KR101847422B1 - Lamp를 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Lamp를 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax) 감염을 진단하기 위한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트, 말라리아 감염 진단용 키트 및 이를 이용한 말라리아 감염 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 고리매개등온증폭용 프라이머 세트는 탁색도, 침전물 생성 또는 형광 발색을 통한 육안 검사만으로도 말라리아 감염 여부를 신속하고 빠르게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자 증폭장치 없이 고리매개등온증폭기술을 이용한 분자진단이 가능하여 기존의 혈액도말진단법과 항원-항체 신속진단법에 비해 신속하면서도 특이도와 민감도가 우수하다.

Description

LAMP를 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosing malaria infection using LAMP and uses thereof}
본 발명은 인간의 혈액(전혈)으로부터 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 기술을 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene) 에 특이적인 LAMP 프라이머 세트와 이를 이용하여 인간의 혈액(전혈)로부터 신속하게 말라리아 감염 여부를 진단하는 말라리아 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 말라리아 감염 진단용 키트, 및 말라리아 진단 방법에 관한 것이다.
말라리아(Malaria)는 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)가 옮기는 전염병으로, 매년 2~3억 명의 사람이 감염되고 수백만 명이 사망하는 주로 열대 지방에서 발병되는 질병이다. 원인 기생충은 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 열대열 원충(Plasmodium falciparum), 사일열 원충(Plasmodium malariae), 난형열 원충(Plasmodium ovale) 등이 있다. 사람을 감염시키는 4가지 종으로는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum; 열대열 말라리아), 플라스모디움 비박스(P. vivax; 삼일열 말라리아), 플라스모디움 말라리아(P. malariae) 및 플라스모디움 오발레(P. ovale)가 있다. 이들 중에서, 플라스모디움 팔시파룸이 급성 말라리아 및 종종 치명적 말라리아를 주로 초래하지만, 각각의 말라리아 감염과 관련된 이병률은 유의 수준이며, 전 세계 인구의 대부분이 이 질병에 걸릴 위험이 있다.
이중 열대열 원충이 감염의 가장 큰 원인이며 증상도 가장 심각하다. 합병증으로는 빈혈, 황달, 뇌성 말라리아, 신부전, 흑수열(용혈성 빈혈과 혈색소뇨증)등이며, 전 세계적으로 열대열 원충 감염이 주요 사망 원인이 되고 있다. 말라리아는 이환율과 사망률이 높은 질환으로, 결핵을 제외하고 전염병 중 가장 많은 사람들을 사망에 이르게 한다. 주 감염원은 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)이지만, 일부는 수혈이나 수직 감염 등이 감염 원인이 되기도 한다. 말라리아는 전 세계 인구의 40%가 살고 있는 지역에서는 공중 보건 문제이고, 이 질병은 이들 지역사회에 대한 심각한 사회적 및 경제적 결과를 갖는다. 최근 국내 말라리아 감염 실태는 대부분 휴전선 인근에서 주로 발생되었으나 서울 강북 지역까지 남하한 상태여서 국민 보건향상에 위협이 되고 있다.
말라리아 진단은 말초 혈액 (peripheral blood)을 사용하는 박층 도말법(thin smear method)과 후층 도말법(thick smear method)이 많이 사용된다. 이 방법에서 흔히 사용하는 염색방법은 라이트-김자(Wright-Giemsa) 염색법인데 많은 시간이 필요하고, 경험이 많은 숙련자들조차 오진 가능성이 크다. 말초혈액 도말검사는 박층 또는 후층도말법, 김자(Giemsa) 염색법 등이 보편적으로 사용되고 있다. 이 중 김자(Giemsa) 법이 라이트(Wright) 염색법보다, 박층보다 후층도말법이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 광학현미경을 사용하여 원충을 확인하기 때문에, 물이나 혈소판을 말라리아 원충으로 오인하는 실수가 자주 발생되어 숙련된 검사자를 필요로 하는 단점이 있다.
