KR100758374B1 - 미생물 분류 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SSH(suppression subtractive hybridization) 방식으로 증폭된 산물을 마이크로어레이 프로브로 사용하여 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 SSH 방식으로 증폭하여 여러 종류의 유전자를 포함한 산물을 직접 프로브로 사용하기 위해 별도의 클로닝 단계를 거치지 않고 직접적으로 프린팅하여 마이크로어레이를 제작하여, 정확하고 보다 간편하게 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
SSH(suppression subtractive hybridization), 마이크로어레이
Description
도 1은 드라이버로 이용된 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis와 테스터로 이용된 S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp. indica, S. enteritidis, S. typhimurium, S. bongori 및 Escherichia coli 의 계통발생학적 근연관계를 알 수 있는 16S rRNA 염기서열 상동성을 비교 분석한 그림이다.
도 2의 A 사진은 모든 테스터와 드라이버 샘플을 Rsa I 제한 효소로 자른 DNA가 100 내지 1500 bp 정도의 사이가 되었음을 아가로스 겔 상에서 에티디움 브로마이드 염색하여 확인한 결과이다.
도 2의 B 사진은 전체 미생물에 보존된 박테리아 1088r 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 후 라이게이션의 효율을 분석한 사진이다.
도 2의 C 사진은 테스터와 드라이버를 혼성화 반응을 시키고, 테스터-특이적 단편을 얻기 위한 첫 번째 PCR 반응시킨 후의 사진이다.
도 2의 D 사진은 첫 번째 행해진 PCR 산물을 템플레이트로 이용하여 두 번째 로 네스티드(nested) PCR 반응시킨 후의 사진이다.
도 3은 S. choleraesuis subsp.indica, S. choleraesuis subsp. salamae, Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, S. typhimurium, S. bongori, S. enteritidis, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae 및 S. choleraesuis subsp. houtenae의 각각의 게놈을 마이크로어레이로 확인한 사진이다. 도 3의 마지막 슬라이드인 3mix는 서로 다른 3개(S. choleraesuis subsp. indica, houtenae 및 diarizonae)의 게놈을 섞어 라벨링하여 마이크로어레이로 확인한 사진이다.
본 발명은 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시킨 산물을 프로브로 사용하여 제작된 마이크로어레이를 이용하여, 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하는 방법에 관한 것이다.
세균, 진균, 바이러스와 같은 다양한 병원성 미생물은 혈액, 체액 및 인체의 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 감염성 질환을 일으킨다. 최근에는 병원성 감염이 사회적으로 크게 부각되고 있는데, 그 빈도가 점차 증가하고 있고 의료계에서 법적인 문제가 되기 시작한 병원성 감염은 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우 인명을 잃을 수 있으므로, 조기 진단과 합병증 없는 신속한 치료가 중요하다. 따라서 이러한 병원성 미생물에 대한 정확하고 신속한 진단법의 개발은 시대가 요구하는 의료 기술이다. 더욱이 최근에는 항생제의 투여의 오남용으로 인해 세균의 배양률이 감소하게 되었고, 이식에 따른 면역 억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 약물투여의 증가, AIDS의 증가로 인한 원인 균주가 다양해지게 되면서 배양 검사와 같은 기존의 감염질환을 진단하는 진단 방법들이 점차 어려움에 부딪히고 있는 실정이다.
미생물학적인 문헌에서 보면 DNA 마이크로어레이 기술의 적용 범위가 무한하다는 것이 점점 더 공통적인 의견이 되어가고 있고, 이 기술이 널리 다른 방향으로도 전환되어져 가는 경향을 나타내면서 고효율의 미생물 분류검출 방식은 여러 방면에서, 또 여러 방식으로서 적용 가능해 졌다(Bodrossy et al., Curr Opin microbiol, 7, 245-254, 2004). DNA 마이크로어레이는 병렬적 분석이 가능하고, 고 효율적 검출과, 핵산의 정량화를 위한 강력한 기술이다. 현재의 마이크로어레이는 특히 환경 미생물학과 미생물 생태학을 포함하여, 생명과학의 대부분을 차지하는 인간, 동물 그리고 음식과 식물의 진단법 등에 널리 적용되어 유용하게 사용되고 있다. DNA 마이크로어레이 기술이 미생물 생태계 안에서 일어나고 있는 중요한 문제들을 설명하기 위해 적용될 수 있는 여지가 많은데 비하여, 실질적인 몇몇의 한계(종과 아종 사이에서 나타나는 낮은 감수성과 낮은 해상도)는 그것의 보편화된 적용을 늦추게 한다(Cook et al., Curr Opin Biotechnol, 14, 311-318, 2003). DNA 마이크로어레이 기술이 실현되기 위해서 이 장기적인 한계는 극복 되 어야만 한다.
