KR101423303B1 - 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101423303B1
KR101423303B1 KR1020110123936A KR20110123936A KR101423303B1 KR 101423303 B1 KR101423303 B1 KR 101423303B1 KR 1020110123936 A KR1020110123936 A KR 1020110123936A KR 20110123936 A KR20110123936 A KR 20110123936A KR 101423303 B1 KR101423303 B1 KR 101423303B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
dna
artificial sequence
gene
norovirus
Prior art date
Application number
KR1020110123936A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130058105A (ko
Inventor
안동준
정우석
정혜영
주후돈
김준배
유은정
김은미
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020110123936A priority Critical patent/KR101423303B1/ko
Publication of KR20130058105A publication Critical patent/KR20130058105A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101423303B1 publication Critical patent/KR101423303B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 송아지설사에 주로 문제시 되고 있는 소설사병 바이러스 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 유전자 진단을 위한 프로브, 유전자칩, 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 병원체 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 여러 단계를 거쳐야 하는 종래의 검사 방법과 달리 한번의 검사로 신속하게 신생우 설사병을 유발하는 주요 바이러스 원인체 및 유전형을 검사 할 수 있다.

Description

소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법{Probe and primer for gene diagnosis of NDC viral pathogens, and method of diagnosis using the same}
본 발명은 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)과 유전자 칩을 이용하여 송아지 설사병을 유발하는 주요 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스를 동시에 검사하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 설사병을 유발하는 바이러스성 원인체 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스를 동시에 효과적으로 검출할 수 있는 특이 프로브(probe), 프라이머(primer) 및 이를 이용한 설사 유발 바이러스들을 동시에 감별검사 할 수 있는 유전자칩과 유전자 진단키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
송아지설사병 (Neonatal Calf Diarrhea, NCD)은 전 세계적으로 널리 분포된 질병으로서 소에서 가장 높은 폐사율과 경제적 피해를 주는 질병이다. 폐사하지 않고 회복한 우군은 증체율 감소, 영구발육저지 등이 나타난다. 송아지 설사병은 원인에 따라 바이러스성(로타바이러스, 코로나바이러스), 세균성(대장균, 살모넬라균), 원충성(콕시듐, 크립토스포리듐), 식이성으로 분류할 수 있어 어떠한 원인에 의해 발병한 송아지 설사병은 조기에 발견이 되지 않고 만성화되어 치료가 힘든 설사병에 빠져 저영양상태에 이르게 된다. 최근에는 인수공통 전염병의 원인체인 노로바이러스가 사람과 동물에 장염을 유발하여 설사를 일으키는 신종 질병으로 보고된 바 있다.
송아지 설사병의 원인체에 따라 발병시기, 임상증상, 변(색, 냄새, 딱딱함, 혈액이나 점액의 혼재여무 등)에 따라 다르다. 비육용 송아지의 출생부터 20일령까지 폐사의 주된 원인은 장관독소원성 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli), 로타바이러스(Rotavirus) 및 코로나바이러스(Coronavirus) 등에 의한 급성 설사증이다. 역학적 조사에 의하면 출생 송아지의 30~50%가 이들 병원체에 감염되며, 폐사율은 10~30% 수준으로 사양관리 정도에 따라 차이가 많다. 이들 질병은 항생물질 등에 의한 치료효과가 없고 급속하게 진행됨으로써 농가에 주는 피해는 대단히 크다. 또한 어린 송아지 때 이러한 질병으로 성장발육이 지연되면 고급육 생산에도 많은 차질이 생기므로 송아지를 건강하게 육성시키는 것은 경쟁력을 높이는데도 대단히 중요한 일이다.
송아지 설사에 의해 발생하는 손실은 폐사에 의한 손실(심한 경우 50%), 치료비나 간호 노력비 지출로 생산비 증가, 발육지연으로 송아지 판매가격하락, 비육시 발육지연, 비육말기에 지방침착 불량 등 계산하기 힘들 정도이다. 일본에서 보고한 바에 의하면 10일간 설사를 하면 두당 4-5만엔(40-50만원)의 손실이 있다는 보고가 있다. 발육지연의 구체적인 예로 14일 이상 설사한 송아지는 9 개월령때 정상 송아지와 비교하여 1 개월분(웅축: 33kg, 자축: 17kg)의 발육지연이 나타난다는 보고도 있다. 또한 미국에서는 송아지 설사병으로 3억불의 경제적 피해와 전체 25%의 폐사피해를 보고하기도 하였다.
설사병의 원인체 검사는 주로 감염된 개체의 장조직을 면역 염색하여 검사하는 방법, 원인체 분리법과 PCR 또는 RT-PCR을 통하여 유전자를 확인하고 유전자염기서열 분석이나 RFLP, RNA 타이핑(typing)을 사용하여 병원체의 종류를 감별검사 할 수 있다. 그러나 이들 유전형 검사기술은 매우 복잡하여 비용이 많이 수반되고 검사시간 또한 3-10일이 소요되어 실험실 검사법으로는 적합하지 않다. 그러나 최근에는 원인체의 유전형이나 혈청형의 검사는 질병을 예방하고 예찰기술을 확립하는데 필수적이라 할 수 있다. 또한 송아지 설사병은 복합감염이 많으므로 동시에 다수의 병원체를 동시에 검사하면서 유전형이나 혈청형을 직접 타이핑할 수 있는 기술은 질병의 예방에 필요한 많은 정보를 제공할 수 있을 것이다.
