KR102113598B1 - 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102113598B1
KR102113598B1 KR1020200021686A KR20200021686A KR102113598B1 KR 102113598 B1 KR102113598 B1 KR 102113598B1 KR 1020200021686 A KR1020200021686 A KR 1020200021686A KR 20200021686 A KR20200021686 A KR 20200021686A KR 102113598 B1 KR102113598 B1 KR 102113598B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
isothermal amplification
corona virus
primer set
present
primer
Prior art date
Application number
KR1020200021686A
Other languages
English (en)
Inventor
송민석
백윤희
최영기
Original Assignee
주식회사 바이오닉스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오닉스 filed Critical 주식회사 바이오닉스
Priority to KR1020200021686A priority Critical patent/KR102113598B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102113598B1 publication Critical patent/KR102113598B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 특정 염기서열로 구성된 등온증폭용 프라이머 세트는 코로나 바이러스를 특이적으로 검출함으로써, 경제적이고 손쉽게 코로나 바이러스를 검출하거나 코로나 바이러스에 의해 발생하는 폐렴의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{PRIMER SETS FOR DETECTING CORONA VIRUSES AND USING THEREOF}
본 발명은 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나 바이러스는 단일가닥 양성 RNA를 게놈으로 가지고, 외피가 있는 바이러스로 1937년 처음 발견된 이후 사람을 포함하여 다양한 동물에게서 분리되었다. 코로나 바이러스는 4개의 그룹으로 나눌 수 있는데, 이중 α-코로나 코로나바이러스 및 β-코로나 바이러스는 주로 포유류에 감염되고, γ-코로나 바이러스 및 δ-코로나 바이러스는 조류에 감염된다. 그러나, 최근 돼지에서 δ-코로나 바이러스의 감염이 확인된 사례가 있다.
이와 같이, 코로나 바이러스는 이종 간 감염이 가능한 바이러스로 2003년에 전세계적으로 유행한 중증급성호흡기증후군을 일으키는 사스(SARS) 코로나 바이러스와 2015년에 국내에 전파되어 확산된 메르스(MERS) 코로나 바이러스가 있다. 이들 코로나 바이러스는 모두 박쥐에서 유래된 것으로 알려졌다. 또한, 최근 중국 우한에서 발생하여 전 세계적으로 유행하고 있는 신종 코로나 바이러스(2019-nCoV)도 이종 감염에 의한 것으로 확인되었다.
박쥐는 포유동물 중 비행능력이 있어 광범위한 지역에 서식할 수 있으며, 동굴 등 협소한 공간에서 다수의 개체가 집단으로 생활하는 특성으로 인해 한 개체가 바이러스에 감염될 경우 집단으로 감염이 전달된다. 또한, 비행을 통해 광범위한 지역으로 이동이 가능하여 다른 동물에로 감염을 확산시킬 수 있다. 또한, 박쥐는 다른 포유류와 달리 체온이 높아 바이러스에 대한 저항력이 있어 코로나 바이러스에 영향을 받지 않고 지속적인 감염을 전파할 수 있다.
즉, 사스나 메르스 바이러스의 대유행으로 큰 혼란을 겪은 바와 같이 사람에게 감염되지 않는 것으로 알려진 코로나 바이러스가 사람에게 감염될 가능성을 배제할 수 없게 되었다. 또한, 사람에게 감염이 되지 않는 것으로 알려진 박쥐 유래 코로나 바이러스가 사람에게 감염 및 전파되는 경우, 이의 확산을 조기에 차단하는 것이 어려워 그 사회적 파장과 혼란은 매우 크다. 따라서, 사전 예방적인 방역망 구축을 위해 사람에게 감염을 일으킬 수 있는 잠재적 위험성을 가진 새로운 코로나 바이러스를 신속 및 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1916899호는 사스와 메르스의 증상이 유사한 점을 감안하여, 사스 코로나 바이러스와 메르스 코로나 바이러스를 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 이용하여 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1916899호
본 발명의 목적은 코로나 바이러스 검출을 위한 등온증폭용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 코로나 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 폐렴 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 폐렴 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 코로나 바이러스 검출을 위한 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 폐렴 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 특정 염기서열로 구성된 등온증폭용 프라이머 세트는 코로나 바이러스를 특이적으로 검출함으로써, 경제적이고 손쉽게 코로나 바이러스를 검출하거나 코로나 바이러스에 의해 발생하는 폐렴의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 등온증폭용 프라이머 세트를 제작하기 위해 28개 스트레인의 코로나 바이러스 염기서열을 비교한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 코로나 바이러스의 표적 유전자에 대한 외부 프라이머, 내부 프라이머 및 루프 프라이머를 제작한 것을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 신종 코로나 바이러스를 등온증폭반응으로 검출한 결과를 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 코로나 바이러스의 농도 및 등온증폭반응 시간에 따른 검출 결과를 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 코로나 바이러스의 검출 민감도를 등온증폭반응 및 실시간 PCR(Ct) 방법으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 신종 코로나 바이러스 유전자의 검출 한계를 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 코로나 바이러스 검출을 위한 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "등온증폭(isothemal amplification)"은 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성, 어닐링 및 연신 단계가 각각 다른 온도 조건하에서 수행되는 것과 달리, 한 온도 조건하에서 DNA 증폭반응을 수행하기 때문에 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 증폭 방법을 의미한다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 109개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 유지 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한, 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 육안으로 관찰할 수 있다는 점에서 간편하게 DNA를 증폭 및 확인할 수 있다.
