FI121428B - Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi - Google Patents
Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI121428B FI121428B FI20085039A FI20085039A FI121428B FI 121428 B FI121428 B FI 121428B FI 20085039 A FI20085039 A FI 20085039A FI 20085039 A FI20085039 A FI 20085039A FI 121428 B FI121428 B FI 121428B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- bacterial
- primers
- bacterial species
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerila-jien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi
Keksinnön ala
Keksintö koskee menetelmää bakteerilajien tunnistamiseksi ja bak-5 teeri-infektioiden diagnosoimiseksi sekä menetelmässä käyttökelpoisia parannettuja laajakirjoisia alukkeita ja testipakkausta.
Keksinnön tausta
Verenmyrkytys on vakava, jopa hengenvaarallinen systeeminen sairaus, joka on seurausta verenkierron infektoitumisesta myrkkyjä tuottavilla bak-10 teereilla. Verenmyrkytyksessä verenkiertojärjestelmän toimintahäiriö saattaa johtaa useiden elinten pettämiseen ja verenpaineen putoamiseen saaden aikaan shokkitilan. Verenmyrkytys on maailmanlaajuisesti yleisin kuolinsyy teho-hoitoyksiköissä kuolleisuusasteen vaihdellessa 20 %:n ja 60 %:n välillä.
Verenmyrkytysten diagnostiikka on pääasiassa bakteeriviljelyn va-15 rassa. Bakteerien viljeleminen on kuitenkin suhteellisen hidasta ja viljelyyn perustuvat diagnostiset menetelmät antavat tuloksia yleensä vasta vuorokausien, joskus jopa viikkojen kuluttua näytteen otosta. Bakteerien viljely ei myöskään aina onnistu laboratorio-olosuhteissa. Tämä voi johtua joko siitä, että käytetty viljelymenetelmä ei ole kyseiselle bakteerille soveltuva tai siitä, että potilaalle 20 on ennen näytteen ottamista annettu mikrobilääkehoitoa. Molekylaarisilla nukleiinihappojen monistamiseen ja hybridisaatioon perustuvilla menetelmillä pyritään ratkaisemaan edellä kuvatut bakteeriviljelyyn liittyvät ongelmat. Tällaisissa menetelmissä patogeeni havaitaan ja tunnistetaan samanaikaisesti, mikä nopeuttaa diagnostiikkaa, eikä aikaa vieviä jatkoviljelyjä tarvita.
25 Eräs bakteeridiagnostiikassa käytetyistä molekylaarisista menetel mistä on ns. laajakirjoinen PCR (polymeraasiketjureaktio), joka perustuu laaja-kirjoisten alukkeiden käyttöön. Yleisimmin käytössä olevissa laajakirjoisissa PCR-menetelmissä käytetään alukkeita, jotka tunnistavat ribosomaalista RNA:ta (16S rDNA/rRNA tai 23S rDNA/rRNA) koodaavien bakteerikromosomi-30 en geenien konservoituneita DNA-jaksoja. Laajakirjoiseen PCR:ään perustuvassa bakteerien tunnistuksessa varsinainen tunnistusvaihe toteutetaan kloonaamalla ja sekvensoimalla saatu PCR-tuote (esim. EP-B1 613 502, US-patenttijulkaisut 6,001,564 ja 2002/0055101).
Laajakirjoisia bakteeri-PCR-menetelmää on jonkin verran sovellettu 35 kliiniseen bakteeridiagnostiikkaan, vaikka se soveltuukin parhaiten bakteeri- ja 2 sienilajien tunnistukseen puhdasviljelmistä. Tähän tarkoitukseen on kehitelty kaupallisia testejä kuten MicroSeq®, (Applied Biosystems). Nämä testit eivät kuitenkaan ole laajalti käytössä, sillä PCR-tuotteen sekvensointi on hidasta ja työlästä. Itse testit ja niiden käyttöön tarvittavat laitteistot, kuten sekvensointi-5 laitteet, ovat myös kalliita ja testien suorittaminen vaatii erikoiskoulutettua henkilökuntaa. Lisäksi monimikrobi-infektioissa voidaan tarvita kattavia kloonaus-testejä.
Myös ribosomaalisen RNA:n käyttöön liittyy ongelmia. Lähisukuisten bakteerilajien erottaminen toisistaan rRNA-molekyylien avulla on vaikeaa, kos-10 ka näiden molekyylien sekvenssit eivät sisällä riittävästi eroja toisiinsa verrattuna. Ja vaikka eri bakteerilajien välisiä eroja löytyisikin, nämä varioivat kohdat ovat yleensä jakautuneet koko rRNA-molekyylin alueelle (esim. 16S rRNA:n pituus on noin 1500 nukleotidia). Tämä rajoittaa diagnostiikassa hyödynnettävien molekylaaristen menetelmien käyttöä. Käytännössä lähisukuiset bakteeri-15 lajit voidaan siis erotella toisistaan vain sekvensoimalla koko rRNA:ta koodaa-va geeni. Tämäkään lähestymistapa ei aina välttämättä riitä bakteerien tunnistukseen. GyrS-geenin on raportoitu olevan fylogeneettisessä analyysissa tarkempi bakteerien tunnistuksessa kuin esimerkiksi 16S rRNA -geeni (Dauga, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52: 531-547, 2002).
20 Kansainvälisessä patenttijulkaisussa W02004046379 kuvataan vä lineitä ja menetelmiä bakteeri-infektioiden, erityisesti hengitystieinfektioiden diagnosoimiseksi. Tässä julkaisussa kuvataan laajakirjoisia alukkeita, jotka ovat peräisin topoisomeraaseja koodaavien geenien, erityisesti gyrB/parE-geenien, konservoinneilta alueilta, ja bakteerilajispesifisiä oligonukleotidikoet-25 timia, jotka ovat peräisin konservoituneiden alueiden välisiltä hypervarioivilta alueita. Näiden laajakirjoisten alukkeiden ja bakteerilajispesifisten koettimien avulla voidaan havaita ja samanaikaisesti tunnistaa infektioita aiheuttavia yksittäisiä tai jopa useita bakteereita. Nämä koettimet kattavat kuitenkin vain tiettyjä bakteerilajeja. Ne eivät myöskään mahdollista kaikkien bakteerikantojen tun-30 nistamista johtuen variaatioista niiden DNA-sekvensseissä. Jotkin koettimista myös ristireagoivat jonkin verran sellaisten kliinisesti merkittävien patogeenien kanssa, jotka eivät ole tunnistuksen kohteena johtaen mahdolliseen väärään tunnistukseen. Koettimilla voi myös olla alhainen hybridisaatiotehokkuus. Aluk-keet puolestaan ovat hyvin degeneroituneita, jolloin niiden oligosynteesi on 35 monimutkaista ja niissä on mahdollisesti valmistuseräkohtaista vaihtelua. Yksittäisen oligovariantin pitoisuus PCR-reaktioseoksessa voi lisäksi olla alhainen 3 ja joidenkin kantojen monistuminen siten tehotonta. Näin ollen alalla on todellinen tarve parannetuille välineille ja menetelmille bakteeridiagnostiikkaan.
Keksinnön lyhyt selostus
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön parannet-5 tuja välineitä ja menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia eri infektiosairauksien, erityisesti verenmyrkytysten bakteeridiagnostiikassa, mutta joilla ei ole edellä kuvattuja bakteerien diagnostiikkaan liittyviä haittoja. Erityisesti keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön uusia molekylaarisiin menetelmiin perustuvassa bakteerien tunnistuksessa ja havaitsemisessa käyttökelpoisia välineitä ja melo netelmiä, jotka ovat herkkiä, tehokkaita ja lajeille tai ylemmän tason taksoneille spesifisiä ja joiden avulla voidaan tunnistaa vain haluttuja bakteereita selektiivisesti. Keksinnön tarkoituksena on myös antaa käyttöön menetelmiä, joilla useita infektiivisiä bakteereita, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavia bakteereita voidaan havaita ja tunnistaa samanaikaisesti täsmällisemmin kuin aiem-15 min on ollut mahdollista, jolloin potilaalle voidaan esimerkiksi määrätä oikea ja tehokas mikrobilääkehoito infektion varhaisemmassa vaiheessa, jolloin infektion kesto lyhenee ja mahdollisesti haitallisten, jopa hengenvaarallisten komplikaatioiden riski vähenee.
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää infektioita aiheuttavien 20 bakteerien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi näytteestä ja menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) monistetaan näytteestä peräisin oleva DNA käyttäen DNA-aluketta, joka käsittää sekvenssin, joka hybridisoituu topoisomeraaseja koo-daavien geenien konservoituneille alueille ja on valittu sekvenssinumeroiden 1 25 ja 2 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä, b) saatetaan monistettu DNA kosketukseen vähintään yhden sellaisen oligonukleotidikoettimen kanssa, joka hybridisoituu bakteerilajispesifiseeen tai ylemmän tason taksoneille spesifiseen hypervarioivan alueen sekvenssiin, 30 joka sijaitsee mainittujen DNA-alukkeiden kanssa hybridisoituvien alueiden välissä, ja joka koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 3-121 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä, c) havaitaan mahdollisten hybridisaatiokompleksien muodostuminen 35 ja tunnistetaan mainittu infektiota aiheuttava bakteeri mainitun havaitsemisen perusteella.
4
Eräässä edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa analysoitava näyte on kliininen näyte.
Eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa infektioita aiheuttavat bakteerit ovat verenmyrkytystä aiheuttavia bakteereita. Tällaisten bakteeri-5 en esimerkkejä kuuluu taksonomisesti ryhmiin: Bacillales, Bacteroidetes, Clostridia, Lactobacillales, ja Proteobacteria (beta, epsilon, gamma). Täsmällisemmin esitettynä havaittavat ja tunnistettavat bakteerit valitaan ryhmästä Proteobacteria, erityisesti beta-proteobakteereista mukaan lukien Neisseria meningitidis, epsilon-proteobakteereista mukaan lukien Campylobacter jejuni, ja gam-10 ma-proteobakteereista mukaan lukien Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica alalaji enterica, Serratia mar-cescens, ja Stenotrophomonas maltophilia, ryhmästä Lactobacillales mukaan 15 lukien Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus agalac-tiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pneumoniae, ja Streptococcus pyogenes, ryhmästä Bacillales mukaan lukien Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, ryhmästä Bacteroidetes mukaan lukien Bacteroides fragilis, ja ryhmästä Clostridia mukaan lukien Clost-20 ridium perfringens. Eräässä suoritusmuodossa havaitaan ja tunnistetaan Staphylococcus-suvun, Proteus-suvun ja/tai Enterobacteriaceae-helmon jäseniä.
