KR101312465B1 - 말라리아의 원인인 삼일열 원충과 열대열 원충의 감염 진단을 위한 유전자 검사용 프라이머, 이의 검사 방법과 검사 키트 - Google Patents

말라리아의 원인인 삼일열 원충과 열대열 원충의 감염 진단을 위한 유전자 검사용 프라이머, 이의 검사 방법과 검사 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응(realtime Polymerase Chain Reaction: RT-PCR) 방법을 이용하여 말라리아의 원인인 삼일열 원충(Plasmodium vivax)과 열대열 원충(Plasmodium falciparum)의 유전자를 동시에 검사하는 프라이머, 검사 방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명이다. 본 발명은 상기 2종의 말라리아 유전자를 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 가지고 검사할 수 있는 프라이머, 검사방법 및 그 키트를 제공한다.

Description

말라리아의 원인인 삼일열 원충과 열대열 원충의 감염 진단을 위한 유전자 검사용 프라이머, 이의 검사 방법과 검사 키트{PRIMEMRS AND METHODS FOR DETECTING PLASMODIUM VIVAX AND PLASMODIUM FALCIPARUM CAUSING MALARIA, AND DETECTION KIT THEREOF}
본 발명은 말라리아의 원인인 삼일열 원충 또는 열대열 원충 유전자 증폭용 프라이머 세트, 이를 이용한 검사 방법 및 검사 키트에 관한 것이다.
말라리아(Malaria)는 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)가 옮기는 전염병으로, 매년 2~3억 명의 사람이 감염되고 수백만 명이 사망하는 주로 열대 지방에서 발병되는 질병이다.
원인 기생충은 Plasmodium vivax (삼일열 원충), Plasmodium faciparum(열대열 원충), Plasmodium malariae(사일열 원충), Plasmodium ovale(난형열 원충) 등이 있다. 이중 열대열 원충이 감염의 가장 큰 원인이며 증상도 가장 심각하다. 합병증으로는 빈혈, 황달, 뇌성 말라리아, 신부전, 흑수열(용혈성 빈혈과 혈색소뇨증)등이며, 전 세계적으로 열대열 원충 감염이 주요 사망 원인이 되고 있다.
말라리아는 이환율과 사망률이 높은 질환으로, 결핵을 제외하고 전염병 중 가장 많은 사람들을 사망에 이르게 한다. 주 감염원은 암컷 아노펠레스 모기(Anopheles mosquito)이지만, 일부는 수혈이나 수직 감염 등이 감염 원인이 되기도 한다. 최근 국내 말라리아 감염 실태는 대부분 휴전선 인근에서 주로 발생되었으나 서울 강북 지역까지 남하한 상태여서 국민 보건향상에 위협이 되고 있다.
기존의 말라리아 검사는 말초혈액 도말검사, 항원검사, 항체검사, 유전자 검사 등이 있다. 말초혈액 도말검사는 박층 또는 후층도말법, 김사(Giemsa) 염색법 등이 보편적으로 사용되고 있다. 이 중 김사(Giemsa) 법이 라이트(Wright) 염색법보다, 박층보다 후층도말법이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 원충 확인시, 이물이나 혈소판을 말라리아 원충으로 오인하는 실수를 범할 수 있는 광학현미경을 사용하므로, 숙련된 검사자를 필요로 하는 단점이 있다.
형광현미경을 사용하는 아크리딘 오렌지 등 형광 염색법이 경제적이고 타염색법보다 빠른 시간 내에 검사할 수 있는 장점이 있다. 그러나 검사자의 주관적 판단이 개입될 수 있는 문제점이 있다.
형광염색법을 이용하여 유세포 측정기로 검사하는 방법도 현재 기생출형증( parasitemia) 검사 목적 이외에는 사용되지 않는다. 원충 항원검사는 단클론성 항체를 이용하여 항원 캡쳐(Antigen capture) ELISA법으로 일부 사용되고 있는데, 예민도가 낮은 문제점이 있다. 이뮤노캡쳐(Immnuocapture)(Dipstick) 방법은 여러 제품이 개발되어 있으나, 서로 다른 표적 항원을 사용하며 예민도가 기존 방법보다 낮고 방법상 위양성이 존재하는 것으로 알려져 있다.
원충 항체검사는 역학 조사와 혈액 제제의 선별 검사용으로 사용되거나, 일부 항체의 경우 진단용으로 사용되는데, 항체가 존재한다고 해서 말리라아 항원이 혈중에 존재하는 것이 아니므로 치료 목적의 검사는 부적절한 점이 있다.