상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭방법일 수 있다. 상기 용어, "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 내부 프라이머(inner primer, FIB/BIF) 및 외부 프라이머(outer primer, B3/F3c)를 사용하여 수행되는 증폭 방법의 하나이다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.
본 발명에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 프라이머는 코로나 바이러스의 표적 유전자에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 코로나 바이러스 검출용 조성물 및 키트는 상기 서술한 바와 같은 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 코로나 바이러스 검출용 조성물에 포함되는 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코로나 바이러스 검출방법은 상기 서술한 바와 같은 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭반응은 고리매개 등온증폭방법일 수 있다. 상기 고리매개 등온증폭방법은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수도 있다.
상기 시료는 코로나 바이러스를 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 등온증폭방법은 57 내지 70℃, 59 내지 70℃, 61 내지 70℃, 57 내지 68℃, 59 내지 68℃, 61 내지 68℃, 57 내지 66℃, 59 내지 66℃ 또는 61 내지 66℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 5 내지 90분, 10 내지 90분, 15 내지 90분, 5 내지 80분, 10 내지 80분, 15 내지 80분, 5 내지 70분, 10 내지 70분, 15 내지 70분, 5 내지 65분, 10 내지 65분 또는 15 내지 65분 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 등온 증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응물에 포함되는 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 폐렴 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 폐렴 진단용 조성물 및 키트는 상기 서술한 바와 같은 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 등온증폭방법을 통해 폐렴을 유발하는 코로나 바이러스를 검출함으로써, 폐렴 여부를 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 페렴 진단용 조성물 및 키트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폐렴(pneumonia)"은 폐의 세기관지 이하 부위, 특히 폐포에 발생한 염증을 의미하는 것으로, 감염성 폐렴 또는 비감염성 폐렴으로 구분할 수 있다. 상기 감염성 폐렴은 세균, 바이러스, 곰팡이 등에 의한 감염으로 발생할 수 있다. 본 발명에서, 상기 폐렴은 바이러스의 감염으로 발생한 폐렴일 수 있고, 더욱 구체적으로 코로나 바이러스의 감염에 의한 폐렴일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코로나 바이러스 검출방법은 상기 서술한 바와 같은 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭반응은 고리매개 등온증폭방법일 수 있다. 상기 고리매개 등온증폭방법은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수도 있다.
또한, 상기 시료는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 시료는 폐렴을 진단하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 상기 서술한 바와 같은 온도 및 시간으로 등온증폭반응을 함으로써 수행될 수 있다. 이때, 상기 등온증폭반응은 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 필요에 따라 적절히 변형되어 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 프라이머의 제작
고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 사용하여 우한에서 유행하는 신종 코로나 바이러스(corona virus)을 검출하기 위해 먼저 프라이머를 설계 및 제작하였다.
먼저, 28개 스트레인(strain)의 신종 코로나 바이러스로부터 분리된 유전자 염기서열을 GISAID(https://www.gisaid.org/)에서 수집하여 공통적인 부분으로서 바이러스 유전자의 28,000 내지 29,000번째 염기서열을 확인하였다(도 1). 이후, 이를 주형으로 외부 프라이머(F3 및 B3), 내부 프라이머(FIP 및 BIP) 및 루프 프라이머(LF 및 LB)를 제작하고, 그 서열을 하기 표 1에 나타내었다(도 2).