Eräässä muussa edullisessa suoritusmuodossa DNA:n monistamiseen käytetään sellaista ensimmäistä DNA-aluketta, joka käsittää vähintään 25 yhden sekvenssinumerossa 1 esitetyn sekvenssin ja sellaista toista DNA-aluketta, joka käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 2 esitetyn sekvenssin.
Lisäksi eräs edullinen keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuoto käsittää biologisesta näytteestä peräisin olevan DNA:n monistamisen 30 PCR:llä. Eräässä muussa keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa biologisesta näytteestä peräisin olevan DNA:n monistuksessa käytetään sopivasti leimattua nukleotidia tai leimattua aluketta havaittavissa olevan kohdejuosteen aikaansaamiseksi.
Vielä eräässä edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suori-35 tusmuodossa monistettu ja mahdollisesti leimattu kohde-DNA saatetaan kosketuksiin vähintään yhden laji- tai ylemmille taksoneille spesifisen, keksinnön 5 mukaisen, sekvenssinumeroista 3-121 ja näiden käänteisistä tai komplementaarisista sekvensseistä valitun, kiinteälle kantajalle kuten käsittelylle lasipinnalle tai silikonipohjaiselle biosirulle kiinnitetyn tai liuoksessa olevan oligonuk-leotidikoettimen kanssa. Vielä eräässä suoritusmuodossa käytetään mikrosiru-5 tekniikkaa.
Esillä oleva menetelmä voi koostua edellä kuvatuista vaiheista tai se voi sisältää esimerkiksi DNA:n monistamisen lisäksi muilla alukkeilla ja/tai monistetun DNA:n saattamisen kosketuksiin lisäksi muiden koettimien kanssa. Joissakin suoritusmuodoissa menetelmä voi sisältää lisävaiheita kuten pesu-ja 10 inkubointivaiheita.
Esillä oleva keksintö koskee myös DNA-alukkeita, jotka käsittävät bakteerien topoisomeraseja koodaavien geenien konservoituneiden alueiden kanssa hybridisoituvia sekvenssejä, jotka valitaan sekvenssinumeroiden 1 ja 2 ja näiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien tai toiminnallisten 15 fragmenttien joukosta. Esillä oleva keksintö koskee myös edellä mainittujen parannettujen alukkeiden käyttöä topoisomeraasigeenien, erityisesti gyB- ja parE-proteiineja koodaavien geenien monistuksessa.
Keksinnön kohteena on myös testipakkaus, joka on tarkoitettu käytettäväksi infektioita, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavien bakteerien ha-20 vaitsemisessa ja tunnistamisessa ja joka käsittää a) vähintään yhden, keksinnön mukaisen DNA-alukkeen, b) vähintään yhden bakteerilajispesifisen tai ylemmille taksoneille spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 3-121 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sek- 25 venssien muodostamasta ryhmästä, mahdollisesti kiinnitettynä kiinteälle kantajalle, c) mahdollisesti vähintään yhden positiivisen ja/tai negatiivisen kont-rollikoetinsekvenssin, ja d) mahdollisesti monistus-, puhdistus-, hybridisaatio-, pesu- ja/tai 30 havaitsemisvaiheissa tarvittavia reagensseja.
Eräässä suoritusmuodossa testipakkaus koostuu edellä kuvatuista komponenteista tai se voi käsittää lisäksi muita alukkeita ja/tai koettimia sekä muita sopivia reagensseja.
Vielä eräässä suoritusmuodossa testipakkaus käsittää yhdelle tai 35 useammalle taksonomiselle ryhmälle tai bakteerilajille spesifisiä koettimia.
6
Kuvioiden lyhyt selostus
Kuviossa 1 esitetään julkaisussa W02004046379 kuvatulla aluke-pariseoksella (näytteet 1A-5A) ja esillä olevan keksinnön mukaisella alukepa-riseoksella (näyteet 1B-5B) toteutetun PCR-reaktion tulokset.
5 Kuviossa 2 esitetään esimerkki konservoituneisiin sekvensseihin rajoittuvasta hypervarioivasta gyrB-geenialueesta Staphylococcus epidermi-diksellä. Sekvenssin 5’- ja 3’-päihin sijoittuvat konservoituneet alueet on merkitty lihavoinnilla. Ne toimivat laajakirjoisten gyrB/parE-alukkeiden kiinnittymis-kohtina. Hypervarioiva alue, jolle bakteerilajispesifiset ja ylemmän tason takso-10 neille spesifiset koettimet on suunniteltu, sijaitsee konservoituneiden alueiden välissä (viisi alleviivattua kohtaa edustaa alueita, joille lajispesifiset koettimet on suunniteltu).
Kuviossa 3 esitetään julkaisussa W02004046379 kuvattujen spesifisten Pseudomonas aeruginosa -gyrB-oligonukleotidikoettimien ja keksinnön 15 mukaisten parannettujen Pseudomonas aeruginosa -koettimien välisiä eroja hybridisaatiotehokkuudessa. Mikrosiru sisälsi kolme Pseudomonas aeru-ginosalle spesifistä gy/E-oligonukleotidikoetinta: kaksi julkaisussa W02004046379 kuvattua (ympyröidyt täplät; sekvenssinumerot 27/27 ja 29/29) sekä keksinnön mukainen parannettu koetin (neliöity täplä; sekvenssi-20 numero 71), jotka kaikki sitoutuivat spesifisesti kohdejuosteeseen. Julkaisussa W02004046379 kuvatuilla Pseudomonas aeruginosan koettimilla oli merkittävästi heikommat signaali-intensiteetit keksinnön mukaisiin koettimiin verrattuna. Myös kaksi positiivista kontrollioligonukleotidia havaittiin (kolmioin merkityt täplät).
25 Kuviossa 4 esitetään mikrosiruhybridisaation tulokset näytteellä, joka sisälsi Klebsiella pneumoniae ja Enterococcus faecalis -bakteereita taudinaiheuttajina. Mikrosiru sisälsi kolme spesifistä Klebsiella pneumoniae -koe-tinta (ympyröidyt täplät; sekvenssinumerot 54 ja 55, yksi tässä keksinnössä julkaisematon), neljä spesifistä Enterococcus faecalis -koetinta (neliöidyt täplät; 30 sekvenssinumerot 33 ja 116, kaksi tässä keksinnössä julkaisematonta sekvenssiä) ja kaksi Enterobacteriaceae-heimospesifistä koetinta (kuusikulmion merkityt täplät; sekvenssinumerot 29 ja 30), mitkä sitoutuivat spesifisesti koh-dejuosteisiin. Myös kaksi positiivista kontrollioligonukleotidia oli havaittavissa (kolmioin merkityt täplät).
35 Kuviossa 5 esitetään negatiivisen veriviljelynäytteen mikrosiruhyb ridisaation tulokset. Mikrosiru sisälsi bakteereiden Enterobacter cloacae, Ente- 7 rococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus py-5 ogenes -spesifisiä gyrS-oligonukleotidejä. Lisäksi sirulla oli spesifiset koettimet Enterobacteriacea-heimolle ja Staphylococcus-suvuWe. Epäspesifistä hybridi-soitumista ei havaittu. Kaksi positiivista kontrollioligonukleotidiä (sirun keskellä) ja kymmenen orientaatiokontrollia (viisi sirun kummallakin puolella) havaittiin odotetusti.
10 Keksinnön yksityiskohtainen selostus
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä ja parannettuja alukkeita käytettäväksi infektioita aiheuttavien bakteerien, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavien bakteerien havaitsemisessa ja tunnistamisessa. Infektioita aiheuttaviin, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttaviin esimerkkibak-15 teereihin kuuluu sekä gram-negatiivisia bakteereita kuten Acinetobacter bau-mannii, Bacteroides fragilis -ryhmä, Campylobacter jejuni, Enterobacter aero-genes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria meningitidis, Proteus mirabi-lis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subspe-20 cies enterica, ja Serratia marcescens sekä gram-positiivisia bakteereita kuten Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus warned, Staphylococcus xy-25 losus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pneumoniae, ja Streptococcus pyogenes.
Topoisomeraasiproteiinit gyraasi B (gyrB eli topoisomeraasi II) ja parE (topoisomeraasi IV:n toinen alayksikkö) ovat bakteerien kannalta tärkeitä molekyylejä, sillä niitä tarvitaan DNA:n pakkaamisessa. Näiden molekyylien 30 tietyt DNA-sekvenssifragmentit ovat säilyneet evoluution aikana lähes muuttumattomina eli ne ovat konservoituneet. Tässä yhteydessä termillä ’’konservoi-tunut alue” tai ’’konservoituneet alueet” tarkoitetaankin topoisomeraasigeenien tai -proteiinien aluetta tai alueita, joiden nukleotidisekvenssi tai vastaavasti aminohapposekvenssi on säilynyt lähes muuttumattomana eri bakteerilajien 35 välillä. Yleensä nämä konservoituneet alueet ovat proteiinin toiminnan kannalta kaikkein tärkeimpiä alueita. gyrB/parE-molekyyleistä on löydettävissä lyhyitä 8 DNA-sekvenssejä, joissa erot eri bakteerilajien välillä (myös lähisukuisten bak-teerilajien välillä) ovat niin suuria, että näitä DNA-sekvenssejä voidaan pitää lajispesifisinä tai ylemmän tason taksoneille spesifisinä. Nämä sekvenssit ovat hypervarioivia sekvenssejä, joilla tässä yhteydessä tarkoitetaan topoisome-5 raasigeenien DNA-sekvenssejä, jotka eroavat nukleotidiemäsjärjestykseltään eri bakteerien välillä riittävästi saaden aikaan bakteerilajispesifisyyden tai spesifisyyden ylemmän tason taksoneille ja jotka sijaitsevat topoisomeraasigeeni-en konservoituneiden sekvenssien lähellä ja ovat mahdollisesti rajoittuneet tai merkitty konservoituneilla sekvensseillä. Termi ’’hypervarioiva sekvenssi” tar-10 koittaa myös mainittujen hypervarioivien DNA-sekvenssien koodaamia aminohapposekvenssejä.