원충 유전자 검사 방법으로는, 원충의 CS(Circumsporozoite protein), MSP-1(Merozoite surface protein 1), EBP(Erythrocyte binding protein) 또는 18S 리보솜 RNA를 암호화 하는 유전자에 대해 중합 효소 연쇄반응을 실시함으로써 말라리아 감염 여부를 검사하는 방법이 있다.
검사 방법 중 예민도가 가장 높으며 유전자 증폭 후 PCR 도트 블랏팅, SSCP, 염기서열 분석을 이용하여 종을 분류할 수 있으나, 비용과 검사 시간이 많이 들고 정량화가 불가능하다는 단점이 있다.
최근 많이 사용되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하는 말라리아 원충 유전자 검사 방법은, 기존 중합효소 연쇄반응을 이용한 검사 방법에 비해 경제적이고 검사 시간이 상대적으로 짧으며, 그리고 말라리아 원충의 혈중 농도를 알 수 있는 정량화된 검사 방법이다. 말라리아의 치료 또는 치료 후 모니터링에 박층 도말 및 후층 도말법이 현재 사용되지만, 형광염색이나 유전자 증폭 같은 예민도가 높은 방법이 권장되고 있다.
본 발명의 목적은 말라리아의 원인인 삼일열 원충 또는 열대열 원충 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 삼일열 원충과 열대열 원충을 1회의 검사로 진단할 수 있고, 동시에 각 말라리아 원충의 혈중 농도를 검사할 수 있는 정량화된 검사 방법 및 검사 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 프라이머, 검사시약을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머와; 서열번호 6 내지 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 1종 이상 포함하는, 말라리아의 원인인 삼일열 원충 또는 열대열 원충 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 이루어진 프라이머는 업스트림 프라이머이고, 상기 서열번호 6 내지 9의 염기서열로 이루어진 프라이머는 다운스트림 프라이머이다. 상기 서열번호 1 내지 5에서 선택되는 하나의 프라이머과 상기 서열번호 6 내지 9에서 선택되는 하나의 프라이머가 조합되어 프라이머쌍을 이루어 유전자 증폭용 프라이머 세트로서의 역할을 한다.
구체적인 프라이머세트의 예로는, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 1 및 8의 염기서열을 가지는 프라머쌍; 서열번호 2 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 2 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 5 및 9의 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 들 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 5의 5' 말단에는 형광물질이 부착되어 검출을 용이하게 수행할 수 있다. 상기 형괄물질은 이 기술분야에서 사용되는 형괄물질이라면 제한없이 사용될 수 있다. 구체적으로 상기 형광 물질은 Sybergreen, Evagreen, Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), (5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 방법을 제공한다. 구체적인 검사 방법은 다음과 같다:
혈액 또는 혈액지(paper) 검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 DNA를, 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머와; 서열번호 6 내지 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 1종 이상 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 유전자를 증폭하는 단계; 및
상기 유전자 증폭물을 멜팅 커브(melting curve) 분석법을 이용하여 삼일열 또는 열대열 원충의 유전자형을 확인하는 단계.
혈액 또는 혈액지(paper) 검체로부터 DNA를 추출하는 단계에서는, 전혈 또는 채혈지 검체로부터 DNA을 추출하기 위해 세포 용해 용액으로 세포를 용해하여 DNA을 얻는다.
다음 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 유전자를 증폭하는 단계에서는, 상기 DNA를 삼일열 원충 및/또는 열대열 원충 유전자에 특이적인 프라이머인 5' PCR 프라이머와 3' PCR 프라이머의 프라이머 세트로 실시간 중합효소 연쇄반응 시약을 사용하여 유전자를 증폭한다. 상기 5' PCR 프라이머는 서열번호 1 내지 5에, 3' PCR 프라이머른 서열번호 6 내지 9에 기재되었다.
상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 1 및 8의 염기서열을 가지는 프라머쌍; 서열번호 2 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 2 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 7의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 5 및 9의 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 유전자 증폭물을 멜팅 커브(melting curve) 분석법을 이용하여 삼일열 또는 열대열 원충의 유전자형을 확인하는 단계에서는, 실시간 유전자 증폭기기를 이용 95℃부터 50℃까지 멜팅 커브를 작성하여 삼일열 원충과 열대열 원충의 유전자 증폭물의 멜팅 온도를 결정하여 종을 구분할 수 있다. 구체적으로, 상기 멜팅 커브 분석법은, 상기 유전자 증폭물을 95℃에서 50℃까지 0.1℃의 기울기로 멜팅 커브 분석을 시행함으로써 수행될 수 있다.
