KR100504763B1 - 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 - Google Patents

전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus)의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 염기서열을 갖는 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 뉴클레오캡시드 유전자는 전염성 기관지염 바이러스의 타입 결정 및 분류를 위한 분자 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자{Nucleocapsid gene of infectious bronchitis virus}
본 발명은 전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus)의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 염기서열을 갖는 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 및 상기 유전자 염기서열을 이용하여 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법에 관한 것이다.
닭의 전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus: IBV)는 단일사슬(single-stranded) 양성(positive-sense) RNA 바이러스로 코로나비리대(Coronaviridae) 과(family) 코로나바이러스(Coronavirus) 속(genus)에 속하며 분리 주에 따라 정도의 차이는 있지만 콧물, 기침, 기관지염 등의 호흡기 증상과 신장염에 의한 폐사, 산란장기 손상에 의한 산란저하 및 난질불량 등을 유발한다(Holmes, Virology 2nd ed, Raven press, New York: 841-856; King and Cavanagh, Diseases of poultry, 9th ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa:471-494; Van Roekel et al., Am J Vet Res, 1951, 12:140-146).
전염성 기관지염 바이러스는 염기서열의 치환, 결손, 첨가 외에도 다른 균주(strain)와의 유전자 재조합이 일어나 다양한 변이 주들이 유행하고 있는 것으로 알려져 있다(Lai et al., J. Virology, 1985, 56, 449-456; Keck et al., J. Virol., 1988, 62, 1810-1813; Cavanagh et al., Avian Path., 1992, 21, 401-408). 또한, 상기 바이러스는 1931년에 최초로 보고(Schalk and Hawn, J. Am Vet. Med. Assoc., 1931, 78, 413-422) 된 이후 전 세계적인 발생 양상을 보이고 있는데, 지역적으로는 미국에서 매사츄세츠(Massachusetts) 형(이하 'Mass형'이라 약칭함)을 포함한 13종 이상의 혈청형과 다수의 변이형이 보고되었고, 유럽과 호주, 일본 등에서도 Mass형 이외의 혈청형과 변이형이 보고되었다(Purchase et al., Avian Dis., 1965, 9, 111-120; Hopkins, Avian Dis., 1978, 22, 71-81; Gelb et al., Avian Dis., 1991, 35, 82-87; Karaca et al., Avian Dis., 1990, 34, 899-904; Kwon et al., Avian Dis., 1993, 37, 194-202; Cook, Avian Path. 1984, 13, 711-741; Picault et al., Avian Path., 1986, 15, 367-383; Kusters et al., J Gen. Virol., 1987, 68, 343-352; Doi et al., Avian Dis., 1982, 26, 946-956).
국내에서는 1968년(유 등, 대한수의학회지, 1968, 8, 24-29)과 1980년(김 등, 대한수의학회지, 1980, 20, 59-64)에 전염성 기관지염 바이러스에 대한 항체 양성 계군이 보고된 바 있고, 1986년(이 등, 대한수의학회지, 1986, 26, 277-282)에는 산란저하 종계군에서 바이러스를 분리하여 최초로 질병 발생을 보고하였다.
기존의 전염성 기관지염의 진단은 SPF(specific pathogenic free) 발육란에 접종하여 3-5대 맹목계대 한 후 나타나는 병변을 관찰하고 증식한 바이러스를 양성혈청으로 중화시험 해야 하므로 많은 시간과 노력이 필요하며 혈청형이 다르거나 변이형일 경우 중화시험에 의한 동정에서 위음성(flase negative)이 나타날 수 있다(Lukert, Infectious bronchitis in Isolation and identification of avian pathogens, 2nd ed., 1980, 70-72). 또한 전염성 기관지염을 진단하는 다른 방법으로는 공통항원에 대한 단클론 항체를 이용하여 감염조직에 대해 형광항체법이나 조직화학염색법으로 직접 전염성 기관지염 바이러스 항원을 검출하거나, 전염성 기관지염 바이러스 1차 배양액을 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 흡착시켜 검출하는 면역블럿팅(immunoblotting) 법 등이 보고되었다(Mocket et al., J. Gen. Virol., 1984, 65, 2281-2286; Naqi, Avian Dis., 1990, 34, 893-898; Wainright et al., Avian Dis., 1989, 33, 482-490; Song et al., Avian Dis., 1998, 42, 92-100).