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön parannettuja laajakirjoisia aluk-keita tai seoksia laajakirjoisista alukkeista, jotka ovat peräisin topoisomeraase-ja koodaavien geenien, erityisesti gyrS/parE-geenien, konservoituneilta alueilta 15 ja jotka monistavat tehokkaasti infektioita aiheuttavien bakteereiden DNA:ta. Tällaisten alukkeiden yleistason suunnittelu on kuvattu kansainvälisessä patenttijulkaisussa W02004046379. Keksinnön mukaiset alukkeet (taulukko 1, sekvenssinumerot 1 ja 2) suunniteltiin sekvenssin samoihin kohtiin kuin julkaisussa W02004046379 kuvatut alukkeet, mutta degeneroitujen alueiden mää-20 rää vähennettiin käyttäen inosiineja ja kliinisesti merkittävien, verenmyrkytykseen liittyvien bakteereiden sekvenssejä priorisoitiin alukesuunnittelussa. Sekvenssit saatiin EMBL:n julkisesta sekvenssitietokannasta tai niissä tapauksissa, joissa tällaisia sekvenssejä ei ollut saatavilla julkisista tietokannoista, ne tuotettiin itse kloonaamalla bakteerilajien gyrB/parE-25 geenisekvenssifragmentteja tai PCR:n avulla käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu lähisukuisten bakteerilajien sekvenssien tai tietokannoista saatavien osittaisten sekvenssien perusteella. Sekvenssien lukumäärä oli oleellisesti suurempi kuin julkaisussa W02004046379 käytetty materiaali. Tiedot analysoitiin systemaattisesti ja sitä käytettiin alukesuunnittelussa. Suunnittelussa ino-30 siinit sijoitettiin alukkeiden päihin, koska substituutio universaaleilla emäksillä on vähemmän destabiloivaa lähempänä nukleotidien päitä kuin lähempänä keskiosaa. Lisäksi vältettiin mahdollisten inosiini-guaniini-emäsparien muodostumista.
Lisäksi alukepareille suunniteltiin osittain päällekkäiset sulamisläm-35 pötilat. Sekvenssinumerossa 1 esitetyn laajakirjoisen alukkeen sulamislämpöti-la oli noin 8 °C-noin 20 °C alhaisempi kuin sekvenssinumerossa 2 esitetyn 9 laajakirjoisen alukkeen sulamislämpöjä. Tällainen sulamislämpötilaero mahdollistaa yksinauhaisen DNA:n tuottamista suosivan uuden DNA-monistusmenetelmän käytön. Menetelmä suoritetaan kahdessa PCR-vaiheessa, joissa käytetään eri kiinnitymislämpötiloja. Sekä sekvenssinume-5 rossa 1 esitetty alukeseos että sekvenssinumerossa 2 esitetty alukeseos kiinnittyy ja pidentää kohde-DNA:ta ensimmäisen PCR-vaiheen kiinnittymislämpö-tilassa, kun ainoastaan sekvenssinumerossa 2 esitetty alukeseos kiinnittyy ja pidentää kohde DNA:ta toisen PCR-vaiheen kiinnittymislämpötilassa. Täten keksinnön mukaisilla alukkeilla on lisäominaisuuksia niiden laajakirjoisten eli 10 universaalien ominaisuuksien lisäksi mahdollistaen yksinauhaisen DNA:n tehokkaan monistamisen. Esillä olevan keksinnön yhteydessä yksinauhaisen bakteeri-DNA:n tuottaminen on edullista, vaikka alukkeita voidaan käyttää tuottamaan ainoastaan kaksinauhaista bakteeri-DNA:ta.
Kaikkein onnistunein puhtaan bakteeri-DNA:n monistuminen saatiin 15 aikaan yhdellä monista erilaisin laboratoriokokein testatuista alukepariseoksis-ta. Kaikkien testattujen bakteerien gyrö/parE-geenejä onnistuttiin monistamaan keksinnön mukaisella alukeseoksella (esimerkki 1). Näin ollen alukkeet toimivat bakteerien universaaleina eli laajakirjoisina alukkeina. Julkaisussa W02004046379 kuvattuun alukepariseokseen verrattuna keksinnön mukaiset 20 alukkeet olivat selvästi tehokkaampia ja herkempiä (esimerkki 2, kuvio 1). Spesifisyys- ja herkkyyskokeissa käytettiin kasvatuskokoelmista (ATCC ja DSM) peräisin olevia bakteerilajeja sekä kliinisiä näytteitä (taulukko 2).
10
Taulukko 1. gyrB/parE-universaalialukkeet
Alukkeen nimi Sekvenssinro Sekvenssi 5’->3’
gB3F 1 CGICCIGGKATGTAYATHGG
gB4R 2 RMICCWACICCRTGYAGICCICC
Alukesekvensseissä I tarkoittaa inosiiniemästä; K tarkoittaa emästä G tai T; Y tarkoittaa emästä C tai T; H tarkoittaa emästä A tai C tai T; R tarkoit-5 taa emästä A tai G; M tarkoittaa emästä A tai C; ja W tarkoittaa emästä A tai T. Keksintö koskee siis alukeseoksia, jotka koostuvat useista eri alukevaihtoeh-doista. Esim. alukkesekvenssinumeron 1 tapauksessa seoksessa on siis aluk-keita, joissa K tarkoittaa G:tä (guaniini) tai K tarkoittaa T:tä (tyrniini).
Myös oligonukleotidianalogit, kuten peptidinukleiinihapot (PNA), tai 10 modifioituja emäksiä sisältävät oligonukleotidit voivat toimia alukkeina ja siksi ne sisältyvät alukkeen määritelmään. Alukkeet voivat koostua vastaavissa sekvenssinumeroissa esitetyistä nukleotidisekvensseistä tai ne voivat käsittää ylimääräisiä nukleotidejä. Alukkeilla ei myöskään tarvitse olla täsmälleen sama sekvenssi kuin templaattinukleiinihapolla, mutta sen pitää olla riittävän komp-15 lementaarinen hybridisoituakseen templaattiin ja säilyttääkseen gyrB/parE-alueen monistuskyvyn. Alukkeisiin voi myös olla liitettynä erilaisia kemiallisia yhdisteitä tai ryhmiä (esim. aminoryhmiä) tai muita molekyylejä, kuten erilaisia leimoja, tai niistä voi kokonaan puuttua modifikaatiot. Luonnollisesti näiden oli-gonukleotidisekvenssien käänteiset ja komplementaariset sekvenssit ovat yhtä 20 käyttökelpoisia, kuten alan ammattimiehelle on ilmeistä. Jokainen spesifinen sekvenssinumero tarkoittaa siis myös sen käänteistä tai komplementaarista sekvenssiä. Samoin mainittujen oligonukleotidisekvenssien toiminnalliset fragmentit ovat käyttökelpoisia alukkeina. Tässä yhteydessä termi ’’toiminnallinen fragmentti” tarkoittaa myös sellaisia modifioituja tai modifioimattomia ly-25 hennettyjä nukleotidisekvenssejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohde-DNA:han ja aloittamaan sen monistamisen.
Tällä alukeseoksella tunnistettiin kaikkien tutkittujen bakteerilajien gyrB ja/tai parE-geenien ensimmäisen osan konservoituneet sekvenssit. Se monisti kliinisten näytteiden DNA:ta ja sen spesifisyys oli säilynyt riittävän laa-30 jana mahdollistaen siten infektioita, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavien eri bakteerilajien gyrS/parE-geenien monistamisen (esimerkki 1). Tämän alu-keseoksen avulla kaikkien fylogeneettisesti hyvinkin etäällä toisistaan olevien 11 bakteerien gyrB/parE-geenit (taulukko 2) voidaan monistaa myös tilanteessa, jossa näytteessä on runsaasti vierasta (ei-bakteeriperäistä) DNA:ta.
Taulukko 2. gyrB-geenin linjaukseen käytetyt bakteerikannat. Näitä bakteereita käytettiin myös alukkeiden ja koettimien herkkyys- ja spesi-5 fisyystestauksiin
Bakteerilaji Toimittajan koodi (näytteen tyyppi)
Acinetobacter baumannii DSM 30007
Bacteroides fragilis ATCC 25285D
Campylobacter jejuni Bakteeripuhdasviljelmä
Clostridium perfringens Bakteeripuhdasviljelmä
Enterobacter aerogenes ATCC 49469
Enterobacter cloacae ATCC 13047
Enterococcus faecalis ATCC 19433
Enterococcus faecium ATCC 19434
Haemophilus influenzae Bakteeripuhdasviljelmä
Escherichia coli DSM 30083
Klebsiella oxytoca DSM 5175
Klebsiella pneumoniae ATCC 700721D
Listeria monocytogenes Bakteeripuhdasviljelmä
Morganella morganii Bakteeripuhdasviljelmä
Neisseria meningitidis ATCC 700532D
Proteus mirabilis DSM 4479
Proteus vulgaris Bakteeripuhdasviljelmä
Pseudomonas aeruginosa DSM 50071
Salmonella enterica alalaji enterica Bakteeripuhdasviljelmä
Serratia marcescens Bakteeripuhdasviljelmä
Stenotrophomonas maltophilia Bakteeripuhdasviljelmä
Staphylococcus aureus ATCC 10832
Staphylococcus capitis ATTC 27840
Staphylococcus epidermidis ATCC 49134
Staphylococcus haemolyticus DSM 20263 12
Staphylococcus hominis ATCC 25615
Staphylococcus lugdunensis DSM 4805
Staphylococcus warnerii ATCC 17917
Staphylococcus xylosus ATCC 35033
Streptococcus agalactiae ATCC 13813
Streptococcus anginosus DSM 20563 ; Streptococcus dysgalactiae ATCC BAA-338
Streptococcus pneumoniae DSM 20566
Streptococcus pyogenes DSM 20565
Yersinia pseudotuberculosis bakteeripuhdasviljelmä ATCC = American Type Culture Collection DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
Esillä olevassa menetelmässä käytetään bakteerilajispesifisiä tai 5 ylemmän tason taksoneille spesifisiä oligonukleotidikoettimia, jotka ovat peräisin topoisomeraaseja koodaavien geenien, erityisesti gyrE/parE-geenien, kon-servoituneiden alueiden välisiltä ns. hypervarioivilta alueita, joilla emäsjärjestys on hyvin erilainen eri bakteerilajeilla. Näiden spesifisten koettimien avulla useita infektioita aiheuttavia bakteereita voidaan paitsi havaita myös samanaikai-10 sesti tunnistaa. Tämä keksinnön yhteydessä termillä ’’ylemmän tason taksoni” tarkoitetaan bakteerisukuja kuten Staphylococcus-suku ja Proteus-suku sekä bakteeriheimoja kuten Enterobacteriaceae-heimo.