또한 본 발명은, DNA 추출 시약; 및 상기프라이머 세트를 포함하는 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 키트를 제공한다.
상기의 삼일열 및 열대열 원충 유전자에 대한 실시간 유전자 증폭에 사용되는 프라이머 세트의 염기 서열 구조는 하기 표1에 기재되어 있다.
본 발명의 검사 키트를 제작하기 위해 하기와 같은 시약, 기구 및 장치로 키트를 구성하였다(도 1 참고).
세포로부터 DNA를 추출하기 위한, 단백질 분해효소(proteinase K)와 추출 용액(10mM Tris-Cl, 7% chelex)이 담겨진 30 ㎖ 튜브;
삼일열 및 열대열 원충 유전자의 실시간 증폭을 위한,
① Taq DNA 중합효소 250 unit(Amplitaq, PE, 미국);
② 프리믹스(Premix) 1 용액[2X PCR 버퍼(100 mM-KCl, 20mM Tris-HCl(pH8.0), 2.0 mM MgCl2), 2.5 mM dNTP, 20 pmol 5' 및 3' 프라이머, 0.001% Sybergreen 또는 Evagreen];
③ 양성대조[pGEM-T vector 에 포함된 삼일열 원충(Genbank No. U83877) 또는 열대열 원충(Genebank No. AL010278)의 18S rRNA 유전자 100 ng/ul]
④ 음성대조 [인간 지노믹(genomic) DNA 100 ng/ul] 및
⑤ 증류수,
그리고 실시간 유전자 증폭물에서 삼일열 및 열대열 원충의 종을 구별하기 위한, Roche사의 LC480(Roche Diagnostics, USA)
등으로 구성되어 있다.
상기 시약, 기구 및 장비들로 혈액 및 혈액지 검체로부터 삼일열 및 열대열 원충의 감염을 진단을 할 수 있으며, 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 검사를 키트화하였다.
1) 세포로부터 DNA 추출을 위한,
① 추출 용액(10mM Tris-HCl(pH8.4), 7% chelex, 20mg/ml proteinase K)이 담겨진 30 ㎖튜브
2) 삼일열 및 열대열 원충 실시간 유전자 증폭을 위한,
① Taq 중합효소 250 unit (Amplitaq, PE, 미국)
② 프리믹스(Premix) 1 용액[2X PCR 버퍼(100 mM-KCl, 20mM Tris-HCl(pH8.0), 2.0 mM MgCl2), 2.5 mM dNTP, 20 pmol 5' 및 3' 프라이머, 0.001% Sybergreen 또는 Evagreen];
③ 양성대조 100 ng/ul 농도의 1.5 ㎖ 튜브
④ 음성대조 100 ng/ul 농도의 1.5 ㎖ 튜브
⑤ 증류수 1 ml의 1.5 ㎖ 튜브
본 발명은 삼일열 원충과 열대열 원충에 특이적인 유전자 증폭용 프라이머를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 프라이머를 이용하여 단 1회의 검사로 삼일열 원충과 열대열 원충 유전자를 검사할 수 있고, 동시에 각 말라리아 원충의 혈중 농도를 검사할 수 있는 정량화된 검사 방법 및 검사 키트를 제공하는 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 삼일열 원충과 열대열 원충 감염을 진단하는 유전자 검사 방법 및 키트는, 감염된 말라리아 원충의 혈중 농도를 계산할 수 있는 정량성을 제공하므로 기존 방법보다 말라리아 감염 여부 및 치료 후 모니터링에 신속하고 정확하게 적용할 수 있다.
아울러 본 발명에 따른 검사 방법은 감염 여부를 확인하기까지의 시간이 총 2시간 이내이기 때문에 산업적으로 매우 유용한 검사 방법이다.
도 1은 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 키트를 구성하고 있는 성분을 나타내고 있는 사진이다.