로타바이러스는 레오바이러스과(Reoviridae)에 속하는 이중가닥 RNA바이러스로 내부캡시드 단백질(inner capsid protein)을 발현하는 VP6유전자에 따라 A, B, C 형으로 구분되는 것으로 보고되어 있으며, 사람, 소, 돼지에서는 주로 A 형이 발견되고 있다.
노로바이러스는 칼리시바이러스과(caliciviridae)에 속하는 이중가닥 RNA바이러스로 RNA의존성 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase protein)을 발현하는 ORF1유전자 영역을 기준으로 그룹 I, II 및 III(GI, GII 및 GIII)로 구분될 수 있다. 그룹 I 및II의 경우는 주로 사람에서 발견되고, 각각 8개와 17개의 아형(subtype)으로 다시 분류되며,그룹 III의 경우는 소에서 발견되고, 2개의 아형으로 다시 구분된다.
코로나바이러스는 코로나바이러스과(coronaviridae)에 속하는 단일가닥 RNA 바이러스로 주요 단백질로 스파이크(spike), 엔밸로프(envelope), 멤브레인(membrane), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 가진다. 코로나바이러스의 경우는 스파이크 유전자를 기준으로 3개의 그룹으로 분리할 수 있으며, 무독성을 나타내는 L9 과 메부스 스트레인(Mebus strain)은 그룹 III 에 속하고, 그 외 대부분의 스트레인들은 설사, 장염, 호흡기에 감염하여 병증을 나타낸다. 또한 국내에서 주로 발견되는 스트레인들은 그룹 I에 속한다.
소설사병의 원인체 검사는 주로 감염된 개체의 장조직을 면역 염색하여 검사하는 방법, 원인체 분리법과 PCR 또는 RT-PCR을 통하여 유전자를 확인하고 유전자염기서열 분석이나 RFLP, RNA 타이핑을 사용하여 병원체의 종류를 감별검사 할 수 있다. 그러나 이들 유전형 검사기술은 매우 복잡하고, 고비용이 수반되며 검사시간 또한 3-10일이 소요되어 실험실 검사법으로는 많은 애로사항을 가지고 있다. 최근에는 원인체의 유전형이나 혈청형의 검사는 질병을 예방하고 예찰 기술을 확립하는데 필수적이라 할 수 있다. 또한 소설사병은 복합감염이 많으므로 동시에 다수의 병원체를 동시에 검사하면서 유전형이나 혈청형을 직접 타이핑할 수 있는 기술은 질병의 예방에 필요한 많은 정보를 제공할 수 있을 것이다.
최근의 생물공학 기술은 마이크로어레이(Microarray)를 이용한 바이오칩 기술, 시료처리에서 분석까지를 담을 수 있는 랩-온-칩(Lab-on-chip) 등과 바이오센서 기술 등 여러 가지 혁신적 기술들을 제공해오고 있는데 그 중 괄목할 만한 기술적 진보가 있었던 것은 바이오칩 기술이라 할 수 있다. 유전자 칩 기술은 약물 관련 유전자 탐색 및 기타 유용 유전자의 대량 스크린에 활용되어 생체의 유전자 정보 대량 검출용으로 사용되어 왔으며 최근에는 암 관련 바이러스 조기검출 및 사스바이러스 검색 등 질병 조기진단 기술로 개발되고 있으며, 대표적인 상용화 유전자칩으로 KFDA(식품의약품안정청)의 승인을 받은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 유전자칩을 들 수 있다(대한민국특허등록 제0382703호 및 제0437626호). 이런 유전자 칩을 만드는 방법은 아민기와 알데히드작용기의 화학결합을 이용한 방법과 스트렙토에버딘-바이오틴(streptavidin-biodin)의 결합방식(Science, 1993년 vol.262, p1706-1708)을 응용한 기술이 가장 널리 사용되고 있는데 고정화 밀도의 균일성 및 프로브 간 공간확보 조절이 힘들어 제조 시 재현성의 문제점을 가지고 있다.
최근 이런 문제점을 해결하고자 구아닌 분자를 인식할 수 있는 링커를 개발하여 이를 표면에 고정화 시켜 연속된 구아닌을 선택적으로 고정화할 수 있는 유전자칩 제작기술이 개발되었고, 이 방법은 프로브간 거리를 일정하게 유지시켜 반응 감도 및 재현성을 향상시킨 새로운 기술이다(대한민국특허등록 제0748082호 및 제0883763호).
상기와 같이, 소설사병원인체를 검사하기 위한 특허 기술로는 반추류의 설사유발 바이러스 동시검출법(대한민국특허출원번호 제2008-0116959호)등이 있으나, 본원의 소설사병을 동시에 진단하는 유전자칩은 없었으며, 로타바이러스와 노로바이러스 경우는 인수공통전염병으로 주로 감염되는 바이러스 아형이 다양한데, 기존 특허는 소를 포함한 반추동물에 해당하는 바이러스 아형에 대해서만 검사가 가능하고 각 유전형에 대해서는 검사가 불가능한 문제점을 가지고 있다. 또한, 유전형을 검사하기 위해서는 유전자 염기서열 등을 시행하여야 하는데 이는 진단하는데 시간과 비용이 많이 소모되는 문제점이 있었다.
따라서, 소에서 가장 높은 폐사율과 경제적 피해를 주는 소모성 질병 중 설사를 일으키는 바이러스성 원인체를 동시에 진단하고, 상기 원인체의 유전형을 함께 검사할 수 있는 효율적인 진단 방법 등이 요구되는 실정이다.