Edellä mainittuja ominaisuuksia käytettiin hyväksi lajeille ja ylemmän tason taksoneille spesifisten oligonukleotidien suunnittelemisessa useille 15 bakteerikannoille samalla tavoin kuin on yleisellä tasolla kuvattu kansainvälisessä patenttijulkaisussa W02004046379. Tällaisten spesifisten koettimien suunnittelussa käytettiin linjaukseen perustuvaa suunnittelustrategiaa. Suunnittelun kohteena olleiden bakteerilajien gyrB- tai parE-geenit linjattiin suunnittelun ulkopuolella olevista bakteereista lähtöisin olevien vastaavien geenien 20 kanssa (esimerkki 3). Sekvenssit saatiin EMBL:n julkisesta sekvenssitietokan-nasta tai niissä tapauksissa, joissa tällaisia sekvenssejä ei ollut saatavilla julkisista tietokannoista, ne tuotettiin itse kloonaamalla bakteerilajien gyrB/parE-geenisekvenssifragmentteja tai PCR:n avulla käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu lähisukuisten bakteerilajien sekvenssien tai tietokannoista saatavi-25 en osittaisten sekvenssien perusteella. Staphylococcus epidermidiksen kon- 13 servatiivisiin alueisiin rajoittuva hypervarioiva gyrö-geenialue esitetään esimerkkinä kuviossa 2.
Oligonukleotidikoettimien spesifisyys testattiin laboratorio-olosuhteissa useilla eri bakteerilajeista eristetyillä puhtailla DNA-näytteillä sekä 5 kliinisillä potilasnäytteillä (esimerkit 4-5; taulukko 2). Oligonukleotidikoettimet käsittävät sekvenssinumeroiden 3-121 mukaisia sekvenssejä tai niiden kanssa käänteisiä ja komplementaarisia sekvenssejä. Koettimet voivat koostua vastaavissa sekvenssinumeroissa esitetyistä nukleotidisekvensseistä tai ne voivat käsittää ylimääräisiä nukleotideja. Ne voivat siten olla eripituisia, ja näiden oli-10 gonukleotidikoettimien haluttu lajispesifisyys tai spesifisyys ylemmän tason taksoneille sekä toimivuus määrää sopivan pituuden hybridisaatioreaktioissa. Tavallisesti oligonukleotidikoettimet ovat 15-60, edullisesti 15-40 ja edullisimmin 20-30, nukleotidiä pitkiä. Koettimet voivat myös olla eri tavoin modifioituja (niissä voidaan esimerkiksi käyttää oligonukleotidianalogeja, kuten peptidinuk-15 leiinihappoja (PNA), tai modifioituja emäksiä sisältäviä oligonukleotideja) kunhan ne säilyttävät lajispesifisyytensä tai spesifisyytensä ylemmän tason taksoneille. Koettimiin voi myös olla liitettynä erilaisia kemiallisia yhdisteitä tai ryhmiä (esim. aminoryhmiä) tai muita molekyylejä, kuten erilaisia detektioon tarvittavia leimoja, tai niistä voi kokonaan puuttua modifikaatiot. Edullisten bakteerilajis-20 pesifisten tai ylemmän tason taksoneille spesifisten koettimien sekvenssit ja spesifisyys esitetään taulukossa 3 ja niillä on sekvenssinumeroiden 3-121 mukaiset sekvenssit. Luonnollisesti näiden oligonukleotidisekvenssien käänteiset ja komplementaariset sekvenssit ovat yhtä käyttökelpoisia, kuten alan ammattimiehelle on ilmeistä. Jokainen spesifinen sekvenssinumero tarkoittaa siis 25 myös sen käänteistä tai komplementaarista sekvenssiä. Samoin mainittujen oligonukleotidisekvenssien toiminnalliset fragmentit ovat käyttökelpoisia aluk-keina. Tässä yhteydessä termi ’’toiminnallinen fragmentti” tarkoittaa myös sellaisia modifioituja tai modifioimattomia lyhennettyjä sekvenssejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdebakteeriin ja siten säilyttävät muuttumattoman la-30 jispesifisyyden tai spesifisyyden ylemmän tason taksoneille.
14
Taulukko 3. Lajispesifiset ja ylemmän tason taksoneille spesifiset koetti-met
Sekvenssi- Spesifisyys (gyrB) Oligosekvenssi 5’->3’ I nro
3 | Acinetobacter baumannii GATGAAGCTTTAGCTGGCCACTG
4 Acinetobacter baumannii AGTGTTTCAGATAATGGCC
5 Acinetobacter baumannii CAGTGTTTCAGATAATGGCCGC
6 Acinetobacter baumannii AATTATTGTCACGATTCACGAGG
7 Bacteroides fragilis -ryhmä AGAAATCTGCCCTCGAAGTTGCC
8 Bacteroides fragilis-ryhmä AATCTGCCCTCGAAGTTGCC
9 Bacteroides fragilis-ryhmä GTATTCCGGTAGATTTCCACGAA
10 Bacteroides fragilis-ryhmä GAAGACAACTCTATCACCGTACA
11 ! Bacteroides fragilis -ryhmä GACCACATCGAAGTGACAATCA
12 Bacteroides fragilis -ryhmä GACCACATCGAAGTGACAATCAA
13 Bacteroides fragilis -ryhmä ACGAAGATAATTCAATCACCGTACA
14 Bacteroides fragilis-ryhmä GAAATCAGCATTGGAAGTAGCAAT
15 Campylobacter jejuni GATGTAGAAATCACTACTGAAGG
16 Campylobacter jejuni TGTATAGTTAGTGATAATGGTCG
17 Campylobacter jejuni ATATGCCAACTTTAACTGTTGTTT
18 Campylobacter jejuni TTGATATGCACCCAACTGAAAAT
19 Clostridium perfringens : GTAGTTGATGACGGAAGAGG
20 Clostridium perfringens GAAGCATTAGCTGGATACTG
21 Clostridium perfringens GGTAGTACTAGTTCAAGAGG
22 Clostridium perfringens GGGAAAACCAACTGTAGAAG
23 I Enterobacter aerogenes ACATCGTTGTTACGATCCACAGC
24 I Enterobacter aerogenes / CCGCGGCATCCCAACCGGCATTC
Klebsiella pneumoniae
25 Enterobacter aerogenes / TCTCCGCGGCGGAAGTTAT
Klebsiella pneumoniae 15
26 I Enterobacter cloacae : GATCCATGCGGACAACTCCGT
27 : Enterobacter cloacae GGTCACGATCCATGCGGACAA
28 Enterobacter cloacae AGAGGGCGTATCTGCTGCG
29 Enterobacteriaceae-heimo GGATGACGGCACCGGTCT
30 Enterobacteriaceae-heimo CTATCGACGAAGCGCTCGC
31 Enterobacteriaceae-heimo TATCGACGAAGCCCTCGCG
32 Enterobacteriaceae-heimo AT CGACGAAGCCCT CGCGGG
33 Enterococcus faecalis AGCTGTGGAAACAGTGTTTACAG
34 Enterococcus faecium TATCACCGTTATTGACGACGGTC
35 Enterococcus faecium TATCCAGGCAAAAACTGGACGTC
36 ; Enterococcus faecium GGATACCTGTAGATATCCAGGCA
37 Enterococcus faecium TCGATCGATGAAGTATTAGCA
38 Enterococcus faecium ACTAGTTCTGAGGGTCTGCATCA
39 Escherichia coli AAATTATCGTCACCATTCACGCC
40 Escherichia coli GGCGCGGCATTCCGACCGGTA
41 Escherichia coli CGCCGATAACTCTGTCTCTGTA
42 Escherichia coli TATCGGCGGCGGAAGTGAT
43 Escherichia coli ACGGGCGCGGCATTCCGAC
44 Escherichia coli AAGAGGGCGTATCGGCGG
45 Haemophilus influenzae TCTGTATCGGTGCAAGATGATGG
46 Haemophilus influenzae GGCCATTGTTCCGATATTATCG
47 Haemophilus influenzae GTTCCGATATTATCGTGACAA
48 Haemophilus influenzae CTGTGGATATTCATCCTGAA
49 Haemophilus influenzae ATGCCATTGATGAAGCCCTCGC 1 2 3
Enterobacter aerogenes / TTACTGTAAAGACATCGTTGTTAC
Klebsiella oxytoca 2
Enterobacter aerogenes / ACTGTAAAGACATCGTTGTTACG
3
Klebsiella oxytoca 16
52 Klebsiella oxytoca GCGGTATTCCAACCGGTATTCA
53 Klebsiella oxytoca GGCCGCGGTATTCCAACCGGT
54 Klebsiella pneumoniae TACTGCAAAGATATCGTTGTCA
55 Klebsiella pneumoniae CTGCAAAGATATCGTTGTCAC
56 Listeria monocytogenes TACAATCGAAGCTGATAACAGCA
57 Listeria monocytogenes ACTGTTCGTGATAACGGACGTGG
58 Listeria monocytogenes GGTCGTCCAACAGTAGAAGT
59 Listeria monocytogenes GCAATTGATGAAGCACTTGCT
60 Neisseria meningitidis AATCACGGTAACGATACACGC
61 Neisseria meningitidis CCATTGACGAAGCACTCGCC
62 Neisseria meningitidis GTATTGGACAACGCCATTGA
63 Neisseria meningitidis GGACATTGCGACAAAATCACG
64 Proteus-suku ATT GT CACTAT CCATT CAGATAACT C
65 Proteus-suku CATGGTGTAGGGGTTTCTGTT
66 Proteus mirabilis ACGGGTATTCATGAAGAAGAGG
67 Proteus mirabilis GTATTCCAACGGGTATTCATGAA
68 Proteus mirabilis ATGAAGAAGAGGGCGTTTCTG
69 Proteus vulgaris ACCAAGAAGAGGGTGTTTCAG
70 Proteus vulgaris CCCAGAAGAGGGTGTCTCA
71 Pseudomonas aeruginosa GATATCCACAAGGAAGAAGGG
72 Pseudomonas aeruginosa TCACTGTCCGCGACAATGGAC
73 Pseudomonas aeruginosa GCCGGTTAYTGCAGCGAAATCA 1 2 3
Salmonella enterica TCGTCGTGACTATTCACGCC
subspecies enterica 2
Salmonella enterica TAACGGATGATGGCCGTGGCATT
3 subspecies enterica 17
76 Serratia marcescens TTCAGCCGCAGAGGTCATCA
77 Serratia marcescens ATTCAGGTCACCATCCATGCC
78 Serratia marcescens TCAGGTCACCATCCATGCCG
79 Serratia marcescens CGACAACTCGGTATCGGTG
80 Staphylococcus aureus AATAGTATCGATGAAGCATTAGCTG
81 Staphylococcus aureus AACGGACGTGGTATCCCAGT
82 Staphylococcus aureus GGACGTGGTATCCCAGTTGATAT
83 Staphylococcus aureus TCCAGCTGTCGAAGTTATTTTAA
84 Staphylococcus epidermidis TAGTCATATTGAAGTTRTAATTGAG
85 Staphylococcus epidermidis GCCCTGCTGTCGAAGTTATC
86 Staphylococcus epidermidis CATTAGCAGGTTATGCTAGTCATA
87 Staphylococcus epidermidis ACGCCCTGCTGTCGAAGTTA
88 Staphylococcus epidermidis AAAGATGGGACGCCCTGCTGTCGAA
89 Staphylococcus-suku GGCATTCCTGTTGATATTCAAGA
90 Staphylococcus-suku TCAACTTCAGAAAAAGGTTTACA
