FI115637B - Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos - Google Patents

Description

115637

Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos

Keksinnön ala 5 Keksintö koskee diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään nukle- iinihappokoettimia ja universaaleja alukkeita, bakteerien tunnistamiseksi ja bakteerien aiheuttamien infektioiden diagnosoimiseksi. Keksintö koskee myös universaaleja alukkeita, jotka ovat peräisin infektioita aiheuttavien bakteerien RNA-polymeraasia koodaavan geenialueen alayksikköä B, rpoB (DNA directed 10 RNA polymerase subunit B), konservoituneiden alueiden lähellä olevilta hyper-varioivilta alueilta.

Keksinnön tausta

Hengitystieinfektiot ovat yleinen syy lääkärin vastaanotolla käyntiin Suomessa ja maailmanlaajuisesti. Hengitystieinfektioita aiheuttaa virusten li-15 säksi suuri joukko erilaisia bakteereja. Streptococcus pyogenes (A-ryhmän streptokokki) on tärkeä nielurisatulehduksen, tonsilliitin, aiheuttaja. Sen aiheuttamaan hoitamattomaan tonsilliittiin liittyy vakavien komplikaatioiden, kuten pe-ritonsillaarisen absessin, riski. Lisäksi S. pyogenes -tonsilliittien jälkitauteina voi esiintyä reumakuumetta ja glomerulonefriittiä, jotka molemmat ovat vaka-20 via, jopa potilaan henkeä uhkaavia tauteja. Avohoitokeuhkokuumeiden tär-: keimpiä taudinaiheuttajia ovat virusten lisäksi Streptococcus pneumoniae . (pneumokokki), Mycoplasma pneumoniae ja Chlamydia pneumoniae, joista ,...: pneumokokki on yleisin ja vakavin keuhkokuumeen aiheuttaja. Harvinaisempi :. keuhkokuumeen aiheuttaja on Legionella pneumophila. Mycobacteriun tuber- 25 culosis -bakteeri puolestaan aiheuttaa keuhkotuberkuloosia. Poskiontelotuleh-’·*’ duksen (sinuiitti) ja välikorvatulehduksen (otitis media) aiheuttajia ovat pneu mokokin lisäksi mm. Haemophilus influenzae ja Moraxella catarrhalis.

: Tällä hetkellä hengitystieinfektioiden diagnostiikka on bakteerien osalta pääasiassa bakteeriviljelyn varassa. Bakteerien viljeleminen on kuiten-30 kin suhteellisen hidasta ja viljelyyn perustuvat diagnostiset menetelmät antavat tuloksia yleensä vasta vuorokausien, joskus jopa viikkojen kuluttua näytteen '·' otosta. Bakteerien viljely ei myöskään aina onnistu laboratorio-olosuhteissa.

:.: Tämä voi johtua joko siitä, että käytetty viljelymenetelmä ei ole kyseiselle bak- teerille soveltuva tai siitä, että potilaalle on ennen näytteen ottamista annettu 35 antibioottihoitoa. Nielutulehdusten diagnostiikassa antigeenin osoitukseen pe- 2 115637 rustuvat pikamenetelmät ovat hyviä bakteeriviljelyä täydentäviä menetelmiä, mutta niiden ongelmana on suppea lajivalikoima (A-ryhmän streptokokki). Joidenkin bakteeri-infektioiden (esim. C. pneumoniae ja M. pneumoniae) diagnostiikassa voidaan käyttää myös serologisia menetelmiä, mutta nämä menetel-5 mät antavat tuloksia vasta päiviä tai useita viikkoja infektion alkamisen jälkeen eivätkä näin ollen välttämättä auta potilaan akuutissa hoidossa.

Molekylaariset nukleiinihappojen monistamiseen ja hybridisaatioon perustuvat menetelmät pyrkivät ratkaisemaan edellä kuvatut bakteeriviljelyyn liittyvät ongelmat. Niiden avulla bakteeri todetaan ja tunnistetaan samanaikai-10 sesti, mikä nopeuttaa diagnostiikkaa, eikä aikaa vieviä jatkoviljelyjä tarvita. Antibiootit eivät myöskään häiritse molekylaarisia menetelmiä samassa määrin kuin bakteeriviljelyä.

Eräs bakteeridiagnostiikassa käytetyistä molekylaarisista menetelmistä on ns. yleis-bakteeri-PCR, joka perustuu ns. universaalien alukkeiden 15 käyttöön. Tällä hetkellä käytössä olevissa yleis-bakteeri-PCR-menetelmissä käytetään ribosomaalista RNA:ta (16S rDNA/rRNA tai 23S rDNA/rRNA) koo-daavien geenien konservoituneille DNA-alueille sijoittuvia alukkeita. Yleis-bakteeri-PCR:ään perustuvassa bakteerien tunnistuksessa varsinainen tunnis-tusvaihe toteutetaan sekvensoimalla saatu PCR-tuote. (Katso esim. EP-20 patentti 613 502, US-patentti 6 001 564 ja US-patenttihakemus 0 020 055 101). Multibakteeri-infektioiden suora tunnistus vaatii kloonaamalla : ·· tuotettujen transformanttikirjastojen tutkimista sekvensoimalla.

Yleis-bakteeri-PCR-menetelmää on jonkin verran sovellettu kliini- : V: seen bakteeridiagnostiikkaan, vaikka se soveltuukin parhaiten bakteeri- ja sie- *:*·: 25 nilajien tunnistukseen puhdasviljelmistä, ja tähän tarkoitukseen on kehitelty ;V: myös kaupallisia testejä, kuten esim. MicroSeq (Applied Biosystems). Nämä .···. testit eivät kuitenkaan ole laajalti käytössä, sillä PCR-tuotteen sekvensointi on hidasta ja työlästä ja itse testit ja niiden käyttöön tarvittavat laitteistot, kuten . . esim. sekvensointilaitteet, ovat kalliita ja testien suorittaminen vaatii koulutettua :;1,: 30 henkilökuntaa.

• ♦ ’·; ·* Toinen bakteeridiagnostiikassa jonkin verran käytetty menetelmä on ;i* spesifisiin oligonukleotideihin perustuva klassinen PCR tai sen sovellutus mul- tiplex-PCR-menetelmä. Tässä menetelmässä monistamiseen käytetään bak-teerilajispesifisten alukkeiden seosta. Hendolin et ai. [Journal of Clinical Micro-*·’·’ 35 biology. 35 (11):2854-2858, 1997] käyttivät multiplex-PCR-menetelmää väli korvantulehdusta aiheuttavien bakteerien tunnistukseen. Kyseisessä menetel- 3 115637 mässä käytettiin toisena PCR-alukkeena universaalia, 16S-rRNA:n konservoi-tuneelle geenialueelle sijoittuvaa aluketta ja toisena PCR-alukkeena alu-keseosta, joka koostuu neljälle eri bakteerilajiIle spesifisistä alukkeista. Baktee-rilajispesifiset alukkeet oli suunniteltu siten, että aikaansaatu PCR-tuote on eri-5 pituinen riippuen siitä, mistä bakteerilajista se on peräisin, jolloin tunnistus perustuu syntyvän PCR-tuotteen pituuteen. Vaikka multiplex-PCR menetelmä onkin suhteellisen herkkä ja nopea, menetelmällä on haittapuolia. Tiedetään, että lyhyemmät DNA-jaksot monistuvat tehokkaammin kuin pidemmät jaksot.

Jos siis samassa näytteessä on kahta bakteeria, monistuu lyhyemmän tuot-10 teen antavan bakteerin DNA todennäköisesti tehokkaammin, mikä vaikuttaa menetelmän herkkyyteen. Lisäksi multiplex-PCR-menetelmällä pystytään samanaikaisesti tunnistamaan vain muutamia bakteerilajeja, sillä käytännössä on mahdotonta suunnitella kymmeniä spesifisiä PCR-alukkeita siten, että ne toimisivat samoissa PCR-olosuhteissa ja että syntyvät PCR-tuotteet eroaisivat 15 pituudeltaan riittävästi toisistaan. Multiplex-PCR ei siis sovellu esim. hengitys-tieinfektiodiagnostiikkaan, jossa kliinisesti tärkeitä taudinaiheuttajia halutaan tutkia huomattavasti enemmän kuin kymmenen yhdellä kertaa.

Myös ribosomaalisen RNA:n käyttöön liittyy ongelmia. Lähisukuisten bakteerilajien erottaminen toisistaan rRNA-molekyylien avulla on vaikeaa, kos-20 ka näiden molekyylien sekvensseihin ei evoluution aikana ole kertynyt riittävästi eroja. Ja vaikka lajien välisiä eroja löytyisikin, nämä varioivat kohdat ovat yleensä jakautuneet koko rRNA-molekyylin alueelle (esim. 16S rRNA:n pituus :V on noin 1500 emästä), mikä rajoittaa diagnostiikassa hyödynnettävien moleky- laaristen menetelmien käyttöä. Käytännössä lähisukuiset bakteerit voidaan siis ,*·*: 25 erotella toisistaan vain sekvensoimalla koko rRNAita koodaava geeni, mikä ei * · ’; sekään aina välttämättä riitä erottamaan lajeja toisistaan.

• *

Keksinnön lyhyt selostus

Esillä oleva keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön välineitä ja : keinoja, jotka ovat käyttökelpoisia infektioita aiheuttavien, erityisesti hengitys- 30 tieinfektioita sekä korva-, nenä-ja kurkkutauteja, aiheuttavien bakteerien diag- • j · nostiikassa, mutta joilla ei ole edellä kuvattuja bakteerien diagnostiikkaan liitty- .··*. viä haittoja. Erityisesti keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön uusia mole- kylaarisiin menetelmiin perustuvassa bakteeridiagnostiikassa käyttökelpoisia * ·: välineitä ja menetelmiä, jotka ovat herkkiä, tehokkaita ja lajispesifisiä ja joiden 35 avulla voidaan tunnistaa vain halutut bakteerit spesifisesti. Keksinnön tarkoituksena on myös antaa käyttöön menetelmiä, joilla infektion aiheuttava baktee- 4 115637 ri voidaan diagnosoida oleellisesti aiempaa nopeammin, jolloin potilaalle voidaan määrätä oikea ja tehokas antibioottihoito taudin varhaisemmassa vaiheessa, jolloin taudin kesto lyhenee ja mahdollisten haitallisten, jopa hengenvaarallisten komplikaatioiden riski vähenee.

5 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön bakteerilajispesifisiä oligonuk- leotidikoettimia, jotka ovat peräisin DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavan geenialueen, rpoB:n (DNA directed RNA polymerase subunit B) konservoituneiden alueiden välisiltä ns. hyperva-rioivilta alueita, joilla emäsjärjestys on hyvin erilainen eri bakteerilajeilla. Näi-10 den bakteerilajispesifisten koettimien avulla infektioissa tavattujen bakteerien perimäaines voidaan paitsi osoittaa myös samanaikaisesti tunnistaa.

Keksintö antaa käyttöön myös universaaleja alukkeita, jotka ovat peräisin infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavien rpoB-geenien konservoituneilta alueilta 15 ja jotka monistavat tehokkaasti infektioita aiheuttavien bakteereiden DNA:ta myös kliinisistä näytteistä, jotka sisältävät runsaasti vierasta (ei-bakteeri-peräistä) DNA:ta.

Lisäksi esillä oleva keksintö antaa käyttöön yksinkertaisia, nopeita, herkkiä ja spesifisiä menetelmiä, joilla olemassa olevan tekniikan mukaisten 20 menetelmien haitat voidaan voittaa. Näillä menetelmillä kliinisesti merkittäviä bakteereja voidaan luotettavasti todeta ja diagnosoida kliinisistä näytteistä tai . · · bakteeriviljelmistä.

,,ν Esillä oleva keksintö koskee diagnostista menetelmää infektioita ai- : V: heuttavan bakteerin osoittamiseksi ja tunnistamiseksi kliinisestä näytteestä, ; · j 25 jolloin menetelmässä

a) kliinisestä näytteestä eristetty DNA monistetaan käyttäen DNA-alukeseosta, joka sisältää sekvenssejä, jotka hybridisoituvat infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B

. , koodaavien φοβ-geenien konservoituneiden alueiden sekvenssien kanssa ja ';;,: 30 jotka käsittävät sekvenssien tunnusnumerot 20 ja 21 mukaiset sekvenssit ja/tai ♦ · ; ' niiden kanssa komplementaariset sekvenssit tai näiden toiminnalliset fragmen- •: · tit, • · I t b) monistettu DNA saatetaan kosketukseen halutun yhdistelmän kanssa oligonukleotidikoetinsekvenssejä, jotka hybridisoituvat normaaleissa 35 hybridisaatio-olosuhteissa infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavien φοΒ-geenien kon- « I » 5 115637 servoituneiden alueiden lähellä olevan hypervarioivan alueen sekvenssin kanssa ja jotka ovat bakteerilajispesifisiä, hybridisaatio-olosuhteissa, ja c) todetaan mahdollinen hybridisaatiokompleksin muodostuminen.

Tällaisia infektioita, erityisesti hengitystieinfektioita sekä korva-, ne-5 nä- ja kurkkutauteja, aiheuttavia bakteereja ovat esimerkiksi bakteerit Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Corynebacterium diphteriae, Mycoplasma pneumoniae, Echerichia coli, Mora-xella catarrhalis ja Neisseria gonorrhoeae.

10 Edullisesti oligonukleotidikoetinsekvenssin pituus on 15 - 30, edulli semmin 19 - 30 ja edullisimmin 19-26 nukleiinihappoa.

Esillä oleva keksintö koskee myös edellä mainittujen oligonukleoti-dikoetinsekvenssien käyttöä hybridisaatiokoettimina.

Edullisesti käytetään oligonukleotidikoetinseosta, joka sisältää minis kä tahansa yhdistelmän, edullisesti kaikki, sekvensseistä, joilla on sekvenssi-tunnusnumerot 1-19, ja/tai näiden kanssa käänteisistä ja/tai komplementaarisista sekvensseistä ja/tai näiden toiminnallisista fragmenteista. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa haluttu koetinseos on kiinnitetty kiinteälle kantajalle. Edullisesti kiinteälle kantajalle on kiinnitetty oligonukleotidikoetinseos, joka si-20 sältää kaikki sekvenssit, joilla on sekvenssitunnusnumerot 1-19, ja/tai näiden kanssa käänteiset ja/tai komplementaariset sekvenssit.

: - Esillä oleva keksintö koskee myös uutta DNA-aiukeseosta, joka si- ·'. ·, ·’ sältää sekvenssejä, jotka hybridisoituvat hengitystieinfektioita aiheuttavien bak- :Y: teerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavi- ·:··· 25 en rpoB-geenien konservoineiden alueiden sekvenssien kanssa ja jotka kä- eittävät sekvenssien tunnusnumerot 20 ja 21 mukaiset sekvenssit ja/tai niiden · · ·. kanssa komplementaariset sekvenssit tai näiden toiminnalliset fragmentit.

• »

Esillä oleva keksintö koskee myös mainitun alukeseoksen käyttöä . . rpoB.n monistamisessa.

» » · ;;/ 30 Edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa ’···’ kliinisestä näytteestä eristetty DNA monistetaan polymeraasiketjureaktiota ·:· käyttäen ja monistettu DNA saatetaan kosketukseen kiinteälle kantajalle kiinni- :'"; tettyjen bakteerilajispesifisten oligonukleotidikoettimien kanssa.

Eräässä edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suoritus-’ · 35 muodossa kliinisestä näytteestä eristetyn DNA: n monistuksessa käytetään so- 6 115637 pivasti leimattua nukleotidiä todettavissa olevan kohdejuosteen aikaansaamiseksi.

Toisessa edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa monistettu ja mahdollisesti leimattu kohde-DNA saatetaan koske-5 tukseen kiinteän kantajan, edullisesti käsitellyn lasin, kanssa, jolle on kiinnitetty kaikki keksinnön mukaiset lajispesifiset oligonukleotidikoettimet, joilla on sek-venssitunnusnumerot 1-19, ja/tai niiden käänteiset ja/tai komplementaariset sekvenssit.

Vielä eräässä edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän suori-10 tusmuodossa monistettu ja mahdollisesti leimattu kohde-DNA saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan, edullisesti käsitellyn lasin, kanssa, jolle on kiinnitetty keksinnön mukaiset, tietylle tai muutamalle hengitystieinfektioita aiheuttavalle bakteerille spesifiset oligonukleotidikoettimet, joilla on vastaavat sekvens-situnnusnumerot taulukosta 3 eli sekvenssit 1 ja 2, 3 ja 4, 5 ja 6, 7 ja 8, 9 ja 10, 15 11 ja 12,13 ja 14,15 ja 16, 17 ja 18 tai sekvenssi 19, ja/tai niiden komplemen taariset sekvenssit ja/tai näiden käänteiset sekvenssit.

Kuvioiden lyhyt selostus

Kuvio 1 esittää esimerkin (Mycoplasma pneumoniae) hyperva-rioivasta /poB-geenialueesta, joka rajoittuu konservoituneisiin alueisiin. Kon-20 servoidut alueet on lihavoitu ja alleviivattu ja ne toimivat rpoB-alukkeiden kiin-nittymiskohtina. Niiden väliin jää hypervarioiva alue, joka on merkitty pienillä kirjaimilla.

;y. Kuviossa 2 esitetään agaroosigeelielektroforeesitarkistus puhdasvil- jeltyjen bakteerien DNA.n leimaus-PCR.n tuloksesta. Kuviossa kaista 1 on M.

: v, 25 catarrhalis, kaista 2 on M. cuniculi, kaista 3 on M. caviae, kaista 4 on N. go-

• I

nonhoeae, kaista 5 on H. influenzae, kaista 6 on H. ducreyi, kaista 7 on H. pa-rainfluenzae, kaista 8 on S. pyogenes, kaista 9 on S. pneumoniae, kaista 10 S. oralis, kaista 11 on S. mitis, kaista 12 on P. aeruginosa, kaista 13 on C. dipht-: heriae, kaista 14 on L. pneumophila, kaista 15 on E. coli, kaista 16 on P.

t * k 30 pneumotropica, kaista 17 on S. aureus, kaista 18 on M. pneumoniae ja M on .:. 100 emäsparin markkeri.

,··>. Kuviossa 3 esitetään esimerkki hybridisaatiotuloksesta koetinlasilla.

» I

Hybridisoitavana kohdejuosteena oli Streptococcus pneumoniaen (patogeeni) . . · ja samaan sukuun kuuluva Streptococcus oraliksen (normaalifloora) puhdasvil- ; 35 jelmästä eristetyn DNA:n /poB-monistuma (epäsymmetrinen Cy-5-dCTP- leimattu PCR-tuote). Esimerkkilasilla on nuolilla merkityt S. pneumonia leimat- 7 115637 tua kohdejuostetta sitovat oligospotit. Niissä olevien oligonukleotidien sekvenssit ovat taulukossa 3 esitetyt S. pneumoniae oligonukleotidikoettimet 5 ja 6. Signaalin antoi myös positiivinen kontrollioligonukleotidi (universaali PCR-aluke sekvenssinumero 21). S. oralis -spesifisiä oligonukleotidispotteja lasilla 5 ei ole.

Keksinnön yksityiskohtainen selostus

Esillä oleva keksintö perustuu tutkimuksiin, joissa pyrittiin löytämään spesifisempiä vaihtoehtoja ribosomaalisen RNA:n käytölle infektioita aiheuttavien bakteerien diagnostiikassa. Tutkimus kohdistettiin muihin geeneihin, jotka 10 ovat elintärkeitä bakteereille. rpoS-geenialue koodaa kolmesta alayksiköstä a, β ja β' (vastaavasti /poA, rpoB ja /poC) koostuvan DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.61 alayksikköä β (rpoB). DNA-ohjatun RNA-polymeraasin tehtävä bakteereissa on DNA.n transkriptio.

Tietyt alueet proteiineista ja vastaavasti myös geeneistä ovat säily-15 neet evoluution aikana lähes muuttumattomina eli konservoituneet. Tässä yhteydessä termillä ’’konservoitunut alue” tai ’’konservoituneet alueet” tarkoitetaankin /poB-geenin tai -proteiinin aluetta tai alueita, joiden emäsjärjestys tai vastaavasti aminohappojärjestys on säilynyt lähes muuttumattomana eri infektioita aiheuttavien bakteerilajien välillä. Yleensä nämä konservoituneet alueet 20 ovat proteiinin toiminnan kannalta kaikkein tärkeimpiä alueita. rpoB-molekyylit • ·.. eivät kuitenkaan ole yhtä konservoituneita kuin ribosomaaliset RNA-molekyylit.

. Koska kyseessä ovat proteiinimolekyylit, niitä koodaavissa geeneissä on ge- .·.·. neettisen koodin luonteesta johtuen enemmän eroja nukleiinihappotasolla kuin mitä rakenteellisia RNA-molekyylejä (esim. 16S rRNA -molekyylit) koodaavissa « · .. . 25 geeneissä. rpoB-molekyylit eivät myöskään kokonaisuudessaan ole evoluution kuluessa säilyneet yhtä muuttumattomina kuin rakenteelliset RNA-molekyylit: '··’ rpoB-molekyyleistä on löydettävissä myös lyhyitä jaksoja, joissa erot eri bak teerilajien välillä ovat niin suuria (myös lähisukuisten välillä), että kyseisiä jak- » · : soja voidaan pitää lajispesifisinä. Tässä yhteydessä ilmaisu hypervarioiva alue 30 viittaakin rpoB-geenien DNA-sekvensseihin, jotka eroavat nukleotidiemässe-kvenssin suhteen eri bakteerien välillä siten, että syntyy lajispesifisyys ja jotka ! t sijaitsevat lähellä rpoS-geenien konservoituneita sekvenssejä ja ovat mahdolli- t | sesti konservoineiden sekvenssien rajaamia tai ympäröimiä. v,: Edellä mainittuja ominaisuuksia käytettiin hyväksi bakteerilajeille ": 35 spesifisten koettimien suunnittelemisessa. Lajispesifisten koettimien (eli oligo nukleotidien) (taulukko 3) suunnittelussa käytettiin linjaukseen perustuvaa 8 115637 suunnittelustrategiaa. Suunnittelun kohteena olleiden bakteerien rpoB-geenit linjattiin referenssibakteereista lähtöisin olevien vastaavien geenien kanssa. Sekvenssit saatiin EMBL:n sekvenssitietokannasta tai tuotettiin itse kloonaamalla niistä bakteerilajeista, joista φοβ-sekvenssiä ei ollut saatavilla julkisista 5 sekvenssitietokannoista. Sekvenssit tuotettiin monistamalla bakteeripuhdasvil-jelmistä haluttu rpoB-sekvenssijakso, joka sitten kloonattiin ja sekvensoitiin. Esimerkki Mycoplasma pneumoniae -bakteerin hypervarioivasta rpoB-geenialueesta, joka rajoittuu konservatiivisiin alueisiin, on esitetty kuviossa 1. Konservoineet alueet on lihavoitu ja alleviivattu ja ne toimivat universaalien 10 /poB-alukkeiden kiinnittymiskohtina. Näiden väliin jää hypervarioiva alue, jolle lajispesifiset koettimet on suunniteltu (pienemmät isot kirjaimet).

Sekvenssien linjauksessa käytettiin BioEdit-ohjelmaa ja ClustalW-linjausalgoritmia. Linjauksesta laskettiin konsensussekvenssi ja sopivasti kon-servoituneet alueet etsittiin manuaalisesti. Nämä alueet tarkoittavat sekvenssi-15 jaksoja, jotka ovat konservoineet suunnittelun kohteena olevien bakteerien geeneissä, mutta joita ei löydy ainakaan kokonaan referenssibakteerien geeneistä. Näistä jaksoista valittiin sopivan pituiset (esim. 19-26 emästä) sek-venssijaksot varsinaisten oligonukleotidien sekvensseiksi. Valittuja oligo-nukleotidisekvenssejä verrattiin EMBL:n prokaryoottitietokantaan FASTA-20 algoritmiä käyttävällä ohjelmalla. Ne oligonukleotidisekvenssit, jotka erosivat muiden kuin suunnittelun kohteena olevien bakteerien /poB-geeneistä vähin- • '·· tään kahden emäksen verran, valittiin jatkotutkimuksiin. Oligonukleotideille määritettiin teoreettinen sulamislämpötila (Tm) ja tutkittiin, muodostavatko oli-:V: gonukleotidit sekundaarirakenteita (hiusneularakenteita). Ne oligonukleotidit, ·...; 25 jotka eivät muodostaneet voimakkaita sekundaarirakenteita ja joiden Tm- : *, ·. lämpötila oli vähintään 45 °C, valittiin kokeellisiin spesifisyystutkimuksiin. Labo- • t [···' ratoriossa koettimien spesifisyys testattiin ensin useilla eri bakteerilajeista eris- • » tetyillä DNA-näytteillä (taulukko 2) sekä lisäksi potilasnäytteillä (taulukko 4).

. , Esillä olevan keksinnön mukaiset oligonukleotidikoettimet käsittävät * · · ·’·· : 30 sekvenssien tunnusnumerot 1-19 mukaiset sekvenssit ja/tai niiden kanssa käänteiset ja/tai komplementaariset sekvenssit ja/tai näiden käänteiset sek-• :· venssit. Ne voivat olla eripituisia, ja niiden sopivan pituuden määrää vain halut- . * · ·. tu laji-spesifisyys ja toimivuus hybridisaatioreaktiossa. Tavallisesti ne ovat 15- 30, edullisesti 19 - 30 ja edullisimmin 19-26, nukleotidiä pitkiä. Koettimet voi-• · ‘ 35 vat myös olla eri tavoin modifioituja (ne voivat esimerkiksi sisältää modifioituja ”: nukleotidejä, kuten inosiini), niihin voi olla liitettynä erilaisia kemiallisia yhdistei- 9 115637 tä tai ryhmiä (esim. aminoryhmiä) tai muita molekyylejä, kuten erilaisia detekti-oon tarvittavia leimoja, tai niistä voi kokonaan puuttua modifikaatiot. Edullisten keksinnön mukaisten bakteerilajispesifisten koettimien sekvenssit on esitetty taulukossa 3 ja niillä on sekvenssitunnusnumerot 1-19. Luonnollisesti näiden 5 oligonukleotidisekvenssien käänteiset ja komplementaariset sekvenssit ovat yhtä käyttökelpoisia ja edullisia, kuten alan ammattimiehelle on ilmeistä. Samoin mainittujen oligonukleotidisekvenssien toiminnalliset fragmentit ovat käyttökelpoisia koettimina edellyttäen, että lajispesifisyys säilyy.

PCR-alukkeiden suunnittelua varten Chlamydia pneumoniaan, 10 Mycoplasma pneumoniaen, Haemophilus influenzaen, Streptococcus pneu-moniaen ja Streptococcus pyogeneksen rpoB-proteiinien aminohappo-sekvenssit linjattiin BioEdit-ohjelmalla käyttäen ClustalW-linjausalgoritmia. Linjauksesta löytyi konservoituneita alueita, jotka otettiin universaalien alukkeiden suunnittelun lähtökohdaksi. Konservoituneet aminohappojaksot käännettiin ta-15 kaisin nukleiinihapposekvenssiksi. Geneettisen koodin luonteesta johtuen alukkeisiin tuli useita degeneroituneita kohtia. Konservoituneiden jaksojen perusteella valmistettiin alukepareja, joita testattiin laboratoriossa (spesifisyys- ja herkkyystestaukset).

Tutkimuksen tavoitteena oli alukepari, joka toimii kliinisistä näytteis-20 tä, mutta samalla säilyttää riittävän laajan spesifisyyden eli sen avulla voidaan monistaa kaikkien hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien rpoB-geenit.

• · Toimiva alukepari on esitetty taulukossa 1. Tämän alukeparin avulla kaikkien : fylogeneettisesti hyvinkin etäällä toisistaan olevien bakteerien (taulukko 2) : V: /poB-geenit voidaan monistaa myös tilanteessa, jossa näytteessä on runsaasti • 1 25 ihmisen DNA:ta.

I · t • · »

• I

• t I 1 > I 1 I 1 1 • · • · · * · · • 1 · · » ·

Ml» • ·

» I

» · · 10 115637

Taulukko 1. rpoB-universaalialukkeet

Alukkeen nimi Sekvenssi 5’->3’ Sekvenssin tunnusnumero rpoB2-for GCYGGNCGHCAYGGWAAYAARGG 20 RPOb2-rew GGYACSCCVAGDGGGTTYA 21

Alukesekvensseissä 5 D tarkoittaa emästä A tai G tai T, Y tarkoittaa emästä C tai T, N tarkoittaa emästä A tai G tai C tai T, H tarkoittaa emästä A tai C tai T, W tarkoittaa emästä A tai T, 10 R tarkoittaa emästä A tai G, S tarkoittaa emästä C tai G ja V tarkoittaa emästä A tai C tai G.

Kyseessä ovat siis alukeseokset, jotka koostuvat useista eri aluke-vaihtoehdoista. Esim. alukkeen rpoB2-for tapauksessa seoksessa on siis aluk-15 keitä, joissa W:n kohdalla on A (adeniini) ja alukkeita, joissa W:n kohdalla on T (tyrniini).

, Keksinnön mukaisesti spesifisiä koettimia voidaan käyttää infektioi ta, erityisesti hengitystieinfektioita sekä korva-, nenä- ja kurkkutauteja aiheut-tavien bakteerien tunnistamiseksi missä tahansa sopivassa menetelmässä, ; 20 jolla hybridisaatio voidaan osoittaa. Tällaiset menetelmät ovat alan ammatti laisten hyvin tuntemia ja ne voidaan toteuttaa sekä liuoksessa että DNA:ta sitovalla kiinteällä kantajalla, kuten nitroselluloosa- tai nylonkalvolia, tai lasilla.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä toteaminen tehdään käyttäen DNA-sirutekniikkaa, jolloin DNA-sirulla tai DNA-lastulla (chip) : 25 tarkoitetaan pienikokoista alustaa, jolle tunnettuja nukleiinihappojaksoja on kiinnitetty tiettyyn ennalta määrättyyn jäijestykseen. Jos sirulle kiinnitetyt nukle-. iinihappojaksot ovat lyhyempiä kuin 100 emäsparia (yleensä noin 20 - 30 emäsparia), puhutaan ns. oligonukleotidisiruista.

* » » # * * * · 11 115637

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä analysoitava näyte voi olla bakteeriviljelmä, kudospala, eritenäyte, kuten yskös- tai sively-näyte, verinäyte tai muu sopiva näyte, erityisesti eritenäyte kliinisissä diagnostisissa sovelluksissa.

5 Analysoitavasta näytteestä eristetään DNA millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten kaupallisesti saatavilla olevilla DNA:n eristyskitteillä (esim. High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche; NucleoSpin, BD Biosciences Clontech; tai QIAamp DNA Mini-kit, Qiagen) tai perinteisillä fenoli-kloroformi tai vastaavilla orgaanisilla liuottimilla tehtävillä uutoilla, joko manuaalisesti tai eri-10 tyisillä DNA:n eristykseen soveltuvilla laitteilla. Edullisesti käytetään helpon saatavuuden, nopeuden ja toistettavuuden vuoksi kaupallisia kittejä.

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä DNA:n monistukseen käytettävät reagenssit voivat olla mitä tahansa alalla DNA:n monistukseen käytettyjä reagensseja, jotka alan ammattimiehet hyvin tuntevat. Sopivia 15 ja edullisia kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ovat erityyppiset Taq-DNA-polymeraasit ja niiden puskurit (esim. AmpliTaqGOLD, AmpliTaqLD, Dy-NAzyme, TaqPlus Precision ja HotStarTaq), nukleotidit tai valmiit nukleoti-diseokset (esim. Sigma, Applied Biosystems, Amersham Biosystems), MgCb (jolloin yleensä käytetään saman valmistajan tuotetta kuin Taq-DNA-20 polymeraasi), Cy5-dCTP (esim. NEN LifeSciences, Amersham Biosciences).

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä kloonaus voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten kaupallisesti saa-:,.v tavilla olevilla kloonauskitillä (esim. Qiagen PCR Cloning Kit, QIAGEN tai v TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen). Kloonaustuotteen sekvensointi voidaan suo- 25 riitaa millä tahansa tähän tarkoitukseen soveltuvalla sekvensaattorilla (esim. Applied Biosystems, mallit 373A, 377 tai 3100 tai Bio-Rad Sequi-Gen GT) tai • « manuaalisella sekvensoinnilla. Sekvenssitulokset voidaan analysoida manuaa- • · * lisesti tai tähän tarkoitukseen kehitetyillä sekvenssianalyysiohjelmilla (Applied : .·, Biosystems Sequencer tai lnforMax:n Vector NTI Suite Version 7).

• ♦ · 30 Monistukseen käytettävä laitteisto voi niin ikään olla mikä tahansa sopiva laitteisto (esim. T1 Thermocycler, Biometra tai GenAmp PCR system 2700, Applied Biosystems). Käytännössä kaikki DNA-monistukseen sopivat laitteet ja laitteistot sopivat tarkoitukseen ja monistus voidaan myös suorittaa ·’·. manuaalisesti siirtämällä reaktioputkia lämpötilasta toiseen. Monistus voidaan ‘ . 35 myös tehdä suoraan DNA-sirulla.

12 115637

Monistustuotteen puhdistus voidaan suorittaa millä tahansa kaupallisella menetelmällä (esim. High Pure PCR Product Purification Kit, Roche, MicroSpin S-400 tai S-300 HR Columns, Amersham Biosciences tai QIAquick PCR-purification-Kit, Qiagen) tai se voidaan tehdä orgaanisella liuottimena ta-5 pahtuvalla uutolla. Monistustuotetta voidaan käyttää hybridisaatioreaktioon myös sellaisenaan ilman puhdistusta tai uuttoa.

Yksijuosteisen kohdejuosteen aikaansaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua menetelmää. Tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi epäsymmetrinen PCR, eksonukleaasimenetelmää tai yksijuosteisen kohde-10 juosteen syntetisointi suoraan sirulla (esim. matriXarray, Roche Applied Science). Keksintö käsittää myös sovellukset, joissa hybridisaatioreaktioon voidaan käyttää kaksijuosteista monistustuotetta. Tässä edullinen menetelmä yksijuosteisen kohdejuosteen aikaan saamiseksi on epäsymmetrinen PCR.

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan leima-15 tun kohdejuosteen aikaansaamiseksi käyttää mitä tahansa sopivaa leimaa. Sopivia leimoja ovat fluorerenssileimat (esim. Cy5, Cy3, Cy2, TexasRed, FITC, Alexa 488, TMR, FluorX, ROX, TET, HEX), radioaktiiviset leimat (esim, 32P, 33P, 33S) ja kemiluminesoivat leimat (esim. HiLight Single-Color Kit). Tässä keksinnössä Cy5-dCTP-fluoresenssileima (Amersham Biosciences) on edulli-20 nen. Keksintö käsittää myös sovellukset, joissa leimaa ei tarvita lainkaan, kuten sellaiset, joissa toteaminen perustuu sähköiseen impulssiin (esim Motoro- : ” lan eSensor).

»

Kun hybridisaatio tapahtuu kiinteällä kantajalla, hybridisaatiossa ·,·,· käytettävät koettimet voidaan kiinnittää alustaansa kovalenttisen tai ei- 25 kovalenttisen sidoksen avulla tai kiinnittämisessä voidaan käyttää muuta ole-massa olevaa kemiallista, sähkökemiallista tai vastaavaa menetelmää. Alusta, .*··. jolle koettimet kiinnitetään voi olla valmistettu lasista, muovista, metallista, nai- lonista, nitroselluloosasta, polyakryyliamidista, silikonista tai näiden yhdistel-: mistä, ja sen koko voi vaihdella muutamasta millimetristä kymmeniin senttimet- 30 reihin. Käytettävän alustan pintakäsittely voi olla aminosilaani- tai mikä tahansa ;*’ muu soveltuva pintakäsittely, kuten esimerkiksi epoksisilaanipintakäsittely, tai voidaan käyttää sellaista alustaa, joka ei vaadi erillistä pintakäsittelyä. Tässä : ’ edullinen alusta koettimille on aminosilaanilla käsitelty mikroskooppilasi (Geno- rama, Asper Biotech Ltd., Eesti).

35 Koettimet voidaan printata käytettävälle alustalle millä tahansa kau pallisesti saatavilla olevalla ja tähän tarkoitukseen soveltuvalla laitteistolla 13 115637 (esim. Qarray-mini arraying system, Lucidea Array Spotter tai OmniGrid, Ge-neMachines arrayer) tai ne voidaan pipetoida alustalle manuaalisesti. Koetti-met voidaan myöskin syntetisoida suoraan alustalle esimerkiksi fotolitografiaa käyttämällä.

5 Hybridisaatiossa käytetty hybridisaatioseos voi olla koostumuksel taan erilainen kuin mitä jäljempänä suoritusesimerkeissä on esitetty, mm. suolan koostumus ja/tai suolapitoisuus voivat vaihdella (esim. 2-4xSSC tai SSPE) tai hybridisaatiossa voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia hybridisaa-tioliuoksia (esim. ArrayHyb, Sigma). Hybridisaatioseoksessa voidaan myöskin 10 käyttää denaturoivia tai stabiloivia lisäaineita (esim. formamidi tai DMSO, di-metyylisulfoksidi) tai aineita, jotka vähentävät epäspesifistä sitoutumista (esim. BSA eli naudan seerumin albumiini tai ssDNA eli lohen maidin DNA). Hybridisaatio voidaan tehdä eri hybridisaatiolämpötilassa (yleensä välillä 40 - 70 °C) ja hybridisaatioon käytettävä aika voi vaihdella riippuen sovelluksesta muuta-15 masta minuutista vuorokauteen. Hybridisaatio voidaan vesihauteen sijaan tehdä esim. lämpökaapissa tai erityisessä hybridisaatiolaitteessa (esim GeneTAC HybStation tai Lucidea Slidepro Hybridizer). Hybridisaation jälkeiset pesut voivat myöskin kestoltaan, määrältään, lämpötilaltaan ja käytettävän pesuliuoksen koostumukseltaan olla erilaiset kuin mitä tässä on esitetty. Lasien pesu voi-20 daan myös suorittaa erillisellä laitteella. Joissakin tapauksissa hybridisaation jälkeinen lasin tai sirun pesu ei ole välttämätön, vaan siru voidaan analysoida . ** heti hybridisaation jälkeen. Tässä edullinen hybridisaatio-olosuhde on +57 °C:n

Lv vesihaude, jossa laseja hybridisoidaan 14-16 tuntia.

Lv Koetinlasit tai -sirut voidaan analysoida millä tahansa tähän tarkoi- ·:··: 25 tukseen soveltuvalla laitteistolla tai lukijalla (esim. GeneTAC UC4, GenePix

Personal 4100A tai Agilent DNA Microarray Scanner) Jos kohdejuoste on lei-mattu fluoresoivalla leimalla, voidaan analysointiin käyttää myös esim. fluore-senssimikroskooppia. Jos leimana on käytetty radioaktiivista leimaa, voidaan : ... siru tai kalvo analysoida autoradiografialla. Jos hybridisaatio on tehty elektroni- LL* 30 sella sirulle ja toteaminen perustuu esim. sähköiseen impulssiin, analysoidaan ’ ·: · ’ ne tätä tarkoitusta varten suunnitellulla laitteistolla.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä ei kärsi tunnetun tek-nilkan ongelmista. Menetelmän monistusvaihe on hyvin herkkä ja universaalit .v, alukkeet monistivat tehokkaasti tietyn geenialueen, rpoB:n fylogenettisesti eri- s * » 35 laisista bakteerilajeista riippumatta siitä, oliko kyseessä gramnegatiivisen vai 14 115637 grampositiivisen soluseinän omaava bakteerilaji (taulukko 2). Lisäksi monistus-tuote on lyhyt (114 emäsparia), mikä edesauttaa monistusreaktion tehokkuutta.

Bakteerilajispesifiset koettimet on suunniteltu φοβ-geenialueelle, joka on huomattavasti varioivampi geenialue kuin esim. 16S rRNA -alue, jota 5 on aiemmin käytetty bakteeridiagnostiikassa. Vaikka menetelmässä käytetyt universaalit alukkeet monistavatkin tehokkaasti myös normaaliflooran bakteereita, tämä ei aiheuta vääriä positiivista, sillä keksinnön mukaiset koettimet ovat hyvin lajispesifisiä ja tunnistavat vain ne bakteerit, joita varten ne on suunniteltu. Hybridisoitaessa lasille esim. Streptococcus pneumoniae -puhdas-10 viljelmästä monistettua kohdejuostetta, hybridisoituu se ainoastaan Streptococcus pneumoniae -spesifisten koettimien ja positiivisen kontrollikoettimen kanssa. Toisaalta hybridisoitaessa lasille vain normaaliflooran bakteerista, esim. Streptococcus oralis, monistettua kohdejuostetta, se ei sitoudu yhteenkään patogeenikoettimeen, vaan ainoastaan positiiviseen kontrollikoettimeen 15 (kuvio 3). Kaikki esillä olevan keksinnön mukaiset spesifiset oliginukleotidikoet-timet testattiin ristiin eri bakteerilajien ja myös useiden normaaliflooraan kuuluvien lajien kanssa, eikä ristireaktioita tapahdu. Siten esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on selvästi herkempi ja spesifisempi kuin aiemmin kuvatut vastaavantyyppiset menetelmät.

20 Seuraavaksi keksintöä valaistaan tarkemmin esimerkkien avulla.

Menetelmää kuvattaessa on viitattu erilaisiin, tässä sovelluksessa käytettyihin laitteistoihin, materiaaleihin, lämpötiloihin, kemikaaleihin tai vastaaviin. Nämä voivat luonnollisesti vaihdella keksinnön eri sovelluksissa tarkoituksenmukaisella tavalla, eivätkä keksintö ja sen suoritusmuodot siten rajoitu alla kuvattui-•: · 25 hin esimerkkeihin.

Esimerkki 1. Keksinnön mukaisten PCR-alukkeiden suunnittelu PCR-alukkeiden suunnittelua varten Chlamydia pneumoniaen, Mycoplasma pneumoniaen, Haemophilus influenzaen, Streptococcus pneu-: moniaen ja Streptococcus pyogeneksen rpoB-proteiinien aminohappose- :: 30 kvenssit linjattiin BioEdit-ohjelmalla käyttäen ClustalVV-linjausalgoritmia.

Linjauksesta löytyi konservoineita alueita. Nämä konservoineet ! · ’ ·. aminohappojaksot otettiin universaalien alukkeiden suunnittelun lähtökohdaksi.

Ensin ne käännettiin takaisin nukleiinihapposekvenssiksi, jolloin niihin tuli ge-v,: neettisen koodin luonteesta johtuen useita degeneroituneita kohtia. Sitten kon- 35 servoitujen jaksojen perusteella syntetisoitiin (alukkeet syntetisoi Sigma-Genosys, Englanti, josta alukkeet tilattiin tilauspalvelun kautta www.sigma- 15 115637 qenosvs.co.uk) alukkeet, joita testattiin spesifisyyden ja herkkyyden suhteen. Spesifisyys testattiin monistamalla taulukossa 2 esitetyistä eri bakteerilajeista eristettyä DNA jäljempänä olevassa esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Alukkeet, jotka monistivat kaikkien tutkittujen bakteerien rpoS-DNA-aluetta, valittiin uni-5 versaaleiksi PCR-monistusalukkeiksi eli alukkeet rpoB2-for, jonka sekvenssi on GCYGGNCGHCAYGGWAAYAARGG (sekvenssitunnusnumero 20), ja RP0b2-rew, jonka sekvenssi on GGYACSCCVAGDGGGTTYA (sekvenssitunnusnumero 21), jolloin D tarkoittaa emästä A tai G tai T, Y tarkoittaa emästä C tai T, N tarkoittaa emästä A tai G tai C tai T, H tarkoittaa emästä A tai C tai T, 10 W tarkoittaa emästä A tai T, R tarkoittaa emästä A tai G, S tarkoittaa emästä C tai G ja V tarkoittaa emästä A tai C tai G (vrt taulukko 1).

Tämä alukeseos tunnisti rpoB-geenin konservoituneet alueet kaikista taulukossa 2 luetteluista bakteereista ja se toimii myös kliinisillä näytteillä (katso esimerkki 6). Erityisesti tämän alukeparin avulla fylogeneettisesti hyvin-15 kin etäällä toisistaan olevien bakteerien (taulukko 2) rpoB-geenit voidaan monistaa myös tilanteessa, jossa näytteessä on runsaasti ihmisen DNA.ta.

! « ·

* I

• ( 1 t 1 * » 1

> · I

* · «

• I

» · < 1 i · * » * » « * 1 16 115637

Taulukko 2. Bakteerikannat, joita käytettiin rpoB-PCR-alukkeiden ja -oligonukleotidikoettimien testauksessa

Bakteerilaji__Toimittajan koodi (näytteen tyyppi)_

Moraxella catarrhalis__DSM 9143 (bakt. kanta)_

Moraxella cuniculi__ATCC VR 1355 (bakt. kanta)_

Moraxella caviae__ATCC 14659 (bakt. kanta)_

Neisseria gonorrhoeaea__ATCC 53420D (DNA)_

Haemophilus influenzae__ATCC 51907D (DNA)_

Haemophilus ducreyi__DSM 8925 (bakt. kanta)_

Haemophilus parainfluenzae__DSM 8978 (bakt. kanta)_

Streptococcus pyogenes__DSM 20565 (bakt. kanta)_

Streptococcus pneumoniae__DSM 20566 (bakt. kanta)_

Streptococcus oralis__DSM 20627 (bakt. kanta)_

Streptococcus mitis__DSM 12643 (bakt. kanta)_

Fusobacterium necrophorum DSM 20698 (bakt. kanta)_

Pseudomonas aeruginosa__DSM 50071 (bakt, kanta)_

Corynebacterium diphtheriae__DSM 44123 (bakt. kanta)_

Legionella pneumophila___ATCC 33152D (DNA)_

Escherichia coli__DSM 30083 (bakt. kanta)_ ' . Pasteurella pneumotropica ATCC 13669 (bakt. kanta)_

Staphylococcus aureus__DSM 20231 (bakt, kanta)_ *’*[ Mycoplasma pneumoniae_ ATCC 519Q7D (DNA)_ ATCC = American Type Culture Collection ! 5 DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ·» ·

Esimerkki 2. Keksinnön mukaisten oligonukleotidikoettimien suunnittelussa tarvittavien uusien sekvenssien tuottaminen kloonaamalla , · · *. Bakteerien Moraxella catarrhalis, Moraxella cuniculi, Moraxella ca- ' ’ ’ viae, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus parainfluen- 10 zae, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Corynebacterium diphtheriae, Legionella pneumophila ja Pasteurella pneumotropica rpoB-sekvenssit sek-V. vensoitiin seuraavassa esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti käytettäviksi keksinnön mukaisten oligonukleotidikoettimien suunnittelussa.

» 1 1 5637 17

Bakteeripuhdasviljelmistä eristetään ensin DNA käyttäen QIAamp DNA Mini -kittiä (Qiagen, Saksa). Kun DNA on eristetty, halutulta DNA-alueelta monistetaan kloonaukseen käytettävä kohdejuoste symmetristä (tavallista) polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttäen. Monistuksen ensimmäisessä vaihees-5 sa valmistetaan reaktioseos sekoittamalla näytteestä eristetty DNA esimerkissä 1 valmistettujen universaalien bakteerialukkeiden ja muiden monistukseen tarvittavien komponenttien kanssa.

Tällöin kloonaus-PCR:ssä 25 μΙ:η reaktioseos sisältää 20 pmol rpoB2-for-alukeseosta, 20 pmol rpoB2-rew-alukeseosta, 200 μΜ kutakin dATP, 10 dGTP, dTTP ja dCTP (Sigma, USA), 1 x HotStarTaq PCR -puskuria (Qiagen, Saksa), johon lisätty MgCfe'.a siten, että lopullinen konsentraatio on 2,8 mM, 1,25 U HotStarTaq DNA-polymeraasia (Qiagen, Saksa) ja 2,5 μΙ eristettyä DNA:ta.

Kloonaus-PCR-reaktio tehdään GenAmp PCR system 2700 -PCR-15 laitteessa (Applied Biosystems) käyttäen seuraavanlaista lämpöohjelmaa: al-kudenaturaatio/polymeraasin aktivaatio 15 min lämpötilassa 95 °C, sen jälkeen kaikkiaan 38 sykliä 35 s lämpötilassa 94 °C, 40 s lämpötilassa 54 °C, 35 s lämpötilassa 72 °C sekä loppupidennys 7 min lämpötilassa 72 °C. Kun PCR-reaktio on valmis, monistumisen onnistuminen tarkastetaan geelielektroforee-20 silla 2-%:isessa agaroosigeelissä, joka sisältää etidiumbromidia.

Itse kloonaus tehdään välittömästi PCR-reaktion jälkeen TOPO TA : ‘·· Cloning Kit -kitillä (Invitrogen). Kloonausreaktioseos sisältää 4 μΙ PCR-tuotetta, 1 μΙ suolaseosta (1,2 M NaCI, 0,06 M MgCI2) ja 1 μΙ TOPO-vektoria (pCR 4-:Y: TOPO), jotka sekoitetaan keskenään eppendorfputkessa. Seosta inkuboidaan ·:··· 25 5 min huoneenlämmössä, minkä jälkeen seosputki siirretään jäille. Tämän jäl- keen tehdään kemiallinen transformaatio, jossa jäähtynyttä PCR-tuote-vektori-.···. seosta lisätään 2 μΙ kompetenteille TOP10 E. coli -soluille (50 μΙ soluja). Tä män jälkeen soluja inkuboidaan jäillä 10 min. Seuraavaksi tehdään lämpösok-, . kikäsittely, jossa soluputki siirretään +42 °C:een 30 sekunnin ajaksi. Sitten put-

30 ki siirretään jäille ja siihen lisätään 250 μΙ huoneenlämpöistä SOC-liuosta (2 % \··’ tryptoni, 0,5 % hiivauute, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM

MgS04, 20 mM glukoosi). Tämän jälkeen putkea ravistellaan vaaka-asennossa (200 rpm) +37 °C:ssa 1 tunti. Seuraavaksi 20 μΙ seosta maljataan LB-Λ bakteerimaljalle (Luria-Bertani, 10 % tryptonia, 0,5 % hiivauutetta, 1,0 % NaCI, 35 1,5% L-agar:ia laimennettuna veteen, pH 7), joka sisältää 50 g/ml ampisilliiniä.

18 115637

Maljoja kasvatetaan +37 °C.ssa yön yli. Seuraavana päivänä maljalta valitaan kymmenen pesäkettä, joista tehdään sekvensointi-PCR.

Sekvensointi-PCR:ssä 50 μΙ:η reaktioseos sisältää 0,4 pmol M13-reverse (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) ja M13-forward (5’-5 GTAAACGACGGCCAG) -alukkeita (sisältyvät kittiin), 150 μΜ kutakin dATP, dGTP, dTTP ja dCTP (Sigma, Yhdysvallat), 1 x HotStarTaq PCR -puskuria (Qiagen, Saksa), 1,25 U HotStarTaq DNA-polymeraasia (Qiagen, Saksa). Monistusta varten pieni osa bakteeripesäkkeestä siirretään näytetikulla PCR-seosputkeen.

10 Sekvensointi-PCR-reaktio tehdään GenAmp PCR system 2700 -PCR-laitteessa (Applied Biosystems) käyttäen seuraavanlaista lämpöohjel-maa: 15 min alkudenaturaatio lämpötilassa 95 °C ja 30 sykliä käsittäen 1 min lämpötilassa 94 °C, 1 min lämpötilassa 55 °C, 1 min lämpötilassa 72 °C sekä 10 min loppupidennys lämpötilassa 72 °C. Kun PCR-reaktio on valmis, monis-15 tumisen onnistuminen tarkastetaan geelielektroforeesilla 2-%:isessa aga-roosigeelissä, joka sisältää etidiumbromidia. Tämän jälkeen PCR-tuote puhdistetaan poistamalla reaktioseoksesta ylimääräiset alukkeet, nukleotidit, puskuri ja polymeraasientsyymi QIAquick PCR -puhdistuskitillä (Qiagen, Saksa).

Puhdistuksen jälkeen vektoriin insertoitunut fragmentti sekvensoi-20 daan. Kaksitoista mikrolitraa sekvensointireaktioseosta sisältää 100 ng PCR-tuotetta ja 5 pmol joko M13-reverse- tai M13-forward-aluketta. Sekvensointi • *·* tehdään BigDye Terminator Version 3.0 -kitillä ja ABIPRISM 3100 -laitteistolla (Applied Biosystems, Yhdysvallat). Sekvenssit analysoidaan Vector NTI Suite Version 7-ohjelmistolla (InforMax).

·:·: 25 Edellä kuvatulla yleisellä menetelmällä tuotettiin rpoB-sekvenssit seuraaville bakteerilajeille: Moraxella catarrhalis, Moraxella cuniculi, Moraxella .···. caviae, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus parain- fluenzae, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Corynebacterium diphthe-. , riae, Legionella pneumophila ja Pasteurella pneumotropica (sekvenssit tun- •;;,: 30 nusnumerot 22 - 32).

I »

Esimerkki 3. Lajispesifisten koettimien suunnittelu .···, Lajispesifisten oligonukleotidien eli koettimien suunnittelussa käytet- • tiin linjaukseen perustuvaa suunnittelustrategiaa. Suunnittelun kohteena ollei- den bakteerien rpoS-geenit linjattiin muutamasta referenssibakteerista (läheis-’· 35 tä sukua olevasta bakteerista) lähtöisin olevien vastaavien geenien kanssa.

Esimerkiksi Streptococcus pneumoniae rpoB-geeni linjattiin bakteereiden 19 115637

Streptococcus pyogenes, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus ja Fusobacterium necrophorum rpoB-geenien kanssa. S. oralis ja S. mitis ovat S. pneumonialle läheistä sukua olevia bakteereja, eivätkä oli-gonukleotidit saa reagoida näiden normaaliflooraan kuuluvien bakteerien 5 kanssa. Sekvenssit saatiin EMBL.n sekvenssitietokannasta tai ne tuotettiin kloonaamalla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Sekvenssien linjauksessa käytettiin BioEdit -ohjelmaa ja ClustalW-linjausalgoritmia. Linjauksesta laskettiin konsensussekvenssi ja sopivasti kon-servoituneet alueet etsittiin manuaalisesti. Nämä alueet tarkoittavat sekvenssi-10 jaksoja, jotka ovat konservoituneet suunnittelun kohteena olevien bakteerien geeneissä, mutta joita ei löydy ainakaan kokonaan referenssibakteerien geeneistä. Näistä jaksoista valittiin sopivanpituiset sekvenssijaksot varsinaisten oligonukleotidien sekvensseiksi (19 - 26 emästä). Valittuja oligonukleotidi-sekvenssejä verrattiin EMBL:n prokaryoottitietokantaan FASTA-algoritmiä 15 käyttävällä ohjelmalla. Ne oligonukleotidisekvenssit, jotka erosivat muiden kuin suunnittelun kohteena olevien bakteerien rpoB-geeneistä vähintään kahden emäksen verran, valittiin jatkotutkimuksiin. Oligonukleotideille määritettiin teoreettinen sulamislämpötila (Tm) ja tutkittiin, muodostavatko oligonukleotidit se-kundaarirakenteita. Tm (°C) laskettiin kaavalla 20 81,5 + 16,6 log [Na]+0,41(%GC) - 0,61 (%for) 500/N, jolloin [Na] on monovalenttisten kationien pitoisuus (laskuissa 50 M), %GC on : ’·· guaniini- ja sytosiiniemästen osuus prosentteina, %for on formamidipitoisuus (laskuissa 0 %) ja N on oligonukleotidin pituus. Sekundaarirakenteiden muo-:V: dostumista tutkittiin Sigma-Genosysin tarjoamaa ohjelmaa käyttäen. Ohjelma ·:·· 25 voi käyttää www-selaimen avulla osoitteesta http://www.sigma- ·*.·; genosys.co.uk/oligos/frameset.html (calculators/basic calculator). Ne oligonuk-

* I

leotidit, jotka eivät muodostaneet voimakkaita sekundaarirakenteita ja joiden Tm-lämpötila oli vähintään 45 °C, valittiin kokeellisiin spesifisyystutkimuksiin.

. Oligonukleotidikoettimet syntetisoitiin ja samalla modifioitiin 5’- 30 päästään (NH2-modifioidut oligot) (Sigma-Genosys, Englanti). Laboratoriossa

I I

koettimien spesifisyys testattiin useilla eri bakteerilajeista eristetyillä DNA-näytteillä (taulukko 2) sekä potilasnäytteillä (taulukko 4) esimerkeissä 4, 5 ja 6 ; ’' kuvatuilla tavoilla. Testatuista koettimista valittiin ne, jotka toimivat parhaiten ja Λ( osoittautuivat kaikkein spesifisimmiksi. Bakteerilajispesifisten koettimien sek- ‘ 35 venssit on esitetty taulukossa 3.

20 115637

Taulukko 3. rpoB-oligonukleotidisekvenssit

Oligonukleotidin Sekvenssi (5'-3') Tunnistettava bakteeri (rpoB- sekvenssinumero___geeni)_ _1____GTTATCTCGAAAATTAACCCAGTTG Haemophilus influenzae_ _2__CGATGAAAATGGTCAGCCAGTTGAA Haemophilus influenzae_ _3___GTCGTTTCACGTATTGTACCAGT__Streptococcus pyogenes_ _4___TTCCAGACGGAACACCAGTTGAC Streptococcus pyogenes_ _5__TTCCAGACGGAACTCCAGTCGA__Streptococcus pneumoniae_ _6__CAGACGGAACTCCAGTCGACAT__Streptococcus pneumoniae_ _7__C AACGGCACCCCGGT CG AC AT__Pseudomonas aeruginosa_ _8__TGGAAGACATGCCGCACGAT__Pseudomonas aeruginosa_ 9__GCCTGTTGAGGATATGCCACA__Legionella pneumophila_ _10__TGGAAGATGGAACAGCAGTAGACA Legionella pneumophila_ 11 __TACGATGAAAACGGTACTCCG__Escherichia coli_ 12 __CAACCCGATCGAAGATATGCC__Escherichia coli_ _13__TATGCCTTACTTACCAGATGGAC__Staphylococcus aureus_ _14__TACCAGATGGACGTCCGATC__Staphylococcus aureus_ _15__CAGTAGCGGACATGCCCCA__Mycoplasma pneumoniae_ _16 TTAGAAGATGGTACTCCAGTCGACA Mycoplasma pneumoniae_ j‘ .^ _17__ATGGCGGACGGCCGTCCTGTG__Neisseria gonorrhoeae_ * . , 18__AAATGGTAATCCTGTAGATATCGTAC Moraxella catarrhalis_ 19__CTGCCTCAGGAAGATATGCCAT__Corynebacterium diphtheriae «tl·» : Esimerkki 4. Näyte-DNA:n monistus 5 Näyte-DNA:t bakteeriviljelmistä tai kliinisistä näytteistä monistettiin ja leimattiin seuraavassa esitettyä yleistä menetelmää käyttäen.

Analysoitavasta näytteestä (bakteeriviljelmä tai kliininen näyte) eris-tetään DNA käyttäen QIAamp DNA Mini-kittiä (Qiagen, Saksa). Kun DNA on *» · eristetty, monistetaan halutulta DNA-alueelta hybridisaatioon käytettävä kohde- ·;;; 10 juoste epäsymmetristä polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttäen. Monistuksen • · ’;** ensimmäisessä vaiheessa valmistetaan reaktioseos sekoittamalla näytteistä :Y: eristetty DNA, esimerkissä 1 valmistetut universaalit rpoB2-for-ja RPOb2-rew- , - * · alukeseokset sekä monistukseen tarvittavat muut komponentit keskenään.

21 115637 PCR.ssä 25 μΙ:η reaktioseos sisältää 32 pmol RPOb2-rew-alukeseosta, 8 pmol rpoB2-for-alukeseosta, 200 μΜ kutakin dATP, dGTP ja dTTP sekä 140 μΜ dCTP (Sigma, USA), 1 x HotStarTaq PCR -puskuria (Qia-gen, Saksa), johon lisätty MgC^ia siten, että lopullinen konsentraatio on 2,8 5 mM, 2,5 nmol Cy5-AP3-dCTP:tä (Amersham Pharmacia Biotech, USA), 1,25 U HotStarTaq DNA-polymeraasia (Qiagen, Saksa) ja 2,5 μΙ eristettyä DNA:ta.

PCR-reaktio suoritetaan GenAmp PCR system 2700 -PCR-laitteessa (Applied Biosystems, Yhdysvallat). PCR-laitteessa käytetty lämpöoh-jelma oli seuraavanlainen: 15 min alkudenturaatio/polymeraasin aktivaatio 10 lämpötilassa 95 °C ja 38 sykliä 35 s lämpötilassa 94 °C, 40 s lämpötilassa 54 °C, 35 s lämpötilassa 72 °C sekä 7 min loppupidennys lämpötilassa 72 °C. Kun PCR reaktio on valmis, monistumisen onnistuminen tarkastetaan gee-lielektroforeesilla 2-%:isessa agaroosigeelissä, joka sisältää etidiumbromidia (kuvio 2). Tämän jälkeen Cy5-leimattu PCR-tuote puhdistetaan poistamalla re-15 aktioseoksesta ylimääräiset alukkeet, nukleotidit, puskuri ja polymeraasient-syymi QIAquick-PCR-puhdistuskitillä (Qiagen, Saksa).

Esimerkki 5. Näytesirujen valmistus ja toiminta

Esimerkissä 3 valmistetut 5’-päästään aminoidut oligonukleotidi-koettimet liuotettiin 400 mM natriumkarbonattipuskuriin (pH 9,0) siten, että lo-20 pulliseksi pitoisuudeksi tuli 50 μΜ. Koettimet kiinnitettiin kovalenttisesti ami-nosilaanilla päällystetyille mikroskooppilaseille (Genorama, Asper Biotech Ltd., : Eesti). Koettimien siirtäminen laseille tehtiin tätä tarkoitusta varten kehitetyllä robotilla (OmniGrid, GeneMachines, USA) ja neuloilla (Telechem SMP3, USA). Yhden printatun koetinalueen keskimääräinen koko oli 120 pm. Laseille printat-25 tiin lisäksi positiivisiksi kontrolleiksi 5’-päästä aminoidut PCR-alukkeet. Printta- • | uksen jälkeen koetinlaseja pidettiin tunnin ajan ammoniakkihöyryssä koettimi-“·' en kiinnittämiseksi lasille. Ammoniakkikäsittelyn jälkeen lasit huuhdeltiin kol meen kertaan tislatussa vedessä ja niiden annettiin kuivua.

: Seuraavaksi Cy5-leimattu kohdejuoste, joka oli valmistettu esimer- 30 kissä 4 kuvatulla tavalla, hybridisoitiin mikroskooppilasille, johon koettimet oli ·:. kiinnitetty. Hybridisaatioseos sisälsi n. 200 - 300 ng kohdejuostetta, 6 μΙ 20 x .···. SSC.ta (20xSSC sisältää 175,3 g NaCI:a ja 88,2 g natriumsitraattia, pH sääde- tään 7.0 HCI.IIa; lopullinen konsentraatio 3,4x), 2 μΙ 10-%:ista natriumdodekyy-* *’ lisulfaattia (SDS; lopullinen konsentraatio 0,3 %) ja steriiliä vettä siten, että 35 hybridisaatioreaktioseoksen tilavuudeksi saatiin 37 μΙ. Hybridisaatio aloitettiin denaturaatiolla lämpötilassa 95 °C 3 min. Tämän jälkeen putket jäähdytettiin 22 115637 nopeasti jäillä. Kun seos oli jäähtynyt, se pipetoitiin koetinlasille ja peitettiin pei-tinlasilla. Koetinlasi asetettiin hybridisaatiokasetin (Arraylt, TeleChem International, USA) sisälle ja kasetti suljettiin tiiviisti. Kasetti upotettiin vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 57 °C ja laseja hybridisoitiin 14 -16 tuntia.

5 Hybridisaation jälkeen hybridisoimattomat tuotteet pestiin pois lasilta seuraavasti: 5 min lämpötilassa 57 °C 0,1-%:isella SDS:llä vedessä, 5 min huoneenlämmössä 01 -%:isella SDS.IIä 0,5 x SSC:ssä ja 5 min huoneenlämmössä 0, 06 x SSC:llä.

Kun lasit olivat kuivuneet, ne analysoitiin lukijalaitteella (Agilent DNA 10 Microarray Scanner, Agilent, USA). Jos Cy5-leimattu kohdejuoste oli sitoutunut yhteen tai useampaan lasilla olevaan koettimeen, näiden koetintäplien kohdalla nähtiin fluoresoiva signaali. Koska koetinlasit sisälsivät myös positiivisen kontrollin, saatiin hybridisaation toimivuuden varmistava fluoresoiva signaali, vaikka näyte ei olisikaan sisältänyt bakteeria.

15 Kuviossa 3 on esitetty esimerkki hybridisaatiosta. Hybrid isottavana kohdejuosteena oli Streptococcus pneumoniaen (patogeeni) ja samaan sukuun kuuluva Streptococcus oraliksen (normaalifloora) puhdasviljelmästä eristetyn DNA:n rpoB-monistuma (epäsymmetrinen Cy-5-dCTP-leimattu PCR-tuote). Esimerkkilasilla on nuolilla merkityt S. pneumonia -leimattua kohdejuos-20 tetta sitovat oligospotit. Niissä olevien oligonukleotidien sekvenssit ovat taulukossa 3 esitetyt S. pneumoniae -oligonukleotidikoettimet 5 ja 6. Signaalin antoivat myös positiivista kontrollioligonukleotidiä sisältävät oligospotit molem-maila laseilla (universaali PCR-aluke sekvenssinumero 21). Positiiviset kontrol-V; lispotit osittavat hybridisaatioreaktion onnistumista, vaikkapa bakteerispesifistä y 25 sitoutumista ei tapahdu. S. oralis -spesifisiä oligonukleotidispotteja näytelevyil-lä (-siruilla) ei ole. Kahden kuvan vertailu osoittaa, että normaaliflooran bakteeri S. oralis ei ristireagoi S. pneumonia (patogeeni) -oligospottien kanssa, koska toisella näytesirulla, jotka oli hybridisoitu S. oralis rpoB-monistuman kanssa, ei , , tapahdu bakteerispesifistä hybridisaatiota. S. pneumonia kohdejuoste ei sitou- ; ; / 30 tunut muihin lasilla olleisiin oligospotteihin.

* 1 ~

Esimerkki 6. Potilasnäytteiden analysointi

Kliinisistä näytteistä, jotka oli saatu hengitystieinfektiosta kärsiviltä ' 1' potilailta, eristettiin ja monistettiin DNA esimerkissä 4 kuvatulla tavalla ja testat- : tiin käyttäen esimerkissä 5 kuvattua koetinlasia, johon oli kiinnitetty taulukossa '; ‘': 35 3 luetellut koettimet sekä positiivisina kontrolleina toimivat PCR-alukkeet.

23 115637

Samat näytteet analysoitiin myös viljelymenetelmällä. Yhteenveto tutkituista potilasnäytteistä on esitetty taulukossa 4. Keksinnön mukaisella menetelmällä saadut tulokset ovat samat kuin tunnetun tekniikan mukaisella viljelymenetelmällä saadut tulokset. Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä 5 on oleellisesti nopeampi, koska tulos saadaan noin vuorokaudessa viljelymenetelmää käyttäessä.

Taulukko 4. Keksinnön mukaisen menetelmän vertailu viljelymenetelmän kanssa Välikorvatulehdus, Viljelytulos Hybridisaatiotulos märkänäyte___ C130__Sp, Hi__Sp Hi_ C131__Sp__Sp, Sa_ C132__Sp, Sa__Sp, Sa_ C156__Hi, Cd__Hi, Cd_ C146 Hi | Hi 10

Taulukossa esitettyjen lyhenteiden merkitykset: Sp - Streptococcus pneumoniae, Hi - Haemophilus influenzae, Sa - Staphylococcus aureus, ja Cd - Corynebacterium diphteriae.

• · • · » 1 » ti» «

I » I

»

Claims (11)

115637

1. Diagnostinen menetelmä infektioita aiheuttavan bakteerin osoittamiseksi ja tunnistamiseksi kliinisestä näytteestä, tunnettu siitä, että a) kliinisestä näytteestä eristetty DNA monistetaan käyttäen DNA-5 alukeseosta, joka sisältää sekvenssejä, jotka hybridisoituvat infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavien rpoB-geenien konservoituneiden alueiden sekvenssien kanssa ja jotka käsittävät sekvenssien tunnusnumerot 20 ja 21 mukaiset sekvenssit ja/tai niiden kanssa komplementaariset sekvenssit ja/tai näiden toiminnalliset frag- 10 mentit, b) monistettu DNA saatetaan hybridisaatio-olosuhteissa kosketukseen halutun yhdistelmän kanssa oligonukleotidikoetinsekvenssejä, jotka hybridisoituvat normaaleissa hybridisaatio-olosuhteissa infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA-polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koo- 15 daavien rpoB-geenien konservoituneiden alueiden lähellä olevan hypervarioi-van alueen sekvenssin kanssa ja jotka ovat bakteerilajispesifisiä, ja c) todetaan mahdollinen hybridisaatiokompleksin muodostuminen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut infektioita aiheuttavat bakteerit ovat hengitys- 20 tieinfektioita ja/tai korva-, nenä- ja kurkkutauteja aiheuttavia bakteereja.

'· 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hypervarioiva alue on bakteerin Haemophilus v\: influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Pseudo- ·:··: monas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Co- 25 rynebacterium diphteriae, Mycoplasma pneumoniae, Echerichia coli, Moraxella • t :" ·. catarrhalis ja Neisseria gonorrhoeae rpoB-geenin hypervarioivan alueen sek- • t I venssi. ; t.§

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen diagnostinen mene- telmä, tunnettu siitä, että vaiheessa b) käytettävien oligonukleotidikoetin-30 sekvenssien pituus on 15 - 30, edullisemmin 19 - 30 ja edullisimmin 19-26 ,;: ‘ nukleiinihappoa ja ne ovat mahdollisesti leimattuja.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen diagnostinen mene-telmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidikoetinsekvenssiyhdistelmä käsittää kaikki tai osan sekvensseistä, joilla on sekvenssitunnusnumerot 1-19, 35 ja/tai mainittujen sekvenssien kanssa käänteiset ja/tai komplementaariset sek- 115637 venssit tai näiden toiminnalliset fragmentit, ja edullisesti se käsittää kaikki sekvenssit, joilla on sekvenssitunnusnumerot 1-19.

6. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu oligonukleotidikoetinyhdistelmä on kiinnitetty 5 kiinteälle kantajalle, edullisesti käsitellylle lasille.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) kliinisestä näytteestä eristetty DNA monistetaan polymeraasiketjureaktiota käyttäen ja että vaiheessa b) monistettu DNA saatetaan kosketukseen kiinteälle kantajalle kiinnitettyjen bakteerilajis- 10 pesifisten oligonukleotidikoettimien kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) kliinisestä näytteestä eristetyn DNA:n monistuksessa käytetään sopivasti leimattua nukleotidia todettavissa olevan kohdejuosteen aikaansaamiseksi ja että vaiheessa b) monistettu ja mahdolli- 15 sesti leimattu kohde-DNA saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan, edullisesti käsitellyn lasin, kanssa, jolle on kiinnitetty kaikki bakteerilajispesifiset oligo-nukleotidikoettimet, joilla on sekvenssitunnusnumerot 1 -19, ja/tai niiden käänteiset ja/tai komplementaariset sekvenssit.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen diagnostinen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että vaiheessa b) monistettu ja mahdollisesti leimattu kohde-DNA saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan, edullisesti käsitellyn lasin, kanssa, jolle on kiinnitetty tietylle tai muutamalle hengitystieinfektioita aiheutta-valle bakteerille spesifiset oligonukleotidikoettimet, joilla on taulukossa 3 annetut vastaavat sekvenssitunnusnumerot, ja/tai niiden komplementaariset sek- ··: 25 venssit.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen menetelmä, ; tunnettu siitä, että vaiheessa c) käytetään mikrosirutekniikkaa.

11. DNA-alukeseos, tunnettu siitä, että se sisältää sekvensse- : jä, jotka hybridisoituvat infektioita aiheuttavien bakteerien DNA-ohjatun RNA- YY 30 polymeraasin [EC:2.7.7.6] alayksikköä B koodaavien rpoB-geenien konservoi- * I tuneiden alueiden sekvenssien kanssa ja jotka käsittävät sekvenssit tunnus-,,Y numerot 20 ja 21 mukaiset sekvenssit ja/tai niiden kanssa komplementaariset Y ’: sekvenssit tai näiden toiminnalliset fragmentit. 115637