전자 구조상의 변화로 인해 서로 다른 이동속도를 가지게 된다. 따라서 비록 같은 길이의 ds-DNA 서열이라 할지라도 다른 유전자 염기를 가지고 있으면 SSCP 방법에 의해 새로운 입체구조를 가진 각기 다른 유전자 조각들이 고분자 혼합젤이 충진된 모세관을 통과하면서 각기 다른 이동속도를 나타내어 염기서열의 판별이 가능하게 되는 것이다.

본 발명의 패혈증-유발 그람 음성균을 검출하는 방법을 이용하면, 간편한 단계만으로 신속하고 정확하게 여러 종류의 패혈증-유발 그람 음성균을 동시에 검출할 수 있으며, 동시에 약물 내성 병원균을 판별해낼 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 패혈증-유발 그람 음성균 검출 방법을 이용하여 패혈증 치료를 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다. 구체적으로 패혈증-유발 그람 음성균의 존재, 종류 및 약물 내성을 조기에 판정하여 적합한 항생제를 처방할 수 있도록 하는 등 패혈증 치료를 위한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 주요 그람 음성 병원체에 특이적인 유전자(대장균의 경우 uidA와 lacY, A.baumannii의 경우 ompA, K. pneumoniae의 경우 phoE, P. aeruginosa의 경우 ecfX)를 수정하여 5 개의 MLPA 프로브 세트를 제작하고, ESBL을 생성하는 그람 음성균을 검출하기 위해 ESBL-생산 그람 음성균에서 가장 많이 유행하는 유전자인 CTX-M 유전자에 대한 MLPA 프로브를 제작했다(실시예 1-3).

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에서 제작한 MLPA 프로브가 비특이적 반응없이 정확하게 표적 병원체를 검출하며, CTX-M group 1 프로브는 기준 병원균과 환자의 혈액을 함께 섞은 샘플 모두에서 ESBL 생산 균주와 ESBL을 생산하지 않는 균주를 구별하는 것을 확인하고(실시예 2), 우수한 특이성을 지닌 다중 식별 시스템을 구축 할 수 있음을 확인하였으며(실시예 3), 28 개의 그람 음성균을 포함한 68 개의 임상 검체에서 DNA를 검사하였을 때 모든 그람 음성균을 성공적으로 확인하여 본 발명의 검출 시스템의 우수한 특이성과 임상적용 가능성을 제시하였다(실시예 4).

본 발명의 다른 실시예에서는 검출 감도를 높이기 위해 표적 특이적인 예비 증폭 단계를 추가한 결과 예비 증폭이 없는 방법에 비해 감도가 100 배 향상되는 것을 확인하였다(실시예 5).

본 발명의 다른 실시예에서는 병원균의 신속한 동정을 위해 이전 연구 ^[15]와 비교하여 혼성화 시간을 최소화하고자 시도한 결과, 혈액 샘플링 후 6 시간 이내에 단일 패혈증을 유발하는 그람 음성균을 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다(실시예 6).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에서는 먼저 10,000 배 이상의 인간 게놈 DNA (10 ng)를 병원균 DNA (10 fg)의 최소 검출 가능한 양과 혼합하여 본 발명의 검출 시스템의 검출 능력을 확인하여본 결과, 비 특이성 또는 위음성 결과는 관찰되지 않음을 확인하였고, A. baumannii 스파이킹 테스트를 통해 감염된 혈액의 혈청에서 그람 음성균을 검출할 수 있는지 평가하였으며, 본 발명의 MLPA-CE-SSCP 시스템이 감염된 혈장의 그람 음성균을 최소 검출 한계 10 CFU / mL로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 'ESBL-생산 E. coli'와 'ESBL-비생산 E. coli'를 구별 할 수 있고, 임상 환경에서 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다(실시예 7).

이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.

실시예 1. 재료 및 방법

1-1. 시료 DNA의 준비

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC), 한국 생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC), 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens, NCCP) 및 덴마크 국립혈청연구소 (Statens Serum Institut, SSI)에서 동정한 하기 표 1의 38종 균주를 패혈증 유발 그람음성 병원균 검출 방법의 참조 균주로 선정하였다.

또한, 질병관리본부(KCDC) 및 서울성모병원에서 수집한 임상에서 분리된 하기 표 2 및 표 3의 68종 병원균을 검출 특이성을 확인하는 데 사용하였다.