프라이머 서열(5'→3') 표적위치 서열번호
nCoV N-F3 TGGACCCCAAAATCAGCG 28285-28302 서열번호 1
nCoV N-B3 AGCCAATTTGGTCATCTGGA 28510-28529 서열번호 2
nCoV N-FIP CGTTGTTTTGATCGCGCCCCATTACGTTTGGTGGACCCTC 28373-28392
+28316-28335		 서열번호 3
nCoV N-BIP ATACTGCGTCTTGGTTCACCGCATTGGAACGCCTTGTCCTC 28416-28437
+28476-28494		 서열번호 4
nCoV N-LF TGCGTTCTCCATTCTGGTTACT 28349-28370 서열번호 5
nCoV N-LB TCTCACTCAACATGGCAAGGAA 28438-28459 서열번호 6
실시예 2. 유전자 증폭 확인
상기 제작된 신종 코로나 바이러스를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 표적 유전자의 증폭을 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 공지된 신종 코로나 바이러스의 표적 유전자를 통상적인 방법으로 합성하고, T7 전사를 통해 바이러스 RNA를 제작하였다. 제작된 RNA를 통상적인 방법으로 순수분리하고, 이를 주형으로 사용하였다. 상기 준비된 RNA 주형에 5 ㎕의 등온증폭 반응 완충액, 1 ㎕의 외부 프라이머, 1 ㎕의 내부 프라이머 및 1 ㎕의 루프 프라이머를 혼합하여 등온증폭반응을 위한 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 65℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 80℃에서 5분 동안 방치하여 Bst 중합효소의 활성을 억제시킴으로써 최종 LAMP 산물을 수득하였다. 이때, 대조군으로서는 주형 RNA를 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 수득된 LAMP 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트는 신종 코로나 바이러스를 등온증폭방법으로 검출하였다.
실시예 3. 유전자 증폭 민감도 확인-(1)
상기 제작된 신종 코로나 바이러스를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 코로나 바이러스의 검출 민감도를 등온증폭반응 시간에 따라 확인하였다.
먼저, 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 제작된 신종 코로나 바이러스의 합성 RNA 유전자를 단계희석하여 준비하였다. 준비된 주형 RNA를 이용하여 등온증폭반응을 10, 20, 30, 40, 50 또는 60분동안 수행한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 등온증폭반응을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 20분 이상 반응시킨 경우에 신종 코로나 바이러스를 효과적으로 검출하였다.
실시예 4. 유전자 증폭 민감도 확인-(2)
상기 제작된 신종 코로나 바이러스를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 코로나 바이러스의 검출 민감도를 등온증폭반응 및 qRT-PCR 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 제작된 신종 코로나 바이러스의 합성 RNA 유전자를 1010 내지 10-1까지 10배 단계희석하여 준비하고, 이를 이용하여 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 등온증폭반응을 수행하였다. 한편, 상기 단계희석된 신종 코로나 바이러스 샘플 및 TOPreal™ One-step RT-qPCR 키트(SYBR Green, lox Row)(Enzynomics, 한국)를 이용하여 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과, 등온증폭결과를 도 5에, 실시간 PCR 결과를 하단에 Ct값으로 나타내었다.
온도 시간 사이클
역전사반응 55℃ 30분 1회
전-변성 95℃ 10분 1회
변성 95℃ 30분 35회
어닐링 60℃ 30초
연신 72℃ 30초
후-연신 72 5분 1회
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하는 경우, 102 카피의 RNA 유전자를 효과적으로 검출할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 등온증폭반응으로 신종 코로나 바이러스를 실시간 PCR 방법과 유사한 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 유전자 검출 한계 확인
상기 제작된 신종 코로나 바이러스를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 코로나 바이러스의 검출한계를 종점한계검출 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 제작된 신종 코로나 바이러스의 합성 RNA 유전자를 103, 102 또는 101 RNA 카피로 준비하고, 등온증폭반응을 30 또는 60분 동안 수행한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 등온증폭반응을 10회 반복 수행하였다. 그 결과, 유전자 검출 한계를 확인한 결과 그래프를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 주형 RNA 유전자를 103 또는 102 카피로 사용하고, 등온증폭반응을 30분동안 수행한 경우에는 각각 100% 및 80%의 한계로 코로나 바이러스가 검출되었다. 한편, 주형 RNA 유전자를 103 또는 102 카피로 사용하고, 등온증폭반응을 60분 동안 수행한 경우에는 각각 100% 및 90%의 한계로 코로나 바이러스가 검출되었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 프라이머 세트가 102 카피 이상의 주형 RNA를 포함하는 시료에서 최소 80% 이상의 검출한계를 가짐을 확인하였다.
실험예 1. 코로나 바이러스의 검출 민감도 확인
상기 제작된 신종 코로나 바이러스를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 코로나 바이러스의 검출 민감도를 등온증폭반응 및 qRT-PCR 방법으로 확인하였다. 실험은 코로나 바이러스의 합성 RNA 대신, 신종 코로나 바이러스(질병관리본부, 한국)로부터 통상적인 방법으로 분리한 RNA를 단계희석하여 준비한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4와 동일한 조건 및 방법으로 등온증폭을 수행하였다. 그 결과, 등온증폭결과를 도 7에, 실시간 PCR 결과를 하단에 Ct값으로 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하는 경우, 10-6으로 희석된 코로나 바이러스의 RNA 유전자를 효과적으로 검출하였다. 이로부터 통상적으로 100 내지 200 카피의 RNA를 실시간 RT-qPCR로 검출하였을 때 Ct 값이 약 37 정도임을 고려하였을 때, 본 발명에 따른 프라이머가 실시간 RT-qPCR과 유사한 정도의 민감도를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 등온증폭반응으로, 실시간 PCR 방법과 민감도는 유사하면서도 더욱 경제적이고 용이하게 신종 코로나 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하였다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> PRIMER SETS FOR DETECTING CORONA VIRUSES AND USING THEREOF <130> DP-2020-0049-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-F3 <400> 1 tggaccccaa aatcagcg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-B3 <400> 2 agccaatttg gtcatctgga 20 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-FIP <400> 3 cgttgttttg atcgcgcccc attacgtttg gtggaccctc 40 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-BIP <400> 4 atactgcgtc ttggttcacc gcattggaac gccttgtcct c 41 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-LF <400> 5 tgcgttctcc attctggtta ct 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nCoV N-LB <400> 6 tctcactcaa catggcaagg aa 22

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 2019-nCoV 코로나 바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 2019-nCoV 코로나 바이러스 검출용 조성물.
  5. 제1항의 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 2019-nCoV 코로나 바이러스 검출용 키트.
  6. 제1항의 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 고리매개 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 2019-nCoV 코로나 바이러스 검출방법.
  7. 제1항의 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 폐렴 진단용 조성물.
  8. 제1항의 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 폐렴 진단용 키트.
  9. 제1항의 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 고리매개 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
KR1020200021686A 2020-02-21 2020-02-21 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 KR102113598B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200021686A KR102113598B1 (ko) 2020-02-21 2020-02-21 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200021686A KR102113598B1 (ko) 2020-02-21 2020-02-21 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102113598B1 true KR102113598B1 (ko) 2020-05-22

Family

ID=70913825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200021686A KR102113598B1 (ko) 2020-02-21 2020-02-21 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102113598B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500792A (zh) * 2020-06-11 2020-08-07 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
CN112226534A (zh) * 2020-09-08 2021-01-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用
WO2022015261A1 (en) * 2020-07-12 2022-01-20 New Senses Uzay Teknoloji Ve Saglik Arastirmalari A.Ş. Artificial intelligence (ai) aided covid - 19 diagnostic kit
KR20220011831A (ko) * 2020-07-21 2022-02-03 동국대학교 산학협력단 Emp2의 바이러스성 폐렴 또는 패혈증의 진단을 위한 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040074264A (ko) * 2003-02-17 2004-08-25 주식회사 인트론바이오테크놀로지 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자
JP2012024039A (ja) * 2010-07-26 2012-02-09 Toshiba Corp コロナウイルスのためのｌａｍｐ増幅用核酸プライマーセット
KR20180052317A (ko) * 2016-11-10 2018-05-18 충북대학교 산학협력단 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101916899B1 (ko) 2017-08-31 2018-11-08 한국생명공학연구원 Sars 관련 코로나바이러스 및 mers 관련 코로나바이러스 동시 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법
KR102004951B1 (ko) * 2018-12-07 2019-08-01 대한민국 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040074264A (ko) * 2003-02-17 2004-08-25 주식회사 인트론바이오테크놀로지 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자
JP2012024039A (ja) * 2010-07-26 2012-02-09 Toshiba Corp コロナウイルスのためのｌａｍｐ増幅用核酸プライマーセット