본 발명은 상기와 같이 소설사병 원인체를 진단함에 있어 상존해 있던 문제점 및 요구사항을 해결하기 위한 것으로서, 소 설사병을 일으키는 대표적인 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 유전자를 일반적인 중합효소연쇄반응에 의해 증폭하고 증폭된 유전자에서 상기 원인체에 대하여 생화학적 검사, 염기서열분석 등 복잡다단한 검사 없이 직접 증폭된 유전자의 염기서열과 교잡반응하여 병원체의 타입을 확인할 수 있는 유전자 프로브(probe)를 고안하고 이를 이용한 유전자칩을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 사용하여 유전형 또는 혈청형을 포함하는 병원체 타입을 쉽고 빠르게 그리고 동시에 검사할 수 있는 진단키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 개발된 유전자프로브 고정화 기술을 사용하여 송아지 설사병의 주요 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 병원체 타입을 결정할 수 있는 유전자 프로브를 제공한다.
본 발명은 상기 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 특정 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 13 내지 91 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 제공한다.
본 발명은 상기 프로브를 하나 이상 포함하는 유전자칩을 제공한다.
본 발명은 상기 유전자칩을 포함하는 유전자 진단키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 12 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 유전자 증폭방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 유전자 칩기술을 사용하여 송아지설사병의 주요 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스의 유전자를 탐지하기 위한 프로브를 포함하는 유전자칩, 유전자키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공함으로써, 송아지 설사병의 주요 바이러스성 원인체의 양성유무 및 유전형 분석을 동시에 검사할 수 있게 되어, 종래 개별 병원체에 대해 검사하거나 유전자염기서열분석을 통하여 유전형을 검사하는 방법에 비해 검사 시간과 비용을 현격하게 줄이고, 보다 효율적으로 진단할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명에서 사용한 프로브의 설계 모형도이다.
도 2는 본 발명에서 설계한 프로브를 구아닌 인식용 유리슬라이드에 집적화 시킨 프로브 서열번호와 위치를 나타낸 프로브 지도이다(NCD DNA Chip Map).
도 3은 로타바이러스 A와 C 그리고 음성시료 6종을 이용하여 복합역전사중합반응을 시행한 뒤 전기영동을 시행한 사진이다.
도 4는 노로바이러스 그룹 II와 음성시료 7종을 이용하여 복합역전사중합반응을 시행한 뒤 전기영동을 시행한 사진이다.
도 5는 코로나바이러스와 음성시료 6종을 이용하여 역전사중합반응을 시행한 뒤 전기영동을 시행한 사진이다.
도 6은 50ul의 교잡반응이 가능한 교잡반응실(hybridization reaction chamber)고무웰플레이트가 부착된 NCD Chip의 사진이다.
도 7은 로타바이러스의 NCD chip 결과를 나타낸 표이다.
도 8은 노로바이러스의 NCD chip 결과를 나타낸 표이다.
도 9는 코로나바이러스의 NCD chip 결과를 나타낸 표이다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
1.유전자증폭용 프라이머 및 증폭단계
본 발명은 소설사병 원인체 바이러스의 유전자를 증폭할 수 있는 표 1의 서열번호 1 내지 12의 프라이머 유전자염기서열을 제공한다. 이 프라이머 또는 이들의 조합을 이용하여 로타바이러스 3개의 혈청형, 노로바이러스 3가지 유전형그룹, 코로나바이러스에 대해 유전자를 증폭을 실시할 수 있다.
로타바이러스, 노로바이러스, 코로나바이러스 검출용 프라이머 서열
서열번호 명칭 바이러스 염기서열(5`→3`)
1 RotaA_F Rota GAAAGATTTAGTTTTCCAAGAG
2 RotaA_R GGTCACATCCTCTCACTAC
3 RotaB_F AGCATGGATCTAATCGAAAC
4 RotaB_R CTTTATTACCTGACCACCTACC
5 RotaC_F ATGATTAGACCAGCTGCTATG
6 RotaC_R TACATTACCATTCTCTTCAC
7 Noro-F Noro TTCTCTTTCTATGGTGATGATG
8 NoroI-R TAGACGCCATCATCATTTAC
9 NoroII-R TCGACGCCATCTTCATTCAC
10 NoroIII-R TGTCAGTCATCTTCATTTAC
11 CoronaF Corona GTAGGAAGGTTGACCTACAAT
12 CoronaR GCAGGACAAGTGCCTATACC
표 1에서 서열번호 1 내지 6은 로타바이러스 유전자 증폭용 특이 프라이머로 유전자 증폭을 함으로써 로타바이러스 A형에 대해서는 646bp, B형에 대해 571bp, C형에 대해 311bp의 증폭크기를 동시에 확인할 수 있으므로, 로타바이러스 A, B, C형의 동시 검사가 가능하다. 서열번호 7 내지 10은 노로바이러스 유전자 증폭용 특이 프라이머로 유전자 증폭결과 노로바이러스 3가지 그룹 I, II, III에 대해 518bp의 증폭크기를 확인할 수 있으며, 서열번호 11 및 12는 코로나바이러스의 유전자 증폭용 특이 프라이머로서 유전자 증폭결과 352bp의 증폭크기를 확인할 수 있다. 사용한 프라이머는 유전자칩에서 검출할 수 있도록 프라이머의 5`에 Cy3 혹은 Cy5등의 형광물질을 부착하여 사용한다.
2.병원체 검사용 유전자 프로브
본 발명은 각 원인체의 유전형 결정이 가능하도록 설계된 표 2 및 표 3의 서열번호 13 내지 87의 특이 유전자 프로브를 제공한다. 이들 유전자 프로브는 상기 증폭된 유전자와 상보적으로 교잡반응한다. 교잡반응 여부에 따라 각 병원체의 타입을 결정할 수 있다.