각각의 균주는 혈액한천배지(Hanil Komed, Co., Korea) 또는 TSA 배지(BD, Sparks, MD, USA)에서 배양하였으며, 분리된 콜로니는 TSA 배지(BD) 또는 Todd Hewitt Yeast 배지(BD)에서 배양 후 GIAamp DNA 키트(Qiagen, Germantown, MD, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.

	No.	Strains	Species	Characteristics
Gram Negative	1	KCTC 12404	Acinetobacter baumannii
	2	KCTC 2508	Acinetobacter harmolyticus
	3	KCTC 2509	Citrobacter freundii
	4	ATCC 25922	Escherichia coli
	5	ATCC 43894	Escherichia coli O157:H7
	6	KCTC 2190	Enterobacter aerogenes
	7	KCTC 2361	Enterobacter cloacae
	8	KCTC 12878	Klebsiella alba
	9	KCTC 1686	Klebsiella oxytoca
	10	KCTC 12385	Klebsiella pneumoniae
	11	NCCP 15782	Klebsiella pneumoniae
	12	KCTC 2566	Proteus mirabilis
	13	NCCP 14570	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	14	NCCP 14571	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	15	NCCP 14572	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	16	NCCP 14573	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	17	ATCC 27853	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	18	KCTC 1644	Pseudomonas putida
	19	KCTC 42171	Serratia marcescens
	20	KCTC 22528	Shigella boydii
	21	KCTC 22192	Shigella flexneri
	22	KCTC 2518	Shigella sonnei
	23	ATCC 19585	Shigella sonnei
Gram Positive	24	KCTC 3135	Baciilus subtilis
	25	KCTC 3624	Bacillus cereus
	26	ATCC 29212	Enterococcus faecalis
	27	BM4147	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	28	KCTC 12400	Salmonella enteritidis
	29	ATCC 19585	Salmonella typhi
	30	KCTC 1917	Staphylococcus epidermidis
	31	KCTC 3345	Staphylococcus saprophyticus
	32	KCTC 3340	Staphylococcus warneri
	33	ATCC 29213	Stapylococcus aureus	methicillin susceptible
	34	82175^a	Streptococcus pneumoniae	serotype 1
	35	82219^a	Streptococcus pneumoniae	serotype 19A
	36	82178^a	Streptococcus pneumoniae	serotype 4
	37	82179^a	Streptococcus pneumoniae	serotype 5
	38	82183^a	Streptococcus pneumoniae	serotype 7F

a, The numbers are assigned from Statens Serum Institut (Copenhagen, Denmark).

	No.	Strains	Species	Characteristics
Gram Negative	1	Aci_080004	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	2	Aci_080014	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	3	Aci_090023	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	4	Aci_090047	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	5	Aci_090050	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	6	Aci_100085	Acinetobacter baumannii	carbapenem susceptible
	7	Aci_100087	Acinetobacter baumannii	carbapenem resistant
	8	Aci_110089	Acinetobacter baumannii	carbapenem susceptible
	9	cmEC-1	Escherichia coli	carbapenem resistant
	10	cm66	Escherichia coli	CTX-M group 9
	11	cm116	Escherichia coli	CTX-M group 9
	12	cm223	Escherichia coli	CTX-M group 1
	13	cm241	Escherichia coli	CTX-M group 1
	14	cm271	Escherichia coli	CTX-M group 1
	15	cm402	Escherichia coli	CTX-M group 1
	16	cm447	Escherichia coli	CTX-M group 9
	17	cm450	Escherichia coli	CTX-M group 1
	18	13B-236	Klebsiella pneumoniae	carbapenem susceptible
	19	13B-333	Klebsiella pneumoniae	carbapenem susceptible
	20	cmKP-1	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	21	cmKP-2	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	22	cmKP-3	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	23	cmKP-4	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	24	cmKP-5	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	25	cmKP-6	Klebsiella pneumoniae	carbapenem resistant
	26	cmPA-1	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	27	cmPA-2	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant
	28	cmPA-4	Pseudomonas aeruginosa	carbapenem resistant

	No.	Strains	Species	Characteristics
Gram positive	1	cmef019293	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	2	cmef03B53	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	3	cmef03B69	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	4	cmef04B18	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	5	cmef04B10	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	6	cmef05B16	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	7	cmef06B3	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	8	cmef13B37	Enterococcus faecium	vancomycin susceptible
	9	cmef13B62	Enterococcus faecium	vancomycin susceptible
	10	cmefV219	Enterococcus faecium	vancomycin resistant
	11	cm03	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	12	cm10	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	13	cm11	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	14	cm14	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	15	cm25	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	16	cm29	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	17	cm90	Stapylococcus aureus	methicillin susceptible
	18	cm93	Stapylococcus aureus	methicillin susceptible
	19	cm97	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	20	cm119	Stapylococcus aureus	methicillin resistant
	21	cmSP_1	Streptococcus pneumoniae
	22	cmSP_8	Streptococcus pneumoniae
	23	cmSP_9	Streptococcus pneumoniae
	24	cmSP-11a	Streptococcus pneumoniae
	25	cmSP-12	Streptococcus pneumoniae
	26	cmSP-13	Streptococcus pneumoniae
	27	cmSP-13a	Streptococcus pneumoniae
	28	cmSP-14	Streptococcus pneumoniae
	29	cmSP_17	Streptococcus pneumoniae
	30	cmSP-18	Streptococcus pneumoniae
	31	cmSP-24	Streptococcus pneumoniae
	32	cmSP-31	Streptococcus pneumoniae
	33	cmSP-33	Streptococcus pneumoniae
	34	cmSP-35	Streptococcus pneumoniae
	35	cmSP-37	Streptococcus pneumoniae
	36	cmSP-39	Streptococcus pneumoniae
	37	cmSP_60	Streptococcus pneumoniae
	38	cmSP-61	Streptococcus pneumoniae
	39	cmSP-65	Streptococcus pneumoniae
	40	cmSP-67	Streptococcus pneumoniae

1-2. 검출 대상이 되는 패혈증-유발 그람 음성균의 서열 결정

주요 패혈증 유발 균주로 널리 알려진 상기 표 1의 대장균(Escherichia. coli), 이질균(Shigella spp), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)에 대하여 문헌 조사를 통해 각 균주 유전자의 검출에 사용되는 종 특이적 유전자 또는 서열을 선정하였다.

각 균주 유전자 검출에 사용되는 유전자와 염기서열의 확보 후 NCBI blast(basic local alignment search tool)를 사용하여 각각의 균주의 DNA 서열의 데이터베이스와 비교한 후 특이적인 염기서열을 결정하였다.

각 균주가 공통으로 포함하는 서열 부분을 프로브가 특이적으로 혼성화하는 부분으로 결정하였다. 그 결과는 아래 표 4과 같다. 각 균주의 서열 부분은 LHS (left hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화하는 표적 서열의 제1 영역과 이와 연속으로 연결되는 RHS(right hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화하는 표적 서열의 제2 영역의 결합이다.

종	혼성화 서열 (Hydridization Sequence)	서열 번호
E. coli	GACGATTTATCTGGTCTGTTTCTGCTTCTTTAACAATACCACCGGTGCAGCGAGCATT	13
Shigella spp E. coli	GAAGGGCGAACAGTTCCTGATCAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGA	14
A. baumannii	CAGTTGAACCAACTCCAGTTGCTCCACAACCACAAGAGTTAACTGAAGACCTTAACATGGAACTTCG	15
K. pneumoniae	CCTGCAGTACCAGGGTAAAAACGAAGGCCGTGAAGCGAAGAAACAGAACGGCGA	16
P. aeruginosa	GCCGCGCGCATTTCTTTTCCAGATCGCCCGCAACTTGTTGCGCGACCATTGG	17
ESBL-생성 균주	GCCAACGGGCGCAGCTGGTGACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATT	18

1-3. MLPA 프로브의 제작

MLPA 프로브는 유니버설 프라이머 인식 서열(universal primer recognition site) 및 표적 혼성화 서열(hybridization sequence)로 이루어지며 상기 실시예 1에서 결정된 특이적 서열을 기반으로 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 디자인하였다.

상기 선정된 유전자 또는 서열의 특이성(uniqueness)을 BLAST로 확인한 후, 상기 확인한 유전자 또는 서열 안에 라이게이션자리(ligation site)가 들어갈 수 있도록 LHS(left hybridization sequence) 와 RHS(right hybridization sequence) 서열을 디자인하였다. 또한 ESBL을 생성하는 그람 음성균을 검출하기 위해 그람 음성균의 CTX-M group 1을 표적으로 하는 MLPA 프로브를 추가로 설계하였다.

상기 LHS 와 RHS의 서열 길이는 각각 21nt~50nt가 되고, LHS 와 RHS의 Tm 을 각각 70 내지 80℃ 및 GC 함량은 35 내지 65%가 되도록 디자인하였다. 각 프로브 시퀀스의 Gibbs 자유 에너지 (Gib)는 mfold 소프트웨어 (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/)를 사용하여 계산하였고 Gibbs 자유 에너지의 값이 0 이하가 되는 프로브를 선택 하였다. 범용 프라이머 서열 정보는 표 4에 열거되어있다. ClustalOmega 소프트웨어(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 CTX-M 패밀리 유전자에 대한 상동성 점수를 계산하여 CTX-M 그룹 1의 특정 서열을 도출하였다. 이와 같이 디자인된 LHS 와 RHS 서열의 특이성을 BLAST를 이용하여 확인하였다.

상기 확인된 LHS, RHS의 모든 서열의 상동성을 비교하여 alignment score가 50 이하가 되도록 하고, 확인된 alignment score가 50 이하인 LHS, RHS에 공통 프라이머 결합 서열(common primer binding sequence)을 더하여 LHO(left hybridization oligonucleotide), RHO(right hybridization oligonucleotide)를 만들고 각각의 LHO, RHO의 Gibbs 자유 에너지 값의 차이가 0 이하가 되도록 하여 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브를 완성하였다. 완성된 프로브 서열을 아래 표 4에 나타내었다. 프로브는 증폭산물의 길이 다형성(length variation)을 고려하지 않고 디자인하였으며, 94~109 nt 의 길이 범위로 하였다.

종	유전자	종류	표적 혼성화 서열 (5'-3')	길이^a)	서열목록
E. coli	lacY	LHS	GACGATTTATCTGGTCTGTTTCTGCTTCTTTAA	106	1
		RHS	CAATACCACCGGTGCAGCGAGCATT		2
Shigella spp E. coli	uidA	LHS	GAAGGGCGAACAGTTCCTGATCAACCACAAACCGT	108	3
		RHS	TCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGA		4
A. baumannii	ompA	LHS	CAGTTGAACCAACTCCAGTTGCTCCACAACCACAA	109	5
		RHS	GAGTTAACTGAAGACCTTAACATGGAACTTCG		6
K. pneumoniae	phoE	LHS	CCTGCAGTACCAGGGTAAAAACGAAGG	96	7
		RHS	CCGTGAAGCGAAGAAACAGAACGGCGA		8
P. aeruginosa	ecfX	LHS	GCCGCGCGCATTTCTTTTCCAGATCGCCCG	94	9
		RHS	CAACTTGTTGCGCGACCATTGG		10
ESBL-생성 균주	CTX-M group 1	LHS	GCCTTAGGTTGAGGCTGGGTGAAG	101	11
		RHS	AATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGG		12

a) 표 5에서 길이는 표적 혼성화 서열 및 프라이머 인식 서열을 포함하는 MLPA 반응 후 총 프로브 길이를 의미함

1-4. 시료 DNA의 예비 증폭(pre-amplification)

준비된 균주에서 분리한 genomic DNA 5μL와 하기 표 5의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 10 μM 및 증류수를 사용하여 20 μL로 조절한 혼합액을 Multiplex PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 사전 증폭용 프라이머는 MLPA 프로브의 혼성화 표적 서열을 포함하는 특정 게놈 영역을 증폭 시키도록 설계되었다(표 6). PCR 반응은 초기 98℃ 10초 변성 후 98℃ 30초(변성), 53℃ 30초(어닐링), 72℃ 60초 신장 반응의 35 사이클과 72℃ 7분 최종 신장 반응으로 진행되었다.

종	유전자	종류	프라이머 서열	서열번호
E. coli	lacY	정방향	TTACCAGCCAGTTTGAAGTGCGTTTT	19
E. coli	lacY	역방향	CTTATCTGGTGCTGGGTCTGGTGG	20
Shigella spp E. coli	uidA	정방향	GTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGT	21
Shigella spp E. coli	uidA	역방향	CTTCAGCGTAAGGGTAATGCGAGGT	22
A. baumannii	ompA	정방향	CACTTGAAGCCTGCTGCTCCTGTAGT	23
A. baumannii	ompA	역방향	AGGTCACACAGATAACACTGGTCCACG	24
K. pneumoniae	phoE	정방향	GCCCAGGATACTTTCGCCCAGT	25
K. pneumoniae	phoE	역방향	AACAGCAGCAGCGCCTCAGCC	26
P. aeruginosa	ecfX	정방향	GACCTACCGCAACACCGACTTCTTC	27
P. aeruginosa	ecfX	역방향	GCCAGCAGGTTCTGATCGTTGGT	28
ESBL-생성 균주	CTX-M group 1	정방향	AATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGG	29
ESBL-생성 균주	CTX-M group 1	역방향	GCCTTAGGTTGAGGCTGGGTGAAG	30

1-5. MLPA 반응

MLPA 반응은 Lig-5a 키트(MRC-Holland, Amsterdam, the Netherlands)를 사용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다.

구체적으로, 균주 gDNA 5μL를 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후 MLPA 버퍼(MRC Holland, Netherland) 1.5 μl, 패혈증 유발 그람 음성균 검출용 프로브 1.5 μL를 넣고 60℃에서 반응시켜서 상기 시료의 표적 서열과 LHO, RHO 2개의 프로브를 혼성화시켰다.

혼성화 후 시료의 반응온도를 54℃로 낮춘 후 Ligase 65 1μL, Ligase-65 버퍼 A, B를 각각 3μL, 3차 증류수 25μL를 넣은 후 54℃에서 15분간 반응시킴으로써 혼성 결합된 LHO, RHO 2개의 프로브를 라이게이션(ligation)시켜 프로브 어셈블리(probe assembly)가 형성되도록 하였다. 이후, 98℃에서 5분간 효소를 불활성화시켰다.

상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 LHO, RHO 2개의 프로브가 포함하는 프라이머 결합 영역에 공통 프라이머를 결합함으로써 PCR 증폭시켰다. 공통 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer)로 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3', 역방향 프라이머(reverse primer)로 5'-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3'을 사용하였다.

상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly) 4μL와 공통 프라이머인 정방향 프라이머 10mM, 역방향 프라이머 10mM에 3차 증류수를 사용하여 20μL로 조절한 혼합액을 pfu-PCR premix (Bioneer, Daejoen, Korea)를 사용하여 98℃에서 10초 초기 변성에 이어서, 98℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 60초를 35회 수행한 후 72 ℃에서 7분 동안 최종 신장하여 라이게이션(ligation) 된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 증폭시켰다.

1-6. CE-SSCP 분석

모세관 전기영동 기반 단일쇄형태다형성 분석(Capillary Electrophoresis based Single Strand Conformation Polymorphism, CE-SSCP)은 Pluronic F108 폴리머(Sligma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 50 cm 모세관을 사용하여 수행하였다.

요약하면, 상기 단계들로부터 얻어진 MLPA 산물을 3차 증류수를 사용하여 희석한 후 희석액 1 μL와 0.3 μL POX 500 size standard(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 8.7 μL deionized formamide를 혼합한 후, 95 ℃에서 5 분간 인큐베이팅 하여 변성시켰다. 이후, 곧바로 4 ℃에서 4 분간 인큐베이팅 하여 켄칭시킨 후 ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 사용하여 CE-SSCP 결과를 분석하였다.

1-7. 혈액 스파이킹 실험(Blood spiking test)

인간 전혈은 Innovative Research (Novi, MI, USA)에서 구입하고, A. baumannii를 spiking 실험에 사용하였다. 배양 후 A. baumannii의 콜로니 형성 단위 (Colony forming unit, CFU)는 Clinical and Laboratory Standard Institute 프로토콜을 따르는 plate counting 방법을 사용하여 결정하였다. 그 후 A. baumannii를 EDTA 처리된 혈액 (10⁶, 10⁴, 10² CFU / mL)에 첨가하였다. 혼합한지 1 시간 후에, 감염된 혈액을 1200×g에서 5 분간 원심 분리하고 혈장을 분리 하였다. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)를 사용하여 혈장에서 게놈 DNA를 추출하고 MLPA-CE-SSCP 실험에 사용하였다.

1-8. 패혈증 환자의 혈액을 이용한 MLPA-CE-SSCP 분석

서울성모병원에 입원한 열혈 환자 7 명을 대상으로 서울성모병원 임상시험위원회의 승인을 얻어 전체 혈액 샘플을 채취 하였다. 5ml의 전혈을 1200×g에서 5 분간 원심 분리하여 혈장을 분리하고, 상기에서 설명한 바와 같이 게놈 DNA를 추출하고 MLPA-CE-SSCP 실험에 사용 하였다.

실시예 2. 제작한 프로브의 검증(도 2 및 도 3)

상기 1-3에서 제작한 MLPA 프로브의 특이성을 검증하기 위하여 Single plex MLPA 반응을 수행하여 각 프로브 세트의 특이성을 확인하여 본 결과, 모든 프로브 세트는 ROX 500 size standard(Applied Biosystems)와 비교하여 상대 이동 시간을 기준으로 식별된 특정 대상 피크를 나타낸다(도 2).

대장균을 검출하기 위해 보편적인 E. coli 표적으로 uidA를 표적으로 하는 프로브를 설계했다. 그러나, E. coli와 Shigella spp. 사이의 유전적 유사성으로 인해, uidA 프로브는 E. coli와 Shigella spp.를 구별할 수 없었다. 이에 대장균 종을 정확하게 확인하기 위해 lactose permease를 코딩하는 대장균 특이적 유전자인 lacY를 표적으로 하는 추가적인 프로브를 설계했다 ^{[17, 22]}.

도 3에 나타난 바와 같이, uidA에 해당하는 하나의 피크는 병원체가 시겔라 종 (sigella spp.)임을 나타낸다. (도 3의 A). uidA와 lacY 모두에 해당하는 두 개의 피크는 병원체가 대장균임을 나타낸다 (도 3의 B). 다른 세 가지 병원균 또한 병원균 특이적 피크에 따라 결정될 수 있다 (도 3의 C, D, E).

ESBL을 생성하는 그람 음성균을 검출하기 위해 CTX-M group 1을 대상으로 한 aMLPA 프로브 세트도 CTX-M group 1 특이 서열을 변형시켜 설계하였다^{[23, 24]}. (표 4).

디자인한 프로브가 ESBL을 생산하는 그람 음성균을 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, ESBL 생성 대장균 시료를 이용하여 검출을 수행한 결과 3 개의 피크(CTX-M group 1 피크 1개 및 E.coli 특정 피크 2개)를 확인할 수 있었다 (도 3의 F). 이 결과는 CTX-M group 1 피크가 그람 음성균 특이 피크 이외에 검출되는 경우 이를 ESBL 생성균으로 판정할 수 있음을 시사한다.

실시예 3. Multiplex MLPA-CE-SSCP 분석을 통한 동시검출 특이도 확인(도 4)

상기 1-3에서 제작한 프로브 세트가 다중 조건에서 간섭 또는 교차 반응없이 특이적으로 표적 병원체를 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 ESBL 생산 대장균을 포함하는 5가지 병원체의 gDNA 혼합물 100 pg을 사용하여 Multiplex MLPA-CE-SSCP 분석을 수행하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 각각의 타겟 유전자의 피크를 확인한 결과, 본 발명의 6종 프로브를 사용하여 생성된 생성물이 고유한 이동도를 가짐으로써 나타나는 피크를 확인할 수 있었다. 비특이적인 봉우리는 나타나지 않았으며 6개의 표적 특이적 피크가 명확하게 분리되어 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 임상에서 분리된 패혈증 유발 그람 음성균의 검출 특이도 확인(도 5)

실제 임상에 적용될 수 있을지 확인하기 위하여 질병관리본부(KCDC) 및 서울성모병원에서 수집한 임상에서 분리된 표 2의 68종 병원균을 검출 특이성을 확인하는 데 사용하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[표 7]

표 7에 나타난 바와 같이, 임상에서 분리된 68개의 병원균에서 20종은 그람 음성균으로써, 그중 9종은 대장균, 8종은 A. baumannii, 3종은 P.pneumoniae 및 3종은 P. aeruginosa 인 것으로 확인되었고, 40종은 그람 양성으로써, 그 중 10종은 Staphyococcus aureus, 20종은 Streptococcus pneumoniae 및 10종은 Enterococcus faecium인 것으로 확인되었다. 28 개의 모든 그람음성 임상 검체는 비특이적인 피크나 신호간섭 없이 성공적으로 확인되었다. 그람양성균 40종에서는 예상대로 피크가 관찰되지 않았다.

CTX-M group과 관련하여, CTX-M group 1에 대한 프로브가 group 1과 다른 group을 정확하게 구별할 수 있는지 여부를 확인하여 본 결과 CTX-M group 1의 5 개 균주 모두가 uidA 및 lacY 피크뿐만 아니라 CTX-M group 1 특이적 피크를 나타내었고, CTX-M group 9 개와 ESBL이 아닌 세 개의 분리주는 모두 CTX-M group 1 피크 음성이었다.

실시예 5. MLPA 프로브의 민감도 확인(도 6)

제작한 MLPA 프로브의 민감도를 확인하기 위하여, 표적 병원체의 게놈 DNA를 1 ng에서 1 fg까지 연속 희석하여 검출을 수행한 결과, 최소 검출 한계는 6 개의 모든 표적에 대해 반응 당 10 pg이었다 (도 6의 A). 검출 민감도를 높이기 위해 예비 증폭 후 MLPA 반응을 수행한 결과, 예비 증폭 단계를 도입한 후 최소 검출 한계는 100 fg이 되어 예비 증폭 단계가 없는 조건에 비해 약 100 배 높은 감도를 나타내었다(도 6의 B).

실시예 6. MLPA 프로브의 검출시간 최소화(도 7)

기존의 MLPA 방법은 주로 혼성화에 소요되는 시간 (약 16 시간) 때문에 최종 결과를 보고하는 데 약 20 시간이 소요된다 ^[25]. 본 발명에서는 총 반응 시간을 최소화하기 위해, 표적 게놈 DNA (100 fg)의 최소 검출 가능한 양을 사용하여 충진제가 없는 MLPA 반응에 대한 최적의 혼성화 시간을 확인하였다.

12시간부터 1시간까지 혼성화 시간을 점차적으로 줄이면서 검출반응을 진행하여본 결과, 모든 표적 특이적 피크가 3 시간의 혼성화 반응 후에 충분하게 검출되었음을 확인하였다(도 7).

실시예 7. 감염환자의 혈액시료에서 패혈증-유발 그람 음성균의 검출(도 8)

숙주 게놈 DNA와의 오염은 병원균 특이적 MLPA 반응을 저해할 수 있으므로, 각 병원체 DNA 100 μg (최소 검출 가능량)을 비교적 많은 양의 인간 게놈 DNA (10 ng)와 혼합하고 제작한 프로브를 사용하여 MLPA CE-SSCP 반응을 수행하여 본 결과, 여섯 개의 피크가 모두 비특이적인 피크없이 명확하게 검출되었다(도 8의 B).

그 다음, 본 발명의 프로브 세트가 감염된 혈장으로부터 분리된 병원균의 무세포 DNA를 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 5 mL 혈액에 다양한 농도의 A. vanumanii (10⁶, 10⁴, 10² CFU / mL)를 첨가하여 혈장을 분리하고, 혈장에서 무 세포 DNA를 추출하여 MLPA-CE-SSCP 반응을 수행하였다. 두 가지 조건 (1200g에서 10 분 또는 5 분)으로 플라즈마를 추출하고 검출 한계를 비교하였다. 그 결과, 혈장에서 최소 검출 가능한 양은 1200×g에서 5 분간의 원심 분리로 10 CFU/mL이었다(도 8의 A).

스파이크 된 병원균으로 인체 혈액의 검출 능력을 확인한 후 환자의 혈액 샘플에서 그람 음성균을 검출할 수 있는지 여부를 테스트 했다. 이를 위해 먼저 7 개의 혈액 샘플의 혈액 배양 검사한 결과, 3 가지는 그람 양성균이고, 4가지는 그람 음성균이었다(표 8).

[표 8]

3 가지 배양 양성 혈액 샘플 모두 대장균 특이 피크 (uidA 및 lacY 유전자)를 나타내지만 그람 음성균 특이 피크는 다른 4 가지 샘플에서 검출되지 않았다 (도 8의B). 대장균 특이 피크가 있는 3 개의 샘플 중 하나 (CMCS 03)는 uidA 및 lacY 피크뿐만 아니라 CTX-M 그룹 1 피크를 나타내어 ESBL이 E.coli를 생성함을 나타낸다 (도 8의 B).

요약하면, 본 발명에서는 임상적으로 중요하고 약물 내성인 그람 음성균의 신속 다중 표식을 위한 스타터 프리 MLPA-CE-SSCP 방법을 개발하였고 패혈증 환자의 혈장으로부터 분리된 무세포 DNA에 대한 적용가능성을 검증했다. 본 발명은 주요 패혈증 유발성, 약물 내성 그람 음성균의 검출 및 임상적 환경에서 패혈증 환자의 혈액으로부터 ESBL 생성-그람 음성균 검출에 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 시스템은 미래의 패혈증 환자를 위한 그람 음성균에 대한 효과적인 항생제 치료를 조기에 시작하는 데 도움이 될 수 있으며 이는 더 나은 치료 결과를 위해 매우 중요하다.