KR20180052317A (ko) * 2016-11-10 2018-05-18 충북대학교 산학협력단 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101916899B1 (ko) 2017-08-31 2018-11-08 한국생명공학연구원 Sars 관련 코로나바이러스 및 mers 관련 코로나바이러스 동시 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법
KR102004951B1 (ko) * 2018-12-07 2019-08-01 대한민국 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Carmine Ceraolo et al., J. Med. Virol., 2020.02.06.* *
Fei Yu et al., 'Measures for diagnosing and treating infections by a novel coronavirus responsible for a pneumonia outbreak originating in Wuhan, China', Microbes and Infection, 2020.02.01.(online) *
Jin Hwa Kim et al., BioChip J., 13(4), pp.341-351, 2019.* *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500792A (zh) * 2020-06-11 2020-08-07 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
WO2022015261A1 (en) * 2020-07-12 2022-01-20 New Senses Uzay Teknoloji Ve Saglik Arastirmalari A.Ş. Artificial intelligence (ai) aided covid - 19 diagnostic kit
KR20220011831A (ko) * 2020-07-21 2022-02-03 동국대학교 산학협력단 Emp2의 바이러스성 폐렴 또는 패혈증의 진단을 위한 용도
KR102649080B1 (ko) 2020-07-21 2024-03-20 동국대학교 산학협력단 Emp2의 바이러스성 폐렴 또는 패혈증의 진단을 위한 용도
CN112226534A (zh) * 2020-09-08 2021-01-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102113596B1 (ko) 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102113598B1 (ko) 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
Kapoor et al. Development of a recombinase polymerase amplification assay for the diagnosis of banana bunchy top virus in different banana cultivars
Manjunatha et al. Rapid detection of Puccinia triticina causing leaf rust of wheat by PCR and loop mediated isothermal amplification
Latrofa et al. A duplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection of and differentiation between Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in dogs and mosquitoes
Burkhardt et al. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. fragariae from infected strawberry plants
KR101149422B1 (ko) 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법
Zhang et al. Multiplex detection of three banana viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)
CA3153071A1 (en) Systems, methods, and compositions for the rapid early-detection of host rna biomarkers of infection and early identification of covid-19 coronavirus infection in humans
Sripiboon et al. Molecular characterisation and genetic variation of Elephant Endotheliotropic Herpesvirus infection in captive young Asian elephants in Thailand
Almasi Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis
Kim et al. Uracil-DNA glycosylase-treated reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of avian influenza virus preventing carry-over contamination
Kim et al. A portable detection assay for apple stem pitting virus using reverse transcription-recombinase polymerase amplification
Rafiqi et al. Molecular characterization of Hepatozoon sp. and Babesia sp. isolated from endangered Asiatic lion (Panthera leo persica)
KR102375698B1 (ko) 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
Tian et al. Visual detection of Didymella bryoniae in cucurbit seeds using a loop-mediated isothermal amplification assay
Ammara et al. Real-time qPCR assay for the TYLCV titer in relation to symptoms-based disease severity scales
KR101780033B1 (ko) 노로바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법
Cho et al. Validation and application of a real-time PCR protocol for the specific detection and quantification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato
US10415096B2 (en) Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by PCR, primers as well as bacteria and fungi detection kit
Kamenova et al. Molecular variability of the coat protein gene of prunus necrotic ringspot virus on sweet and sour cherry in Bulgaria
Esvaran et al. Targeting essential genes of Nosema for the diagnosis of pebrine disease in silkworms
KR102630773B1 (ko) 코로나 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
Lou et al. Development of a tandem repeat-based polymerase chain displacement reaction method for highly sensitive detection of ‘Candidatus liberibacter asiaticus’
JP3449961B2 (ja) マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant