KR20100061438A

KR20100061438A - 치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정용 마이크로어레이 및 이를 이용한 세균 감염성 구강 질환 진단방법

Info

Publication number: KR20100061438A
Application number: KR1020107000177A
Authority: KR
Inventors: 김철민; 장현정; 최영미
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 주식회사 진인
Priority date: 2007-07-04
Filing date: 2007-07-04
Publication date: 2010-06-07
Also published as: WO2009005178A1

Abstract

본 발명은 치주 질환의 발병에 관여하는 병원성 세균의 검출 및 감별 방법과 이를 이용한 세균 감염성 구강 질환 진단방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 세균 염기서열의 과변이 부위인 ITS를 표적으로 고안된 그람양성 및 그람음성 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 치주 질환 원인 세균의 속(genus) 및 종(species) 특이적 올리고뉴클레오티드, 세균 염기서열의 보존적인 부위인 23S rDNA 유전자에서 세균에만 공통적으로 존재하는 모든 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 이중 적어도 하나 이상을 프로브로 포함하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 치주 질환 원인 세균 감별 방법과 세균 감염성 구강 질환 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 신속하고 민감한 방법의 마이크로어레이 진단 방법을 이용함으로써, 치주 질환의 조기 발견 및 치료가 가능하므로, 치주 질환 관련 세균으로 인한 다양한 심혈관계 질환 등의 다양한 전신 질환이 개선될 수 있을 것이다.

Description

치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정용 마이크로어레이 및 이를 이용한 세균 감염성 구강 질환 진단방법{MICROARRAYS FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS ASSOCIATED WITH PERIODONTAL DISEASES AND METHOD FOR DIAGNOSIS OF INFECTIOUS ORAL DISEASES USING THE MICROARRAY}

본 발명은 치주 질환의 발병에 관여하는 병원성 세균의 검출 및 감별 방법과 이를 이용한 세균 감염성 구강 질환 진단에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 세균 염기서열의 과변이 부위인 ITS를 표적으로 고안된 그람양성 및 그람음성 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 치주 질환 원인 세균의 속(genus) 및 종(species) 특이적 올리고뉴클레오티드, 세균 염기서열의 보존적인 부위인 23S rDNA 유전자에서 세균에만 공통적으로 존재하는 모든 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 이중 적어도 하나 이상을 프로브로 포함하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 치주 질환 원인 세균 감별 방법과 세균 감염성 구강 질환 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.

구강은 인체에 에너지를 공급하는 창구 역할을 하는 곳으로서 몸의 건강 산태가 즉각 반영된다. 특히 구강 질환의 원인인 구강 세균은 혈액을 통해서 혈관에 침입하여 신체 다른 부분에 이르게 되고 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨, 조산, 그리고 저체중아 출산 등과 같은 전신 질환의 원인이 된다((Jin LJ, et al., Hong Kong Med J. 9:31-37(2003), Pennisi E, Science, 307:1899-1901(2005), Xu P, et al., J Bacteriol. 189:3166-3175(2007)).

구강 질환 중 치주 질환(periodontal disease)은 크게 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나누는데 대부분의 성인 약 7 ∼ 16％가 치주 질환을 갖고 있다((텐데라 아베, 출원번호 10-2006-7017584(2006), Jin LJ, et al., Hong Kong Med J. 9:31-37(2003)). 이처럼 치주 질환은 만연되어 있으나 다른 종류의 만성 질환처럼 통증을 느끼거나 치아가 흔들리는 등 아주 진행된 단계가 되기 전에는 이상을 느끼지 못하기 때문에 침묵의 질환(Silent disease)이라고도 한다.

치주 질환은 인간의 가장 일반적인 감염 질환의 하나로, 세균 감염에 의한 염증으로 치조골(alveolar bone)을 포함한 치아를 지지하는 조직의 파괴가 동반되는 질환이다((Jin LJ, et al., Hong Kong Med J. 9:31-37(2003)). 치주 질환은 하나 이상의 치아에 영향을 미치며 치태(plaque)내의 세균이 치은(gingiva)에 염증을 일으킬 때 시작된다. 치은염은 치주 질환의 초기 형태로 치은이 빨갛게 부풀어 나타나는 상태이며, 치주염은 치은염이 진전되어 나타나는 상태로 다른 감염성 질환과는 달리 숙주에 존재하는 세균의 균형이 깨어져 발병하게 되는 감염성 질환이다((Shay K, Clin Infect Dis. 34:1215-1223(2002)). 치주 질환은 치수 및 치근단 질환(pulp and periapical Diseases)과 더불어 구강 질환의 발병의 중요 인자로 호기성 및 혐기성 세균은 병변 형성에서 중요한 역할을 한다((Kwak JS, et al., J Kor Acad Cons Dent, 30:335-343(2005)).

치주염의 가장 중요하고 유력한 원인균은 혐기성 세균으로 알려져 있다 ((Bascones-Martinez A and Figuero-Ruiz E, Avances en Periodoncia, 3:111-118(2005)). 적어도 약 500 분류군 이상의 세균이 치주낭 내에서 동정되었다. 그러나 상대적으로 소수의 종만이 분명하게 치주염 진행과 관련있는 것으로 보고되었으며, 다음의 표 1과 같다((Slots J, J Periodontol. 75:1553-1565(2004)). 지금까지 구강 질환 관련 원인균 규명을 위하여 구강 내 상재균의 약 50％만이 성공적으로 배양되어 구강 질환의 원인이 규명되었다.

표 1. 추정 치주 병원균과 치주염 사이의 관계

치주 질환은 원인균에 따라 만성 치주염(chronic periodontitis)와 급진성 치주염(aggressive periodontitis)으로 구별된다. 만성 치주염은 세균 검사결과 증가된 나선상균(spirochete)이 관찰되며, 만성 치주염의 치태 내에 90％의 혐기성 세균, 75％의 그람 음성균이 차지하는 치주염이다. 원인균으로는 Porphyromonas gingivalis, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Peptostreptococcus micros, Treponema denticola, Eubacterium nodatum, Prevotella intermedia, Tannerella forsythensis, Selenomonas noxia 등이 다수 분포하고 있다. 급진성 치주염의 주된 원인균은 그람 음성, 캡노피릭(capnophilic), 혐기성 간균과 Actinobacillus actinomycetemcomitans, T.annerella forsythensis, Eikenella corrodens, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis 등이 일부 확인 된다((류인철, KRIBB CONFERENCE(2004), Lilian Edesi-Neuss, DISSERTATION(2005)).