현재 이용되고 있는 것들 중 하나는 16S rRNA의 유전자에 기반을 둔 마이크로어레이로서 살모넬라를 포함하여 병원성 미생물의 진단을 위해 제작, 사용되었다. 이 마이크로어레이는 고 효율적으로 다른 병원성 미생물을 검출 할 수 있게 하는 유용한 진보된 방법이지만, 종 수준에선 약한 해상도를 나타내는 문제점이 있다. 따라서 좀 더 높은 해상도와 종 수준 이하의 유전자까지도 정확하게 검출되는 방식이 요구되게 되었다. DNA간의 관계성을 기본으로 하여 발달되어진 GPM(Genome-probing microarray)의 분류검출법은 비록 SSU rDNA 마이크로어레이를 기본으로 하는 것 보다 높은 해상도를 보여주지만, 이것은 단지 종 특이성 수준에서만 분류 검출할 수 있다는 문제점이 있다.
이전에 본 발명자들은 DNA 마이크로어레이의 새로운 방식, 즉 GPM(genome-probing microarray)을 개발하였다. 이러한 GPM는 미생물 가공처리(bioprocess)의 고효율 진단법으로 DNA 마이크로어레이의 유용성 있는 첫 번째 시도였다(식물성 음식에서의 유산균 발효). GPM의 특징은 기존의 마이크로어레이에서 사용되는 프로브와는 다른 프로브를 사용한다는 것이다. 이것은 기존의 미생물 진단용 마이크로어레이에서 사용하던 cDNA 이나 올리고누클레오타이드가 아닌 게놈성 DNA(gDNA)을 이용한다는 데 그 차이를 두고 있다. DNA 마이크로어레이의 프로브나 타겟으로 gDNA를 사용함으로써, 이전부터 사용해 왔던 16S rRNA 유전자의 검출을 기본으로 하는 미생물 진단용 마이크로어레이를 사용할 때 나타난 결과보다 10배 이상의 감수성(sensitivity)을 나타낸다는 커다란 장점이 있었다. 감수성 뿐 아니라, 자 연 환경 내에서 검출하고자 하는 특정한 미생물을 찾는데 16S rRNA 유전자 검출 마이크로어레이 보다 GPM이 종 판별력에 있어 높은 특이성을 보여준다. 현재 미생물의 병렬적 분석과 고 효율적 검출, 그리고 정량화 분석 등의 GPM의 훌륭한 적용에도 불구하고, 더 낮은 단계 분류군(taxon)에서의 감수성과 특이성이 여느 때보다 더 강하게 요구되어지고 있다. 종 단계에서의 결정에 있어 진단을 위한 충분한 정보가 공개되지 않았기 때문에 환경 미생물학 뿐 아니라, 임상 적용 시 종 수준 아래인 아종의 결정 유전자적 표시에 대한 요구는 명백하다.
본 발명자들은 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시켜 별도의 클로닝을 거치지 않고 직접적으로 프린팅하는 간단한 방법으로 제작한 마이크로어레이가 정확하게 미생물을 아종까지 분류 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
하나의 양태로서, 본 발명은 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시켜서 얻은 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적으로 마이크로어레이에 프린팅하여 제작한 마이크로어레이를 이용하여, 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하기 위한, 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시켜 얻은 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적으로 마이크로어레이에 프린팅하여 제작한 마이크로어레이 를 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시켜서 얻은 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적으로 마이클로어레이에 프린팅하여 제작한 마이크로어레이를 이용하여, 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게는 (a) 병원성 미생물의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시키는 단계; (b) SSH 산물을 프린팅하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; 및 (c) 표지화된 시료를 마이크로어레이에 하이브리드화하여 시그날을 검출하는 단계를 포함하되, 단계 (a)에서 획득한 SSH 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접 마이크로어레이에 프린팅함을 특징으로 하는, 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 “병원성 미생물”이란 세균, 진균, 바이러스 등으로 혈액, 체액 및 인체의 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 감염성 질환을 일으키는 미생물을 말한다. 본 발명의 병원성 미생물로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 살모넬라(Salmonella), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 크로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium perfringens) 및 크로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)등이 해당되며, 바람직하게는 살모넬라이다.
살모넬라는 전 세계 인간에게서 발병 가능한 식중독 원인의 대표적 병원성 미 생물 중 하나이다. 살모넬라 속 (genus) 은 2300 serovars 보다 더 많이 분화되어 있고, 이들 간에 유전자형 유사도가 매우 높아 속한 종 들 간에 대해서 계통발생학적으로 분류하는데 있어서 어려움이 있다. 살모넬라 속(genus)에 속한 종 수준 뿐 아니라, 종 수준 이하의 고 효율적인 검출(high-throughput detection)은 인간에게 미치는 병원성 미생물에 관한 폭넓은 연구를 수행함에 있어 매우 중요한 기술적 요소이다. 이처럼 현재 살모넬라 속에 속한 종들의 유전자의 유사도가 높아 구분 및 분류하는데 많은 어려움이 있고, 종 단계에서의 결정에 있어 진단을 위한 충분한 정보가 공개되지 않았기 때문에 환경 미생물학 뿐 아니라 임상 적용 시, 아종 결정 유전자적 표시에 대한 요구가 명백히 필요시 된다.
본 발명의 분류 검출 방법에 적용하기에 바람직한 병원성 미생물은 살모넬라이며, 보다 바람직하게는 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp. indica, S. enteritidis, S. typhimurium 및 S. bongori 을 포함한다. 상기 살모넬라 균주는 Salmonella choleraesuis , S. enteritidis, S. typhimurium 및 S. bongori 의 4종의 살모넬라를 포함하고, Salmonella choleraesuis 종에 속하는 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae 및 indica 의 6개의 아종을 포함한다. 상기의 살모넬라 균주에 본 발명의 방법을 적용하여 유전자의 유사도가 매우 높은 살모넬라의 종들 및 아종들간을 정확히 100%의 감도로 분류 검출 할 수 있었다.
본 발명에서의 “분류 검출”은 시료 중 병원성 미생물의 존재여부 및 병원성 미생물이 존재할 경우 존재하는 그 병원성 미생물의 종 또는 아종까지 구분하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 "SSH(suppression subtractive hybridization) 방식"이란 매우 밀접히 연관되어 있는 2개의 게놈 라이브러리를 구별하는 DNA 분자를 선별하기 위해 널리 이용되고 있는 방법이다(Rebrikov et al., Methods Mol Biol., 258, 107-134, 2004). 방법의 중요한 특징은 2개의 게놈 라이브러리에서 동시에 존재하는 유전자에 대해서 표준화(normalization) 단계와 감산(subtraction) 단계를 수행하는 것이다. 표준화 단계란 타겟(target) 집단 내에 매우 많은 DNA 단편들이 존재할 경우 이들을 균등화시키는 것을 말하며, 감산(subtraction) 단계란 비교되는 2 집단 내에 공통적인 염기서열이 있을 경우 이 부분을 제외시켜 나가는 과정이다. 보다 구체적으로는 2 집단의 균주에서 DNA를 추출해내고, 추출해낸 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하여 얻은 DNA 단편들에 대해 타겟 균주에만 특이적으로 존재하는 DNA 단편에만 특이적인 어덥터(adaptor)를 사용하여 2 집단의 DNA 단편들을 혼성화(hybridization)시킨 후(비교되는 균주를 드라이버(driver)라 하며, 드라이버에 없는 특이적인 DNA를 가지는 균주를 테스터(tester)라 한다), PCR을 수행하여 테스터 균주에만 존재하는 단편(tester-specific fragments)를 증폭시키는 방법을 말한다. 즉, 테스터에만 존재하는 DNA 단편을 선택적으로 증폭시키며, 동시에 드라이버의 DNA 단편의 증폭은 억제하는 개념이다. 이러한 SSH는 유전자의 특정 부분 을 증폭시켜 두개의 매우 가까운 관계의 균주 사이에서도 미세한 유전자의 차이점을 감지하여 동정 가능하고 환경의 메타 게놈 내의 유전적 다양성도 알 수 있다.
본 발명에서의 “마이크로어레이”란 고체 지지체 상에 구획으로 나누어져 일정한 영역을 가지는 분리된 부위를 가진 1차 또는 2차의 배열 (array) 을 말하는 것으로, 일반적으로 수천 혹은 수 만개 이상의 핵산이나 단백질 등을 일정 간격으로 배열하고 분석 대상 물질을 처리하여 그 결합 양상을 분석할 수 있는 바이오칩을 의미한다. 바이오칩은 핵산 및 단백질 칩이 대표적이고, 칩은 마이크로어레이와 혼용된다. 마이크로어레이의 밀도는 고체 지지체 표면에 위치한 검출하고자 하는 핵산의 총수에 따라 결정되는데, 50/cm2이상이 바람직하며, 100/cm2이상이 더욱 바람직하고 500/cm2 이상이 보다 바람직하다.
본 발명에서의 “프린팅”은 SSH 방식으로 증폭된 산물을 마이크로어레이에 고정시키는 것을 의미하며 용어 “스포팅”과 혼용된다. 본 발명의 마이크로어레이에서 1종의 살모넬라 SSH 마이크로어레이 프로브를 4개의 위치에 스포팅하였다.
마이크로어레이를 제작하는 방법은 기존에 알려진 핀을 이용한 마이크로스포팅, 잉크젯 원리를 이용한 마이크로드로핑, 전기를 이용한 어드레싱 등의 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 핀 마이크로어레이법 특히, 핀의 맨끝에 펜끝부분(quill)처럼 가는 슬릿이 들어 있는 펜을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 DNA 프로브를 로봇으로 스포팅함으로써 높은 재현성을 나타내는 소형화된 마이크로어레이를 제작하였다.
마이크로어레이의 고체 지지체는 하이브리드화에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 통상 슬라이드 글라스, 실리콘 칩, 니트로셀룰로오스나 나이론 막 등을 사용할 수 있다. 지지체 표면은 공유결합 또는 비공유결합에 의해 1개 사슬 또는 2개 사슬의 핵산을 고정화시킬 수 있는 것이면 어떤 것이어도 되고, 지지체 표면에 친수성 또는 소수성의 관능기를 갖고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있고, 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대, 수산기, 아미노산, 티올기, 알데히드기, 카르복실기, 아실기 등을 갖고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 관능기는 지지체 자체의 표면 처리물로는, 예컨대 유리를 아미노 알킬실란 등의 시판되고 있는 실란 커플링제로 처리한 것이나, 폴리라이신이나 폴리에틸렌아민 등의 폴리 양이온으로 처리한 것 등을 들 수 있다. 또한, 이들 처리를 한 슬라이드 글라스의 일부는 시판되고 있으므로 구입하여 사용가능하다. 본 발명의 SSH 산물을 마이크로어레이 기계로 상기와 같은 슬라이드 글라스에 스포팅한 후, 프로브의 고정을 위해 UV를 조사하여 크로스 링킹(cross-linking)시킨 후 적당한 습도에서 장시간 방치할 수 있다.
본 발명에서의 “시료”는 환경, 인간 및 동물의 소화기, 물, 음식물 등의 병원성 미생물을 포함할 수 있는 모든 종류의 시료가 이에 포함된다. 또한 하나의 시료에서 특정 병원성 미생물에 대한 하나 이상의 종 또는 아종이 존재할 경우 이의 분류 검출도 가능하다.
본 발명에서의 “표지화”는 시료의 DNA와 마이크로어레이의 프로브와의 하이브리드화 여부를 확인하기 위한 라벨링을 의미한다. DNA 라벨링하는 방법은 공지의 기술을 이용할 수 있고, 예를 들어 게놈 DNA 또는 이들의 일부를 6개의 무작위 헥사머(hexamer) 및 Cy3 또는 Cy5의 형광색소 시약 등과 혼합하여 형광물질이 부착된 DNA 또는 이들의 일부를 얻을 수 있고, 변성과정을 거쳐 단일 가닥으로 만든 후 하이브리드화 반응에 사용될 수 있다. Cy3 또는 Cy5(Amersham Pharmacia, U.K.)의 형광색소 시약을 DNA에 라벨링을 위해 사용하는데, 이는 임의의 색깔차이로써 유전자 하이브리드화 여부를 판단할 수 있다. 본 발명에서는 Cy5 dCTP를 사용하지만, Cy3-dCTP, Cy5 dUTP 또는 Cy3-dUTP를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서의 “하이브리드화”란 상보적인 양 핵산이 짝을 짓는 것을 말한다. 하이브리드화 및 하이브리드화의 강도는 양 핵산간의 상보적인 정도, 형성된 하이브리드의 Tm, 반응조건의 가혹도(stringency), 핵산의 GC 함량에 의해 결정된다.
시료에서 얻은 DNA와 마이크로어레이를 하이브리드화하고 세척하는 방법은 변성제, 온도, 또는 염의 농도를 변화시키면서 통상의 방법으로 적절한 조건을 찾아 행할 수 있다. 일반적으로 하이브리드화 완충액내의 변성제는 포름아미드(formamide) 또는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 등을 사용할 수 있는데, 변성제의 농도가 높을수록 하이브리드화의 민감도가 증가한다. 본 발명에서는 10 내지 70%, 바람직하게는 30 내지 50%의 포름아미드를 사용할 수 있다. 하이브리드화 민감도를 고려하여 하이브리드화하는 온도와 세척액 내 염의 농도 또한 적절한 조건으로 정할 수 있다. 또한, 세척액의 염농도는 0 내지 1X SSC, 바람직하게는 0.01 내지 0.1X SSC에서 수행할 수 있다.
시료와 프로브의 하이브리드화 여부를 확인하는 방법은 시료에서 분리한 DNA를 라벨링한 방법에 따라 다양하나, 하이브리드화 및 마이크로어레이를 세척하여 하이브리드화되지 않은 유전자를 제거한 후 하이브리드화된 유전자를 레이저 형광 분석기 등 고해상도의 형광스캐너로 병원성 미생물을 검출 동정할 수 있다. 형광염료를 사용하는 레이저 유발 형광법은 현재 가장 많이 사용되는 검출방법으로서, 형광에 의한 검출한계를 극복하고, 배경에 의한 노이즈가 비교적 작다는 장점이 있다. 검출계로서 집광부에 CCD 또는 공초점레이저를 사용할 수 잇다. 하나의 구체적이 양태로서, 시료에서 유래한 핵산을 Cy3 또는 Cy5로 라벨링할 수 있는데, Cy3의 흡수파장은 550nm이고, 형광방출 파장은 570nm이며, Cy5의 경우는 흡수파장이 649nm, 형광방출파장이 670nm로서, 각각 녹색과 적색을 나타내므로 형광의 정도를 비교하여 검출한다. 또한 형광여부 및 형광의 정도를 수치로 나타내어 정량적으로 측정하는 것도 가능하다.
마이크로어레이에 의한 하이브리드화의 결과는 슬라이드글라스 상으로부터 형광 스캐너에 의해 화상이미지로 얻을 수 있다. 이 화상은 BMP 또는 TIFF라는 형식으로 스캐너에서 출력되므로, 이 화상에서 각 스팟의 형광 시그널 강도를 수치화하는 것이 필요한데, 이 화상처리소프트는 스캐너에 부속되어 있는 것을 사용하거나 다른 소프트를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법은 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류검출하는데 있어, 획득한 SSH 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적으로 마이크로어레이에 프린팅함 을 특징으로 한다.
현재 개발된 마이크로어레이는 하나의 프로브 스폿(probe spot)에 한 종류의 유전자(cDNA)나 한 종류의 올리고뉴클레오타이드만을 스포팅한다. 이러한 하나의 유전자 또는 올리고뉴클레오타이드를 얻기 위해서는 클로닝 작업이 필수적이며, 이러한 작업은 많은 시간과 노력이 요구되는 작업이다.
그러나, 본 발명의 방법은 별도의 클로닝 과정을 거치지 않고도 정확하게 종 뿐만 아니라 아종 수준의 미생물을 분류 검출할 수 있으며, 특히 살모넬라와 같이 유전자형이 매우 유사하여 종 또는 아종을 분류하기 어려운 균주를 대상으로 하여 SSH 산물을 별도의 클로닝 과정을 거치지 않고 마이크로어레이에 스포팅하여 제작된 마이크로어레이를 이용하여 살모넬라의 종 또는 아종을 정확하고 간편하게 분류 검출하는데 성공하였다.
따라서 구체적 양태로서, 본 발명은 살모넬라의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시켜서 얻은 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적으로 마이크로어레이에 프린팅하여 제작한 마이크로어레이를 이용하여, 살모넬라의 종 또는 아종을 분류검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로 (a) 살모넬라의 유전자를 SSH 방식으로 증폭시키는 단계; (b) SSH 산물을 프린팅하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; 및 (c) 표지화된 시료를 마이크로어레이에 하이브리드화하여 시그날을 검출하는 단계를 포함하되, 단계 (a)에서 획득한 SSH 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접 마이크로어레이에 프린팅함을 특징으로 하는, 살모넬라의 종 또는 아종을 분류검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 적용되는 살모넬라는 모든 종 및 아종이 가능하며, 바람직하게는 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, S.choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp. indica, S. enteritidis, S. typhimurium 및 S. bongori 를 예로 들 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 테스터로서 S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp.indica, S. enteritidis, S. typhimurium 및 S. bongori 를 드라이버로서 S. choleraesuis subsp. choleraesuis 균주를 사용한다.
두 균주 중, 비교되는 유전자를 가지는 균주를 드라이버(driver)라 하며, 드라이버에 없는 특이적인 유전자를 가지는 균주를 테스터(tester)라 한다.
9개의 살모넬라 타입 스트레인과 이. 콜라이 타입 스트레인(Escherichia coli type strain)에 관한 자세한 것은 표 1과 같다. 각각의 균주는 Korean Collection for Type Cultures(KCTC), German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ), American Type Culture Collection(ATCC)에서 분양 받아 실험하였다. 모든 균주는 각 분양 기관에서 보내준 성장 조건 방식을 따랐다.
* 모든 유전자 프로브는 4개의 위치에 프린팅하였다. 미생물의 유전자는 첫줄에 프린팅하고, SSH 프로브는 두번째 줄에 프린팅하였다. 마이크로어레이상의 위치는 왼쪽에서부터 번호가 정해졌다.
상기 균주들로부터 DNA를 추출하여 SSH 방식으로 증폭시킨 산물을 클로닝하지 않고 직접적으로 마이클로어레이에 스포팅한 후, 타겟 균주의 추출한 DNA를 라벨링하여 마이크로어레이에 하이브리드화하였다. 도 3에서와 같이 각각의 게놈이 실제 어레이 상에서 교차 하이브리드화 없이, 라벨링이 된 타겟에 상응하는 DNA만이 SSH 게놈 마이크로어레이 슬라이드 상에서 강한 시그널을 나타내었다. 또한, 서로 다른 3개 (S. choleraesuis subsp. indica, houtenae, 및 diarizonae) 의 게놈을 한 종당 500ng 섞어 라벨링하여 SSH 게놈 microarray 로 확인한 결과도 마찬 가지로 교차 하이브리드화 없이 각각 상응하는 DNA 스팟에서만 강한 시그널을 나타냈다(도 3에서의 3 mix). 즉, 본 발명의 SSH 방식으로 제작된 마이크로어레이 프로브는 종 수준 이하의 미생물에게 특이적으로 작용함을 나타낸다. 이와는 반대로 기존에 개발된 미생물 게놈을 그대로 마이크로어레이 프로브로 사용할 경우(GPM방식, Genome Probing Microarray), 아종 사이의 교차 혼성화 범위가 1-92% 였다. 이러한 결과로 미루어 보아, GPM은 미생물의 종 수준에서 특이적으로 반응하나 종 수준 이하에서는 구분능력이 떨어지고, 본 발명의 SSH 방식으로 증폭된 유전자를 프로브로 사용한 마이크로어레이 방식은 종 수준 이하의 아종에서 특이적으로 작용함을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 살모넬라 속 에 속한 종들간의 계통발생학적 분석
본 발명에 사용되는 표 1의 살모넬라 속에 속한 종들간의 계통발생학적 분석을 위해, 각 균주들은 윤 등이 발표한 것에 따라 두개의 일반적인 프라이머(universal primer)를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭하였고, 역시 윤 등에 따라 증폭된 16S rDNA를 시퀀싱하였다. 이것을 Clustal X program을 이용하여 정렬하였다. Jukes와 Cantor의 방법에 따라 진화상의 거리 (distanceswere)가 계산되어졌다. 계통발생학적인 트리(tree)는 MEGA 2 Program 의 네이버-조이닝 방법(neighbor-joining method,)에 의해 형성화 되었다. 유사성의 비교를 위해 16S rRNA 의 이체 동형 행렬(homology matrix)을 Clustal W program을 기초로 한 PairProWin.exe (http://microarray.kaist.ac.kr)에 의해 만들었다. 이 소프트에어를 사용하여 16S rRNA 염기서열의 FASTA 포맷으로부터 Excel (Microsoft) 포맷의 테이블들이 제작되었다. 분석 결과는 도 1에서 나타내었다.
실시예 2: 균주들의 DNA 추출
표 1의 균주, Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp. indica, S. enteritidis, S. typhimurium , S. bongori 및 E. coli 를 KCTC, DSMZ 또는 ATCC에서 분양받았다. 모든 균주들은 각 분양 기관에서 보내준 성장 조건 방식을 따랐다. 분양받은 균주를 배양하는데 최고의 성장률을 보일 때 수확하고, 사용하고 남은 세포는 -80℃ 에 보관하였다. 이전에 설명한 비드-비팅(bead-beating)방법으로 게놈 DNA를 추출하였다(Yeates et al., 1998). 모든 DNA 샘플은 RNase A(Sigma, St. Louis, MO)를 처리하여 절단하여 사용하며, 본격적인 SSH의 실험 이전에 아가로즈 겔에서 DNA의 상태를 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 확인하는 단계를 거쳤다. 추출한 DNA의 농도는 분광광도계(spectrophotometer(Nanodrop Technologies, Rockland, DE))를 이용하여 측정하였다.
실시예 3: SSH 방식에 의한 증폭
S. choleraesuis subsp. choleraesuis 를 SSH의 드라이버로, 다른 8개의 균주들을 SSH의 테스터로 이용하였다. SSH를 수행하기 위해 S. choleraesuis subsp. choleraesuis, S. typhimurium 의 16S rRNA 염기서열 부분 중 알려진 유전자에 관한 정보가 많거나, 각 종의 유사한 부분을 취하여 한 종을 드라이버로 선정하였다. 테스터와 드라이버 샘플을 각각의 단편의 길이가 유사하도록 Rsa I 제한효소로 잘라주었다. 잘린 DNA가 100~1500bp 정도가 되었음을 아가로즈 겔 상에서 에티디움 브로마이드로 염색화여 확인하였다(도 2a). PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit (Clontech)의 절차를 따라 수행하였다. 매뉴얼에 따라 Clontech kit을 사용하여 라이게이션시키고, 이 수행에 따른 효율 분석 역시 매뉴얼의 bacterial 1088r primer로 확인하였다. 테스터-특이적 단편(tester-specific fragment)의 PCR 수행은 테스터의 한 쪽 끝에 연결할 어덥터(adaptor)의 염기서열을 프라이머로 사용하여 증폭시켰다. The AccuPower PCR PreMix(Bioneer, Korea)과 Peltier Thermal Cycler(DNA Engine DYAD, MJ Research)을 이용하여 첫 번째와 두 번째 PCR 증폭을 수행하였다. 두 번의 PCR 과정은 Clontech kit 의 매뉴얼에서 추천하는 프라이머이며, 시료(template) 의 농도에 따라야 하며 최종 볼륨의 농도가 50 ㎕가 되게 조절하였다. 처음의 PCR 사이클링 조건은 94℃에서 5분 인큐베이션 후, 94℃ 10초, 66℃ 30 초, 72℃ 1.5 분으로 30 사이클링하였다. 두 번째 PCR 조건에서 다른 조건은 같고 어닐링 온도만 68℃로 하였다. 첫 번째 PCR 반응 후의 결과를 나타내는 도 2c에서 보는 바와 같이 전체적으로 증폭산물의 강도(intensity)와 크기(size)는 비슷함을 알 수 있다. 두 번째 PCR 반응 후의 결과를 나타내는 도 2d에서는 테스터에 따라 밴드의 강도와 크기가 유동적임을 확인하였다. 즉, 각 미생물의 특이적인 부분들의 패턴이 각각 다름을 나타내었다. PCR 산물을 5배(250 ㎕)로 만들어 the AccuPrepPCR Purification Kit (Bioneer, Korea) 을 이용하여 정제 (purify) 하여 사용하였다.
실시예 4: 마이크로어레이 제작, 라벨링 및 하이브리드화.
각 균주에서 추출한 DNA와 SSH 방식으로 특이적 증폭을 시킨 유전자를 최종 농도 400 ng/ul가 되게 0.1X TE 버퍼로 희석시켰다. 프로브로 사용하기 위한 DNA들을 5ul 씩을 덜어 384-웰 마이크로플레이트에 각각 분주하고, 동량의 2X 마이크로어레이 스포팅 용액(ArrayItTM, Telechem International, Inc., Sunnyvale, CA)을 첨가하여 잘 섞이도록 한 뒤 프린팅을 하였다. 프로브 세트는 한 슬라이드에 같은 배열로 4세트가 프린팅 되게 하였다. 슬라이드 위의 게놈 DNA가 프린팅 되어진 정확한 위치에 관한 자세한 것은 표 1에서 설명한 바와 같다. 더 단단한 DNA 결합을 위해 마이크로어레이를 120mJ 의 UV를 통해 크로스 링킹(cross-linking)한 후, 슬라이드를 1-메틸-2-피롤리디논(1-methyl-2-pyrrolidinone) 240ml과 1M 붕산 10.7ml 혼합액에 용해된 0.17M 숙신산 무수물(succinic anhydride)에 반응시켜 DNA가 붙지 않은 남은 잔기를 비활성화 시켰다. 비활성화 직후, DNA는 2분간 끓여 변성시켰고, 95% 차가운 에탄올에 잠깐 담근 뒤 실온의 공기 중에 말린 뒤 어두운 곳에서 보관하였다.
타겟 균주의 추출된 DNA는 2.5 mM Cy5 dCTP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)이라는 형광 색소 시약을 이용하여 BioPrime DNA Labeling System의 사용 방법에 37℃에서 3시간 동안 반응하여 라벨링하였다. QIAquick PCR purification column(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 라벨링 된 타겟 DNA를 정제하여 사용하고, Speedvac으로 완전히 말려 농축을 시킨 후, 4.35ul의 증류수로 재현탁하여 하이브리드화 반응을 수행하였다. 모든 마이크로어레이의 하이브리드화 반응은 통계 분석 시 용이하게 하기 위해 3배수 (triplicate)로 수행하여 분석하였다(각 프로브당 총 12배). 하이브리드화 반응 후에 각각의 마이크로어레이의 슬라이드는 각각 꺼내어 용액 1(1SSC 및 0.2% SDS)에서 세척하면서 커버 슬립(cover slip)을 떼어준다. 슬라이드는 세척액 1, 세척액 2 (0.1x SSC and 0.2% SDS) 그리고 세척액 3 (0.1x SSC)에서 각각 5분씩 순서대로 옮겨가면서 세척하고 원심분리기를 이용하여 슬라이드의 수분을 말려 주었다.
실시예 5: 마이크로어레이 스캐닝과 데이터 분석
반응이 끝난 마이크로어레이를 스캐닝 하기 위해 GenePix 4000B microarray scanner set(Axon instruments, Union City,CA)을 사용되었다. 모든 하이브리드화된 슬라이드의 일관된 스캐닝을 위해 레이저 파워와 photomultiplier tube(PMT)의 게인(gain)은 모두 100%에서 이루어졌다. 스캐닝된 이미지는 16비트 티프(TIFF) 파일로 저장되었고, 각각의 하이브리드화된 스팟의 픽셀 강도(pixel density (intensity))는 제네픽스 (GenePix) 소프트에어 4.1(Axon instruments)을 통해 정량화함으로서 측정되었다. 여기서 나타내는 하이브리드화 된 결과의 시각적인 표시는 대표화된 이미지로 사용한 소프트웨어로 인해 자동적으로 대조 조정이 가능하다. 어레이(array) 상의 각 DNA 스팟 장소의 위치를 정의하고 있는 개개의 원의 격자는 정량화되어 형광성 스팟의 이미지로 나타내게 된다. 신호 강도의 의미는 각각의 스팟을 위해 자동적으로 결정되어 진다. 부분적인 배경신호(local background signal)는 각각의 스팟에서의 하이브리드화 신호(hybridization signal)에서 자동적으로 감하였다. 각 스팟의 SNR( signal-to-noise ratio) 값은 아래 공식에 따라 계산되었다.
Signal Intensity: 각 스팟의 빛의 세기
Background Intensity: 배경에서 나오는 빛의 세기
Standard Deviation of Background: 배경에서 발산되는 빛 세기의 표준편차
"배경 (Background) 측정은 부분적인 스팟 배경의 강도를 참조하였다. 그리고 "배경의 표준 편차 (Standard Deviation of Background)"는 GenePix software를 이용하여 모든 픽셀을 통해 계산되었다. 통계분석은 Excel 2003(Microsoft)과 Sigmaplot 8.0(Jandel Scientific, San Rafael, CA)을 이용하여 수행되었다.
수행한 결과 도 3에서 보는 바와 같이 S. choleraesuis subsp. indica, S. choleraesuis subsp. salamae, Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, S. typhimurium, S. bongori, S. enteritidis, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae 및 S. choleraesuis subsp. houtenae 각각의 게놈이 실제 어레이 상에서 교차-하이브리드화 없이, 라벨링이 된 타겟에 상응하는 DNA만이 SSH 게놈 마이크로어레이 슬라이드 상에서 강한 시그널을 나타내고 있다. 마지막의 슬라이드는 서로 다른 3개 (S. choleraesuis subsp. indica, houtenae, and diarizonae) 의 게놈을 한 종당 500ng 섞어 라벨링 하여 SSH 게놈 마이크로어레이로 본 결과로, 이것 역시 교차-하이브리드화 없이 타겟에 상응하는 DNA 스팟에서만 강한 시그널을 나타냈다(도 3의 3 mix).
본 발명의 SSH 방식으로 증폭된 유전자를 프로브로 이용한 마이크로어레이는 종 뿐만 아니라 종 수준 이하의 특징적인 병원성 미생물을 분류 검출할 수 있다. 또한, SSH 방식으로 증폭한 산물을 프로브로 사용하기 위해 별도의 클로닝 단계를 거치지 않고 직접적으로 프린팅하여 마이크로어레이를 제작함으로써, 보다 간편하게 분류 검출할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이로 유전자들의 유사도가 높은 병원성 미생물인 살모넬라 속의 종 또는 아종을 분류 검출하는데 성공하였고, 이는 환경 미생물학 뿐 아니라, 임상 적용시에도 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (4)
- (a) 병원성 미생물의 유전자를 SSH (suppression subtractive hybridization) 방식으로 증폭시키는 단계; (b) SSH 산물을 프린팅하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; 및 (c) 표지화된 시료를 마이크로어레이에 하이브리드화하여 시그날을 검출하는 단계를 포함하되, 단계 (a)에서 획득한 SSH 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접 마이크로어레이에 프린팅함을 특징으로 하는, 병원성 미생물의 종 또는 아종을 분류검출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 병원성 미생물이 살모넬라임을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 살모넬라가 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis , S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp.indica, S. enteritidis, S. typhimurium, 또는 S. bongori 인 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, S. choleraesuis subsp.indica, S. enteritidis, S. typhimurium, 또는 S. bongori 를 테스터로서, 그리고 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis를 드라이버로 사용하여 SSH 방식으로 증폭시키는 단계; (b) SSH 산물을 프린팅하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; 및 (c) 표지화된 시료를 마이크로어레이에 하이브리드화하여 시그날을 검출하는 단계를 포함하되, 단계 (a)에서 획득한 SSH 산물을 클로닝하여 분리하지 않고 직접적 마이크로어레이에 프린팅함을 특징으로 하는, 살모넬라의 종 또는 아종을 분류검출하는 방법.
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