91 Staphylococcus-suku TCAACTTCAGAAAGAGGTTTGCA
92 Staphylococcus-suku GTTGATAATAGTATTGACGAAGC
93 Staphylococcus-suku CGCCCAGCAGTTGAAGTTATCT
94 Staphylococcus-suku CCAGCAGTTGAAGTTATCTTAAC
95 Staphylococcus-suku CCAGCAGTTGAGGTTATTTTAA
96 Staphylococcus-suku GGGGCGCCCAGCAGTTGAA
97 Stenotrophomonas maltophilia TCGGTGTCCGACAACGG
98 Stenotrophomonas maltophilia GGCAAGCACGAGCAGATGAG
99 Stenotrophomonas maltophilia GCCGAAGTGGTGATGACGGT
100 Streptococcus agalactiae TTACATTGAACCAGATAACTCTA
101 Streptococcus agalactiae TGGAAGACCAGCTGTAGAGACAG
102 Streptococcus agalactiae CCTTAGCTGGATTTGCAGGACA
103 Streptococcus agalactiae ATTCCGGTAGATATCCAAGAAAA 1
Streptococcus dysgalactiae ATCGTCGACAATTCTATTGACGA
18
105 Streptococcus dysgalactiae ATTAGCCGGATTTGCTACTCAC
106 Streptococcus dysgalactiae AGGCAGATAATTCAATCACAGT
107 Streptococcus dysgalactiae CTACTCACATCCAGGTGTTTAT
108 Streptococcus dysgalactiae ATCCAGGTGTTTATCGAGGC
109 Streptococcus pneumoniae ; TCCTGCTGTTGAGACCGTCTT
110 Streptococcus pneumoniae ! TCAACCTCAAAAGAAGGTCTTCAC
111 Streptococcus pneumoniae j AGTTTTTATTGAGCCAGATGAT
112 Streptococcus pyogenes GTCCCGCCGTTGAAACAGTT
113 Streptococcus pyogenes TTTTTACAGTCTTACACGCAGGT
114 Streptococcus pyogenes GCAGGTTTT GCCTCT CAT ATT AAAGT CTT
115 Streptococcus pyogenes TTACAGTCTTACACGCAGGTGG
Sekvenssi- Spesifisyys (parE) Oligosekvenssi 5’-> 3’
Nro
116 Enterococcus faecalis CTGGTATCCCAACAGTAGAAGTA
117 Enterococcus faecium TTTGGTCGAGGAGGGTACAAAAC
118 Staphylococcus aureus GTAAACCGACAGTCGAAGTTATC
119 Staphylococcus aureus CGTGGTATGCCAACAGGTAT
120 Staphylococcus aureus GTATTTCTATAGAAGATAATGGAC
121 Staphylococcus epidermidis TGGTTATGGTGATGCGATTACAGT
Lisäksi esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän havaita ja tunnistaa infektioita aiheuttavia bakteereita analysoitavassa näytteessä. Tässä yhteydessä termiin ’’näyte” kuuluu erityyppisiä näytteitä mukaan lukien baktee-5 ri- ja soluviljelmät, ruokanäytteet, maanäytteet, biologiset nesteet ja kliiniset näytteet kuten kudospalat, eritenäytteet (kuten yskös- tai s ive ly näytteet), verinäytteet tai muut sopivat näytteet, jotka on saatu potilaasta, jolla epäillään olevan jokin infektiosairaus. Analysoitava näyte on erityisesti kliinisiin diagnostisiin sovelluksiin sopiva positiivinen veriviljelynäyte.
10 Keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa bakteerien tunnistuksessa käytetään DNA-sirutekniikkaa. Tässä yhteydessä DNA-mikrosirulla tai DNA-lastuila tarkoitetaan pienikokoista alustaa, jolle tunnettuja nukleiinihapposekvenssejä on kiinnitetty. Jos mikrosirulle kiinnitetyt 19 nukleiinihappofragmentit ovat lyhyempiä kuin 100 emäsparia (yleensä noin 20-60 emäsparia), puhutaan ns. oligonukleotidisiruista.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä bakteerise-kvenssien kloonaus voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä, 5 kuten käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia kloonauspakkauksia (esim. Qi-agen PCR Cloning Kit tai Invitrogen TOPO TA Cloning® Kit). Kloonaustuotteen sekvensointi voidaan suorittaa millä tahansa tähän tarkoitukseen soveltuvalla sekvensaattorilla (esim. Applied Biosystems, mallit 373A, 377 tai 3100 tai Bio-Rad Sequi-Gen® GT) tai manuaalisella sekvensoinnilla. Kloonauksella, PCR:n 10 avulla tai bioinformatiikan keinoin saadut sekvenssit voidaan analysoida manuaalisesti tai tähän tarkoitukseen kehitetyillä sekvenssianalyysiohjelmilla (esim. Applied Biosystems Sequencer tai Invitrogen Vector NTI Advance®).
Analysoitavasta näytteestä voidaan eristää DNA millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten kaupallisesti saatavilla olevilla DNA:n eristyspak-15 kauksilla (esim. Roche High Pure PCR Template Preparation Kit, BD Biosciences Clontech NucleoSpin®, tai Qiagen QIAamp® DNA Mini-kit) tai perinteisillä, fenoli-kloroformilla tai vastaavilla orgaanisilla liuottimilla tehtävillä uutoilla, joko manuaalisesti tai erityisillä DNA:n eristykseen soveltuvilla laitteilla. Edullisesti DNA:n eristykseen käytetään automatisoituja näytteenvalmistusalustoja (esim. 20 bioMerieux NucIiSENS® easy-MAG™) niiden helpon saatavuuden, nopeuden ja toistettavuuden vuoksi. DNA voidaan saada myös suoraan analysoitavasta näytteestä ilman erillistä eristysvaihetta.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä DNA:n monistukseen käytettävät reagenssit voivat olla mitä tahansa DNA:n monistukseen 25 tavallisesti käytettyjä reagensseja, jotka alan ammattimiehet hyvin tuntevat. Sopivia ja edullisia kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ovat erityyppiset DNA-polymeraasit ja niiden puskurit (esim. AmpliTaqGOLD™, AmpliTaq® LD, DyNAzyme™, TaqPlus® Precision tai HotStartTaq®), nukleotidit tai valmiit nukleotidiseokset (esim. Sigma, Applied Biosystems tai Amersham Biosys-30 tems) ja MgCfe (jolloin yleensä käytetään saman valmistajan tuotetta kuin DNA-polymeraasi).
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää useita tunnettuja leimausmenetelmiä leimatun kohdejuosteen aikaansaamiseksi, kuten fluoresenssileimoja (esim. Cy5, Cy3, Cy2, TexasRed, FITC, Alexa 35 488, TMR, FluorX, ROX, TET tai HEX), radioaktiivisia leimoja (esim. 32P, 33P
tai 33S), kemiluminesoivia leimoja (esim. HiLight Single-Color Kit) ja kolorimet- 20 ristä havaitsemista (esim. biotiini-streptaviini-entsyymikonjugaatteja). Keksintö käsittää myös sovelluksia, joissa leimaa ei tarvita lainkaan, kuten sellaisia sovelluksia, joissa nukleiinihappojen havaitseminen perustuu sähköiseen impulssiin (esim Motorolan eSensor™).
5 Monistukseen käytettävä laitteisto voi niin ikään olla mikä tahansa sopiva laitteisto (esim. Biometra® T1 Thermocycler, Applied Biosystems GenAmp® PCR system 2700, tai Eppendorf Mastercycler®). Käytännössä voidaan käyttää kaikkia DNA-monistukseen sopivia laitteita ja laitteistoja ja monistus voidaan myös suorittaa manuaalisesti siirtämällä reaktioputkia lämpötilasta 10 toiseen. Monistus voidaan myös tehdä suoraan biosirulla, joka sisältää erityisiä PCR-reaktioon tarkoitettuja kaivoja ja erityisen hybridisaatioalueen, johon koet-timet ja kontrolliologonukleotidit voidaan kiinnittää.
PCR-tuotteen puhdistus voidaan suorittaa millä tahansa kaupallisella menetelmällä (esim. Roche High Pure PCR Product Purification Kit, 15 Amersham Biosciences MicroSpin™ S-400 tai S-300 HR -pylväät, tai Qiagen QIAquick® PCR-purification-Kit) tai se voidaan tehdä orgaanisella liuottimena tapahtuvalla uutolla. Monistustuotetta voidaan käyttää hybridisaatioreaktioon myös sellaisenaan ilman puhdistus- tai uuttovaiheita.
Yksijuosteisen kohdejuosteen aikaansaamiseksi voidaan käyttää 20 mitä tahansa sopivaa menetelmää kuten epäsymmetristä PCR:ää tai eksonuk-leaasikäsittelyä. Keksintö käsittää myös sovelluksia, joissa hybridisaatioreaktioon voidaan käyttää kaksijuosteista PCR-tuotetta.
Kun hybridisaatio tapahtuu kiinteällä kantajalla, hybridisaatiossa käytettävät koettimet voidaan kiinnittää kiinteän kantajan pintaan kovalenttisen 25 tai ei-kovalenttisen sidoksen avulla. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita kemiallisia, sähkökemiallisia tai vastaavia kiinnitysmenetelmiä. Koettimeen voi olla kiinnitettynä liitoskappale (linker) tai välikappale (spacer). Alusta tai tuki, jolle koettimet kiinnitetään voi olla valmistettu lasista, muovista, polymeereistä, metallista, nailonista, nitroselluloosasta, polyakryyliamidista, silikonista, piiiok-30 sidista, silikasta tai näiden yhdistelmistä, ja sen koko voi vaihdella muutamasta millimetristä muutamiin senttimetreihin. Käytettävän alustan pinta voi olla päällystetty aminosilaani- tai muulla soveltuvalla pintakäsittelyllä, kuten esimerkiksi epoksisilaanipintakäsittelyllä, tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää sellaista alustaa, joka ei vaadi erillistä pintakäsittelyä. Edullisia alustoja oligonukleotidikoet-35 timille ovat lasi ja silikoni.