또한 이러한 혐기성 세균은 인체의 여러 부위에 상재균으로서 존재하고 심한 감염의 흔한 원인이 되기도 한다. 한편 혐기성 세균 배양용 검체는 상재균이 오염되기 쉬우며, 염기성 세균 감염증은 호기성 세균과의 혼합 감염이 흔하기 때문에 감염증 치료에 어려움이 있다((Shin HJ, et al., Korean J Clin Pathol, 19:70-77(1999)).

최근까지 세균 동정법으로는 전통적인 세균 배양법, checkerboard DNA-DNA hybridization 법, 세균 종-특이 항체를 이용하는 방법, 종-특이 프라이머를 이용한 PCR, 그리고 세균의 16S rDNA 유전자 염기서열 결정법 등을 이용하였다. 그러나, 전통적인 세균 배양법은 많은 시간, 비용, 노동력이 필요하고, 세균을 배양하기 위한 실험 환경을 갖추고 있어야 하므로 환경에 민감한 특히 혐기성 세균을 확인하는데 적합하지 않다. DNA 프로브 법과 PCR 프라이머 이용한 방법은 짧은 시간에 특정 세균을 검출 가능하나, 특정 세균 종을 대상으로 하므로 모든 세균 종을 동정이 불가능하다는 단점이 있다. 또한, 클론 라이브러리, quantitative PCR과 형광 in situ hybridization 분석법과 같은 분자 기술들은 유익한 방법이지만, 노동- 집약적이고 일상의 환자 모니터링을 위해 비실용적이다((LM, et al., Adv Dent Res. 18: 6-11(2005), Lee YJ, et al., J Kor Acad Cons Dent, 30: 409-422(2005), Eick S and Pfister WJ, Clin Periodontol, 29:638-644(2002), Shin HJ, et al., Korean J Clin Pathol, 19:70-77(1999)).

특히, 혐기성 세균은 분리와 동정에 있어 자라는 속도가 느려 시간이 오래 걸리고 까다로운 배양조건 등으로 인하여 혐기성 세균을 정확히 감별할 수 있는 전혀 새로운 진단 기술이 필요하다. 신속하고 정확한 미생물학 실험 절차에 의한 진단 및 치료는 진행성과 난치성 치주염 형성에 영향을 미치게 된다. 치주 질환 원인균을 포함한 혐기성 세균의 조기 검출 및 진단을 위해 아주 민감하고 고도의 병렬 분석 방법을 이용한 빠르고 정확한 진단 방법 개발이 시급하다((LM, et al., Adv Dent Res. 18:6-11(2005), Eick S and Pfister WJ, Clin Periodontol, 29:638-644(2002), Shin HJ, et al., Korean J Clin Pathol, 19:70-77(1999)). 또한, 인간 구강의 복잡한 미생물 군집의 특성을 파악하기 위해 초고속 체제(high-throughput format)로 고신뢰성 데이터(high-fidelity data)를 제공하는 방법이 필요하다.

최근에 DNA 칩 및 올리고뉴클레오티드 칩 등을 포함한 마이크로어레이는 게놈 연구, 독성학 연구와 돌연변이 및 단일염기다형성에 의한 약제 내성과 균종 감별 등의 연구에 중요성이 점차 증가하고 있다. 마이크로어레이는 단시간에 동시에 수많은 DNA 염기서열을 분석할 수 있는 강력한 도구이다. 이러한 마이크로어레이 기술을 이용한 병원성 세균 분석 시에는 하나의 마이크로어레이를 이용하여 동시에 다수의 균종을 감별할 수 있으며, 또한 다수의 세균에 대해 다수의 유전자를 표적 으로 검출로 한번에 대규모 분석이 가능하다((Park H, et al., J Clin Microbiol. 43:1782-1788(2005), Warsen AE, Appl Environ Microbiol. 70:4216-4221(2004), Sergeev N, et al., Biosens Bioelectron. 20:684-98(2004))

이러한 마이크로어레이는 한번에 다수의 종을 동정할 수 있으며 중복 감염과 미생물 생태학에 특히 적용 가능하다. 이러한 마이크로어레이는 이제 구강 질환의 포괄적인 특징을 나타내는 도구로 사용된다((Smoot LM, et al., Adv Dent Res. 18:6-11(2005), Vianna ME, et al., Oral Microbiol Immunol. 20:253-258(2005), Kim JH, et al., J Kor Acad Cons Dent, 28:178-183(2003), Lee YJ, et al., J Kor Acad Cons Dent, 30: 409-422(2005)). Vianna ME 등은 근관 감염 관련 세균의 동정을 위해 기존 세균 배양법에서 배양이 어려운 균종에 대해 16S rDNA 유전자의 염기서열을 대상으로 표적 프로브를 디자인하여 마이크로어레이를 이용하여 정보를 추가할 수 있었다((Vianna ME, et al., Oral Microbiol Immunol. 20:253-258(2005)). 또한, Smoot LM 등은 구강 미생물 군집의 특징을 나타내기 위해 타액 진단 도구로서 DNA 마이크로어레이를 이용하였다((Smoot LM, et al., Adv Dent Res. 18:6-11(2005)). 이러한 예와 같이, 마이크로어레이는 기존의 다수의 호기성의 병원성 세균 동정 및 진단용 외에도 구강으로부터 미생물 검출과 마이크로어레이 기반의 동정용 진단 방법으로 임상 적용이 가능함을 확인할 수 있다.

다수의 병원성 세균을 동시에 균종 감별하기 위해서는 표적 유전자 선정 및 이를 이용한 프로브 디자인이 중요하다. 즉, 속과 종 수준에서의 균종 감별을 위한 표적 유전자의 중요 특징으로는 속-특이적인 보존지역과 종-특이적인 과변이 지역 모두를 포함하는 유전자를 표적으로 해야 한다((Gilbert GL, Trends Mol Med. 8:280-287(2002)). 이러한 표적 유전자의 염기서열 다형성은 신속하고 정확한 분자생물학적 분석법의 디자인의 가능성을 제공한다((Park H, et al., J Clin Microbiol. 43:1782-1788(2005)).

다수의 문헌들에서 분자생물학적인 분석법을 이용한 세균 동정용 표적 유전자로 공공 염기서열 데이터베이스(nucleoteice database)를 통해 이미 대부분의 염기서열 정보 등이 공개된 유전자인 16S rDNA를 표적 부위로 하게 된다((Baker GC, et al., J Microbiol Methods, 55:541-555(2003), Vianna ME, et al., Oral Microbiol Immunol. 20:253-258(2005), Harris KA and Hartley JC, J Med Microbiol, 52:685-691(2003), Smoot LM, et al., Adv Dent Res. 18:6-11(2005), Shang S, et al., Pediatr Res, 58:143-148( 2005)). 그러나, 16S rDNA는 세균의 매우 보존적이며 종 수준에서의 염기서열 변이가 매우 적어서 균종 감별에 어려움이 있다. 또한 최근에는 아직 염기서열이 많이 밝혀지지 않은 23S rDNA를 기초로 세균을 검출하는 방법이 있으나 이 기술로는 서로 다른 몇몇 세균만을 검출하거나 한 속에서 몇 종의 원인균만을 검출하는 방법이라는 한계가 있다((Anthony RM, et al., J Clin Microbiol, 38:781-788(2000), Dunbar SA, et al., J Microbiol Methods, 53:245-252(2003), Mitterer G, et al., J Clin Microbiol, 42:1048-1057(2004)).

최근에는 혐기성 세균의 균종 감별 및 계통분석 등의 표적에 16S rDNA 유전자 대신 ITS(internal transcribed spacer region, 내부전사지역) 부위의 염기서열 을 분석하는 논문들이 발표되고 있다. ITS 부위는 기존 16S rDNA와 23S rDNA의 사이에 존재하는 부위로서 특징적인 두가지 부위로 구성되어있다. 즉, 속 수준을 감별 가능한 보존적인 부위와 종 수준에서 감별 가능한 과변이 부위를 포함하고 있으며((Kuwahara T, et al., Microbiol Immunol. 45:191-199(2001), Conrads G, et al., Int J Syst Evol Microbiol. 52:493-499(2002), Park H, et al., J Clin Microbiol. 38:4080-4085( 2000), Park H, et al., J Clin Microbiol. 43:1782-l788(2005)). 이는 본 발명에서 목적하는 세균의 균종 감별에 적절한 표적 부위이다. 그러나, 혐기성 세균을 대상으로 연구한 논문들은 ITS 부위를 대상으로 프라이머를 디자인하여 PCR 방법에 의한 균종 감별을 실시함으로서, 다수의 균종을 동시에 검출하는 것이 불가능하고 민감도가 마이크로어레이 보다 낮다는 한계가 있다.

기술적 과제

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하고자 마이크로어레이 기술을 이용하고, 염기서열의 보존 영역과 과변이 영역 모두를 보유한 ITS 부위를 표적으로 하여 치주 질환 관련한 일부 호기성 세균 및 혐기성 세균에 대한 속-특이적 및 종-특이적 올리고뉴클레오티드 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로브로 포함하는 치주 질환 관련 원인 세균 감별 및 진단용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로브로 구강 질환 원인 세균 감별 및 진단용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 마이크로어레이를 이용한 치주 질환을 포함한 구강 질환 원인 세균 감별 및 검출을 위한 동정 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 마이크로어레이를 이용한 치주 질환을 포함한 구강 질환 원인 세균의 감별 및 검출을 위한 진단 키트를 제공하는데 있다.

기술적 해결방법

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 세균의 감별을 위한 ITS 부위의 표적 DNA를 제공한다. 상기 표적 DNA는 임상적으로 중요하면서 아직 ITS의 염기서열이 밝혀지지 않은 세균 중 6종의 염기서열을 밝힌 것으로, 세균의 감별을 위한 프라이머 또는 프로브를 고안하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 13 내지 32 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 33 내지 68 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 세균의 ITS 과변이 염기서열 영역의 다중서열정렬(multiple alignment)에 의거하여 고안하였고, 이는 그람양성세균과 그람음성세균에 특이적이고, 세균의 속과 종 특이적인 감별을 위한 특이적 핵산 분자 증폭 방법에 유용한 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 또한 혼성화 방법에 유용한 프로브 서열로도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치주 질환 관련 세균의 감별을 위해 본 발명자가 개발한 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 프로브(PCT/KR2006/000237) 와 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 프로브 세트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치주 질환 관련 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사성(radioactive) 또는 비방사성(non-radioactive) 표지될 수 있으며, 비방사성 표지는 통상의 바이오틴(biotin), Dig(digoxigenin), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 형광(Cy5, Cy3 등) 표지 등을 포함한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있으며, 별도의 표적 DNA 증폭을 위한 프라이머가 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치주 질환 관련 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 본 발명의 균종 감별용 올리고뉴클레오티드외에 Kim CM 등에 의해 16S rDNA와 23S rDNA 유전자에서 디자인된 모든 세균 검출용 올리고뉴클레오티드(universal oligonucleotide) 및 그람-양성(gram-positive) 및 그람-음성(gram-negative) 세균을 구별하기 위해 Kim CM 등에 의해 디자인된 올리고뉴클레오티드((Kim CM, et al., 2004-68313호(2005), Kim CM, et al., PCT/KR2006/000237(2006))를 하나의 마이크로어레이 위에 함께 제공할 수도 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA) 같은 전통적인 핵산뿐만 아니라, 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체도 될 수 있다. 상기 핵산유사체는 핵산분해효소(nuclease)등 효소에 안정하고, 구조상으로 염기서열에 매우 특이적 결합을 하며, 열에 안정적인 장점이 있다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 혼성화할 수 있는 그 염기서열에 특징이 있으므로, 상기 염기서열과 동일한 염기서열을 가지는 한 상기 핵산유사체를 포함하는 개념으로 이해되어야 한다.

본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 프로브는 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)용으로 제작될 수 있다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호들의 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 프로브는 마이크로어레이의 품질관리용 QC프로브를 더 포함할수도 있다. 상기 QC프로브 (김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호, (2006))는 표적산물의 염기서열과 서로 상보적인 서열을 가지거나 또는 임의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 형광물질을 표지하되, 상기 형광물질은 표적산물에 표지된 형광물질과는 다른 여기/방출(excitation/emission) 파장을 가지는 것임을 특징으로 한다. 이로써, 표적 프로브와 표적 산물과의 혼성화 반응 전 또는 후에 상기 형광물질에서 발생하는 형광신호를 스캐닝함으로써 표적 프로브와의 상호 간섭(spectral interference)없이 지지체에 고정된 프로브 각각에 대한 고정화 여부와 고정화된 프로브의 모양과 농도 등에 대한 검증, 표적 프로브와 표적 산물의 결합 반응 또는 혼성화 반응에 대한 검증이 가능하다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 마이크로어레이는 당업계에 알려진 통상의 핀 마이크로어레이(pin microarray)(Microarray printing technology, Don Rose, Ph.D., Cartesian Technologies, Inc., Anal Biochem, 320(2):281-91(2003)), 잉크젯(ink jet)(Nat Biotech, 18;438-441(2000), Bioconjug Chem,13(1);97-103(2002)), 포토리소그래피(photolithography)(Cur Opinion Chem Biol, 2;404-410(1998), Nature genetics supplement, 21:20-24(1999)), 또는 전기어레이(electric array)(Ann Biomed Eng. 20(4):423-37(1992), Psychiatric Genetics, 12;181-192(2002)) 방법등으로 제작될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이는 진단키트의 형태로 제공될 때, 본 발명의 마이크로어레이외에 표적 DNA를 분리하기 위한 추출용 시약, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 혼성화 반응용액, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 마이크로어레이 상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다. 상기 검출방법에 있어서, 본 발명자가 개발한(특허등록, 제10-0650162호) 품질관리용 QC 프로브를 사용함으로써 마이크로어레이의 혼성화 반응 전후 모든 과정에서의 품질관리가 가능하다.

본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 표적 DNA를 증폭하는 단계는 일반적인 PCR 반응뿐만 아니라, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응과 RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification)방법을 이용할 수도 있다.

또한 위의 증폭 단계를 거치거나 또는 거치지 않고 tyramide signal amplification이나 gold nanoparticle probe와 Raman-active dye, branched DNA와 같은 probe amplification과 signal amplification 반응을 이용할 수도 있다((Karsten SL, et al., Nucleic Acids Res. 30:e4(2002), Cao YC, et al., Science, 297;1536-1540(2002)).

본 발명의 방법에서, 핵산의 분리는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법이나 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, DNA 증폭은 통상의 PCR 방법으로 수행될 수 있으며, PCR 검출 방법은 통상의 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동 분석 방법으로 수행하거나, 마이크로어레이 시그날 검출은 통상의 Cy5 또는 Cy3 등 형광 염료 결합 및 시그날 검출용 스캐너를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 세균 공통(특허출원 제04-68313호, 서열번호 46)(본 발명의 서열번호 9), 그람양성세균(PCT/KR2006/000237, 서열번호 1 내지 2), (본 발명 서열번호 10 내지 11) 및 그람음성세균(PCT/KR2006/000237, 서열번호 3), (본 발명 서열번호 12), Actinobacillus 속(서열번호 13 내지 14) 및 종(서열번호 33 내지 34), Actinomyces 속(서열번호 15 내지 16) 및 종(서열번호 35 내지 36), Campylobacter 속(서열번호 17번) 및 종(서열번호 37), Enterococcus 속(서열번호 18번) 및 종(서열번호 38), Fusobacterium 속(서열번호 19 내지 21) 및 종(서열번호 39 내지 48), Klebsiella 속(서열번호 22) 및 종(서열번호 49), Pantoea 속(서열번호 23) 및 종(서열번호 51), Peptostreptococcus 속(서열번호 24) 및 종(서열번호 52 내지 53), Porphyromonas 속(서열번호 25) 및 종(서열번호 54 내지 55), Staphylococcus 속(서열번호 26) 및 종(서열번호 56), Streptococcus 속(서열번호 27 내지 29) 및 종(서열번호 62 내지 68), Treponema 속(서열번호 30) 및 종(서열번호 59), Veillonella 속(서열번호 31) 및 종(서열번호 60), Propionibacterium 속(서열번호 32) 및 종(서열번호 61)과 Leptotrichia buccalis 종(서열번호 50)과 Tannerella forsythia 종(서열번호 57 내지 58)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정 방법을 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 단일 검체로부터 치주 질환 관련 세균의 그람양성과 그람음성 감별과 함께 하나 또는 여러 세균의 검출이 동시에 가능한 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과, 원인 세균의 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위해 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 하나의 염기서열 차이를 기본으로 하는 SBE(Single base extension), Sequencing, RFLP(Restriction fragment length polymorphism), REA(Restriction endonuclease analysis) 등을 이용한 검출 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 치주 질환 관련 원인 세균의 존재 유무, 그람-양성 및 그람-음성 세균 감별, 원인균 속 및 종을 정확하게 감별하는 방법에 관한 것으로 자세하게는 하기 단계로 구성 된다 :

(

) 필요한 경우, 배양 또는 임상 검체 등에서 다중 핵산의 분리,

(

) 필요한 경우, 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 상기 세균의 표적 서열 또는 그 일부의 증폭,

(

) 단계 (

) 및/또는 (

)에서 확보된 다중 핵산과, 표 2 내지 표 4에 나타낸 그람-양성 및 그람-음성 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 원인 세균의 속 및 종-특이적 올리고뉴클레오티드 즉, 프로브 서열, 프로브 역 서열 또는 프로브 상보 서열로 반응할 수 있는 하나 이상의 프로브의 혼성화 반응,

(

) 단계 (

)에서 형성된 하이브리드의 검출,

(

) 단계 (

)에서 얻은 혼성화 반응 시그날로부터, 상기 치주 질환 관련 원인 세균의 감염 가능성에 관한 추정.

마이크로어레이의 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (

)에서 지지체를 구성하고 있는 프로브 구성의 다양성과 하나 이상의 프로브들의 조합인 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 동시에 그람-양성 세균과 그람-음성 세균을 감별하고, 원인균 속과 종을 검출할 수 있는 동일한 혼성화 반응 및 세척 조건하에서, 상기 프로브들이 그들의 표적 부위들에 동시에 혼성화하도록 최적화된 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 지지체에 부착된 치주 질환 관련 원인균의 그람-양성 세균과 그람-음성 세균의 감별 및 원인균의 속과 종의 감별을 위한 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이는 단 1회의 실험으로 하나의 검체로부터 동시에 그람-양성 또는 그람-음성 세균을 구분하고, 원인균 속 및 종의 감별이 가능한 신속하고 정확한 마이크로어레이를 제공한다.

또한 본 마이크로어레이에 포함되지 않은 종일 경우, 최소한 속 수준에서 검출 가능하고, 프로브가 포함되지 않은 속에 대한 종일 경우, 모든 세균 검출용 프로브(universal 프로브)를 통해 세균 존재 유무의 검출이 가능하다.

도 1은 세균을 생물학적 시료에서 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 증폭용 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 도면이다. 세균 유전자의 염기서열분석 결과 속(genus) 수준의 보존 영역과 과변이 영역 모두를 포함하는 ITS와 이 부위를 증폭할 수 있는 세균에 공통적으로 존재하는 프라이머 위치와 본 발명자가 개발한 그람양성 및 그람음성 세균 특이적 프로브와 본 발명에 의해 디자인한 치주 포함 구강 질환 관련 원인균의 속 및 종 특이적 프로브 위치를 대략적으로 나타낸다.

본 발명에서 치주 질환 등의 구강 질환 원인균의 동정을 위한 표적 서열 중, 현재 공개되지 않은 새로 분석한 6종의 ITS 염기서열과 그중 3종은 ITS와 23S rDNA를 일부 포함한 염기서열 표 1과 같으며, 또한 본 발명자가 개발한 세균 존재 유무 감별 위한 세균 공통 프로브용(특허출원 제04-68313호, 서열번호 46)과 그람양성 및 그람음성 세균 특이적 감별을 위한 프로브용(PCT/KR2006/000237, 2006) 올리고뉴클레오티드는 표 2와 같다.

표 1

6종에 대해 새로 분석한 8개 유형의 ITS 염기서열과 3종에 대하여 동시에 23S rDNA 유전자의 일부분 염기서열 분석 결과

표 2

모든 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 그람-양성 및 그람-음성 세균 특이적 감별용 올리고뉴클레오티드

※ Mixed Base의 Code Name

V: G+A+C, Y: C+T, M: A+C, W: A+T

본 발명에서 개발한 치주 질환 관련 원인 세균의 속-특이적 감별을 위한 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 3과 같다.

표 3

치주 질환 관련 원인 세균 속 특이적(genus-specific) 감별을 위한 신규 프로브

※ Mixed Base의 Code Name

W: A+T, K: G+T, M: A+C, S: G+C, V: G+A+C, R: A+G, N: A+G+C+T

본 발명에서 개발한 치주 질환 원인 세균의 종-특이적 감별을 위한 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 4와 같다.

표 4

치주 질환 관련 원인 세균 종 특이적(species-specific) 감별을 위한 신규 프로브

※ Mixed Base의 Code Name

K: G+T, R: A+G, Y: C+T,

도 1은 혐기성 및 호기성 세균의 구강 질환 관련 원인균을 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 프라이머 및 프로브의 위치를 나타내는 도면이다.

도 2는 세균 특이적 염기 서열로 디자인된 프라이머 쌍에 의한 PCR 표적 산물 증폭 여부를 확인한 도면이다.

도 3은 본 발명의 구체 예의 치주 질환 관련 세균을 동정하기 위한 세균 공통적(universal) 프로브와 속 특이적(genus-specific)이고 종 특이적(species-specific)인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.

도 4는 치주 질환 관련 세균 중 Actinomyces viscosus와 Peptostreptococcus micros 종에 대한 세균 공통 프로브와 각각의 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.

도 5는 치주 질환 관련 세균 중 Staphylococcus aureus 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.

도 6은 치주 질환 관련 세균 중 Actinobacillus actinomycetemcomitans 종에 대한 세균 공통적(universal) 프로브, 그람음성 특이적 프로브, 속 특이적 및 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.

도 7은 본 발명의 구체 예의 치주 질환 관련 세균을 더 구체적으로 감별하기 위한 세균 공통적(universal) 프로브, 그람양성(gram-positive) 및 그람음성(gram-negative) 특이적인 프로브, 그리고 속 특이적(genus-specific)이고 종 특이적 (species-specific)인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.

도 8은 QC 프로브와 표적 프로브 및 음성조절 프로브를 일정 비율로 혼합하여 슬라이드에 고정시킨 후 슬라이드를 세척한 후에 스케너로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 치주 질환 관련 세균 중 그람음성세균에 속하는 Porphyromonas gingivalis 종에 대한 세균 공통 프로브, 그람음성 특이적 프로브, 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.

도 10은 치주 질환 관련 세균 중 Pantoea agglomerans 종에 대한 세균 공통 프로브, 그람음성 특이적 프로브, 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

다음의 실시 예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 실시 예로 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 세균의 배양 및 DNA 추출

본 연구에 사용된 56여종 표준 균주는 ATCC(American Type Culture Collection, Virginia, U.S.A)과 국내 유전자은행 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Taejon, Korea)과 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 구입하였다. 각 세균의 배양을 위한 배지와 배양 조건은 ATCC와 KCTC에서 제공하는 각 방법에 따라 선택하였다. 또한 본 발명자들은 부산경남지역의 종합대학 병원과의 네트워크를 통해 다수의 임상 검체는 확보하였다. 이후, 배양된 균주는 인스타진 매트릭스(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)가 100 ㎕ 분주된 1.5 ㎖ 튜브에 집락을 백금이로 따서 넣고 10초 진탕 후, 56℃ 항온 수조에서 30분간 반응하였다. 다시 10초 진탕과 100℃에서 8분간 열처리 과정과 10초 진탕을 진행한 후, 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 후 DNA를 회수하였다. 추출된 DNA는 실험에 사용 전까지 -20℃에 냉동 보관하였다. 표 5는 본 발명의 실시 예를 위해 사용된 균주 목록이다.

표 5

본 발명의 실험에 사용된 균주 목록

실시 예 2: 프로브 디자인

본 발명에 사용된 치주 질환 관련 원인균 균종 감별용 속-특이적 및 종-특이적 올리고뉴클레오티드(특히 프로브)를 디자인하기 위해 GenBank에 공개된 관련 원인균의 ITS 표적 염기서열을 선별하여 다중염기서열정렬(multiple alignment)과 BLAST 검색으로 프로브의 특이성 여부를 확인하였다. 본 발명에 사용된 치주 질환 관련 각 원인균의 속-특이적 프로브는 선정한 동일 속의 세균에 해당하는 세균들의 표적 유전자에서만 보존적이고 다른 속 수준의 세균들과는 상동성이 매우 낮은 약 15∼25 mer 길이의 염기서열이 위치하는 부위를 선정하였고, 종-특이적 프로브는 대상 종과 그 외의 다른 종과의 유사성이 적은 다형성을 나타내는 염기서열을 선정하였다. 디자인한 속-특이적 및 종-특이적 프로브는 표 3부터 표 4에 기재하였다. 위의 모든 프로브는 표2에서 표4의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포한한 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 디자인하여 이용할 수 있다.

실시 예 3: 표적 DNA 준비

치주 질환 관련 원인균의 감별을 위한 ITS 표적 부위의 증폭을 위해 이미 알려져 있는 2개의 16S rDNA의 공통 프라이머((Applied and Environmental Microbiology, 64:795-799(1998))와 본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허 출원중인 2개의 23S rDNA의 공통 프라이머(특허출원 제04-68313호, 서열번호 54와 서열번호 42)를 각각 쌍을 이루어 사용하였다. 즉, 16S-1387F: 5'-바이오틴-GCCTTGTACACWCCGCCC-3'와 23S-520R: 5'-바이오틴-NAGAACCTGAAACCGTGTGC-3', 그리고, 16S-1525F: 5'-바이오틴-GGYTGGAWCACCTCCTT-3'와 23S-389R: 5'-바이오틴-ATTTCACGTGTCCCGCCNTA-3'를 쌍을 이루어 사용하였다. 이때, 염기서열 분석을 위한 프라이머는 바이오틴을 표지화 하지 않은 상태로 제작하였으며, DNA chip 실험을 위한 표적 산물 증폭용 프라이머는 5' 말단에 각각 바이오틴을 표지화하여 제작하여 사용하였다. PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 반응 조성물은 10× PCR 완충액(100 mM KCl, 20 mM Tris HCl (pH 9.0), 15 mM MgCl₂) 5 ㎕, dNTP 혼합물 (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP 각각 10 mM) 1 ㎕, 전방향과 역방향의 프라이머 (각각 10 pmole) 각 1 ㎕, Taq polymerase (5 units/㎕, QIAGEN, Inc., Valencia, USA) 0.2 ㎕, 주형 DNA 4 ㎕를 첨가 후 총 반응액이 25 ㎕ 되도록 준비하였다. 준비된 반응액을 94℃에서 3분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후 다시 94℃에서 1분간 변성 반응, 50℃에서 1분간 교잡 반응, 72℃에서 1분간 연장 반응의 3과정을 35회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10 분간 연장반응을 수행하였다.

실시 예 4: 증폭산물의 확인 및 염기서열 분석

상기 실시 예 3 과정을 통해 증폭된 PCR 산물은 전기영동하여 각기 다른 size로서 확인하였다. 기존의 공공 뉴클레오타이드 데이터베이스를 통해 유전정보가 밝혀지지 않은 표적 세균의 표적 유전자에 대해 염기서열 분석 과정을 진행하여 표적 부위에 대한 염기서열을 확보하였다.

도 2는 세균에만 특이적으로 증폭 가능한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면으로 이미 공개된 16S rDNA의 1387F와 1525F 프라이머와 본 발명자가 개발한 특허((특허출원 제04-68313호(2004))에서 23S rDNA 부위의 특이적 염기서열 중 389R과 520R을 조합하여 PCR 반응에 이용한 후, 전기영동으로 증폭 여부 및 약 800에서 1500 bp 크기의 증폭 산물을 확인한 도면이다. 도 4a에서 4d의 M은 분자량 표지로 100 bp DNA 마커이며, N은 음성대조군을 나타낸다. 도 4a는 Porphyromonas gingivalis에 대한 증폭 결과로, 2번에서 6번은 16S-1387F와 23S-520R을 조합한 것으로 4은 ATCC 33277, 5는 ATCC 49417, 그 외 2, 3, 6은 임상 검체로부터 추출된 DNA를 이용한 결과이다. 또한, 1은 ATCC 49417을 16S-1525F와 23S-389R 조합한 것으로 5에 비해 크기가 작은 것을 확인할 수 있다. 도 4b의 1에서 4는 Enterococcus faecalis, 5에서 14는 Fusobacterium nucleatum로 5는 ATCC 51191, 6은 ATCC 51190, 7은 ATCC 25586, 8은 ATCC 23726, 9는 ATCC 10953, 그리고 10은 ATCC 49256이며, 11에서 14는 임상 검체에 대한 결과이다. 도 4c의 1에서 6은 Streptococcus mitis에 대한 결과로 1은 ATCC 49456, 6은 ATCC 9811의 DNA를 대상으로 하고, 2에서 5는 임상검체를 대상으로 하였다. 7에서 10은 Streptococcus sanguinis를 대상으로, 7은 ATCC 10556의 DNA를 분석한 결과이며, 8에서 10은 임상검체에 대한 결과 이다. 11은 Treponema denticola에 대한 ATCC 95404, 12는 Veillonella parvula ATCC 10790와 13은 이에 대한 임상겅체를, 14는 Propionibacterium acnes의 ATCC 6919에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 4d는 1은 Fusobacterium periodonticum ATCC 33693, 2에서 4는 임상 검체 F. periodonticum, 6은 Campylobacter concisus ATCC 33237, 7과 8은 임상 검체 C. concisus에 대한 결과이며, 9는 Enterococcus faecalis ATCC 19433, 11에서 14는 Pantoea agglomerans에 대한 증폭 결과이다. 이 결과에서 보여주듯이 세균 특이적 각 프라이머 쌍에 의한 증폭산물에 의해 1차적으로 세균과 human DNA, virus DNA 등의 다른 유기체와의 감별이 가능하였고 이로써 신속하고 더욱 정확한 진단을 위한 가장 기본적이며 중요한 진단 과정 및 방법으로써 비용 절감 효과도 얻게 된다.

실시 예 5: 표적 프로브 제작

실시 예 2에서 디자인된 프로브는 5' 말단에 아민-변형과 C6-15개 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15-25개의 디자인된 특정 염기서열을 갖는 프로브를 합성의뢰 하였다. 본 발명에서 제작된 속- 및 종-특이적 프로브는 표 3과 및 표 4의 서열번호 13 내지 68과 같다. 또한, 본 발명의 실시 예에 사용한 모든 세균 특이적 프로브((김철민, 특허출원 제04-68313호, 서열번호 46))와 그람양성 및 그람음성 세균 특이적 프로브((Kim CM et al.,, PCT/KR2006/000237(2006), 서열번호 1내지 3))를 본 진단 방법 및 균종 감별을 위한 프로브로 추가 사용하였다.

실시 예 6 : 형광 염료로 표지된 QC 프로브 제작

본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허등록 한 QC 프로브를 본 실험에 사용하였다((김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호, (2006)).

실시 예 7 : 지지체에 프로브 부착

실시 예 5에서 제작된 표적 프로브를 각각 5∼100 pmol로 희석하고 실시 예 6에서 제작된 QC 프로브 1∼10 pmol 및 Micro-spotting 용액 또는 3× SSC 용액을 첨가하여 잘 혼합하였다. 마이크로어레이어(Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA)를 이용하여 프로브를 부착하였다. 한 종류의 프로브 당 두 개의 점(spot)을 지지체에 부착시킨 후, 실온에서 24시간 정도 정치 또는 50℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 정치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.

실시 예 8 : 프로브 고정화에 대한 품질 관리 조사

세척 전 슬라이드에 고정화된 프로브의 고정화 정도와 상태가 결과 분석에 중요한 영향을 미칠 수 있으므로 본 발명자에 의해 개발 및 등록된 품질관리용 프로브(QC 프로브)를 세척 전의 상태를 확인하였다((김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철 민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호(2006)). QC 프로브를 이용하여 표적 프로브의 부착 및 고정화와 DNA chip의 전반적인 상태 파악 등이 결과 분석에 중요한 영향을 미칠 수 있으므로 세척 전의 상태를 확인하였다. 실시 예 7에서 제작된 마이크로어레이의 프로브 고정화 후, 세척 전의 슬라이드에서 프로브의 고정화 여부와 스팟의 상태를 레이저 스캐너(laser scanner)로 분석하였다. 도 8은 그 결과를 나타낸 것이다.

실시 예 9 : 고정화되지 않은 프로브 세척

실시 예 8의 과정을 통해 품질 관리 조사를 마친 슬라이드에 고정화되지 않은 프로브를 세척하기 위하여 실시하였다. 실온에서 0.2％ SDS 완충액을 이용하여 세척한 후, dH2O를 이용하여 세척하였다. 다음 sodium borohydride(NaBH4) 용액에 5분간 방치한 후, 100℃에서 세척하였다. 마지막으로 다시, 0.2％ SDS와 dH2O를 이용하여 세척한 후, 원심분리기를 이용하여 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.

실시 예 10: 염료 결합 및 혼성화 반응

실시 예 3에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 산물을 열처리하여 단일 가닥으로 변성시킨 후, 4℃로 냉각시켰다. 1∼5 ㎕의 표적 산물을 포함하는 교잡반응 용액과 Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 포함하는 반응용액 총 10 ㎕ 또는 60 ㎕를 제조하였다. 실시 예 8을 마친 슬라이드에 교잡반응 용액을 분주하고 기포가 생기지 않도록 커버 슬립을 덮거나 혹은 커버씰(cover seal)을 덮은 슬라이드는 60 ㎕의 반응액을 분주한 뒤 빛을 차단한 후, 40℃에서 30분간 반응시켰다.

실시 예 11: 비특이적 교잡반응 표적 산물의 세척

혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 표적 산물을 세척하기 위해 2 × SSC(300 mM NaCl, 30 mM Na-Citrate, pH 7.0) 세척 용액을 이용하여 커버 슬립을 제거한 후에 2 × SSC와 0.2 × SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하였다. 마지막으로 원심분리기를 이용하여 세척한 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.

실시 예 12: 결과 분석

결합 반응 분석을 위해 비공초점 레이저 스캐너(laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 스캐닝하고 화상분석을 통해 결과를 분석하였다.

도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예인 치주 질환 관련 원인 세균의 존재 유무와 속 특이적이고 종 특이적인 감별을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레을 나타내는 도면으로 본 발명에 의한 마이크로어레이는 하나의 지지체로 둘 이상의 마이크로어레이를 제작할 수 있어 단시간에 많은 수의 샘플을 동시에 분석할 수 있다.

도 4는 Actinomyces viscosus와 Peptostreptococcus micros 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 함께 Actinomyces 속 특이적 프로브(서열번호 15과 16) 및 A. viscosus 종 특이적 프로브(서열번호 36)와 Peptostreptococcus 속 특이적 프로브(서열번호 24) 및 P. micros 종 특이적 프로브(서열번호 52과 53)의 두가지 균종에 중복감염 된 경우에 대해 각각의 균종의 속 및 종 특이적인 프로브에 반응한 결과를 나타낸 도 면이다.

도 5는 Staphylococcus aureus 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 함께 Staphylococcus 속 특이적 프로브(서열번호 26)와 S. aureus 종 특이적 프로브(서열번호 56)에만 특이적으로 반응한 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명의 바람직한 실시 예인 치주 질환 관련 원인 세균의 존재 유무와 그람양성과 그람음성의 감별을 위한 프로브, 그리고 속 및 종 특이적인 프로브를 한 세트로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면과 Actinobacillus actinomycetemcomitans 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 그람음성 세균 특이적 프로브(PCT/KR2006/000237), (서열번호 10)과 함께 Actinobacillus 속 특이적 프로브(서열번호 13)와 A. actinomycetemcomitans 종 특이적 프로브(서열번호 33)에만 특이적으로 반응한 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명의 바람직한 실시 예인 치주 질환 관련 원인 세균을 더 구체적으로 감별하기 위한 세균의 존재 유무(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 그람양성과 그람음성의 감별을 위한 프로브(PCT/KR2006/000237), (서열번호 10, 11, 12), 그리고 속 특이적이고 종 특이적인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레를 나타내는 도면으로 본 발명에 의한 마이크로어레이는 하나의 지지체로 둘 이상의 마이크로어레이를 제작할 수 있어 단시간에 많은 수의 샘플을 동시에 분석할 수 있다.

도 8은 도 7의 마이크로어레이 도면에 표적 프로브와 품질관리용 프로브(특허등록, 제10-0650162호)를 일정 비율로 혼합하여 지지체에 고정시킨 후 슬라이드를 세척한 후 스캐너로 분석한 마이크로어에이의 품질 상태를 나타낸 결과로, 지지체에 고정된 프로브의 모양 및 농도 등의 고정화 상태가 양호함을 확인할 수 있다.

도 9는 도 8에서 품질 상태가 확인된 치주 질환 관련 원인 세균 검출 및 동정용 마이크로어레이를 이용한 Porphyromonas gingivalis 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 그람음성 세균 특이적 프로브(PCT/KR2006/000237), (서열번호 10)와 함께 Porphyromonas 속 특이적 프로브(서열번호 25)과 P. gingivalis 종 특이적 프로브(서열번호 55)에만 특이적으로 반응한 결과를 나타낸 도면이다.

도 10은 Pantoea agglomerans 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제04-68313호), (서열번호 9)와 그람음성 세균 특이적 프로브(PCT/KR2006/000237), (서열번호 10)와 함께 Pantoea 속 특이적 프로브(서열번호 23)와 P. agglomerans 종 특이적 프로브(서열번호 51)에만 특이적으로 반응한 결과를 나타낸 도면이다.

이것은 본 발명에서 고안한 신규 올리고뉴클레오티드 중 대표적인 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 본 발명에 제한되지 않고 각 프로브 구성 및 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 병원성 세균의 검출 및 동정을 위한 세균의 속 수준의 보존적인 부위와 염기서열 과변이 영역 모두를 포함하는 ITS 부위로부터 치주 질환 관련 세균의 속과 종 특이적 프로브를 디자인 및 조합하여 이를 포함하는 마이크로어레이와 진단 키트를 개발하였으며, 이에 대한 특이성을 확인하였다. 이는 세균에 공통적으로 존재하는 염기서열로 증폭하여 치주 질환 관련 세균의 존재 유무와 함께 그람양성 및 그람음성을 구별하고 속과 종에 대한 정확한 감별이 가능함으로 감염원에 따른 항생제 치료로 빈버히 발생하는 항생제의 오남용을 예방할 수 있다.

또한, 신속하고 민감한 방법의 마이크로어레이 진단 방법을 이용함으로써, 치주 질환의 조기 발견 및 치료가 가능하므로, 치주 질환 관련 세균으로 인한 다양한 심혈관계 질환 등의 다양한 전신 질환이 개선될 수 있을 것이다. 마이크로어레이는 고밀도 프로브를 포함할 수 있어 다수의 미생물을 동시에 검출 가능하므로 구강 미생물 진단에 특히 유용하다. 동시에 다수의 미생물을 검출진전에 대한 대단한 희망을 제공한다. 치과의사와 임상 의사가 치과 분야에서 구강 내 병원균 검출에 마이크로어레이를 기반으로한 장치를 이용함으로서 진단 및 예방과 감시 방법을 개선하여 환자의 치아 치료 관리를 보다 잘 이끌게 될 것이다.

Claims

서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 세균의 감별을 위한 ITS 부위의 표적 DNA.
서열번호 10 내지 11 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 그람양성 세균 특이적 동정을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 12의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 그람음성 세균 특이적 동정을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 13 내지 32 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 속 특이적 동정을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 33 내지 68 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 치주 질환 관련 세균의 종 특이적 동정을 위한 올리고뉴클레오티드.
제 2항 내지 제 5항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치주 질환 관련 세균 증폭용 프라이머 세트.
제 2항 또는 제 5항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치주 질환 관련 세균 동정용 프로브 세트.
제 2항 내지 제 5항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트.
제 2항에 따른 치주 질환 관련 그람양성 세균의 특이적 동정을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
제 3항에 따른 치주 질환 관련 그람음성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
제 4항에 따른 치주 질환 관련 세균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
제 5항에 따른 치주 질환 관련 세균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
제 2항에 따른 치주 질환 관련 그람양성 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴 클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
제 3항에 따른 치주 질환 관련 그람음성 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
제 4항에 따른 치주 질환 관련 세균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
제 5항에 따른 치주 질환 관련 세균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 또는 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이의 품질관리용 QC프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화 반응 단계 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날 검출 단계를 포함하는 치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정 방법.
제 20항에 있어서, 세균 공통(특허출원 제04-68313호, 서열번호 46)(본 발명의 서열번호 9), 그람양성세균(PCT/KR2006/000237, 서열번호 1 내지 2), (본 발명 서열번호 10 내지 11) 및 그람음성세균(PCT/KR2006/000237, 서열번호 3), (본 발명 서열번호 12), Actinobacillus 속(서열번호 13 내지 14) 및 종(서열번호 33 내지 34), Actinomyces 속(서열번호 15 내지 16) 및 종(서열번호 35 내지 36), Campylobacter 속(서열번호 17번) 및 종(서열번호 37), Enterococcus 속(서열번호 18번) 및 종(서열번호 38), Fusobacterium 속(서열번호 19 내지 21) 및 종(서열번호 39 내지 48), Klebsiella 속(서열번호 22) 및 종(서열번호 49), Pantoea 속(서열번호 23) 및 종(서열번호 51), Peptostreptococcus 속(서열번호 24) 및 종(서열 번호 52 내지 53), Porphyromonas 속(서열번호 25) 및 종(서열번호 54 내지 55), Staphylococcus 속(서열번호 26) 및 종(서열번호 56), Streptococcus 속(서열번호 27 내지 29) 및 종(서열번호 62 내지 68), Treponema 속(서열번호 30) 및 종(서열번호 59), Veillonella 속(서열번호 31) 및 종(서열번호 60), Propionibacterium 속(서열번호 32) 및 종(서열번호 61)과 Leptotrichia buccalis 종(서열번호 50)과 Tannerella forsythia 종(서열번호 57 내지 58)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정 방법.