KR102004951B1 - 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 용해 버퍼; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법{Direct LAMP kit and method for diagnosing malaria infection}
본 발명은 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법에 관한 것이다.
2014년까지 보건 의료법상 말라리아 확진은 현미경 관찰(Microscopy)만으로 설정되어 있지만, 검사자의 숙련도에 따른 편차 및 원충혈증(parasitemia)이 낮은 환자의 경우 진단의 어려움이 자주 보고되고 있다. 신속항원검사법은 편리함의 장점이 있으나 항원-항체 반응의 특성상 위음성이 잦아 검사의 정확도에 문제점이 있다. 이에 2015년 질병관리본부는 PCR(polymerase chain reaction) 진단법을 확진 카테고리에 포함시키는 안의 고시를 개정하였다. 따라서 군에서도 이에 제반한 진단 대책이 요망되는 상황이다.
현재 군병원에서는 말라리아 진단을 위해 말초혈액도말 및 신속진단(면역크로마토그래피법, ICA(imperialist competitive algorithm)) 키트를 사용하고 있으나 도말검사법은 검사자의 숙련도에 따른 편차가 크며, 원충혈증 수치가 낮은 환자의 경우 말라리아 진단의 어려움이 있어 질병관리본부에서는 민감도와 특이도가 높은 PCR을 사용할 것을 권고하고 있다. 2018년도에도 도말 및 ICA법의 위음성(false negative)이 국군의학연구소에 세팅된 PCR 진단에서 다수 확인되었기에, 분자진단의 도입이 시급한 실정이다.
사람을 감염시키는 4가지 말라리아 종으로는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum; 열대열 말라리아), 플라스모디움 비박스(P. vivax; 삼일열 말라리아), 플라스모디움 말라리아(P. malariae) 및 플라스모디움 오발레(P. ovale)가 있다. 말라리아는 이환율과 사망률이 높은 질환으로, 결핵을 제외하고 전염병 중 가장 많은 사람들을 사망에 이르게 한다. 주 감염원은 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)이지만, 일부는 수혈이나 수직 감염 등이 감염 원인이 되기도 한다. 말라리아는 전 세계 인구의 40%가 살고 있는 지역에서는 공중 보건 문제이고, 이 질병은 이들 지역사회에 대한 심각한 사회적 및 경제적 결과를 갖는다. 최근 국내 말라리아 감염 실태는 대부분 휴전선 인근에서 주로 발생되었으나 서울 강북 지역까지 남하한 상태여서 국민 보건향상에 위협이 되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1847422호에는 삼일열 말라리아 원충의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)를 표적으로 하는 'LAMP를 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2003-0088294호에는 '신속 면역크로마토그라피법 및 효소면역측정법에 의해사람 전혈에서 말라리아 항원 젖산탈수소효소를 검출하는방법 및 진단 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트 및 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 혈액 시료로부터 핵산 추출 및 정제과정 없이 등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 수행하기 위해, Direct LAMP용 용해 버퍼를 제작하였고, 상기 용해 버퍼를 이용하여 전처리한 혈액 시료를 등온증폭수행한 결과, 혈액도말 및 항원-항체 신속진단법에서 위음성으로 나타났던 시료가 양성으로 확인되어 본 발명 방법의 높은 민감도를 확인하였고, 본 발명의 용해 버퍼 및 프라이머 세트를 이용하여 다수의 삼일열 말라리아 양성 또는 음성 임상 시료를 분석한 결과, 100%의 민감도 및 특이도 결과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 용해 버퍼; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 인간 혈액을 용해 버퍼로 전처리하는 단계; 상기 용해 버퍼로 전처리된 인간 혈액을 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭하여 삼일열 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자에 특이적인 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 및 용해 버퍼를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 말라리아 감염 진단을 위한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 말라리아 감염 진단용 조성물은 유전자 증폭장치 없이 형광발색만으로도 인간의 혈액(전혈)으로부터 신속하게 말라리아 감염여부를 높은 민감도와 특이도로 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 말라리아 감염을 진단하는 Direct LAMP 방법은 말라리아 감염 의심 임상 검체(예컨대, 혈액)를 용해 버퍼와 혼합한 후 LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 및 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트와 조성물은 말라리아 감염 진단용 키트 또는 말라리아 감염을 진단하는 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자 염기서열에서 서열번호 1 내지 서열번호 6의 프라이머 각각의 위치를 보여준다.
도 2는 임상검체를 이용한 고리매개등온증폭 분석 결과이다. 빨간색으로 표시된 검체는 혈액도말진단법(S) 및 항원-항체 신속진단법(RDT)에서 위음성으로 확인되었던 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 삼일열 말라리아 감염 진단의 검출한도를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 고리매개등온증폭 분석의 민감도 및 특이도를 확인하기 위해, 24개의 삼일열 말라리아 양성 임상검체 및 28개의 삼일열 말라리아 음성 임상검체를 이용한 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 용해 버퍼; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트는 GenBank accession no. XR_003001229.1인 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.
상기 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트이다.
본 발명에 있어서, 용어 'LAMP(Loop-mediated isothermal amplification, 고리매개등온증폭)'는 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법이다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.
상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2 종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.
본 발명의 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LF이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LB이다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5 및 6 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3 및 4 내의 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트에 있어서, 상기 용해 버퍼는 바람직하게는 0.05~0.15 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~50 mM Tris일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 40 mM Tris일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트는 말라리아 감염 의심 임상 검체(시료)를 키트에 포함된 용해 버퍼와 혼합한 후 LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 및 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 Direct LAMP용 키트이다.
본 발명은 또한,
분리된 인간 혈액을 용해 버퍼로 전처리하는 단계;
상기 용해 버퍼로 전처리된 인간 혈액을 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭하여 삼일열 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자에 특이적인 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 방법을 제공한다.
본 발명의 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP 방법은 분리된 인간 혈액으로부터 DNA를 추출 및 정제하는 단계를 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 '분리된 인간 혈액'은 채취한 인간의 혈액(전혈)일 수 있으나, 삼일열 말라리아 원충에 감염되었을 것으로 의심되는 시료이면 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 분리된 인간 혈액을 용해 버퍼로 전처리하는 단계는, 바람직하게는 분리된 인간 혈액과 용해 버퍼를 1:9의 부피비로 혼합하고 5분 이내에 사용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용해 버퍼는 바람직하게는 0.05~0.15 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~50 mM Tris일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 40 mM Tris일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 Direct LAMP 방법에 있어서, 상기 등온증폭의 반응 온도는 50℃~65℃일 수 있으며, 바람직하게는 55℃~60℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 57℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 등온증폭의 반응 시간은 10분~1시간일 수 있으며, 바람직하게는 20~40분일 수 있고, 가장 바람직하게는 30분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색 또는 전기영동을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 말라리아 감염을 진단하는 Direct LAMP 방법은 말라리아 감염 의심 임상 검체(예컨대, 혈액)를 용해 버퍼와 혼합한 후 LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 및 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 장점이 있다.
본 발명은 또한, 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 및 용해 버퍼를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 임상검체를 이용한 Direct LAMP 검사의 분석능 평가
국군양주병원, 국군고양병원 및 국군포천병원으로부터, 혈액도말진단법 및 항원-항체 신속진단법을 통해 말라리아 감염 양성 또는 음성으로 진단받은 5개의 환자 혈액과 혈액도말진단법 및 항원-항체 신속진단법에서 위음성(false negative)로 진단받은 1개의 환자 혈액 시료를 포함한 총 6개의 임상 시료를 분석에 사용하였다. 분석에 사용된 위음성 시료는 Nested PCR을 통해 혈액도말진단법 및 항원-항체 신속진단법 결과가 위음성임을 확인한 시료이다.
환자 혈액(EDTA WB) 50㎕와 본 발명자가 개발한 용해 버퍼(40mM Tris, pH 6.5, 0.1% Triton X-100) 450㎕를 혼합한 후, 상기 혼합액 중 2㎕를 취하여 LAMP premix (Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10× buffer 2.5㎕, 10mM dNTPs 3.5㎕, 10mM 황산마그네슘(MgSO4) 1㎕, 5M 베타인(betaine) 5㎕) 및 증류수(up to ~25㎕)를 첨가하고, 프라이머 3쌍(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 20~40pmol, LF 및 LB는 각각 10pmol)을 추가하여 히팅 블록 57℃에서 30분간 반응시켰다. 등온증폭 후 형광물질(고농도 SYBR Green, 1,000X 농도)을 첨가하여 육안, UV, 전기영동으로 결과를 판정하였다.
그 결과, 본 발명의 Direct LAMP 반응은 말라리아 감염 양성 또는 음성 시료를 정확하게 확인할 수 있었고, 특히, 혈액도말진단법(S) 및 항원-항체 신속진단법(RDT)에서 위음성으로 진단받은 시료가 본 발명의 Direct LAMP 반응에서는 양성으로 확인되어, 본 발명의 높은 반응 민감도를 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 2. Direct LAMP 검사의 검출한도 및 특이도, 민감도 평가
본 발명의 방법을 이용한 말라리아 검출의 한도를 분석하였다(spike test). 간단하게, 말라리아 감염 음성 혈액 20㎕, PCR 산물 2㎕(:Plasmodium vivax isolate SV6 18S ribosomal RNA 유전자의 partial sequence(GenBank: JQ627158.1) 1,800 bp 단편을 PCR로 100ng/㎕ 농도로 합성하였고, 이를 copy number로 환산하면 100ng은 약 5×1010이다. 이것을 100까지 계열 희석하여 각각의 copy number를 계산하였다) 및 용해 버퍼 180㎕를 혼합하고 이 중 2㎕를 취하여, 상기 실시예 1에 기술된 LAMP premix와 혼합하여 57℃ 30분 반응시킨 후, 형광물질(고농도 SYBR Green)을 첨가하여 육안, UV, 전기영동 및 LED로 결과를 판정하였다. 그 결과, 본 발명의 방법은 삼일열 말라리아의 18S rRNA를 1 카피(100)까지 진단 가능함을 확인하였다(도 3).
또한, Nested PCR을 통해 감염 유무가 확인된, 삼일열 말라리아 감염 양성 임상 검체(24개) 및 음성 검체(28개)를 이용하여 본 발명 Direct LAMP 검사법의 특이도 및 민감도를 확인하였다. 그 결과, 도 4에 개시된 것과 같이, 본 발명 Direct LAMP 검사법은 100% 특이도 및 100% 민감도를 나타내어, 말라리아 감염 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상되었다.
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Claims (6)

  1. 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 용해 버퍼; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 키트로서,
    상기 용해 버퍼는 0.05~0.15 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~50 mM Tris로 이루어진 것을 특징으로 하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 키트.
  2. 삭제
  3. 분리된 인간 혈액을 용해 버퍼로 전처리하는 단계;
    상기 용해 버퍼로 전처리된 인간 혈액을 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭하여 삼일열 말라리아 원충의 18S rRNA 유전자에 특이적인 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 방법으로서,
    상기 용해 버퍼는 0.05~0.15 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~50 mM Tris로 이루어진 것을 특징으로 하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 형광발색 또는 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 Direct LAMP 방법.
  6. 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 18S rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 및 용해 버퍼를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물로서,
    상기 용해 버퍼는 0.05~0.15 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~50 mM Tris로 이루어진 것을 특징으로 하는 말라리아 감염 진단을 위한 Direct LAMP용 조성물.
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