최근에는 분자생물학적인 기법의 발달과 그에 따른 유전정보의 축적으로 전염성 기관지염 바이러스의 RNA를 상보적인 DNA로 전환한 후 특정 부위를 증폭하여 바이러스의 존재 여부를 확인하는 RT-PCR 법이 개발되었고, RT-PCR로 증폭시킨 산물을 프로브(probe)로 이용하여 검출하는 방법, 또는 바이러스 균주간의 구분을 위해 증폭된 산물을 제한효소로 처리하여 생산되는 산물의 수와 크기로 구분하는 PCR-RFLP법 등이 개발되어 응용되고 있다(Andreasen et al., Avian Dis., 1991, 35, 216-220; Zwaagstra et al., J. Clin. Microbiology, 1992, 30, 79-84; Falcone et al., J. Virol. Methods, 1997, 64, 125-130; Kwon et al., Avian Dis., 1993, 37, 194-202).
국내에서 전염성 기관지염 바이러스의 분리는 1986년에 최초로 이루어졌으나 최초 분리 이전인 1980년에도 전염성 기관지염 바이러스가 존재했다는 사실이 RT-PCR 및 염기서열 결정법에 의해 보고되었으며 최초 분리주는 외국주와 염기서열에서 차이가 있었다(권 등., 대한수의학회지, 2001, 41, 59-65). 상기와 같이 국내에서 분리한 전염성 기관지염 바이러스는 외국 균주들과 염기서열에서 차이가 있기 때문에 기존의 외국에서 개발한 RT-PCR 또는 PCR-RFLP 등과 같은 방법으로는 정확한 진단을 하기가 어렵고 이에 국내 분리주들에 대한 정확한 진단 방법의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 신속 정확한 진단법의 부재로 그 피해 상황이 과소평가 되고 있는 전염성 기관지염의 피해를 줄이기 위해 대한민국에만 존재하는 바이러스 균주에 적합한 진단 및 백신 개발에 유용하게 사용될 수 있는 대한민국에서 분리된 전염성 기관지염 바이러스 균주의 신규한 뉴클레오캡시드 유전자를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자를 제공한다.
전염성 기관지염 바이러스는 유전자 재조합이 빈번하게 일어나는 바이러스이며 그 중 바이러스 표면에 분포하는 스파이크(Spike) 유전자는 면역반응에 의한 선택에 의해 그 염기서열이 매우 다양하여 모든 전염성 기관지염 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 선정에 어려움이 많습니다. 그에 비해 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스를 분류할 정도의 다양성이 있고, 바이러스의 내부에 존재하여 상대적으로 그 염기서열이 보존되어 있어 모든 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 선정이 용이하다.
본 발명의 뉴클레오캡시드 유전자는 기존에 밝혀진 뉴클레오캡시드 유전자와는 다른 염기서열을 갖는 것으로 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자이며, 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 유전자는 IBV-SNU80108(서열번호 2), IBV-SNU8615(서열번호 3), IBV-SNU8622(서열번호 4), IBV-SNU8628(서열번호 5), IBV-SNU8644(서열번호 6), IBV-SNU8650(서열번호 7), IBV-SNU869(서열번호 8), IBV-SNU90110(서열번호 9), IBV-SNU90129C(서열번호 10), IBV-SNU9993(서열번호 11), IBV-SNU99133(서열번호 12), IBV-SNU99143(서열번호 13), IBV-SNU99169(서열번호 14), IBV-SNU99186(서열번호 15), IBV-SNU99193(서열번호 16), IBV-SNU99199(서열번호 17), IBV-SNU99204(서열번호 18), IBV-SNU0049(서열번호 19), IBV-SNU011005(서열번호 20), iIBV011018(서열번호 21), iIBV01935(서열번호 22) iIBV02-01(서열번호 23), iIBV02-09(서열번호 24), iIBV02-10(서열번호 25), iIBV02-11(서열번호 26), iIBV02-23(서열번호 27), iIBV02-26(서열번호 28), iIBV02-31(서열번호 29), iIBV02-62(서열번호 30), iIBV02-68(서열번호 31), iIBV02-72(서열번호 32), iIBV02-73(서열번호 33), iIBV02-74(서열번호 34), IB96213(서열번호 35), IB96266(서열번호 36), IB97041(서열번호 37), IBEY95(서열번호 38) 및 IBKC90(서열번호 39) 바이러스 주에 존재하는 뉴클레오캡시드 유전자로서, 상기 염기서열들은 모두 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 152에서 396에 해당하는 부분을 포함하는 부분 염기서열이다.
본 발명자들은 상기 서열번호 23으로 기재되는 염기서열을 포함하는 뉴클레오캡시드를 갖는 전염성 기관지염 바이러스를 "iIBV0201(chicken coronavirus)"라 명명하고, 이를 2002년 5월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10266BP).