21
Syntetisoidut koettimet voidaan printata mikrosirualustan pintaan millä tahansa kaupallisesti saatavilla olevalla ja tähän tarkoitukseen soveltuvalla laitteistolla (esim. Qarray-mini arraying system, Lucidea Array Spotter, Om-niGrid® arrayer) tai ne voidaan pipetoida alustalle manuaalisesti. Vaihtoehtoi-5 sesti koettimet voidaan syntetisoida suoraan pinnalle sopivaa in situ -synteesi-menetelmää kuten fotolitografiaa tai ink-jet-tekniikkaa käyttämällä.
Keksinnön mukaisesti spesifisiä koettimia voidaan käyttää infektioita aiheuttavien patogeenien, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavien bakteerei-den tunnistamiseen millä tahansa sopivalla menetelmällä, jolla normaaliolosuh-10 teissä tapahtuva hybridisaatio voidaan osoittaa, kuten Southern-blottauksella, Northern-blottauksella, kolonihybridisaatiolla, in situ -fluoresenssihybridisaatiolla (FISH), sekvensoimalla ja RT-PCR-menetelmillä. Tällaiset menetelmät ovat alan ammattilaisten hyvin tuntemia ja ne voidaan toteuttaa sekä liuoksessa että DNA:ta sitovalla kiinteällä kantajalla, kuten nitro-15 selluloosa- tai nylonkalvolla, tai lasilla tai silikonipohjaisella pinnalla.
Hybridisaatiossa käytetty hybridisaatioseos voi olla koostumukseltaan erilainen kuin mitä jäljempänä suoritusesimerkeissä on esitetty, esimerkiksi suolan koostumus ja/tai suolapitoisuus voivat vaihdella (esim. 2-4xSSC tai SSPE), tai hybridisaatiossa voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia 20 hybridisaatioliuoksia (esim. Sigma ArrayHyb™). Hybridisaatioseoksessa voidaan myöskin käyttää denaturoivia tai stabiloivia lisäaineita (esim. formamidi tai dimetyylisulfoksidi (DMSO)) tai aineita, jotka vähentävät epäspesifistä sitoutumista (esim. naudan seerumin albumiini (BSA) tai lohen maidin DNA (ssDNA)). Hybridisaatio voidaan tehdä eri hybridisaatiolämpötiloissa (yleensä 25 välillä 40-70 °C) ja hybridisaatioon tarvittava aika voi vaihdella sovelluksesta riippuen muutamasta minuutista muutamaan vuorokauteen. Hybridisaatio voidaan vesihauteen asemesta tehdä esim. lämpökaapissa tai erityisessä hybridi-saatiolaitteessa (esim GeneTAC HybStation tai Lucidea Slidepro Hybridizer). Hybridisaation jälkeiset pesut voivat myöskin vaihdella kestoltaan, tilavuudel-30 taan, lämpötilaltaan ja käytettävän pesuliuoksen koostumukseltaan ja siksi olla erilaiset kuin mitä esimerkkimenetelmässä on esitetty. Mikrosirujen pesu voidaan myös suorittaa erillisellä laitteella. Joissakin tapauksissa pesu ei ole välttämätön, vaan mikrosiru voidaan analysoida heti hybridisaation jälkeen. Edullisessa menetelmässä hybridisaatio toteutetaan 53-58 °C:ssa erityisessä hybri-35 disaatiolaitteessa tai lämpökaapissa noin 10-30 minuutin ajan.
22
Mikrosirut voidaan analysoida millä tahansa tähän tarkoitukseen soveltuvalla laitteistolla tai lukijalla (esim. GeneTAC UC4, GenePix® Personal 4100A, Agilent DNA Microarray Scanner, tai valonlähteestä ja kamerasta koostuva lukija). Jos kohdejuoste on leimattu fluoresoivalla leimalla, voidaan ana-5 lysointiin käyttää myös esim. fluoresenssimikroskooppia. Jos leimana on käytetty radioaktiivista leimaa, voidaan siru tai kalvo analysoida autoradiografialla. Jos hybridisaatio on tehty elektronisen mikrosirun pinnalla ja toteaminen perustuu siten sähköiseen havaitsemiseen, voidaan mikrosiru analysoida tätä tarkoitusta varten suunnitellulla erityisellä laitteistolla.
10 Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä ei kärsi tunnetun tek niikan ongelmista. Keksinnön mukaiseen menetelmään sisällytetty monistus-vaihe on hyvin herkkä. Keksinnön mukaiset parannetut laajakirjoiset alukkeet monistivat tehokkaasti gyrB/parE-geenialueen fylogenettisesti erilaisista bak-teerilajeista riippumatta siitä, onko kyseessä gram-negatiivinen vai gram-15 positiivinen bakteerilaji (taulukko 2). Lisäksi PCR-tuote on lyhyt (noin 300 emäsparia), mikä edesauttaa monistusreaktion tehokkuutta.
Parannetut bakteerilajispesifiset ja ylemmän tason taksoneille spesifiset koettimet on suunniteltu hybridisoitumaan gyrB/parE-geenialueelle, joka on huomattavasti varioivampi geenialue kuin esim. 16S rRNA -geenialue, jota 20 on aiemmin käytetty bakteeridiagnostiikassa. Vaikka menetelmässä käytetyt laajakirjoiset alukkeet monistavatkin tehokkaasti myös normaaliflooran baktee-rilajeja, suunnittelun ulkopuolisia tunnistuksia ei tapahdu, sillä koettimet ovat bakteerilajispesifisiä tai ylemmän tason taksoneille spesifisiä ja tunnistavat vain ne bakteerit, joita varten ne on suunniteltu. Kaikki tässä kuvatut spesifiset oli-25 ginukleotidikoettimet testattiin ristiin eri bakteerilajien kanssa, mukaan lukien monia normaaliflooraan kuuluvia bakteerilajeja ja lähisukuisia kliinisesti merkittäviä bakteereita, koetinsuunnittelun optimoimiseksi. Siten esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on selvästi herkempi ja spesifisempi kuin aiemmin kuvatut vastaavantyyppiset menetelmät.
30 Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön testipakkauksen infekti oita aiheuttavien bakteerien, erityisesti verenmyrkytystä aiheuttavien bakteerien havaitsemiseen ja tunnistamiseen. Pakkaus käsittää vähintään yhden edellä yksityiskohtaisesti kuvatun, keksinnön mukaisen parannetun DNA-alukkeen, minkä tahansa sopivan ja halutun seoksen edellä yksityiskohtaisesti kuvattuja 35 parannettuja bakteerilajispesifisiä tai ylemmän tason taksoneille spesifisiä oli-gonukleotidikoetinsekvenssejä mahdollisesti kiinteälle alustalle kiinnitettynä, 23 mahdollisesti vähintään yhden sopivan positiivisen ja/tai negatiivisen kontrolli-koetinsekvenssin sekä mahdollisesti monistus-, puhdistus-, hybridisaatio-, pesu- ja/tai havaitsemisvaiheissa tarvittavia reagensseja, kuten edellä on esitetty. Keksinnön mukainen testipakkaus sisältää edullisesti DNA-5 alukeseoksen, joka käsittää sekvenssinumeroiden 1 ja 2 muodostamasta ryhmästä valittuja sekvenssejä, ja sirun, joka sisältää siihen kiinnitettynä vähintään yhden sekvenssinumeroiden 3-121 muodostamasta ryhmästä valitun oli-gonukleotidikoetinsekvenssin, mahdollisesti vähintään yhden positiivisen ja/tai negatiivisen kontrollin, ja mahdollisesti keksinnön mukaisen menetelmän suo-10 rittamiseen tarvittavia reagensseja.
Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoinen oligonukleotidikoettimi-en yhdistelmä käsittää vähintään kaksi oligonukleotidikoetinsekvenssiä valittuna sekvenssinumeroiden 3-121 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien tai toiminnallisten fragmenttien muodostamasta ryhmästä. Erääs-15 sä suoritusmuodossa yhdistelmä voi myös käsittää koettimia, jotka tunnistavat yhden tai useita haluttuja bakteereita ryhmästä, joka koostuu seuraavista: Acinetobacter baumannii, Bacteroides fragilis, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, 20 Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica alalaji enterica, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Stenot-25 rophomonas maltophilia, Proteus-suku, Staphylococcus-suku, ja Enterobacte-riaceae- heimo.
Seuraavaksi keksintöä valaistaan tarkemmin esimerkkien avulla. Menetelmää kuvattaessa on viitattu erilaisiin, tässä sovelluksessa käytettyihin laitteistoihin, materiaaleihin, lämpötiloihin, kemikaaleihin tai vastaaviin. Nämä 30 voivat luonnollisesti vaihdella keksinnön eri sovelluksissa tarkoituksenmukaisella tavalla. Tämän vuoksi keksintö ja sen suoritusmuodot siten rajoitu alla kuvattuihin esimerkkeihin.
Esimerkki 1. DNA:n PCR-monistus laajakirjoisten alukkeiden avulla
Bakteeripuhdasviljelmistä tai kliinisistä potilasnäytteistä peräisin 35 oleva DNA monistettiin käyttäen alla kuvattua menetelmää.
24 DNA eristettiin analysoitavasta näytteestä käyttäen nukleiinihap-poeristysrobottia (Nuclisens® easyMAG™, bioMeriex, Ranska). DNA:n eristämisen jälkeen haluttu kohde monistettiin PCR:n avulla. Ensin valmistettiin reak-tioseos. Tämä PCR-reaktioseos sisälsi 1 μΜ gB3F-alukeseosta (sekvenssi nro 5 1; tilattu yritykseltä Thermo Electron, USA), 1 μΜ Cy5-leimattua gB4R- alukeseosta (sekvenssi nro 2; tilattu yritykseltä Thermo Electron, USA), 1 x Hot Start Taq® PCR -puskuria (Qiagen, Saksa), johon oli lisätty MgCI2:a siten, että lopullinen konsentraatio oli 2,0 mM, 300 μΜ kutakin dATP, dGTP, dTTP ja dCTP (Finnzymes, Suomi), 1,5 g/l BSA (EuroCIone, Italia), 0,125 U/μΙ Hot 10 Start Taq® DNA-polymeraasia (Qiagen, Saksa) ja 1,5 μΙ eristettyä DNA:ta kokonaistilavuudessa 15 μΙ.
PCR suoritettiin PCR-laitteessa (Mastercycler®, Eppendorf, Saksa). Käytettiin seuraavanlaista PCR-ohjelmaa: 15 min denaturaatiovaihe lämpötilassa 95 °C, 36 sykliä 20 s lämpötilassa 95 °C, 35 s lämpötilassa 52 °C, 20 s 15 lämpötilassa 72 °C, minkä jälkeen 10 sykliä 10 s lämpötilassa 95 °C ja 30 s lämpötilassa 67 °C sekä lopuksi 5 sykliä 10 s lämpötilassa 95 °C ja 30 s lämpötilassa 69 °C. PCR:n jälkeen dsDNA:n ja ssDNA:n monistumisen onnistuminen tarkastettiin geelielektroforeesilla 2-%:isessa agaroosigeelissä, joka sisälsi SYBR® Green ll:ta (Invitrogen, USA).
20 Esimerkki 2. PCR-reaktio käyttäen kahta eri alukepariseosta
Esillä olevan keksinnön mukaisten alukkeiden ominaisuuksia tutkittiin suhteessa julkaisussa W02004046379 kuvattuihin alukkeisiin, jotka myös monistavat gyrS-geeniä.
Staphylococcus epidermidiksen puhdasviljelmistä eristettyä viittä 25 DNA-näytettä monistettiin käyttäen esimerkissä 1 kuvattua reaktioseosta. Valmistettiin kaksi rinnakkaista reaktiota käyttäen kahta eri alukeseosta. Sen lisäksi, että käytettiin keksinnön mukaisia alukkeita (sekvenssi nrot 1 ja 2), valmistettiin myös reaktiot käyttäen julkaisussa W02004046379 kuvattuja alukkeita (sekvenssi nrot 76-77 ). Käytettiin seuraavanlaista PCR-ohjelmaa: 15 min 30 denaturaatiovaihe lämpötilassa 95 °C, 36 sykliä 10 s lämpötilassa 96 °C, 35 s lämpötilassa 52 °C, ja 10 s lämpötilassa 72 °C, minkä jälkeen 5 sykliä 5 s lämpötilassa 96 °C ja 30 s lämpötilassa 65 °C sekä lopuksi 5 sykliä 5 s lämpötilassa 96 °C ja 30 s lämpötilassa 68 °C. Monistustuotteet analysoitiin agaroosigee-lielektroforeesilla etidiumbromidia käyttäen.
35 Tulokset esitetään kuviossa 1. Keksinnön mukainen alukepariseos sai aikaan voimakkaan DNA-raidan kaikista näytteistä (1B-5B). Sen sijaan jul- 25 kaisussa W02004046379 kuvatuilla alukkeilla toteutettu monistaminen sai aikaan voimakkaan DNA-raidan kolmesta näytteestä (1A-3A) ja hyvin heikon DNA-raidan kahdesta näytteestä (4A-5A). Esillä olevan keksinnön mukaiset alukkeet siis selvästi paransivat monistusreaktion tehokkuutta antaen tuotteen 5 kaikista testatuista S. epidermidis -kannoista.
Esimerkki 3. Lajispesifisten tai ylemmän tason taksoneille spesifisten koettimien suunnittelu
Bakteerilajispesifisten tai ylemmän tason taksoneille spesifisten oli-gonukleotidien eli koettimien suunnittelussa käytettiin linjaukseen perustuvaa 10 suunnittelustrategiaa. Suunnittelun kohteena olleiden bakteerilajien gyrB- ja parE-geenit linjattiin muutamasta läheistä sukua olevasta bakteerilajista peräisin olevien vastaavien geenien kanssa. Esimerkiksi Streptococcus pneu-moniaen gyrB-geeni linjattiin bakteerien Streptococcus pyogenes, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus ja Fusobacterium nec-15 rophorum gyrB-geenien kanssa. S. oralis ja S. mitis ovat läheistä sukua S. pneumonialle. Siksi S. pneumoniaelle suunnitellut oligonukleotidit eivät saa reagoida näiden normaaliflooraan kuuluvien bakteerien kanssa. Sekvenssit saatiin EMBL:n julkisesta sekvenssitietokannasta tai ne tuotettiin kloonaamalla tai PCR:llä sellaisten alukkeiden avulla, jotka oli suunniteltu käyttäen lä-20 hisukuisten bakteerilajien sekvenssejä tai tietokannoissa olevia osittaisia sekvenssejä.
Sekvenssien linjauksessa käytettiin Bio Edit -ohjelmaa ja ClustalVV-linjausalgoritmia. Linjauksista laskettiin konsensussekvenssi ja sopivasti kon-servoituneet alueet etsittiin manuaalisesti. Nämä alueet tarkoittavat sekvenssi-25 jaksoja, jotka ovat konservoituneet suunnittelun kohteena olevien bakteerilajien geeneissä, mutta joita ei löydy ainakaan kokonaan suunnittelun ulkopuolella olevien bakteerien geeneistä. Näiltä alueilta valittiin sopivan pituisia oligo-nukleotidisekvenssejä (15-40 nukleotidia) vertailuanalyyseihin. Valittuja oligo-nukleotidisekvenssejä verrattiin EMBL:n prokaryoottisekvenssitietokantaan 30 FastA-algoritmiä käyttäen. Ne oligonukleotidisekvenssit, jotka erosivat suunnittelun ulkopuolella olevien bakteerien gy/E/parE-geeneistä vähintään kahden emäksen verran, valittiin jatkotutkimuksiin. Oligonukleotideille määritettiin teoreettinen sulamislämpötila (Tm) ja tutkittiin, muodostavatko oligonukleotidit se-kundaarirakenteita. Tm (°C) laskettiin kaavalla 35 81,5 + 16,6 log [Na]+0,41(%GC) - 0,61 (%for) 500/N, 26 jolloin Na on monovalenttisten kationien pitoisuus (laskuissa 50 M), %GC on guaniini- ja sytosiini-emästen osuus, %for on formaliinipitoisuus (laskuissa 0 %) ja N on oligonukleotidin pituus. Sekundaarirakenteiden muodostumista tutkittiin Sigma-Genosysin tarjoamaa ohjelmaa käyttäen. Ne oligonuk-5 leotidit, jotka eivät muodostaneet voimakkaita sekundaarirakenteita ja joiden Tm-lämpötila oli vähintään 45 °C valittiin kokeellisiin spesifisyystutkimuksiin.
Oligonukleotidikoettimia syntetisoitiin ja samalla modifioitiin 5’-päästään (Nh^-modifioidut oligot) (Thermo Electron, USA). Koettimien spesifisyys testattiin laboratoriossa mikrosiruilla käyttäen eri bakteerilajeista ja poti-10 lasnäytteistä eristettyä DNA:ta (taulukko 2). Eristetyn DNA:n PCR tehtiin keksinnön mukaisen alukepariseoksen (sekvenssinumerot 1-2) avulla. Testatuista koettimista valittiin ne, jotka toimivat parhaiten ja osoittautuivat kaikkein spesi-fisimmiksi. Bakteerilajispesifisten ja ylemmän tason taksoneille spesifisten koettimien sekvenssit ja spesifisyys esitetään taulukoissa 3Aja 3B.
15 Esimerkki 4. Mikrosirujen käyttäminen parannetuilla alukkeilla ja koettimilla
Pseudomonas aeruginosaa taudinaiheuttajana sisältävästä potilas-näytteestä eristetty gyrB-geenin DNA käsiteltiin esimerkin 1 mukaisesti.
Cy5-leimattu kohde hybridisoitiin silikonipohjaiselle biosirulle, johon 20 koettimet oli kiinnitetty. Hybridisaatioreaktioseos sisälsi n. 50-100 ng leimattua kohdetta, 2xhybridisaatiopuskuria (koostumus: 1 PBS-tabletti, pH 7,4 (Sigma, USA), 0,7 M NaCI (Fluka, Sveitsi), 0,1 % Tween® 20 (100 %, Fluka, Sveitsi), 2xDenhardt’s (5x, Sigma, USA), 20 μg/ml lohen maidin DNA (dsDNA) (Amersham, Yhdistynyt kuningaskunta)), hybridisaatiokontrolli-25 oligonukelotidejä, ja steriiliä vettä. Reaktioseoksen tilavuus oli 25 μΙ. 2xHybridisaatiopuskuri esilämmitettiin 55 °C:een ennen käyttöä. Hybridisaatioreaktioseos siirrettiin biosirun hybridisaatioalueelle. Hybridisaatioalue suljettiin puristimilla ja biosiru asetettiin erityiseen hybridisaatiolaitteeseen. Kymmenen minuutin hybridisaation aikana lämpötilassa 55 °C sitoutui Cy5-leimattu 30 ssDNA-kohde mikrosirulle immobilisoituihin komplementaarisiin koetinse-kvensseihin muodostaen leimatun kaksinauhaisen rakenteen.
Hybridisaatiovaiheen jälkeen biosiru pestiin nopeasti hybridisoitu-mattoman DNA:n poistamiseksi. Pesuvaihe toteutettiin seuraavasti: 1 min 2xSSC-liuoksessa lämpötilassa 40 °C, ja 1 min 0,2xSSC-liuoksessa lämpöti-35 lassa 40 °C. Pesun jälkeen biosirut kuivattiin. Biosirut analysoitiin LED-valolähteestä ja CCD-kamerasta koostuvalla optisella lukijalaitteella. Havait- 27 seminen perustuu Cy5-leimatun geenituotteen vapauttamaan ja kameran vangitsemaan fluoresoivaan signaaliin.
Kuviossa 3 on esitetty esimerkki hybridisaatiotuloksista. Se havainnollistaa myös keksinnön mukaisten koettimien etuja julkaisussa 5 W02004046379 kuvattuihin koettimiin verrattuna. Julkaisussa W02004046379 kuvattujen Pseudomonas aeruginosa -koettimien tuottamien signaalien intensiteetit olivat heikkoja keksinnön mukaisten parannettujen koettimien tuottamien signaalien voimakkaisiin intensiteetteihin verrattuina. Koetinten uusi suunnittelu lisäsi siis patogeenien havaitsemista selvästi.
10 Esimerkki 5. Potilasnäytteiden analysoiminen mikrosirulla
Verenmyrkytyspotilaiden positiivisista veriviljelynäytteistä eristettyä DNA:ta monistettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan käyttäen alukepitoisuuksia 2 μΜ. Sekä PCR että monistetun DNA:n hybridisaatio (kuvattu esimerkissä 4) tehtiin samalla biosirulla, joka sisälsi kaivoja PCR-reaktiota varten sekä erityi-15 sen hybridisaatioalueen, johon taulukosta 3 valitut koettimet oli kiinnitetty. Samassa näytteessä havaittiin kaksi bakteerilajia, Klebsiella pneumoniae ja Enterococcus faecalis (kuvio 4). Tunnistustulos oli linjassa veriviljelystä saatujen tulosten kanssa.