형광현미경을 사용하는 아크리딘 오렌지 등 형광 염색법은 경제적이고 다른 염색법보다 빠른 시간내에 검사할 수 있는 장점이 있다. 그러나 검사자의 주관적 판단이 개입될 수 있는 문제점이 있다. 형광염색법을 이용하여 유세포 측정기로 검사하는 방법도 현재 기생출형증(parasitemia) 검사 목적 이외에는 사용되지 않는다. 원충 항원검사는 단클론성 항체를 이용하여 항원 캡쳐(Antigen capture) ELISA법으로 일부 사용되고 있는데, 예민도가 낮은 문제점이 있다. 이뮤노캡쳐(Immnuocapture)(Dipstick) 방법은 여러 제품이 개발되어 있으나, 서로 다른 표적 항원을 사용하며 예민도가 기존 방법보다 낮고 방법상 위양성이 존재하는 것으로 알려져 있다. 원충 항체검사는 역학 조사와 혈액 제제의 선별 검사용으로 사용되거나, 일부 항체의 경우 진단용으로 사용되는데, 항체가 존재한다고 해서 말리라아 항원이 혈중에 존재하는 것이 아니므로 치료 목적의 검사는 부적절한 점이 있다. 원충 유전자 검사 방법으로는, 원충의 CS (Circumsporozoite protein), MSP-1 (Merozoite surface protein 1), EBP (Erythrocyte binding protein) 또는 18S 리보솜 RNA를 암호화하는 유전자에 대해 중합 효소 연쇄반응을 실시함으로써 말라리아 감염 여부를 검사하는 방법이 있다. 검사 방법 중 예민도가 가장 높으며 유전자 증폭 후 PCR 도트 블랏팅, SSCP, 염기서열 분석을 이용하여 종을 분류할 수 있으나, 비용과 검사 시간이 많이 들고 정량화가 불가능하다는 단점이 있다.
최근 많이 사용되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하는 말라리아 원충 유전자 검사 방법은, 기존 중합효소 연쇄반응을 이용한 검사 방법에 비해 경제적이고 검사 시간이 상대적으로 짧으며, 그리고 말라리아 원충의 혈중 농도를 알 수 있는 정량화된 검사 방법으로 Rubio 등(Rubio JM, Garcia L. et al., J Clin Microbiol. 1999. Vol. 37, No. 10, pp 3260-3264.)이 발표한 원충 DNA의 중합효소 반응을 이용한 말라리아 검출법이 주로 사용된다. 유전자 검사법(NestedPCR)을 적용한 것이 주로 사용되며 표적 유전자는 원충의 포자소체(circumsporozoite) 단백 유전자, 메로조이트(merozoite) 표면 단백 유전자, 적혈구 결합 단백 유전자등을 증폭한다. PCR은 높은 민감도 때문에 말라리아의 치료 후 추적에도 응용되지만 정량화하여 말라리아의 혈중 농도를 계산하기가 힘들다는 단점이 있다(Pieroni P. et al., Trans R Soc Trop Med Hyg. 1998. Vol. 92, No. 2, pp 166-169.).
또한 한국의 삼일열 말라리아(Plamodium vivax)는 1달 이내의 짧은 잠복기를 보이기도 하나 보통 6개월에서 1년, 길게는 3년 이상의 장기 잠복 기간을 갖는 경우가 많다. 이런 지연형 잠복기(prolonged incubation type)를 보이는 경우는 항체가 형성되지 않거나, 항원의 양이 매우 적어 무증상으로 나타날 수 있어 진단하기에 어려움이 많다. 따라서 이를 조기 진단해야만 한다. 또한 삼일열 말라리아는 한국, 중국, 동남아시아 및 남미의 해결되지 않은 감염성 질환일 뿐만 아니라 수혈 등을 통해서 전파될 수 있어서 혈액의 스크리닝이 필요한 질환이다. 현재 세계적으로 가장 많이 쓰이는 방법이 딥스틱 키트(Dipstick kit)법인데 말라리아의 특이항원 중 플라스모디움 젖산 탈수소효소(Plasmodium lactate dehydrogenase; pLDH), 플라스모디움 히스티딘 고함유 단백질-2(Plasmodium histidine rich protein-2; pHRP-2) 항원을 검출하는 방법이다. 이를 활용하여 제품화된 것으로 ICTTM Malaria Pf/Pv (Amrad ICT, Australia), OptiMAL (Flow Inc., U.S.A), 및 ParaSightTM F (Becton Dickinson, U.S.A) 등 크게 3가지 제품이 사용되고 있는데, 표적항원은 서로 다르다. 이러한 3개 회사의 제품을 찬수다(Chansuda W, Rapid diagnostic techniques for malaria control, Trends Parasitol. 2001. Vol. 17, No. 7, pp 307-309.)가 조사한 결과, 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대해서는 88-98% 정도의 높은 진단 민감율이 있는 반면, 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 민감도는 각각, 75%, 83% 및 87% 정도로 문제가 있었다. 제품 공급 회사의 주장과는 달리 예민도가 기존 방법보다 낮기 때문에 보완이 필요한데, 특히 삼일열 말라리아에 대한 진단율은 70-80% 정도 밖에 되지 않는다(Cooke AH. et al., Am J Trop Med Hyg. 1999. Vol. 60, No. 2, pp 173-176.). 이런 이유 중에 하나는 선진국에서는 주로 열대열 말라리아에 대한 연구가 진행 되어져 왔고 상대적으로 삼일열 말라리아에 대한 연구가 덜 진행 되어져 왔기 때문이다. 순수 배양의 한계나 원충의 지역별 차이 등으로 인해 삼일열 말라리아에 대한 연구나 진단, 치료에 한계가 있어왔다(Moody A., Rapid diagnostic tests for malaria parasites, Clin Microbiol Rev, 15(1), pp66-78, 2002).
이와 관련하여, 삼일열 말라리아 진단 또는 치료를 위해 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 아종 사이에서 아미노산 서열이 100% 일치하는 표면단백질 MSP (memorized surface protein)의 C-말단부위 PVC200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약(대한민국 특허등록 제0411496호), 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 말라리아 원인인 삼일열 원충(Plasmodium vivax)과 열대열 원충(Plasmodium falciparum)의 유전자를 동시에 검사하는 프라이머, 검사 방법 및 그에 사용되는 키트(대한민국 특허등록 제1312465호)에 대한 연구가 보고되어 있다. 분자진단의 경우 혈액도말법 및 항원-항체 신속진단법에 비해 높은 감도로 정확한 반면 고가의 분자진단 장비를 요하는 단점이 있어 현장에서 진단하기에는 어려움이 있어 분자진단 장비 없이 신속하고 높은 감도로 삼일열 원충에 의한 말라리아 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 방안이 필요하다. 항원-항체 신속진단법은 간편한 대신 민감도 및 위양성의 문제점이 필요하여 이를 개선할 필요성이 있다.
본 발명은 상기한 종래 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명에서는 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 프라이머 세트를 제작하고 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)를 이용하여 인간의 혈액(전혈)으로부터 신속하게 말라리아 유전자 존재 유무를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 적혈구 및 말라리아 감염모기에 존재하는 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 말라리아 감염 여부를 진단하기 고리매개등온증폭반응용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LAMP용 프라이머 세트와 Bst 폴리머라제를 이용하여 LAMP 반응 후, 탁색도 또는 형광발색으로 인간의 혈액(전혈)으로부터 말라리아 감염여부를 신속하게 확인할 수 있는 말라리아 감염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 말라리아 감염 진단용 조성물을 포함하는 말라리아 감염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 인간 혈액으로부터 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 말라리아 진단용 프라이머 세트 또는 또는 말라리아 진단용 조성물을 이용하여 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭산물을 동정하는 단계를 포함하는 말라리아 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 말라리아 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 말라리아 진단용 조성물은 유전자 증폭장치 없이 탁색도 또는 침전물 생성, 형광발색만으로도 인간의 혈액(전혈)으로부터 신속하게 말라리아 감염여부를 확인할 수 있다. 따라서 상기 프라이머 세트와 조성물은 말라리아 감염 진단용 키트 또는 말라리아 감염을 진단하는 방법으로 제공될 수 있을 것이다.
도 1은 말라리아 감염을 진단하기 위해 본 발명에서 사용한 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머 제작에 사용된 염기서열 부위와 LAMP 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명에 의해 제조된 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응 후, 수득한 LAMP 반응물에 대해 탁색도로 말라리아 유전자의 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명에 의해 제조된 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응 후, 수득한 LAMP 반응물을 스핀다운하여 반응물 침전유무로 말라리아 유전자 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 본 발명에 의해 제조된 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응 후, 수득한 LAMP 반응물의 탁색도와 반응물 침전유무 결과를 DNA laddering하여 재확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의해 제조된 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응 후, 수득한 LAMP 반응물에 SYBR Green I (x1,000) 1㎕를 첨가하여 형광 발색 유무로 말라리아 유전자 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의해 제조된 nested PCR 프라이머를 사용하여 혈액도말 말라리아 양성 환자 15명과 음성 환자 11명에 대한 전기영동 분석결과(도 4a)와 양성 환자 6명과 음성 환자 17명에 대한 전기영동 분석 결과(도 4b)를 나타낸 것이다. S; 혈액도말진단법, N; nested PCR, RDT; 항원-항체 신속진단.
도 5는 본 발명에 의해 제조된 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응 후, 수득한 LAMP 반응물을 DNA laddering한 결과를 나타낸 것이다. S; 혈액도말진단법, N; nested PCR, RDT; 항원-항체 신속진단.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 서열 내의 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
또한, 본 발명의 "프라이머"는 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트를 포함하는 말라리아 감염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP PCR 프라이머 세트 및 고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 말라리아 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위해 Bst 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
분리된 인간 혈액으로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 말라리아 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 대상 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 혈액(전혈)일 수 있으나, 삼일열 말라리아 원충에 감염되었을 것으로 의심되는 시료이면 제한되지 않는다. 상기 시료에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 대상 시료가 분리된 인간의 혈액(전혈)인 경우, 이로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, DNeasy blood & Tissue kit (Qiagen사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 Bst 폴리머라제를 첨가하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다.
상기 LAMP 반응의 어닐링 온도는 54℃~68℃일 수 있으며, 바람직하게는 58℃~66℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 64℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 탁색도, 침전물 생성, SYBR Green I을 이용한 형광 측정, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 탁색도, SYBR Green I을 이용한 형광 측정, DNA laddering일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1: 인간의 혈액(전혈)로부터 DNA 분리
말라리아 감염 양성 환자 22명과 음성 환자 27명으로부터 혈액(전혈)을 채취하여 Qiagen 사의 DNeasy Blood & Tissue kit의 매뉴얼을 참조하여 DNA를 추출하였다. 자세하게는 프로테아제 K 20㎕, 4㎕ RNase (100 ㎎/㎖)을 시료에 첨가하여 상온에서 2분간 반응시킨 후, 원심분리하여 200㎕ PBS로 현탁하였다. 20㎕ 프로테아제 K를 첨가하여 상온에서 2분간 반응시킨 후, 200㎕ AL버퍼를 첨가하여 56℃, 10분간 반응시켰다. 상기 반응물에 200㎕ 에탄올을 첨가한 후 DNeasy mini spin 칼럼으로 원심분리하였고, spin 칼럼에 500㎕ AW1 버퍼와 AW2 버퍼를 순서대로 첨가하여 원심분리한 후, DNA를 추출하였다.
실시예 2: 삼일열 말라리아 원충( Plasmodium vivax )의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머 세트 설계
삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene) 영역을 Genebank를 통하여 확보하였다. 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)에 사용할 프라이머는 OptiGene 사의 LAMP Design software를 이용하여 프라이머를 설계하였다. 본 발명에 사용한 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene, Genebank accession number U03079.1)에 특이적인 LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 1에 나타난 바와 같고, 하기 표 1에 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머 세트를 나타내었다.
본 발명에 사용된 LAMP 프라이머
명칭 프라이머(5'-3') 서열번호
F3 CAC GTA ATG GAT CCG TCC 1
B3 CCA GAT TGG CCT TAT ATT GT 2
FIP TTC TCA GGC TCC CTC TCCG CCT AAC ATG GCT ATG ACGG 3
BIP ACC AGA TCT AAG GAA GGC AGC TCT TGT CAC TAC CTC TCT TCTT 4
LPF TCG AAC TCT AAT TCC CCG TTAC 5
LPB AGG CGC GTA AAT TAC CCA AT 6
PLU5 CTT GTT GTT GCC TTA AAC TTC 7
PLU6 TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG 8
VIV1 CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC 9
VIV2 ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA 10
실시예 3: 탁색도에 의한 말라리아 유전자 검사
실시예 2에서 설계 및 제조된 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머를 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 반응에 사용하였다. 양성대조군(positive control)으로는 국군양주병원에서 혈액도말법으로 원충이 확인되고, RDT 및 Nested PCR로 양성이 확인된 검체를 사용하였다. LAMP 반응은 주형 DNA를 3㎕, Bst 폴리머라제 1㎕ (8U), 10×buffer 2.5㎕, 10mM dNTP 3.5㎕, 10mM MgSO4 1㎕, 5M betaine 5㎕, 6개의 각 프라이머 1㎕씩을 포함하는 총 25㎕의 반응액에서 수행하였다. LAMP 반응은 multi-therm (Benchmark사), heat block heater, 항온 수조(water bath) 중 하나를 선택하여 64℃, 30분간 수행하였다.
반응이 끝난 LAMP 반응물을 육안으로 확인하였다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 말라리아 감염 양성 환자(붉은색 글자, #1과 #2)의 반응시료는 양성대조군과 동일하게 탁색을 확인할 수 있었고, 반면 음성 환자(검은색 글자, #1과 #2)의 반응시료는 탁색이 전혀 관찰되지 않았다. 탁색도 결과를 검증하기 위해, 상기 반응물을 스핀다운 하여 말라리아 유전자의 반응물 존재 유무를 다시 확인한 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 양성대조군과 동일하게 말라리아 양성 환자의 LAMP 반응물만이 흰색의 침전이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 제작한 LAMP 프라이머의 정확도를 검증하기 위해 상기 육안으로 확인한 반응 시료들을 아가로즈 겔에서 DNA laddering으로 재확인한 결과, 말라리아 양성 환자의 시료(붉은색 글자, #1과 #2)에서 양성대조군과 동일한 사다리형 LAMP 증폭산물을 확인할 수 있었다(도 2c). 상기 결과로부터 본 발명에서 제작한 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 PCR 장치 또는 전기영동 분석 등과 같은 추가적인 과정 없이 LAMP 반응 후 검사자의 육안만으로도 말라리아 유전자 존재 유무를 정확하게 확인할 수 있었다.
실시예 4: 삼일열 말라리아 원충( Plasmodium vivax )의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자( blood stage small subunit rRNA gene )에 특이적인 LAMP 프라이머를 사용한 LAMP 진단법의 특이도 및 민감도 측정
말라리아 감염 양성 환자 22명과 음성 환자 27명의 혈액(전혈)으로부터 추출한 DNA를 주형으로 제작한 LAMP 프라이머로 증폭시킨 후, 증폭산물에 SYBR Green I (x1,000) 1㎕를 첨가하여 형광 발색 유무로 말라리아 유전자 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 원충혈증이 낮은 감염 양성 환자 1명(도말 음성, Nested PCR 양성, RDT 음성)을 제외한 말라리아 감염 양성 환자 21명의 반응 시료에서 밝은 녹색이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
기존의 말라리아 감염 진단 방법인 혈액도말진단법(S로 표기)과 항원-항체 신속진단법(RDT로 표기)으로 상기 말라리아 감염 양성 환자 22명과 음성 환자 27명에 대하여 말라리아 감염여부를 진단하였고, 혈액도말진단법에서 양성으로 진단된 환자의 경우 S+로, 항원-항체 신속진단법에서 양성으로 진단된 환자의 경우는 RDT+로 표기하였다. 본 발명의 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 LAMP 프라이머를 사용한 LAMP 진단법의 정확도를 혈액도말진단법과 항원-항체 신속진단법과 비교하여 보았다. 그 첫 번째 확인 과정으로 서열번호 7번 ~ 10번의 프라이머를 사용하여 nested PCR을 수행하여 혈액도말진단법과 항원-항체 신속진단법과 비교한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 혈액도말 음성, 항원-항체 신속진단법에서 양성으로 판정된 모호한 2723번 환자에서는 nested PCR 결과 말라리아 유전자가 검출되지 않아 항원-항체 위양성을 확인할 수 있었고(도 4a), 혈액도말진단법과 항원-항체 신속진단법에서 음성으로 확인된 7842번 환자에서 말라리아 유전자가 존재하는 것으로 확인되어 원충혈증이 낮은 말라리아를 진단할 수 있었다(도 4b). Nested PCR 결과와 본 발명의 LAMP 진단법으로 동일한 환자들에 대하여 비교 분석한 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 혈액도말 검사결과 음성으로 확인된 원충혈증이 낮은 1명의 환자를 제외하고, LAMP 진단으로 21명이 양성으로, 항원-항체 위양성을 포함한 27명이 음성으로 확인되어, 본 발명의 LAMP 진단법은 95%의 민감도와 100%의 특이도를 가짐을 확인할 수 있었다(도 5a와 b). 항원-항원 신속진단법에서 양성으로 확인된 1건(2723번 환자(S-, N-, RDT+))의 경우, 본 발명의 LAMP 진단법 수행 결과, 음성으로 확인되었으며(도 5b), 이러한 결과로부터 본 발명의 LAMP 진단법은 항원-항체 신속진단법보다 더 높은 특이도를 가지는 것을 최종 확인할 수 있었다.
<110> The Armed Forces Medical Command <120> Composition for diagnosing malaria infection using LAMP and uses thereof <130> PN17016 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cacgtaatgg atccgtcc 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccagattggc cttatattgt 20 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttctcaggct ccctctccgc ctaacatggc tatgacgg 38 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accagatcta aggaaggcag ctcttgtcac tacctctctt ctt 43 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcgaactcta attccccgtt ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aggcgcgtaa attacccaat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cttgttgttg ccttaaactt c 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttaaaattgt tgcagttaaa acg 23 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgcttctagc ttaatccaca taactgatac 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acttccaagc cgaagcaaag aaagtcctta 30

Claims (5)

  1. 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자(blood stage small subunit rRNA gene)에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 말라리아 감염 여부를 진단하기 위한 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 따른 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트를 포함하는 말라리아 감염 진단용 조성물.
  3. 제1항에 따른 프라이머 세트 및 고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 말라리아 감염 진단용 키트.
  4. 분리된 인간 혈액으로부터 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 혈액 단계의 소단위 rRNA 유전자에 특이적인 서열을 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성, 형광발색 또는 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 말라리아 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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