로타바이러스, 노로바이러스 검출용 프로브 서열
서열번호 target type 염기서열 (5`~3`)
13 rotavirus A ATTGAATCTGCAGTTTGTGAATC
14 GGTATTCGCTACACAGAGTAATC
15 GTAAGGATGCGTCTAGGTATTCGC
16 CTGTTTGAACTCTGTAAGTAAGG
17 GTAGCTACGTAAAGCTGTTTGAAC
18 ACTTTGGTGAGTTTGTAGCTACG
19 GTCAAATGAGGACCAAGCTAACC
20 CTTGCAGCGTGTCTTTACAGTGG
21 CAAGGGAGGATAACTTGCAGCG
22 B GAGCAAGTGGTTGTGAGACAACC
23 AACTGAAAAGTTTGGTTTCTGAC
24 TTAGAGCAGCTATTGGTAGGTGG
25 CTTAATGGTGGCAACATTAGAGC
26 AGACAACCAGCTAGTCTTAATGG
27 GTTGGTTGGTATCATTGAGCAAG
28 ACTGAAAATCCTTTGTTGGTTGG
29 TCAGCCAGAGGTGGTAGAAACTG
30 CTGCAGACACTGCACTTATTCAG
31 CGCAAATTTTGCTGCTGCAGAC
32 C GTTGCTAGTTGCATCCGTGAAGAG
33 GGATAATTTGGAAAGATTGTTGC
34 GGTCGCTCAAGAGGATAATTTGG
35 GTTGTCCAACTACACGGTCGCTC
36 CCATGGGAACAGACGTTGTCCAAC
37 CCAACCAGGATTTCCATGGGAAC
38 GCTGGAACGGTTTTCCAACCAGG
39 GATTCAGCGATGCCAGCTGGAAC
40 norovirus GI TCTTAAGGAGGACAATCTCA
41 GCCCGAATTCGTAAATGATGA
42 CGCTTCCATGATCTCGGATTGTG
43 GTTCCGCTGGATGCGCTTCCATG
44 CTATGTTCCGCTGGATGCGCTTC
45 GGAAATGTATGTGCCAGGCTGGC
46 AGTCATACAGGAGATAAAGACTG
47 ATGGTGAGAAGTTTTATAGGAAA
48 GCGAGGCTTCCCTTCATGGTGAG
로타바이러스, 노로바이러스, 코로나바이러스 검출용 프로브 서열
서열번호 target type 염기서열 (5`~3`)
49 norovirus GII AGATCTGAGCACGTGGGAGGGCG
50 GGAGGGCGATCGCAATCTGGCTC
51 TCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATG
52 GAGCCAATGTTCAGATGGATGAG
53 ACGTGCCCAGGCAAGAGCCAATG
54 GTGGTATGGATTTTTACGTGCCC
55 GCAGAGCTAAAAGAAGGTGGTATG
56 CAGCAAATTAGTCATTGCAGAGC
57 CTACAGTAAAATCAGCAAATTAG
58 CTCCACGGCCCAACATTCTACAG
59 GIII CGTTTTCATGATTTGTCGCTGTG
60 TCGCGACATCCTCCCCGATTTTG
61 CCATGTTTGCCTGGATGCGTTTTC
62 TTTACCTTCTTTCCGCTCCATGTTTG
63 GGAATGGAGATTTTTGTACCTTC
64 CGAAGCCCGCAGCGGCGGAATGG
65 CGCTGGTGACCGCCGAAGCCCGC
66 CGCCGCGTTGGCTCGCTGGTGAC
67 GGAAAAGTTCTACCGCCGCGTTG
68 GTTTGCTTGGATGAGATTTCATG
69 CCATGTTTGCTTGGATGAGATTTC
70 AGGTAGTCGCGACACCCTTCCCG
71 GTCATTGTGGGAAGGTAGTCGCG
72 GAGATTTCATGATTTGTCATTGTG
73 CCATCGCACCGCTCCATGTTTGC
74 GGCCAAGGAAGGGGGAATGGAG
75 CCATGGTCACTGCAGAGGCCAAG
76 CGCCGGGTGAGCTCCATGGTCAC
77 CGGTGAGAAATTTTATCGCCGGG
78 coronavirus - CTGGTTATAAAAATAGTGGTATAG
79 CCTGGTATAGATGCTGGTTATAA
80 TGTGTAGGTAATGGTCCTGGTATAG
81 TGGATGGGTCTTTGTGTGTAGG
82 AATTTCTGTCCGTGTAAATTGGATG
83 TGCTCCCACAAATTTCTGTCCGTG
84 CACAACATTGTTTTAAAGCTCCC
85 AGCCTCAACCTGTAGGTGTTTTTAC
86 GGGGGGGGGACAATCTGTTTTTAAGCCTCAAC
87 CTTGGAATAGGAGATTTGGTTTTAC
88 rota-HC A GTAGTGAGAGGATGTGACC
89 noro-HC II GTGAATGAAGATGGCGTCGA
90 corona-HC - GGTATAGGCACTTGTCCTGC
91 NC - TCTGCTGCTCGTCGTCGTCAT
표 2 및 표 3에서 서열번호 13 내지 87은 각 원인체에 특이적으로 반응하는 유전자 프로브의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 13 내지 39는 로타바이러스의 양성 및 A, B, C 형의 혈청형을 탐지하는 프로브이며, 서열번호 40 내지 77은 노로바이러스의 양성 및 3가지 그룹 I, II, III(GI, GII, GIII)를 탐지하는 프로브이고, 서열번호 78 내지 87은 코로나바이러스와 반응하여 코로나바이러스의 양성 및 변이유형을 탐지하는 프로브이다. 또한 서열번호 88 내지 90은 칩과의 반응 유무를 확인하기 위한 교잡반응용 양성대조프로브이며, 서열번호 91은 음성대조프로브이다.