Myös negatiivinen veriviljelynäyte analysoitiin, kuten edellä kuva-20 taan. Kuten odotettua, tulos ei paljastanut signaalia millään bakteerispesifisellä tai ylemmän tason taksoneille spesifisellä koettimella (kuvio 5).
Tulokset osoittavat useiden sellaisten patogeenien, joita ei voitu havaita julkaisussa W02004046379 kuvatuilla koettimilla, samanaikaisen havaitsemisen samasta näytteestä. Epäspesifistä hybridisoitumista ei myöskään ha-25 vaittu negatiivisessa näytteessä.
Claims (18)
1. Menetelmä infektioita aiheuttavien bakteereiden havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi näytteestä käsittäen vaiheet, joissa 5 a) monistetaan näytteestä peräisin oleva DNA käyttäen DNA-alu- ketta, joka käsittää sekvenssin, joka hybridisoituu topoisomeraaseja koodaavi-en geenien konservoituneille alueille, jolloin mainittu aluke on valittu sekvens-sinumeroiden 1 ja 2 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä, 10 b) saatetaan monistettu DNA kosketukseen vähintään yhden sellai sen oligonukleotidikoettimen kanssa, joka hybridisoituu bakteerilajispesifiseen tai ylemmän tason taksoneille spesifiseen hypervarioivaan alueeseen, joka sijaitsee mainittujen DNA-alukkeiden kanssa hybridisoituvien alueiden välissä, ja joka koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 3-121 ja 15 niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä, c) havaitaan mahdollisten hybridisaatiokompleksin muodostuminen ja tunnistetaan mainittu infektiota aiheuttava bakteeri mainitun havaitsemisen perusteella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu näyte on kliininen näyte.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa mainitut infektioita aiheuttavat bakteerit ovat verenmyrkytystä aiheuttavia bakteereita.
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, 25 jossa havaitaan ja tunnistetaan vähintään yksi bakteerilaji tai ylemmän tason taksoni, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: Bacillales, Bacteri-oidetes, Clostridia, Lactobacillales ja Proteobacteria.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa mainittu bakteerilaji on valittu ryhmästä, joka koostuu lajeista Acinetobacter baumannii,
30 Bacteroides fragilis, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Enterobac-ter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica ala-35 laji enterica, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Strepto- coccus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, ja Stenotrophomonas maltophi-lia.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa mainittu ylemmän tason taksoni on valittu Staphylococcus-suvusta tai Proteous-suvusta.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa mainittu ylem män tason taksoni on Enterobacteriaceae-heimo.
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa havaitaan ja tunnistetaan kaikki patenttivaatimuksessa 5 esitetyt bakteerilajit.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että vaiheessa a) käytetään ensimmäistä DNA-aluketta, joka käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 1 esitetyn sekvenssin, ja toista DNA-aluketta, joka käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 2 esitetyn sekvenssin.
10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, 15 jossa DNA:n monistusmenetelmä vaiheessa a) on polymeraasiketjureaktio (PCR).
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, jossa DNA:n monistuksessa vaiheessa a) käytetään leimattuja nukleotideja tai alukkeita.
12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, jossa mainitut oligonukleotidikoettimet on kiinnitetty kiinteään kantajaan.
13. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, jossa mainitut oligonukleotidikoettimet ovat liuoksessa.
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, 25 jossa vaiheessa c) käytetään mikrosirutekniikkaa.
15. DNA-aluke, joka käsittää vähintään yhden sekvenssin, joka hyb-ridisoituu topoisomeraaseja koodaavien geenien konservoituneille alueille ja joka on valittu sekvenssinumeroiden 1 ja 2 ja niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
16. Testipakkaus, joka on tarkoitettu käytettäväksi patenttivaatimuk sen 1 mukaisessa menetelmässä infektioita aiheuttavien bakteerien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi ja joka käsittää a) vähintään yhden, patenttivaatimuksen 15 mukaisen DNA-aluk- keen, 35 b) vähintään yhden bakteerilajispesifisen tai ylemmän tason takso- neille spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka käsittää sekvenssin, joka on va- littusekvenssinumeroiden 3-121 niiden käänteisten tai komplementaaristen sekvenssien muodostamasta ryhmästä, mahdollisesti kiinteälle kantajalle kiinnitettynä.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, joka käsittää 5 vähintään yhden positiivisen ja/tai negatiivisen kontrollikoetinsekvenssin.
18. patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, joka käsittää monistus- hybridisaatio-, puhdistus-, pesu- ja/tai havaitsemisvaiheissa tarvittavia reagensseja.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20085039A FI121428B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi |
| PCT/FI2009/050037 WO2009090311A2 (en) | 2008-01-17 | 2009-01-16 | Nucleic acid probes and broad-range primers |
| EP09702038.2A EP2240605B1 (en) | 2008-01-17 | 2009-01-16 | Nucleic acid probes and broad-range primers for detecting infectious bacteria |
| EP13188069.2A EP2716770A3 (en) | 2008-01-17 | 2009-01-16 | Nucleic acid probes for species-specific detection of infectious bacteria |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20085039A FI121428B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi |
| FI20085039 | 2008-01-17 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20085039A0 FI20085039A0 (fi) | 2008-01-17 |
| FI20085039A FI20085039A (fi) | 2009-07-18 |
| FI121428B true FI121428B (fi) | 2010-11-15 |
Family
ID=39004339
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20085039A FI121428B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP2716770A3 (fi) |
| FI (1) | FI121428B (fi) |
| WO (1) | WO2009090311A2 (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL391020A1 (pl) * | 2010-04-20 | 2011-10-24 | Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy Jana Kochanowskiego W Kielcach | Zdegenerowane oligonukleotydy oraz sposób molekularnej identyfikacji bakterii ureolitycznych |
| US9567649B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-02-14 | Jørn Erland Koch | System for identification of microorganism and detection of infectious disease |
| EP2702174B1 (en) * | 2011-04-28 | 2016-04-13 | Zymonostics ApS | System for identification of micro-organisms and detection of infectious disorders |
| CN102653793A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-09-05 | 江苏大学 | 鲍曼不动杆菌多重降落pcr检测试剂盒 |
| GB201317355D0 (en) | 2013-10-01 | 2013-11-13 | Epistem Ltd | Mutation Analysis |
| EP3607096A1 (en) * | 2017-04-03 | 2020-02-12 | Bio-Me AS | Microorganism detection methods |
| BR102018003245A2 (pt) * | 2018-02-20 | 2019-09-10 | Fundação Oswaldo Cruz | oligonucleotídeo, conjunto de oligonucleotídeos, método para detecção simultânea de neisseria meningitidis, streptococcus pneumoniae e haemophilus influenzae, e, kit. |
| CN114317790B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-02-13 | 北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所） | 预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2116543C (en) | 1991-07-31 | 2007-10-02 | Kay S. Greisen | Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid |
| US6001564A (en) | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| AU4546300A (en) * | 1999-04-10 | 2000-11-14 | Merlin Gesellschaft Fur Mikrobiologische Diagnostika Mbh | Genotypic classification method |
| FI113549B (fi) * | 2002-11-19 | 2004-05-14 | Mobidiag Oy | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos |
| FR2883298B1 (fr) * | 2005-03-17 | 2009-07-24 | Univ Aix Marseille Ii | Fragments d'acides nucleiques et methode de detection specifique par identification moleculaire de differentes especes de bacteries du genre acinetobacter |
-
2008
- 2008-01-17 FI FI20085039A patent/FI121428B/fi active IP Right Grant
-
2009
- 2009-01-16 EP EP13188069.2A patent/EP2716770A3/en not_active Withdrawn
- 2009-01-16 EP EP09702038.2A patent/EP2240605B1/en active Active
- 2009-01-16 WO PCT/FI2009/050037 patent/WO2009090311A2/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2716770A2 (en) | 2014-04-09 |
| EP2240605A2 (en) | 2010-10-20 |
| WO2009090311A2 (en) | 2009-07-23 |
| EP2716770A3 (en) | 2014-07-02 |
| WO2009090311A3 (en) | 2009-11-12 |
| FI20085039A0 (fi) | 2008-01-17 |
| FI20085039A (fi) | 2009-07-18 |
| EP2240605B1 (en) | 2014-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI121428B (fi) | Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi | |
| Barken et al. | Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections | |
| Fakruddin | Loop mediated isothermal amplification (LAMP)–an alternative to polymerase chain reaction (PCR) | |
| WO2016180037A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING PATHOGENS IN RESPIRATORY TRACT INFECTIONs | |
| EP1791956A1 (en) | Oligonucleotide for detection of microorganism diagnostic kits and methods for detection of microorganis using the oligonucleotide | |
| JP2010532665A (ja) | 細菌性および真菌性敗血症の病原菌の高感度な増幅および検出用の核酸配列およびその組合せ | |
| EP2570489A1 (en) | Food-poisoning bacteria detection carrier, and method for detecting food-poisoning bacteria | |
| AU2013353904A1 (en) | Method for detecting Helicobacter pylori DNA in a stool sample | |
| EP2014775B1 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera Anaplasma/Ehrlichia and Bartonella | |
| AU776981B2 (en) | Identification of bacteria by amplification and probing | |
| EP2829616B1 (en) | Composition and methods for detecting nucleic acid from mollicutes | |
| KR101373756B1 (ko) | 황색포도상구균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 황색포도상구균 동정 방법 | |
| EP1565573B1 (en) | Nucleic acid probes and broad-range primers from regions in topoisomerase genes, and methods in which they are used | |
| Hu et al. | Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay | |
| FI121884B (fi) | Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus | |
| EP1802771B1 (en) | Detection, identification and differentiation of serratia species using the spacer region | |
| KR20190134202A (ko) | 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 mlpa 프로브 및 그 용도 | |
| FI115637B (fi) | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos | |
| JP6873903B2 (ja) | 強毒型クロストリジウムディフィシル株の存在を検出するための方法 | |
| FI121379B (fi) | Menetelmä yksijuosteisen DNA:n tuottamiseksi kaksivaiheisella symmetrisellä PCR:llä sekä menetelmään tarkoitettu reagenssipakkaus | |
| EP1529848B1 (en) | Substances, sequences and methods for identifying epidemic methicillin resistant Staphylococcus aureus strains | |
| JP2007289170A (ja) | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 121428 Country of ref document: FI |