도 2a 내지 2c는 삼일열 원충의 실시간 유전자 증폭 검사의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 열대열 원충의 실시간 유전자 증폭 검사의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 4d는 삼일열 및 열대열 원충 중복 감염 검체에서의 각 종의 구별 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 5h는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 생성물이 삼일열 원충과 열대열 원충 각각의 유전자를 정확하게 증폭했는지를 확인하기 위한 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 말라리아에 감염된 검체에서 추출된 유전자에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응시 농도에 따른 Ct 값의 변화를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 혈액 또는 혈액지 검체로부터 DNA의 추출
전혈 50 ul 또는 채혈지 검체 직경 0.5 cm을 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 넣고 Tris-Cl(10 mM, pH 8.0) 1ml를 넣은 후 1,000G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버린 후 추출 용액(10 mM Tris-HCl(pH8.0), 7% chelex, 20 mg/ml proteinase K)로 재부유하였다. 이를 55℃, 1 시간 동안 방치한 후 100℃에서 10분간 배양하고 1,4000g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 유전자 검사에 이용하였다. 기존의 추출 방법과 비교하면, 기존의 추출방법에서 사용하는 유기용매를 사용하지 않기 때문에 환경 오염의 위험성을 제거 할 수 있다.
실시예 2 : 삼일열 및 열대열 원충 유전자의 검사 방법
실시간 유전자 증폭 방법을 사용하였다. 말라리아 진단을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 2의 각 프라이머 세트를 사용하였다. 실시간 유전자 증폭을 위해 검체를 0.2 ㎖ PCR 튜브에 5.0 ㎕씩 넣어 PCR 시행 전에 95℃에서 10 분동안 전변성처리(pre-denaturation)하였다. 2X 프리믹스 버퍼 10.0 ㎕, Taq 중합효소 0.3 ㎕, 주형 DNA 5 ㎕를 포함하여 증류수로 20 ㎕가 되게 하였다. 실시간 유전자 증폭은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분씩 40회를 시행하였다(LC480, Roche Diagnostics). 실시간 유전자 증폭이 끝난 후 유전자 증폭물은 95℃에서 50℃까지 0.1℃의 기울기로 멜팅커브 분석법을 시행하였다(LC480, Roche Diagnostics).
삼일열 원충과 열대열 원충 각각의 유전자 검사결과는 멜팅 커브 분석에서 각각의 프라이머 세트에서 모두 유전자 증폭이 확인 되었다(도 1 내지 2).
프라이머 염기서열 구조
서열번호 이름 구분 염기서열
1 mG-F1 업스트림 GAA CGA GAT CTT AAC CTG C
2 mG-F2 업스트림 AAC GAG ATC TTA ACC TGC T
3 mG-F3 업스트림 CGA GAT CTT AAC CTG CTA A
4 mG-F4 업스트림 TCT TAA CCT GCT AAT TAG C
5 mG-F5 업스트림 CTT AAC CTG CTA ATT AGC G
6 mG-R1 다운스트림 GTT CCT CTA AGA AGC TTT A
7 mG-R2 다운스트림 ACC TGT TGT TGC CTT AAA C
8 mG-R3 다운스트림 AGA CCT GTT GTT GCC TTA A
9 mG-R4 다운스트림 CAT CAC AGA CCT GTT GTT G
프라이머 세트 구성
프라이머 세트 5' 프라이머 3' 프라이머
1 mG-F1 mG-R2
2 mG-F1 mG-R3
3 mG-F2 mG-R1
4 mG-F2 mG-R3
5 mG-F3 mG-R3
6 mG-F4 mG-R1
7 mG-F5 mG-R1
8 mG-F5 mG-R4
실시예 3 : 삼일열 및 열대열 원충의 중복 감염 검체에서의 검사
실시예 2와 동일한 실시간 유전자 증폭 방법을 사용하였다. 말라리아 진단을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 2의 각 프라이머 세트를 사용하였다. 실시간 유전자 증폭을 위해 검체를 0.2 ㎖ PCR 튜브에 5.0 ㎕씩 넣어 PCR 시행 전에 95℃에서 10분 동안 전변성처리하였다. 프리믹스 버퍼 10.0 ㎕, 20 pmol 프라이머 2.0 ㎕, 주형 DNA 5 ㎕를 포함하여 증류수로 20 ㎕가 되게 하였다. 실시간 유전자 증폭은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초씩 40회를 시행하였다(LC480, Roche Diagnostics). 실시간 유전자 증폭이 끝난 후 유전자 증폭물은 95℃에서 50℃까지 0.1℃의 기울기로 멜팅 커브 분석을 시행하였다(LC480, Roche Diagnostics).
삼일열 원충과 열대열 원충의 중복 감염 검사 결과, 멜팅 커브 분석시 서로 다른 온도에서 피크를 보여 각각의 유전자가 구별이 가능하여 원충종의 구별이 가능한 것을 알 수 있다(표 3 및 도 4).
[표 3] 각 프라이머세트에 따른 삼일열 및 열대열 원충 중복감염 검체에서의 각 종에 따른 Tm값 비교
Figure 112010007152202-pat00001

실시예 4: 본 발명의 검사 방법과 염기서열 분석 방법의 비교
실시간 중합효소 연쇄 반응후 PCR 생성물이 삼일열 원충과 열대열 원충 각각의 유전자를 정확하게 증폭했는지를 확인하기 위하여 염기서열 분석을 시행하였다. 각 검체의 PCR 생성물을 주형으로 PCR 생성물 5 ㎕에 빅다이(Bigdye) 8 ㎕, 각 유전자의 5' 프라이머 1 ㎕를 포함하여 증류수로 총 20 ㎕가 되게 하였다. 염기서열 분석 반응은 95℃에서 2분 동안 변성하고 95℃ 20초, 50℃ 5초, 60℃ 2분을 25회 실시하여 수행하였다(ABI3100, Applied Biosystems). 염기서열 분석 결과 각 검체별 본 발명의 검사 방법과 결과가 모두 일치함을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5: 삼일열 원충과 열대열 원충 유전자 검사를 위한 검사 방법과 검사 키트화
본 발명의 검사 키트는 혈액 또는 혈액지 검체에서 DNA를 추출하는 기구와 시약을 키트화한 부분과, 삼일열 원충과 열대열 원충의 유전자를 실시간 중합효소 연쇄반응에 필요한 시약을 키트화 한 부분으로 구성된다(도 1).
5-1: DNA 추출 방법의 키트화
실시예 1에서 기재된 바에 따라 제조된 기구와 시약을 키트화하였다. 단백질 분해효소(protienase K, Sigma, 미국) 20 mg/ml 농도와 chelex 7%가 담겨진 30 ml 튜브로 구성되는데, 모두 실온에 보관한다. 처리 조작 및 사용 방법은 실시예 1과 동일하다.
5-2: 실시간 중합효소 연쇄반응을 위해 구성된 시약의 키트화
실시예 2에 기재된 바에 따라, 삼일열 원충과 열대열 원충의 실시간 유전자 증폭을 위한 시약을 키트화하였다. 그 구성은 ① Taq. DNA 중합효소(Amplitaq, PE, 미국)가 250 unit 포함된 1.5 ml 튜브; ② 프리믹스 1 용액 1 ml가 포함된 1.5 ml 튜브[2X PCR 버퍼(100 mM-KCl, 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 2.0 mM MgCl2), 2.5 mM dNTP, 20 pmol 5' 프라이머, 20 pmol 3' 프라이머], ③. 100 ng/ul 양성대조 유전자가 100 ul가 포함된 1.5 ml 튜브; ④ 100 ng/ul 음성대조 유전자가 100 ul가 포함된 1.5 ml튜브 및 ⑤ 증류수 1 ml가 포함된 1.5 ml 튜브이다. 이들 모두는 -20℃ 냉동고에 보관하고 사용 방법은 실시예 2와 동일하다.
본 발명의 말라리아 진단을 위한 삼일열 및 열대열 원충의 유전자 검사를 위한 시약들을 키트화하면 다량의 검체에 대한 검사를 시간과 노력을 줄이며 손쉽게 할 수 있다.
실시예 6: 삼일열 원충과 열대열 원충 유전자 검사시의 정량성 테스트
실시예 2와 같은 방법으로 삼일열 원충과 열대열 원충의 실시간 유전자 증폭을 하였다. 말라리아에 감염된 검체에서 추출된 유전자 300 ng/ul를 5배씩 계열 희석하여 60 ng/ul, 12 ng/ul, 2.5 ng/ul의 검체에 대해 실시간 중합효소 연쇄반응시 농도에 따라 Ct 값의 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 포함하는, 말라리아의 원인인 삼일열 원충 또는 열대열 원충 유전자 증폭용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 5' 말단에 형광물질이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 말라리아의 원인인 삼일열 원충 또는 열대열 원충 유전자 증폭용 프라이머 세트.
  4. 혈액 또는 혈액지 검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 DNA를, 서열번호 1 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 유전자를 증폭하는 단계; 및
    상기 유전자 증폭물을 멜팅 커브(melting curve) 분석법을 이용하여 삼일열 또는 열대열 원충의 유전자형을 확인하는 단계;
    를 포함하는 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 상기 멜팅 커브 분석법은, 상기 유전자 증폭물을 95℃에서 50℃까지 0.1℃의 기울기로 멜팅 커브 분석을 시행하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 방법.
  7. DNA 추출 시약; 및
    제1항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트
    를 포함하는 말라리아 진단을 위한 삼일열 원충 또는 열대열 원충의 유전자 검사 키트.
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