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Claims

정방향 프라이머 결합 영역, 및 표적 서열의 제1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LPO(left probe oligonucleotide); 및
상기 표적 서열의 상기 제1 영역과 연속으로 연결된 제2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RPO(right probe oligonucleotide);로 구성되고,
상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열 번호 1 및 서열번호 2인 제1 프로브, 서열번호 3 및 서열번호 4인 제2 프로브, 서열번호 5 및 서열번호 6인 제3 프로브, 서열번호 7 및 서열번호 8인 제4 프로브 및 서열번호 9 및 서열번호 10인 제5 프로브로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia. coli), 이질균(Shigella spp), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae) 및 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 서열 번호 1 및 서열 번호 2인 제1 프로브는 대장균(Escherichia. coli)의 유전자 lacY의 서열 번호 13에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 3 및 서열번호 4인 제2 프로브는 대장균(Escherichia. coli) 및 이질균(Shigella spp)의 유전자 uidA의 서열번호 14에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 5 및 서열번호 6인 제3 프로브는 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 유전자 ompA의 서열 번호 15에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 7 및 서열번호 8인 제4 프로브는 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae)의 유전자 phoE의 서열 번호 16에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 9 및 서열번호 10인 제5 프로브는 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)의 유전자 ecfX의 서열 번호 17에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열 번호 11 및 서열번호 12인 제6 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 서열번호 11 및 서열번호 12인 제6 프로브는 ESBL-생성 균주의 유전자 CTX-M group 1의 서열 번호 18에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는, 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 키트.
하기 단계를 포함하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법:
시료를 예비 증폭시키는 단계(S1);
예비 증폭된 시료를 제1항의 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트와 접촉시켜 혼성화시키는 단계(S2);
상기 시료와 혼성화된 프로브를 라이게이션(ligation)하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성시키는 단계(S3);
상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계(S4);
상기 증폭 산물을 분리 및 검출하는 단계(S5);
상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 패혈증-유발 그람 음성균이 존재하는 것으로 판단하는 단계(S6).
제8항에 있어서,
상기 단계(S1)의 시료를 예비 증폭시키는 단계에서는 제1 프라이머 세트 내지 제6 프라이머 세트를 이용하여 시료 내의 균주의 표적 서열의 제1 영역 및 상기 제1 영역과 연속으로 연결된 제2 영역을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 서열번호 19 및 서열번호 20인 제1 프라이머 세트는 대장균(Escherichia. coli)의 유전자 lacY의 제1 영역 및 제2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 21 및 서열번호 22인 제2 프라이머 세트는 대장균(Escherichia. coli) 및 이질균(Shigella spp)의 유전자 uidA의 제1 영역 및 제2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 23 및 서열번호 24인 제3 프라이머 세트는 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 유전자 ompA의 제1 영역 및 제2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 25 및 서열번호 26인 제4 프라이머 세트는 크렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae)의 유전자 phoE의 제1 영역 및 제2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 27 및 서열번호 28인 제5 프라이머 세트는 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)의 유전자 ecfX의 제1 영역 및 제2 영역을 증폭하는 것을 특징으로 하는, 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S2)에서, 상기 시료의 표적 서열 제1 영역과 상기 LPO 프로브의 LHS가 혼성화되고, 상기 시료의 표적 서열 제2 영역과 상기 RPO 프로브의 RHS 가 혼성화되는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S2)에서 3시간 내지 20시간 동안 혼성화되는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S3)에서, 상기 시료의 제 1 영역과 혼성 결합된 LPO의 LHS의 말단과 상기 시료의 제2 영역과 혼성 결합된 RPO의 RHS의 말단을 라이게이션(ligation)하여 정방향 프라이머 결합 영역-LHS-RHS-역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S4)에서, 상기 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 LPO(left probe oligonucleotide)가 포함하는 정방향 프라이머 결합 영역, 및 RPO(right probe oligonucleotide)가 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역에 상보적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)가 PCR 증폭되는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S5)에서, 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 증폭된 PCR 산물을 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 및 검출하는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계(S2)에서, 제4항에 의한 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 프로브 세트를 사용하여 복수의 그람 음성균의 존재를 한 번에 검출하는 것을 특징으로 하는 패혈증-유발 그람 음성균의 존재를 검출하는 방법.
제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법을 이용한, 패혈증 치료를 위한 정보제공 방법.