3. 유전자칩의 프로브맵
본 발명은 상기 표 2 및 표 3의 프로브를 하나 이상 포함하여 일정한 위치에 고정화한 유전자칩을 제공한다. 상기 유전자칩의 복수 원인체를 탐지할 수 있다.
상기 유전자칩은 상기 표 2 및 표 3의 서열번호 13 내지 91중에서 선택된 적어도 하나 이상의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.
4. 진단키트
유전자의 증폭을 위한 유전자 증폭시약과 증폭된 유전자에서 원인체의 타입검사을 위한 상기 유전자칩을 포함하는 진단키트를 이용하여 소설사병 바이러스성 주요 원인체인 로타바이러스, 노로바이러스 및 코로나바이러스에 대하여 존재여부를 탐지하고 병원체의 유전형을 분석할 수 있다. 기타 증폭 및 탐지에 필요한 시약 및 효소 등이 진단키트에 포함될 수 있다.
5. 진단방법
소설사병 바이러스성원인체인 로타바이러스, 노로바이러스 및 코로나바이러스의 진단 방법은 진단개체의 원인체 유전자를 추출하는 단계; 상기 증폭시약을 이용하여 추출된 상기 진단개체의 원인체 유전자를 증폭하는 단계; 상기 유전자칩을 이용하여 상기 증폭된 유전자와의 교잡반응(hybridization)을 수행하는 단계; 및 형광신호를 분석하여 소설사병바이러스성 원인체의 존재 여부를 파악하는 단계를 포함한다.
즉, 먼저 진단개체(소)의 분변희석액으로부터 유전자를 추출하여 Cy3 또는 Cy5의 형광물질이 부착된 프라이머를 포함하는 증폭시약으로 증폭한 후, 상기 유전자칩에서 교잡반응(hybridization)을 수행한다. 상기 교잡반응의 형광신호를 분석함으로써 소설사병바이러스성 원인체의 존재 여부와 유전형을 탐지할 수 있게 된다.
본 발명의 송아지설사병의 주요 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 타입 검사를 위한 프로브, 유전자칩을 이용한 병원체 타입 검사방법은 다음과 같은 실시예를 통하여 구체화될 수 있다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예 일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 이하, 첨부된 도면 및 서열목록을 참조하여 본 발명을 설명한다.
[실시예 1]유전자 추출
로타바이러스, 노로바이러스 및 코로나바이러스에 대한 각 표준주는 ATCC사에서 구매하거나 물환경 바이러스 소재은행으로부터 유전자를 분양받아 사용하였고, 가검시료는 농장의 소분변이나 국립수의과학검역원으로부터 유전자를 분양받아 사용하였다.
RNA 추출은 분변시료를 무게비율로 10%가 되도록 PBS로 희석 후 8000rpm에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 사용하여 Qiagen RNeasy mini kit을 이용하여 제조사의 사용설명서에 따라 유전자를 추출하였다.
[실시예 2]유전자 증폭
(1)로타바이러스 A, B, C 복합역전사중합효소 연쇄반응(Rota A,B,C MP RT-PCR)
로타바이러스는 A, B, C 혈청형을 구분할 수 있는 VP6 유전자 영역에서 설계된 서열번호 1 내지 6을 이용하여 복합역전사중합효소연쇄반응을 시행하여 로타바이러스 A형에 대해서는 646bp, B형에 대해 571bp, C형에 대해 311bp의 증폭크기를 확인 할 수 있다.
복합역전사중합효소연쇄반응은 다음과 같은 방법으로 시행한다. Qiagen사의 원스톱 RT-PCR 키트를 사용하여 정해진 매뉴얼에 따라 최종부피 25ul의 반응혼합용액을 만든다. 이때 사용한 프라이머의 양은 반응용액 25ul에 각 10pmol을 사용한다. PCR 프로그램은 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 동안 각 1 사이클, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초 동안 35 사이클, 72℃에서 10분 동안 1 사이클 시행하여 유전자를 증폭한다.
증폭한 결과물은 5ul를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 섞은 뒤 1.5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma) 용액에서 15분간 염색한 후, 자외선 하에서 각 DNA의 특정길이를 확인한다(도 3 참조).
(2)노로바이러스 복합역전사중합효소 연쇄반응(Noro 그룹 I, II, III MP RT-PCR)
노로바이러스는 3가지 그룹으로 구분할 수 있는 ORF1 유전자 영역에서 설계된 서열번호 7 내지 10을 이용하여 복합역전사중합효소연쇄반응을 시행하여 노로바이러스 3가지 그룹에 대해 518bp의 증폭크기를 확인할 수 있다.
복합역전사중합효소연쇄반응은 다음과 같은 방법으로 시행한다. Qiagen사의 Onestep RT-PCR kit를 사용하여 정해진 매뉴얼에 따라 최종부피 25ul의 반응혼합용액을 만든다. 이때 사용한 프라이머의 양은 반응용액 25ul에 각 10 pmol을 사용한다. PCR 프로그램은 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 동안 각 1 사이클, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초 동안 35 사이클, 72℃에서 10분 동안 1 사이클 시행하여 유전자를 증폭한다.
증폭한 결과물은 5ul를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 섞은 뒤 1.5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma) 용액에서 15분간 염색한 후, 자외선 하에서 각 DNA의 특정길이를 확인한다(도 4 참조).