서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 본 발명의 전염성 기관지염 바이러스 뉴클레오캡시드의 신규한 염기서열을 외국 전염성 기관지염 바이러스 균주와 비교하여 보면, 서열번호 5로 기재되는 뉴클레오캡시드의 염기서열은 백신주인 H120 주와 99.5%의 높은 상동성을 보이나 또 다른 백신주인 M41과는 89.6%의 상동성만을 보이며, H120 백신 접종 후 분리된 바이러스이다. 그러나, 서열번호 2 내지 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8, 서열번호 9 내지 서열번호 39는 백신주인 H120과 M41과는 각각 89.1%내지 94.0%, 87.4%내지 94.0%의 상동성을 보이므로, 이들 약독화된 백신주와는 다른 야외주이다. 서열번호 2 내지 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8, 서열번호 9 내지 서열번호 39는 호주에서 분리된 N188주와 65%의 매우 낮은 상동성을 보이나 그 밖의 외국 분리 야외 주와 86.3% 내지 96.2%의 상동성을 보이고, 서로 간에는 88.5% 내지 100%의 상동성을 보인다(도 2 참조). 상기에서 백신주는 야외주를 약독화하기 위해서 계태아 등에서 수십번 계대 배양하여 만든 약독형이며 일반적으로 야외주는 백신주에 비해 병원성이 높다.
본 발명의 전염성 기관지염 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열에 근거하여 계통수를 제작한 결과, 1980년과 2001년 사이의 대한민국에서 분리한 병원성 전염성 기관지염 바이러스 균주는 외국 바이러스 균주들과 다른 클러스터(cluster)를 형성하였고, 백신주와도 구분되는 클러스터를 형성하였다(도 3 참조).
따라서, 본 발명의 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 전염성 기관지염 바이러스 균주의 유전자는 기존에 알려진 바이러스 균주들과는 다른 염기서열을 갖고 있으며 일반적인 백신주와도 다른 클러스터를 형성하기 때문에 대한민국에서 분리한 전염성 기관지염 바이러스의 타입 및 병원성을 정확히 판단할 수 있으며, 대한민국에만 존재하는 전염성 기관지염 바이러스를 치료하기 위한 백신을 개발하는 데도 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바이러스 타입 결정 방법은
1) 검체의 DNA와 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
2) 단계 1의 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및
3) 단계 2에서 분석한 염기서열을 서열번호 1로 기재되는 염기서열과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머는 전염성 기관지염 바이러스 유전자에 공통적으로 존재하는 서열로서, 검체의 DNA와 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하게 되면 검체에 전염성 기관지염 바이러스가 존재하는 경우에 증폭이 일어나게 되어 전염성 기관지염 바이러스의 존재 유무를 간편하게 확인할 수 있다(도 1 참조). 또한, 상기에서 검체의 DNA는 전염성 기관지염 바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 동물의 조직 또는 혈액으로부터 추출될 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 2에 있어서, 단계 1의 PCR 산물을 염기서열 분석하는 것은 당업자에게 있어서 자명한 방법으로 어떤 방법으로 염기서열을 분석하여도 무방하다.
상기 단계 3에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 대한민국에 존재하는 전염성 기관지염 바이러스 유전자에 특이적인 서열이므로 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열과 단계 1에서 증폭된 염기서열을 비교함으로써 진단하고자하는 검체가 어떤 타입의 바이러스인지 정확하게 진단할 수 있다. 상기에서 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 진단 방법 이외에도 본 발명의 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 유전자를 이용하여 전염성 기관지염 바이러스 균주의 타입을 결정할 수 있는 다른 방법으로는 상기 유전자에 특이적인 염기서열을 이용하여 RT-PCR, PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 수행하거나 또는 상기 염기서열을 프로브로 사용하여 서던 블럿팅과 같은 교잡 반응을 수행하는 등의 방법이 있다.
또한, 상기 전염성 기관지염 바이러스 진단 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 이를 제한효소로 절단함으로써 전염성 기관지염 바이러스가 백신주인지 야외주인지를 구별하여 유전자형을 분석할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 제한효소로 GCNGC 부위를 인식하는 Fnu4HI를 이용하여 RFLP를 수행한 후 PCR 산물이 상기 제한효소에 의해 절단되는지 여부를 확인함으로써 백신주와 야외주를 구별하였다(도 4 참조). 즉, 백신주인 M41과 H120, 그리고 야외에서 분리되었으나 H120백신을 한 계군에서 분리되어 유전형도 H120과 유사해 백신주로 생각되는 IBV-SNU 8628과 IBV-SNU 8910A등만 Fnu4HI에 의해 절단되어 절단되지 않는 야외주들과 구별되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전염성 기관지염 바이러스 균주의 분리
본 발명자들은 대한민국 특이적인 전염성 기관지염 바이러스를 분리하기 위하여, 여러 분류의 닭으로부터 52개의 전염성 기관지염 바이러스를 분리하였다(표 1 및 표 2). 구체적으로, 전염성 기관지염 바이러스의 분리 재료는 닭의 기관(trachea), 전위(proventricle), 소장(small intestine), 맹장편도(cecal tonsil), 신장(kidney)의 병소 부위를 사용하였으며, 바이러스 균주 분리는 10% BCS(bovine calf serum, GIBCO/BRL, Grand Island, NY)를 첨가한 DMEM(GIBCO/BRL, Grand Island, NY) 배지에서 키운 계태아 간세포 혹은 신장세포에 재료를 접종하여 5% 이산화탄소, 37℃ 습윤 배양한 후 계태아(Sunrise Co., NY)의 요막강(allantoic cavity)에 접종하거나 직접 접종한 후 요막액(allantoic fluid)을 회수하였다. 상기 회수한 요막액은 -20℃에서 보존하며 실험에 사용하였다.
바이러스 분리재료* 분리연도 품종** 주령 임상증상
IBV-SNU80108 CT 1980 ? ? ?
IBV-SNU869 CT 1986 L 42.0 산란저하
IBV-SNU8615 CT 1986 LB 14.3 호흡기 징후
IBV-SNU8622 T 1986 L 17.5 호흡기 징후
IBV-SNU8628 TS 1986 LB 34.0 호흡기 징후, 산란저하
IBV-SNU8644 T,L 1986 BB 5.0 호흡기 징후
IBV-SNU8650 T,L 1986 L 23.2 호흡기 징후, 산란저하
IBV-SNU8910A T 1989 BB 1.3 호흡기 징후
IBV-SNU90110 T 1990 BB 3.1 호흡기 징후
IBV-SNU90129C K 1990 B 3.3 호흡기 징후
IBV-SNU9993 T 1999 B 2.6 호흡기 징후
IBV-SNU99114 T,P 1999 B 3.3 호흡기 징후
IBV-SNU99122 L,S 1999 B 3.3 호흡기 징후
IBV-SNU99133 S,P 1999 B 7.5 호흡기 징후
IBV-SNU99143 T,S 1999 B 5.2 호흡기 징후, 설사
IBV-SNU99169 T 1999 BB 9.2 호흡기 징후
IBV-SNU99186 K 1999 SPF ? 호흡기 징후
IBV-SNU99192 K 1999 LB 14.3 호흡기 징후
IBV-SNU99193 T 1999 B 14.4 호흡기 징후
IBV-SNU99199 K 1999 L 6.6 호흡기 징후
IBV-SNU99204 K 1999 L 12.7 호흡기 징후
IBV-SNU0049 T 2000 B ? 호흡기 징후
* 맹장편도 (CT), 기관 (T), 폐장 (L), 전위 (P), 소장 (S), 신장 (K)
** 산란계 (L), 산란종계 (LB), 육계 (B), 육용종계 (BB)
바이러스 분리재료* 분리연도 품종** 주령 임상증상
IBV-SNU0081 T 2000 B ? 호흡기 징후
IBV-SNU0091 T 2000 L ? 호흡기 징후
iIBV01935 T 2001 L ? 호흡기 징후
iIBV011005 T 2001 B ? 호흡기 징후
iIBV011018 T 2001 B ? 호흡기 징후
iIBV02-01 T/CT 2002 BB ? 호흡기 징후, 신장종대
iIBDV02-09 T/CT 2002 토종 11.0 ?
iIBDV02-10 T/CT 2002 B 3.3 ?
iIBDV02-11 T/CT/L 2002 BB 34.0 성격나쁘고 꾸준한 폐사
iIBDV02-16 L 2002 BB 18.0 ?
iIBDV02-23 T/CT/L/K 2002 ? ? ?
iIBV02-26 T/CT 2002 BB 38.0 호흡기 징후
iIBV02-31 T 2002 B 4.5 호흡기 징후
iIBV02-34 T/CT/K 2002 ? ? 호흡기 징후
iIBV02-36 T/CT 2002 B 3.0 호흡기 징후
iIBV02-40 T 2002 L 12.1 호흡기 징후,산란저하
iIBV02-41 T/S/K 2002 B 2.6 호흡기 징후
iIBV02-52 T/CT/K 2002 ? 2.5 호흡기 징후
iIBV02-62 T 2002 토종 8.0 호흡기 징후,신장종대/설사
iIBV02-64 T/CT/K 2002 토종 2.4 호흡기 징후, 신장종대
iIBV02-68 T 2002 L 15.0 호흡기 징후
iIBV02-69 T/CT 2002 BB ? 호흡기 징후, 신장종대 및 요산침착
iIBV02-72 T/K 2002 ? ? 호흡기 징후, 폐사
iIBV02-73 T/K 2002 ? ? 호흡기 징후, 폐사
iIBV02-74 T/CT 2002 토종 ? 호흡기 징후
IB96213 ? 1996 ? ? ?
IB96266 ? 1996 ? ? ?
IB97041 ? 1997 ? ? ?
IBEY95 ? 1995 ? ? ?
IBKC90 T/K 1990 ? ? 호흡기 징후, 신장종대 및 요산침착, 폐사
* 맹장편도 (CT), 기관 (T), 폐장 (L), 전위 (P), 소장 (S), 신장 (K)
** 산란계 (L), 산란종계 (LB), 육계 (B), 육용종계 (BB)
<실시예 2> 전염성 기관지염 바이러스의 진단
본 발명자들은 전염성 기관지염 바이러스의 유무를 확인하기 위하여, 전염성 기관지염 바이러스 유전자에 공통적으로 존재하는 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머로 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 산-구아니디넘-페놀(acid-guanidinium-phenol) 방법(Chomzinski, P., and Sacci, N. Anal. Biochem. 1987, 162, 156)에 의해 요막액으로부터 바이러스 게놈 RNA를 추출하였다. 구체적으로 RNA 분리를 위해 발육계란 배양 요막강액 100 ㎕에 이지블루(easyBlue; iNtRON co. ltd., Seoul, Republic of Korea) 1 ㎖를 첨가하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리하여 DEPC(diethyl-pyrocarbonate; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA)로 처리한 멸균 3차 증류수 10 ㎕에 용해하였다. cDNA 합성을 위해 1차 사슬 버퍼(1st strand buffer; iNtRON Co.) 4 ㎕, 0.1 M DTT(iNtRON Co.) 1 ㎕, 2.5 mM dNTP(iNtRON Co.) 1 ㎕, 랜덤 헥사머(random hexamer, 50 ng/㎕) 1 ㎕와 RNA 10 ㎕를 첨가하여 70℃에서 15분간 가온한 후 얼음 속에서 급랭시켰다. 실온에서 10분간 정치한 후 역전사효소(iNtRON Co.) 1 ㎕를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰고, 95℃에서 5분간 역전사효소를 불활성화 하였다. PCR은 10X PCR 버퍼 1 ㎕, 2.5 mM dNTP 0.2 ㎕, 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머(5 pmol/㎕)를 각각 0.2 ㎕, Taq 중합효소(iNtRON Co., 1 U/㎕) 0.2 ㎕, 멸균증류수 7.2 ㎕, cDNA 1 ㎕를 혼합하여 94℃에서 4분간 변성한 후 94℃-30초, 48℃-15초, 72℃-20초의 반응을 35회 실시한 후 72℃에서 7분간 반응하였다(Thermocycler 9600; Perkin-Elmer Co, Foster City, CA, USA). 증폭산물은 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, 상기 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 예측되는 크기인 263 bp 크기의 증폭산물을 관찰하였으며 염기서열을 분석한 결과 특이적인 밴드임을 확인하였다(도 1). 상기 결과로부터 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 전염성 기관지염 바이러스의 존재 여부를 정확히 알 수 있음을 확인하였다.
<실시예 3> 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 얻은 뉴클레오캡시드 유전자의 PCR 산물을 ABI377 DNA 자동분석장치와 다이 종결 키트(dye terminator kit, Perkin Elmer, Foster, CA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다(권 등., 대한수의학회지, 41권 1호, 59-65, 2001). 구체적으로, 증폭산물 5 ㎕에 95% 에탄올 12.5 ㎕와 3 M 소듐 아세테이트(pH 5.2) 1 ㎕를 첨가해 -20℃에서 10분간 정치한 후 4℃에서 14,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 에탄올을 제거하고 다시 70% 에탄올 100 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 5분간 동일 조건에서 원심분리 하였다. 에탄올을 제거하고 건조시킨 후 1x PCR 버퍼 10 ㎕에 용해하였다. 염기서열 결정을 위해 침전시킨 증폭산물 1 ㎕, PCR 프라이머(3 p㏖/㎕) 1 ㎕, 다이 종결자(Dye terminator; Perkin-Elmer Co) 1 ㎕, 1x PCR 버퍼 2 ㎕를 첨가하여 96℃에서 10초 동안 변성시킨 후, 96℃-10초, 52℃-5초, 60℃-30초의 일련의 반응을 25회 반복 수행하였다. 반응물은 동일한 방법으로 에탄올 침전하였고, 건조 후 블루 덱스트란/EDTA 로딩버퍼(덱스트란/EDTA 1 부피 + 포름아미드 5 부피) 2 ㎕ 첨가하여 용해한 후 95℃에서 5분간 가열하여 얼음 속에 넣은 상태로 사용하였다. 전기영동 및 염기서열 결정을 위해 ABI 프리즘 377 (Perkin-Elmer Co)과 염기서열 분석 프로그램 버전 1.01(Perkin-Elmer Co)을 사용하였다.
그 결과, 상기 균주에서 분석한 뉴클레오캡시드 유전자는 서열번호 2 내지 서열번호 39로 기재되는 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용한 균주와 상기 균주에서 분석한 신규한 전염성 기관지염 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자는 각각 IBV-SNU80108(서열번호 2), IBV-SNU8615(서열번호 3), IBV-SNU8622(서열번호 4), IBV-SNU8628(서열번호 5), IBV-SNU8644(서열번호 6), IBV-SNU8650(서열번호 7), IBV-SNU869(서열번호 8), IBV-SNU90110(서열번호 9), IBV-SNU90129C(서열번호 10), IBV-SNU9993(서열번호 11), IBV-SNU99133(서열번호 12), IBV-SNU99143(서열번호 13), IBV-SNU99169(서열번호 14), IBV-SNU99186(서열번호 15), IBV-SNU99193(서열번호 16), IBV-SNU99199(서열번호 17), IBV-SNU99204(서열번호 18), IBV-SNU0049(서열번호 19), IBV-SNU011005(서열번호 20), iIBV-011018(서열번호 21) 또는 iIBV-01935(서열번호 22), iIBV02-01(서열번호 23), iIBV02-09(서열번호 24), iIBV02-10(서열번호 25), iIBV02-11(서열번호 26), iIBV02-23(서열번호 27), iIBV02-26(서열번호 28), iIBV02-31(서열번호 29), iIBV02-62(서열번호 30), iIBV02-68(서열번호 31), iIBV02-72(서열번호 32), iIBV02-73(서열번호 33), iIBV02-74(서열번호 34), IB96213(서열번호 35), IB96266(서열번호 36), IB97041(서열번호 37), IBEY95(서열번호 38), IBKC90(서열번호 39)로 기재되며 모두 뉴클레오캡시드를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 152에서 396에 해당하는 부분 염기서열이다.
본 발명자들은 상기 서열번호 23로 기재되는 염기서열을 포함하는 뉴클레오캡시드를 갖는 전염성 기관지염 바이러스를 "iIBV0201(chicken coronavirus)"라 명명하고, 이를 2002년 5월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10266BP).
<실시예 4> 다른 균주와 염기서열 비교분석
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 분석한 염기서열을 멕 얼라인 패키지(MegAlign package, Windows version 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis, USA)의 클러스탈 방법을 이용하여 기존의 염기서열들과 비교 분석하였다. 비교 분석한 외국 전염성 기관지염 바이러스 균주는 진뱅크(GenBank)에서 입수하였으며, 그들의 가입 번호(accession number)는 다음과 같다: Beaudette(M28565), KB8523(M21515), A가99(M85244), CU-T2(U04805), D1466U(X58002), M41(M28566), Gray(S48137), M85246, N1/62(U52596), N1/88(U52599), HT120(AY028296).
상기와 같이 본 발명의 국내 분리 전염성 기관지염 바이러스의 신규한 염기서열을 기존의 전염성 기관지염 바이러스 균주와 비교 분석한 결과, 서열번호 5로 기재되는 뉴클레오캡시드 단백질의 염기서열은 백신주인 H120 주와 99.5%의 높은 상동성을 보이나 또 다른 백신주인 M41과는 89.6%의 상동성만을 보이며 H120 백신 접종 후 분리된 바이러스이었다. 그러나, 서열번호 2 내지 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8, 서열번호 9 내지 서열번호 39는 백신주인 H120과 M41과는 각각 89.1%내지 94.0%, 87.4%내지 94.0%의 상동성을 보여 백신주와 다른 야외주이었다. 서열번호 2 내지 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8, 서열번호 9 내지 서열번호 39는 호주에서 분리된 N188주와 65.0%의 매우 낮은 상동성을 보였으나 그 밖의 외국 분리 주와 86.3% 내지 96.2%의 상동성을 보였고, 서로 간에는 88.5% 내지 100%의 상동성을 보였다(도 2).
전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 염기서열에 근거하여 계통수를 제작한 결과, 1980년과 2002년 사이의 한국에서 분리한 병원성 전염성 기관지염 바이러스 균주는 서열번호 3을 제외하고 외국 바이러스 균주들과 다른 클러스터를 형성하고, 백신 주와도 구분되는 클러스터를 형성하여 구분이 용이하였다(도 3).
<실시예 5> PCR-RFLP에 의한 백신주와 야외주의 분석
본 발명자들은 상기에서 분리한 전염성 기관지염 바이러스가 백신주인지 아니면 야외주인지 확인하기 위하여, 본 발명의 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 PCR 산물 5 ㎕에 제한효소 Fnu4HI 5 unit에 10 ×버퍼 1㎕를 넣고 나머지는 증류수로 총 10 ㎕가 되도록 넣어준 후 37℃에서 1시간 반응하여 상기 PCR 산물을 절단하였다. 상기 절단된 반응산물 10 ㎕전체를 2% 아가로스 젤에 전기 영동하여 관찰하였다.
그 결과, 제한효소 Fnu4HI에 의해 PCR 산물이 잘리는 것은 백신주이고, 잘리지 않는 것은 야외주인 것을 알 수 있었다(도 4). 상기의 백신주는 계태아에서 수십 번 계대하여 병원성을 없앤 바이러스로 야외주와는 병원성 및 유전형에서 차이가 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 Fnu4HI을 이용하여 RFLP를 수행하면, 전염성 기관지염 바이러스가 백신주인지 야외주인지를 쉽게 구별할 수 있어 유전자형 분석에 용이하게 사용할 수 있을 뿐 아니라 진단시 백신주와의 감별에 용이하게 사용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 전염성 기관지염 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자는 국내에서 분리한 전염성 기관지염 바이러스에 특이적인 서열을 포함하고 있어 전염성 기관지염 바이러스 타입 결정의 마커로 사용될 수 있을 뿐 아니라 새로운 백신을 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머로 PCR을 수행하여 전염성 기관지염 바이러스의 유무를 확인한 전기영동 사진이고,
M ; DNA ladder, 1: H120, 2: Ma5, 3: IBV-SNU80108, 4: IBV-SNU869,
5: IBV-SNU8615, 6: IBV-SNU8622, 7: IBV-SNU8628, 8: IBV-SNU8644,
9: IBV-SNU8650, 10: IBV-SNU8910A, 11: IBV-SNU90110, 12: IBV-SNU90129C,
13:IBV-SNU9993, 14: IBV-SNU99114, 15: IBV-SNU99122, 16: IBV-SNU99133,
17: IBV-SNU99143, 18: IBV-SNU99169, 19: IBV-SNU99192, 20: IBV-SNU99193,
21: IBV-SNU99199, 22: IBV-SNU99204
도 2는 전염성 기관지염 바이러스 균주들 사이에서 뉴클레오캡시드 단백질의 뉴클레오티드(152-396) 유사성을 비교한 것이고,
도 3은 전염성 기관지염 바이러스 균주들 사이에서 뉴클레오캡시드 단백질의 뉴클레오티드(152-396) 유사성을 근거로 하여 계통수를 작성한 것이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 제한효소 Fnu4H I으로 PCR-RFLP를 수행하여 전염성 기관지염 바이러스가 야외주인지 백신주인지를 구별한 전기영동 사진이다.
M ; DNA ladder, 1: H120, 2: Ma5, 3: IBV-SNU80108, 4: IBV-SNU869,
5: IBV-SNU8615, 6: IBV-SNU8622, 7: IBV-SNU8628, 8: IBV-SNU8644,
9: IBV-SNU8650, 10: IBV-SNU8910A, 11: IBV-SNU90110, 12: IBV-SNU90129C,
13:IBV-SNU9993, 14: IBV-SNU99114, 15: IBV-SNU99122, 16: IBV-SNU99133,
17: IBV-SNU99143, 18: IBV-SNU99169, 19: IBV-SNU99192, 20: IBV-SNU99193,
21: IBV-SNU99199, 22: IBV-SNU99204
<110> iNtRON Biotechnology Co., Ltd. <120> Nucleocapsid gene of infectious bronchitis virus <130> 1p-11-12 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 1 ccnaangtng gnnnnncngg anannnntnn tggttncann cnntaaangn naanaannnn 60 annnnnnnnn nncnnanntt nnnaggnagn ggngtncctg ataannnnaa nntnaannna 120 nnnnnncanc anggntantg gannngncan nnnanntnnn anncnnnnaa aggnngnaga 180 nn 182 <210> 2 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 2 cctaaagttg gttctgctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aatacacctc cacctaagtt tgaaggtagc ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaaaca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaagtaa aggcgggaga 180 aa 182 <210> 3 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 3 cctaaagttg gttcttctgg aaatgtatct tggtttcaag caataaaagc caagaagtta 60 aattcacctc cgcctaagtt tgaaggtagc ggtgttcctg ataatgaaaa tctaaaacca 120 agtcagcagc atggatattg gagacgccaa gctaggttta agccaggtaa aggtggaaga 180 aa 182 <210> 4 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 4 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aattcacctg ctcctaagtt tcaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 5 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 5 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag cactaaaagc caagaagtta 60 aattcacctc ctcctaagtt tgaaggtagc ggcgttcctg ataatgaaaa tcttaaatta 120 agccagcaac atgggtactg gagacgtcaa gccaggtaca agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 6 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 6 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aatacacctc cacctaagtt tgaaggtagt ggtgtgcctg ataatgaaaa tcttaaaaca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 7 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 7 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aatacacctc cacctaagtt tgaaggtagt ggtgtgcctg ataatgaaaa tcttaaaaca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 8 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 8 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcattt tggtttcaag ccctaaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 gg 182 <210> 9 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 9 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcagg cactaaaagc caagaagcta 60 agttcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgtgcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gaggcgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 10 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 10 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcgtct tggtttcagg cactaaaagc caagaagcta 60 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcgtct tggtttcagg cactaaaagc caagaagcta 120 agccagcaac atggatactg gagacgtcaa gccaggtata agccaggtaa aggcggaaga 180 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aaatgcatct tggtttcaag ccctaaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcgggaga 180 aa 182 <210> 22 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 22 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aagtcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 23 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 23 ccaaaagttg gctcttctgg aaatgcatct tggtttcagg caataaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaacca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 24 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 24 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaac ccataaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccatgtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 25 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 25 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccctaaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggcagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 26 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 26 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggttccaag ccctaaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcgggaga 180 aa 182 <210> 27 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 27 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aagtcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaagtca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 28 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 28 ccaaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcagg cactaaaagc caagaagcta 60 aattcaactg ctcctaagtt tggaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 29 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 29 cctaaagttg gtccttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aagtcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 30 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 30 cctaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aagtcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 31 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 31 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaacca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 32 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 32 cctaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aaktcacctk ctcctaaatt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 33 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 33 ccaaaggtag ggtcttccgg aaatgcatct tggtttcaag ccataaaagc caagaagcta 60 aagtcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 34 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 34 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgtatct tggtttcaag ctctaaaagc caagaagcta 60 aatacacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 35 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 35 ccaaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcagg cactaaaagc caagaagtta 60 aattcacctg ctcctaaatt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaacca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 36 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 36 ccaaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcagg cactaaaagc caagaagtta 60 aattcacctg ctcctaaatt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaaaca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 37 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 37 ccaaaagttg gttcttccgg aaatgcatct tggtttcagg cactaaaagc caagaagcta 60 aattcaactg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tctcaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 38 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 38 cctaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcaag cactaaaagc caagaagtta 60 aattcacctg ctcctaagtt tgaaggtagt ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaatca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gctaggttta agccaagtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 39 <211> 182 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 39 ccaaaagttg gttcttctgg aaatgcatct tggtttcagg caataaaagc caagaagcta 60 aattcacctg ctcctaggtt tgaaggcagc ggtgttcctg ataatgaaaa tcttaaacca 120 agccagcaac atggatactg gagacgccaa gccaggttta agccaggtaa aggcggaaga 180 aa 182 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBNF <400> 40 ccagtyatya aactaggagg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBNR <400> 41 gcggcwggtc ctgttccagt 20

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 1) 검체의 DNA와 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    2) 단계 1의 PCR 산물을 제한효소 Fnu4HI으로 절단하는 단계; 및
    3) 단계 2의 절단산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 전염성 기관지염 바이러스의 타입을 결정하는 방법.
  4. 서열번호 40 및 서열번호 41로 기재되는 전염성 기관지염 바이러스의 타입 결정용 프라이머쌍.
  5. 제 4항의 프라이머쌍을 포함하는 감염성 기관지염 바이러스의 타입 결정 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 제한효소 Fnu4HI을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 기관지염 바이러스의 타입 결정 키트.
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