(3)코로나바이러스 역전사중합효소 연쇄반응(Corona RT-PCR)
코로나이러스는 spike 유전자 영역에서 설계된 서열번호 11 내지 12를 이용하여 역전사중합효소연쇄반응을 시행하여 코로나바이러스 352bp의 증폭크기를 확인 할 수 있다.
역전사중합효소연쇄반응은 다음과 같은 방법으로 시행한다. Qiagen사의 원스톱 RT-PCR 키트를 사용하여 정해진 매뉴얼에 따라 최종부피 25ul의 반응혼합용액을 만든다. 이때 사용한 프라이머의 양은 반응용액 25ul에 각 10pmol을 사용한다. PCR 프로그램은 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 동안 각 1 사이클, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초 동안 35 사이클, 72℃에서 10분 동안 1 사이클 시행하여 유전자를 증폭한다.
증폭한 결과물은 5ul를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 섞은 뒤 1.5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma) 용액에서 15분간 염색한 후, 자외선 하에서 각 DNA의 특정길이를 확인한다(도 5 참조).
[실시예 3]유전자칩의 제작
유전자칩 제작은 ㈜바이오메트릭스 테크놀로지의 구아닌인식용 유리슬라이드에 제조사의 제공 매뉴얼에 따라 프로브를 고정화한다.
설사병 원인체들의 프로브는 도 1에 나타난 프로브 설계 모형도와 같이 5'-끝단에 연속된 9 개의 구아닌을 합성하고(GGGGGGGGG) 여유공간 확보를 위한 3개의 염기서열(AAA or TTT) 합성한 뒤 목표유전자와 반응하는 유전자염기서열 영역을 서열번호 13 내지 91의 염기서열을 넣어 프로브를 합성하였다(도 1 참조). 참고로 위와 같은 구조 대신 반응의 차이는 있으나 유전자 서열번호에 기존의 화학결합방식을 이용하여 칩 제작이 가능하며, 프로브 구조 내 여유공간 확보를 위한 3개의 염기는 생략 가능하다.
프로브는 (주)바이오메트릭스 테크놀로지의 구아닌인식용 유리슬라이드에 제조사의 제공 매뉴얼에 따라 도 2의 NCD DNA Chip Map과 같이 고정화되었다(이하 NCD Chip이라 함). 도 2의 NCD Chip Map의 프로브 HC와 NC는 교잡반응이 정상적으로 이루어졌는지를 검정하는 프로브이다. 프로브 NC(서열번호 91)는 증폭된 유전자 염기서열을 포함하고 있지 않는 비특이적 교잡반응의 존재 여부를 확인하기 위한 것으로 항상 반응하지 않아야 하는 프로브이다. HC는 교잡 반응 시 항상 반응하는 프로브이다. 이 프로브는 정상적인 교잡반응이 이루어졌는지를 검정하는데 사용하며 아울러 유전자 칩 내 8개를 일정한 위치에 고정화하여 교잡반응 후 각 병원체별 프로브의 위치를 확인할 수 있게 한다. HC는 서열번호 88 내지 90 프로브의 혼합액으로 제작한다.
[실시예 4]유전자칩에서 유전형 검사
(1) 교잡반응(hybridization) 형광 검출
소설사병 바이러스성 주요원인체 대한 프로브가 고정화된 NCD chip에 위에서 증폭된 유전자 증폭산물과 교잡반응을 실시한다. 교잡반응실(hybridization reaction chamber)로 50ul 용량의 고무 웰 플레이트를 사용한다. 상기 고무 웰 플레이트가 부착된 NCD Chip의 사진은 도 6과 같다.
고무 웰 플레이트가 부착된 칩기판 위에 교잡용액(saline-sodium citrate:SSC, SDS, formamide) 40ul와 증폭 산물 10ul를 혼합하여 뿌려준다. 고무 웰 플레이트 위를 플레이트 실러(plate sealer)를 사용하여 밀봉하여 용액의 증발을 막은 뒤 인큐베이터 48도에서 1 시간 반응한다.
교잡반응이 끝난 후 고무 웰 플레이트와 플레이트 실러를 제거하고, 워시(Wash) 1(SSC, SDS)용액 45 ~ 25℃에서 2분간 세척 후 다시 워시 2(SSC) 용액으로 2분간 세척하여 준 뒤 칩을 건조시켜준다.
[실시예 5]유전형의 판정
건조된 NCD chip은 레이저 스캐너(laser scanner, Innopsys Innoscan 700)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation　550nm, emission 570nm). 분석한 결과는 하기 도 7 내지 9에 나타내었다.
[실시예 6]유전자칩 결과의 해석
NCD Chip의 유전자지도는 도 2와 같으며, 각 원인체에 대한 Cy5가 표지된 유전자 증폭산물을 이용하여 일정조건에서 교잡반응하고, 형광검출 스캐너를 이용하여 검출한 결과 도 7, 8 및 9에서 보는 것과 같이 각 시료의 이론값과 유전자칩에서 얻은 실험결과가 100% 일치함을 알 수 있다.
우선, 유전자칩 반응 후 HC 프로브(검정프로브)가 8 곳(spot) 모두 정상적으로 반응함을 확인 할 수 있고, 서열번호 13 ~ 87에 대한 특이 프로브로부터 각 원인체의 유전형 또는 혈청형을 확인할 수 있었다.
로타바이러스는 A, B, C 3가지 혈청형이 존재하는데 표 3에서 보는 봐와 같이 A형과 C형 로타바이러스에 대해 양성 및 혈청형이 구분되었으며 유전형을 알 수 없었던 가검시료에 대해 칩결과로부터 A형임을 확인할 수 있었다. 노로바이러스는 3가지 그룹으로 구분되는데 주로 사람에서는 GI, GII가 감염되고, GIII는 소에서 감염된다. 도 8에서 보는 바와 같이 3종의 GII 시료에 대해 유전자칩으로 모두 GII임을 확인할 수 있었으며, GIII 시료 2종에 대해 모두 GIII임을 확인할 수 있었다. 코로나바이러스는 변이가 많지 않은 바이러스로 알려져있는데 L9 표준주와 가검시료 4종을 포함하여 모두 유전자칩에서 양성확인 하였으며 검사결과 모두 같은 결과를 확인할 수 있었다
본 발명은 유전자 칩기술을 사용하여 송아지설사병의 주요 바이러스성 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 유전자를 동시에 탐지하기 위한 프로브를 포함하는 유전자칩, 유전자키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 이로써 송아지 설사병의 주요 바이러스성 원인체의 양성 유무 및 유전형 분석을 동시에 검사할 수 있게 되어 종래 개별 병원체에 대해 검사하거나 유전자염기서열분석을 통하여 유전형을 검사하는 방법에 비해 검사 시간과 비용을 현격하게 줄이고, 보다 효율적으로 진단할 수 있게 되어 소사육 농가의 주요 바이러스성 설사병 원인체인 노로바이러스, 로타바이러스 및 코로나바이러스의 스크린검사에 유용하며, 또한 바이러스 변이 유무 등 예찰 검사 등의 진단 산업에 이용 가능하다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Animal Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency) <120> Probe and primer for gene diagnosis of NDC viral pathogens, and method of diagnosis using the same <130> YPD201110-0006 <160> 91 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Rotavirus <400> 1 gaaagattta gttttccaag ag 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Rotavirus <400> 2 ggtcacatcc tctcactac 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Rotavirus <400> 3 agcatggatc taatcgaaac 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Rotavirus <400> 4 ctttattacc tgaccaccta cc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Rotavirus <400> 5 atgattagac cagctgctat g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Rotavirus <400> 6 tacattacca ttctcttcac 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Norovirus <400> 7 ttctctttct atggtgatga tg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Norovirus <400> 8 tagacgccat catcatttac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Norovirus <400> 9 tcgacgccat cttcattcac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Norovirus <400> 10 tgtcagtcat cttcatttac 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Coronavirus <400> 11 gtaggaaggt tgacctacaa t 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Coronavirus <400> 12 gcaggacaag tgcctatacc 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 13 attgaatctg cagtttgtga atc 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 14 ggtattcgct acacagagta atc 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 15 gtaaggatgc gtctaggtat tcgc 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 16 ctgtttgaac tctgtaagta agg 23 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 17 gtagctacgt aaagctgttt gaac 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 18 actttggtga gtttgtagct acg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 19 gtcaaatgag gaccaagcta acc 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 20 cttgcagcgt gtctttacag tgg 23 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus A <400> 21 caagggagga taacttgcag cg 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 22 gagcaagtgg ttgtgagaca acc 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 23 aactgaaaag tttggtttct gac 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 24 ttagagcagc tattggtagg tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 25 cttaatggtg gcaacattag agc 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 26 agacaaccag ctagtcttaa tgg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 27 gttggttggt atcattgagc aag 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 28 actgaaaatc ctttgttggt tgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 29 tcagccagag gtggtagaaa ctg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 30 ctgcagacac tgcacttatt cag 23 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus B <400> 31 cgcaaatttt gctgctgcag ac 22 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 32 gttgctagtt gcatccgtga agag 24 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 33 ggataatttg gaaagattgt tgc 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 34 ggtcgctcaa gaggataatt tgg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 35 gttgtccaac tacacggtcg ctc 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 36 ccatgggaac agacgttgtc caac 24 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 37 ccaaccagga tttccatggg aac 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 38 gctggaacgg ttttccaacc agg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Rotavirus C <400> 39 gattcagcga tgccagctgg aac 23 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 40 tcttaaggag gacaatctca 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 41 gcccgaattc gtaaatgatg a 21 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 42 cgcttccatg atctcggatt gtg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 43 gttccgctgg atgcgcttcc atg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 44 ctatgttccg ctggatgcgc ttc 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 45 ggaaatgtat gtgccaggct ggc 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 46 agtcatacag gagataaaga ctg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 47 atggtgagaa gttttatagg aaa 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus I <400> 48 gcgaggcttc ccttcatggt gag 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 49 agatctgagc acgtgggagg gcg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 50 ggagggcgat cgcaatctgg ctc 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 51 tctggctccc agttttgtga atg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 52 gagccaatgt tcagatggat gag 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 53 acgtgcccag gcaagagcca atg 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 54 gtggtatgga tttttacgtg ccc 23 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 55 gcagagctaa aagaaggtgg tatg 24 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 56 cagcaaatta gtcattgcag agc 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 57 ctacagtaaa atcagcaaat tag 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus II <400> 58 ctccacggcc caacattcta cag 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 59 cgttttcatg atttgtcgct gtg 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 60 tcgcgacatc ctccccgatt ttg 23 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 61 ccatgtttgc ctggatgcgt tttc 24 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 62 tttaccttct ttccgctcca tgtttg 26 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 63 ggaatggaga tttttgtacc ttc 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 64 cgaagcccgc agcggcggaa tgg 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 65 cgctggtgac cgccgaagcc cgc 23 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 66 cgccgcgttg gctcgctggt gac 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 67 ggaaaagttc taccgccgcg ttg 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 68 gtttgcttgg atgagatttc atg 23 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 69 ccatgtttgc ttggatgaga tttc 24 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 70 aggtagtcgc gacacccttc ccg 23 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 71 gtcattgtgg gaaggtagtc gcg 23 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 72 gagatttcat gatttgtcat tgtg 24 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 73 ccatcgcacc gctccatgtt tgc 23 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 74 ggccaaggaa gggggaatgg ag 22 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 75 ccatggtcac tgcagaggcc aag 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 76 cgccgggtga gctccatggt cac 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Norovirus III <400> 77 cggtgagaaa ttttatcgcc ggg 23 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 78 ctggttataa aaatagtggt atag 24 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 79 cctggtatag atgctggtta taa 23 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 80 tgtgtaggta atggtcctgg tatag 25 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 81 tggatgggtc tttgtgtgta gg 22 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 82 aatttctgtc cgtgtaaatt ggatg 25 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 83 tgctcccaca aatttctgtc cgtg 24 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 84 cacaacattg ttttaaagct ccc 23 <210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 85 agcctcaacc tgtaggtgtt tttac 25 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 86 ggggggggga caatctgttt ttaagcctca ac 32 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Coronavirus <400> 87 cttggaatag gagatttggt tttac 25 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for rota-HC <400> 88 gtagtgagag gatgtgacc 19 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for noro-HC II <400> 89 gtgaatgaag atggcgtcga 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for corona-HC <400> 90 ggtataggca cttgtcctgc 20 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for NC <400> 91 tctgctgctc gtcgtcgtca t 21

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열번호 13 내지 서열번호 91로 구성되는 유전자 탐침군을 포함하는, 로타바이러스, 노로바이러스 및 코로나바이러스로 구성되는 송아지설사병 바이러스 원인체군의 동시 검사 및 감별용 유전자 칩.
  6. 제5항의 유전자 칩;
    로타바이러스에 대해서는 서열번호 1 내지 6의 프라이머, 노로바이러스에 대해서는 서열번호 7 내지 10의 프라이머, 및 코로나바이러스에 대해서는 서열번호 11 및 12의 프라이머로 구성되는 프라이머군을 포함하는, 로타바이러스, 노로바이러스 및 코로나바이러스로 구성되는 송아지설사병 바이러스 원인체군의 동시 검사 및 감별용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 로타바이러스의 양성 및 A, B, C 형을 동시에 검사하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는 노로바이러스의 양성 및 그룹 I, 그룹 II. 그룹 III를 동시에 검사하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제6항에 있어서, 상기 키트는 코로나바이러스의 양성 및 변이유형을 검사하는 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020110123936A 2011-11-25 2011-11-25 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법 KR101423303B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110123936A KR101423303B1 (ko) 2011-11-25 2011-11-25 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110123936A KR101423303B1 (ko) 2011-11-25 2011-11-25 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130058105A KR20130058105A (ko) 2013-06-04
KR101423303B1 true KR101423303B1 (ko) 2014-07-29

Family

ID=48857424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110123936A KR101423303B1 (ko) 2011-11-25 2011-11-25 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101423303B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102282884B1 (ko) * 2019-10-11 2021-07-28 전북대학교산학협력단 신생 송아지의 장내미생물총 데이터 지표를 이용한 로타바이러스 설사증 진단 방법
KR102538417B1 (ko) 2020-10-29 2023-06-01 주식회사 셀트릭스 소 설사 바이러스 결합 펩타이드 및 이를 이용한 소 설사 바이러스 검출 키트

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050239057A1 (en) * 2001-02-20 2005-10-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050239057A1 (en) * 2001-02-20 2005-10-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jan Vinje 등. Journal of Virological Methods. Vol. 116, No. 2, 페이지 109-117 (2004) *
Jan Vinje 등. Journal of Virological Methods. Vol. 116, No. 2, 페이지 109-117 (2004)*
유은아 등. 울산광역시보건환경연구원보 제5권, 페이지 362-377 (2009) *
유은아 등. 울산광역시보건환경연구원보 제5권, 페이지 362-377 (2009)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130058105A (ko) 2013-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Belák Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine
JP5317430B2 (ja) プローブセット、プローブ担体、及び真菌の判別同定方法
CN110699489B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN113249499B (zh) 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN107735500A (zh) 用于检测乳腺癌的宏基因组组合物和方法
Abdel-Alim et al. Characterization of Egyptian field strains of infectious bursal disease virus
CN101230404B (zh) 同时检测多种混合感染病毒的基因芯片
CN110592278A (zh) PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒
KR101423303B1 (ko) 소설사병 바이러스성 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 프라이머 및 이를 이용한 진단방법
CN114958975A (zh) 重组酶介导的等温核酸扩增组合产品
Lee et al. Concurrent infection of a novel genotype of hepatopancreatic parvovirus and Enterocytozoon hepatopenaei in Penaeus vannamei in Taiwan
CN106868198B (zh) 一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重pcr引物组及监测方法
KR100617951B1 (ko) 돼지 전염성 위장염，호흡기 코로나 바이러스，유행성설사바이러스 동시 감별 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한동시감별방법
CN111500774B (zh) 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒
CN114395643A (zh) 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
KR100904772B1 (ko) 유전자칩, 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법 및 그를포함하는 진단키트
KR101395938B1 (ko) 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법
KR100504763B1 (ko) 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자
CN110257560A (zh) 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用
KR100647474B1 (ko) 병원성 알엔에이 바이러스 검출방법, 및 검출키트
KR102395969B1 (ko) 코로나바이러스의 검출을 위한 루프-매개 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR100758374B1 (ko) 미생물 분류 검출 방법
RU2738901C1 (ru) Тест-система для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
KR102532166B1 (ko) 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant