PL230445B1 - Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozy - Google Patents
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozyInfo
- Publication number
- PL230445B1 PL230445B1 PL412309A PL41230915A PL230445B1 PL 230445 B1 PL230445 B1 PL 230445B1 PL 412309 A PL412309 A PL 412309A PL 41230915 A PL41230915 A PL 41230915A PL 230445 B1 PL230445 B1 PL 230445B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- detection
- identification
- protozoa
- babesia
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Dziedzina techniki
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, zwłaszcza w materiale genetycznym izolowanym od ludzi i zwierząt, zwłaszcza z wykorzystaniem technik amplifikacji kwasów nukleinowych, zwłaszcza PCR i Real-time PCR, zwłaszcza w wersji „single-tube”. Przedmiotem wynalazku jest również starter do zastosowania w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia babeszjozą lub nosicielstwa babeszjozy, służący do wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia.
Stan techniki
Babesia to niewielkie pierwotniaki pasożytujące w krwinkach czerwonych człowieka i zwierząt. Choroba wywołana inwazją Babesia, nazywana babeszjozą (albo szerzej: piroplazmozą), stanowi poważny problem medyczny i weterynaryjny. Do tej pory odkryto i opisano ponad 100 różnych gatunków oraz szczepów tych pierwotniaków, które występują na całym świecie. Zachorowania u ludzi wywołuje kilka różnych gatunków Babesia, spośród których najczęściej rejestrowano inwazje wywoływane: B. microti, B. divergens i B. venatorum - znane też pod nazwą Babesia sp. EU1 (doi: 10.1016/j.ijppaw.2012.11.003). Natomiast u psów zachorowania powodują 3 gatunki Babesia, a w Polsce najczęściej B. canis (doi: 10.1016/j.vetpar.2011.04.023).
Pierwotniaki z rodzaju Babesia są organizmami, które w cyklu rozwojowym wymagają obecności dwóch różnych żywicieli: pośredniego - ludzie i zwierzęta, oraz ostatecznego - kleszcza, najczęściej lxodidae. Zarażenie określonym gatunkiem Babesia zależy od regionu geograficznego, co jest związane z występowaniem właściwych wektorów i żywicieli pośrednich (doi: 10.1186/1471-2334-13-99). Dane epidemiologiczne wskazują na geograficzną ekspansję oraz stały wzrost liczby przypadków babeszjozy. Coraz większy problem stanowią inwazje pierwotniaków z rodzaju Babesia, które szerzą się drogą krwionośną poprzez transfuzje (Kogut et al. Emerg Infect Dis. 2005;11(3):476-8) i/lub transplantacje narządów (Slovut et al. Transplantation. 1996;62(4):537-9). Opisano także kilka przypadków babeszjozy wrodzonej (Yeruham et al. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2003;50(2):60-2).
Podstawę diagnostyki inwazji pierwotniaków z rodzaju Babesia stanowią mikroskopowe badania rozmazów krwi: grubej kropli i cienkiego rozmazu. Ze względu na ograniczenia metod mikroskopowych w diagnostyce inwazji pierwotniaków z rodzaju Babesia stosowane są dodatkowe techniki badań laboratoryjnych takie jak: badania serologiczne na obecność swoistych przeciwciał IgG i/lub IgM technikami immunofluorescencji pośredniej (IFA), ELISA, immunoblotingu, immunochromatografii, ale metody te także mają ograniczenia. Większość dostępnych obecnie komercyjnie testów IFA i ELISA jest dostosowana do wykrywania inwazji B. microti i nie wykrywają zarażeń wywołanych szczepami dominującymi w Europie tj: B. divergens, B. divergenslike oraz B. venatorum. U pacjentów z infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi, chorobami autoimmunologicznymi, tkanki łącznej, czy malarią często występują wyniki fałszywie dodatnie (doi: 10.1155/2009/984568). Testy serologiczne nie są zalecane jako samodzielne badanie w diagnostyce babeszjozy, ani do wykrywania bardzo niskiego poziomu przeciwciał, ponieważ mogą dawać wyniki fałszywie ujemne w badaniach wczesnych stadiów choroby, u pacjentów po splenektomii, w immunosupresji, czy chorych na AIDS (Schaarschmidt et al. Schweiz Arch Tierheilkd. 2006;148(12):633-40).
W laboratoriach referencyjnych do wykrywania inwazji Babesia stosuje się metodę polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), która jest ok. 10-krotnie bardziej czuła niż mikroskopowa ocena rozmazów w wykrywaniu fazy ostrej babeszjozy (doi: 10.1128/JCM.05848-11). Na rynku są dostępne testy PCR i Real-time PCR, które zostały opracowane głównie na potrzeby weterynaryjnych laboratoriów diagnostycznych (Espy et al. Clin Microbiol Rev. 2006; 19(1): 165-256), ale są one zwykle specyficzne dla wybranego szczepu lub genotypu (Persing et al. J Clin Microbiol. 1992;30(8):2097-103; Kim et al. Am J Trop Med Hyg. 2007;77(5):837-41), mają ograniczenia w stosowaniu w badaniach środowiskowych (Herwaldt et al. Emerg Infect Dis. 2003;9(8):942-8), wymagają sekwencjonowania, lub wymagają dodatkowego trawienia enzymami restrykcyjnymi w celu określenia gatunku Babesia (Bonnet et al. Parasitology. 2007;134(2):197-207).
Ujawnienie istoty wynalazku
Istotę wynalazku stanowi wykrywanie i/lub identyfikacja i/lub różnicowanie pierwotniaków z rodzaju Babesia w jednej reakcji w oparciu o amplifikację kwasu nukleinowego z zastosowaniem specyficznych starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji genów kodujących małą podjednostkę
PL 230 445 Β1 rybosomu (18S rRNA) Babesia zdeponowanych w bazie GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): przy wykorzystaniu nowych starterów według wynalazku tj.:
starter sensowny Primer 1 (TGACCTAAACCCTCACCAGAGTAAC), SEQ ID NO:1, starter sensowny Primer 2 (GAATCTAAACCCTTCCCAGAGTATC), SEQ ID NO: 2, starter antysensowny Primer 3 (GCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTTA), SEQ ID NO: 3.
Numery identyfikacyjne sekwencji wyjściowych (GenBank ID), pozycję starterów oraz wielkość uzyskiwanego amplikonu z ich zastosowaniem przedstawiono w zestawieniu poniżej, w Tabeli 1:
Tabela 1:
Startery do wykrywania i różnicowania pierwotniaków z rodzaju Babesia
| Gatunek patogenu GenBankID | Lokalizacja startera | Wielkość uzyskiwanego amplikonu (pz) | ||
| Primer 1 | Primer 2 | Primer 3 | ||
| B. divergens AY144688 | 35-59 | - | 393-415 | 381 |
| B. microti JO711225 | 21-45 | 406-428 | 407 | |
| B. venatorum JX040642 | 22-46 | - | 380-402 | 381 |
| B. canis AY072926 | 481-503 | 839-861 | 381 |
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest wykrywanie i/lub identyfikacja, korzystnie w czasie rzeczywistym, pierwotniaków z wielu różnych gatunków rodzaju Babesia, w tym: B. microti, B. venatorum (= Babesia sp. EU1), B. canis, B. divergens, w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, sposobem według wynalazku obejmującym jedną reakcję amplifikacji kwasów nukleinowych z zastosowaniem trzech zaprojektowanych starterów według wynalazku: Primer 1, Primer 2, Primer 3. Jak stwierdzili Twórcy, ze względu na ryzyko kontaminacji materiałem genetycznym: Plasmodium, Toxoplasma albo żywiciela, dla uzyskania efektu, jakim jest zapewnienie możliwości wykrywania i/lub identyfikacji wielu różnych gatunków z rodzaju Babesia, przy wykorzystaniu jednej reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych, konieczne jest stosowanie starterów hybrydyzujących dokładnie w miejscach przedstawionych w Tabeli 1. Twórcy wykazali, że przesunięcie miejsca hybrydyzacji starterów nawet jedynie o jedną pozycję skutkuje obniżeniem skuteczności przeprowadzanej reakcji np. przesunięcie startera Primer 3 o jeden nukleotyd w kierunku 3’, obniża stabilność 3’-końca, prowadzi do powstawania oddziaływań typu primer-dimer (AG-6,09 kcal/mol) oraz tworzenia struktury typu hairpin (tzw. spinki do włosów, AG-1,59 kcal/mol), a tym samym utrudnia poprawne oddziaływanie starterów z matrycowym DNA. Sposobem według wynalazku można prowadzić detekcję i/lub identyfikację pierwotniaków z wielu różnych gatunków rodzaju Babesia w celu diagnostyki objawowej babeszjozy jak i bezobjawowej babeszjozy.
Przedmiotem wynalazku jest więc sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, który obejmuje następujące etapy
a) amplifikacji kwasów nukleinowych w jednej reakcji, z zastosowaniem starterów: Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3;
b) detekcji; oraz ewentualnie
c) identyfikacji.
Detekcję, czyli wykrywanie prowadzi się w celu stwierdzenia zajścia lub braku zajścia amplifikacji kwasów nukleinowych w określonej próbce zawierającej kwasy nukleinowe jak i w celu analizy właściwości, szczególnie fizycznych, uzyskanych produktów amplifikacji.
Identyfikacja prowadzona jest w oparciu o analizę porównawczą danych, dla zamplifikowanych, bądź nie, kwasów nukleinowych uzyskiwanych dla prób badanych z wynikami uzyskiwanymi dla zamplifikowanych, bądź nie, kwasów nukleinowych dla kontroli (szczególnie kontroli pozytywnej), dostoso
PL 230 445 Β1 waną do konkretnej metody detekcji. Identyfikacja korzystnie prowadzona jest w oparciu o analizę porównawczą danych uzyskiwanych dla prób badanych z wystandaryzowanymi wynikami wyznaczonymi dla prób kontrolnych dla różnych gatunków DNA kontrolnego, szczególnie dla B. microti, lub B. venatorum, lub B. canis, lub B. divergens. Pozwala to przyspieszyć proces wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, pozwala na uzyskanie pewnego rezultatu wyniku i prowadzi do oszczędności wykorzystywanych odczynników, ma więc wymiar ekonomiczny.
Identyfikację prowadzi się w oparciu o analizę porównawczą uzyskanych krzywych nieznanej próbki z krzywą uzyskaną dla próby kontrolnej zawierającej przykładowo 10, lub 25, lub 50 ng/1 μΙ DNA kontrolnego B. microti, lub B. venatorum, lub B. canis, lub B. divergens poprzez analizę krzywych topnienia, uzyskanych produktów amplifikacji, w wysokiej rozdzielczości (HRM).
W jednym przykładzie wykonania opisanym poniżej, stosowane są startery Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3.
W innym przykładzie wykonania stosowane są startery Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3.
W jeszcze innym przykładzie wykonania, poza starterami Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3, dodatkowo stosowany jest jeden lub więcej innych starterów.
Korzystnie, na etapie amplifikacji kwasów nukleinowych hybrydyzację starterów przeprowadza się w temperaturze w zakresie 55-63°C.
W korzystnym przykładzie wykonania, etap amplifikacji kwasów nukleinowych przeprowadzany jest metodą klasycznej reakcji PCR, multipleks PCR, Real-time PCR.
Korzystnie w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia etap detekcji prowadzi się z zastosowaniem technik wybranych z analizy właściwości fizycznych uzyskanych produktów amplifikacji, korzystnie analizy krzywych topnienia, uzyskanych produktów amplifikacji, w wysokiej rozdzielczości (HRM), technik detekcji z wykorzystaniem sond molekularnych, sekwencjonowania produktów amplifikacji, analizy wielkości i/lub masy produktów amplifikacji, różnic w migracji konformerów produktów amplifikacji, amplifikacji i/lub analizy polimorfizmu miejsc restrykcyjnych.
Korzystnie w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, etap identyfikacji prowadzi się w oparciu o analizę porównawczą danych uzyskiwanych dla prób badanych z wynikami uzyskiwanymi dla kontroli dostosowanymi do konkretnej metody detekcji.
Najkorzystniej w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, zarówno etap amplifikacji kwasów nukleinowych jak i etap detekcji przeprowadzane są w jednym naczyniu („single-tube”).
W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania sposobu wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia amplifikacja kwasów nukleinowych prowadzona jest metodą Real-time PCR a etap detekcji prowadzony jest za pomocą analizy krzywych topnienia, uzyskanych produktów amplifikacji, w wysokiej rozdzielczości (HRM) z jednoczesnym etapem identyfikacji.
Korzystnie w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, próbki zawierające kwasy nukleinowe zostały uzyskane z tkanek ludzi i/lub zwierząt, w tym pajęczaków, korzystnie z krwi ludzi i/lub zwierząt.
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku pozwala na wykrycie materiału genetycznego pierwotniaków z wielu gatunków rodzaju Babesia (w tym: B. canis, B. divergens, B. microti, B. venatorum), z wykorzystaniem różnych metod opartych na PCR. W opisanych w literaturze i dostępnych na rynku testach wykrywających pierwotniaki z rodzaju Babesia w oparciu o techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, wykorzystane w reakcji startery ściśle definiują odmianę PCR, w jakiej mogą zostać wykorzystane. Sposób amplifikacji DNA Babesia według wynalazku za pomocą specyficznych starterów, według wynalazku, charakteryzuje się uniwersalnością, co znaczy, że możliwe jest zastosowanie starterów: Primer 1 i Primer 2 i Primer 3, w postaci zestawu do multipleks PCR. Sposób według wynalazku pozwala na wykorzystanie tego samego zestawu starterów według wynalazku w kilku odmianach PCR: klasycznej reakcji PCR, multipleks PCR, Real-time PCR. Korzystnie reakcję prowadzi się w temperaturze hybrydyzacji starterów w zakresie 55-63°C. Hybrydyzację starterów można również prowadzić w innym zakresie temperatur.
Wsposobie według wynalazku uzyskiwane są amplikony, które w zależności od gatunku Babesia różnią się wielkością od ok. 380 do ok. 410 par zasad i/lub sekwencją nukleotydową. Korzystnie bada się właściwości fizyczne produktów amplifikacji, zwłaszcza temperaturę topnienia, z wykorzystaniem analizy krzywych topnienia. Rozwiązanie według wynalazku pozwala na łatwiejszą niż w przypadku
PL 230 445 Β1 sposobów ze stanu techniki identyfikację gatunku i/lub genotypu Babesia na podstawie różnic we właściwościach fizycznych produktów PCR, zwłaszcza wyrażonych w postaci krzywych topnienia DNA, w korzystnym przykładzie wykonania w formacie „single tubę” (amplifikacja, detekcja i identyfikacja w jednym naczyniu reakcyjnym, w jednej reakcji).
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku pozwala też na identyfikację materiału genetycznego pierwotniaków z rodzaju Babesia poprzez sekwencjonowanie produktów amplifikacji.
Sposób według wynalazku znajduje zastosowanie w diagnostyce medycznej, diagnostyce weterynaryjnej, w badaniach epidemiologicznych i w badaniach środowiskowych.
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku skraca czas wykonania badań detekcji i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia. \N korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku zmniejsza się ryzyko kontaminacji badanej próby kwasów nukleinowych (rekcja typu „single-tube”).
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku pozwala obniżyć koszty wykonania badań, ponieważ: zmniejsza zużycie odczynników, nie wymaga sekwencjonowania, nie wymaga zastosowania enzymów restrykcyjnych.
Sposób według wynalazku pozwala na wykrywanie nieopisanych dotychczas wariantów genetycznych Babesia.
Sposób według wynalazku może zostać zaadaptowany do stworzenia komercyjnego testu diagnostycznego dla laboratoriów medycznych. Test taki znajdzie zastosowanie w laboratoriach, do rozpoznawania przypadków babeszjozy, użyteczny będzie także do badania dawców krwi i dawców organów w kierunku bezobjawowych zarażeń Babesia.
Sposób według wynalazku może też zostać zaadaptowany do stworzenia komercyjnego testu diagnostycznego dla laboratoriów weterynaryjnych.
Sposób według wynalazku może zostać zaadaptowany do stworzenia komercyjnego testu diagnostycznego, który znajdzie zastosowanie w badaniach epidemiologicznych i/ lub środowiskowych.
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku w odróżnieniu od wcześniej znanych metod pozwala na wykrywanie zarażeń gatunkami dominującymi w Europie tj.: B. divergens, B. divergens-podobnym\ oraz B. venatorum i nie jest ograniczony do wybranego szczepu czy też genotypu.
Stosowanie sposobu wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku pozwala uniknąć uzyskiwania wyników fałszywie dodatnich, a przez to osobnik właściwie zdiagnozowany unika niepotrzebnej i kosztownej kuracji leczniczej.
Stosowanie sposobu wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku pozwala uniknąć uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych, a przez to osobnik właściwie zdiagnozowany poddawany jest potrzebnej kuracji.
Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku ze względu na szerokie spektrum rozpoznawanych gatunków pierwotniaków z rodzaju Babesia jest stosowany zarówno do diagnostyki objawowej jak i bezobjawowej inwazji pierwotniaków z rodzaju Babesia. Ze względu na szerokie spektrum rozpoznawanych gatunków pierwotniaków z rodzaju Babesia sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków według wynalazku jest korzystnie stosowany w diagnostyce bezobjawowej inwazji pierwotniaków z rodzaju Babesia, gdyż zapewnia szybkie i pewne potwierdzenie lub wykluczenie inwazji, a w związku z tym podjęcie odpowiedniego działania leczniczego lub prewencyjnego.
Przedmiotem wynalazku jest również starter do zastosowania w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe według wynalazku, który ma sekwencję SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 3.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia babeszjozą lub nosicielstwa babeszjozy, służący do wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis, i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, który obejmuje starter Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i starter Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 oraz starter Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3 oraz korzystnie odczynniki do reakcji PCR. Dodatkowo do zestawu może być dołączona instrukcja użytkownika.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie startera Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3 do wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub
PL 230 445 Β1
B. divergensw próbkach zawierających kwasy nukleinowe, korzystnie w próbkach uzyskanych z tkanek ludzi i/lub zwierząt, w tym pajęczaków, korzystnie z krwi ludzi i/lub zwierząt.
Zestaw według wynalazku zawiera jednocześnie wszystkie trzy startery Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1, Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 oraz Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3.
Krótki opis figur rysunku
Wynalazek wyjaśniono bliżej w przykładach, które jednak nie ograniczają jego zakresu. Przykłady realizacji obrazują figury, na których:
fig. 1. przedstawia przykładowy rozdział elektroforetyczny produktów reakcji PCR, przeprowadzony na 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny, w dwóch układach doświadczalnych: (A) lewa strona: Primer 1 + Primer 3 oraz (B) prawa strona: Primer 2 + Primer 3. Próby badane oznaczono od 1 do 6, M (marker) - wzorzec masowy (GPB 600bp DNA Ladder, GenoPlast).
fig. 2. przedstawia piki krzywych topnienia DNA produktów reakcji Real-time PCR, uzyskanych z zastosowaniem starterów: Primer 1 + Primer 2 + Primer 3, dla prób zawierających DNA Babesia: B. canis (linia ciągła), B. divergens (—-) oraz B. microti (.....).
fig. 3. przedstawia analizę krzywych topnienia produktów uzyskanych w reakcji Real-time PCR wobec krzywej topnienia referencyjnego DNA (DNA B. venatorum). Przedstawiono wyniki dla prób zawierających kontrolne DNA Babesia: B. canis (linia ciągła), B. divergens (—-), B. microti (.....), B. venatorum= Babesia sp EU1 (—-).
fig. 4. przedstawia wyniki elektroforezy produktów reakcji Real-time multipleks PCR przeprowadzonej z zastosowaniem trzech starterów: Primer 1 + Primer 2 + Primer 3, na 4% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.
fig. 5. przedstawia wyniki analizy topnienia DNA uzyskanego w reakcji Real-time PCR z zastosowaniem starterów: Primer 1, Primer 2, Primer 3 dla prób DNA wyizolowanego z krwi psów chorych na babeszjozę i dwóch kontroli pozytywnych zawierających DNA B. microti (.....) i B. canis (—-). Próby badane oznaczono linią ciągłą.
Przykłady realizacji wynalazku
Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:
18S rRNA - mała podjednostka rybosomu
DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy
HRM - analiza krzywych topnienia DNA w wysokiej rozdzielczości multipleks PCR - metoda umożliwiająca amplifikację wielu matryc podczas jednej reakcji PCR
PCR - łańcuchowa reakcja polimerazy pz - par zasad
Real-time PCR - PCR z analizą w czasie rzeczywistym
Przykład 1: Zastosowanie starterów Primer 1, Primer 2, Primer 3 do wykrywania DNA Babesia metodą PCR
Doświadczenie przeprowadzono na materiale genetycznym wyizolowanym z: krwi nornika naturalnie zarażonego B. microti (próby oznaczone jako 2A i 2B), ze śledziony jelenia naturalnie zarażonego B. divergens (3A i 3B), z krwi psa zarażonego B. canis (4A i 4B). Kontrole ujemne: zawiesina hodowlana pierwotniaka Toxoplasma gondii (5A i 5B), ludzki płyn owodniowy (6A i 6B), woda dejonizowana (1A i 1B). W reakcjach zastosowano startery o następujących sekwencjach:
| Starter | sekwencja (5'—>3') | Nr sekwencji |
| Primer 1 | TGACCTAAACCCTCACCAGAGTAAC | SEQ ID NO: 1 |
| Primer 2 | GAATCTAAACCCTTCCCAGAGTATC | SEQ ID NO: 2 |
| Primer 3 | GCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTTA | SEO ID NO: 3 |
Reakcję PCR prowadzono w dwóch niezależnych układach doświadczalnych, w następujących kombinacjach: (część A) Primer 1 + Primer 3 oraz (część B) Primer 2 + Primer 3. W obu przypadkach reakcje prowadzono w mieszaninie o objętości całkowitej 25 μΙ w następujących warunkach:
PL 230 445 Β1
| Składniki | Dodawana objętość (μΙ/reakcję) |
| H2O | 12,375 |
| Bufor Q | 5 |
| Bufor PCR | 2,5 |
| dNTPs | 0,5 |
| Primer 1, 10 μΜ lub Primer 2, 10 μΜ | 1,25 |
| Primer 3, 10 μΜ | 1,25 |
| Polimeraza Hot Star Taq® DNA | 0,125 |
| Izolat zawierający materiał genetyczny (stężenie DNA całkowitego w próbce: 10-500ng/1 μΙ) | 2 |
Reakcja przebiegała w probówkach polipropylenowych o pojemności 200 μΙ wolnych od DNaz i RNaz, do stosowania w reakcjach PCR. Reakcja przebiegała w 40 cyklach zgodnie z poniższym profilem temperaturowym:
| Etap | Warunki | |
| Preinkubacja | 95°C, 15min | |
| Amplifikacja | Denaturacja | 95°C, 60s |
| Przyłączanie | 60°C, 90s | |
| Synteza | 72°C, 60s | |
| Etap końcowy reakcji PCR | 72°C, 10min | |
| Schłodzenie mieszaniny reakcyjnej | 8°C |
Po zakończeniu reakcji otrzymane produkty PCR (dla B. microti - 407pz, B. divergens oraz B. canis - 381 pz) rozdzielono elektroforetycznie na 2% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny.
Wyniki eksperymentu obrazuje fig. 1. Prążek świadczący o obecności DNA pasożyta zaobserwowano w studzienkach: 2A - próbka zawierająca DNA z krwi nornika zarażonego naturalnie B. microti·, 3A i 3B - próbki zawierające DNA ze śledziony jelenia zarażonego naturalnie B. divergens oraz DNA z krwi psa zarażonego naturalnie B. canis (studzienka 4B). W żadnym z dwóch badanych układów doświadczalnych nie zaobserwowano specyficznych produktów amplifikacji w próbach kontroli ujemnych: DNA T. gondii (5A i 5B), DNA ludzki (6A i 6B), woda dejonizowana (1A i 1B).
Uzyskane wyniki wskazują na użyteczność zastosowanego sposobu amplifikacji do wykrywania DNA pierwotniaków Babesia z gatunków: B. microti, B. divergens. B. canis w izolatach DNA z prób z tkanek ludzi i zwierząt.
Przykład 2. Badanie specyficzności sposobu amplifikacji DNA w reakcji touch-down PCR za pomocą zaprojektowanych starterów Primer 1, Primer 2, Primer 3.
Amplifikację przeprowadzano w formie touch-down PCR w zakresie temperatur od 63°C do 55°C. W doświadczeniu użyto starterów: Primer 1, Primer 2, Primer 3 o sekwencjach opisanych wcześniej w Przykładzie 1. Analizowano próby zawierające następujący materiał genetyczny:
- DNA Toxoplasma gondii (Apicomplexa)
- DNA B. microti
- DNA B. divergens
- woda dejonizowana (H2O)
- DNA B. canis
- DNA ludzki
- DNA kleszcza I. ricinus.
Reakcję Real-time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości całkowitej 20 μΙ przy użyciu odczynników zestawu SsoFast™ EvaGreen® Supermix, w następujących proporcjach:
PL 230 445 Β1
| Składniki | Dodawana objętość (μΙ/reakcję) |
| 2X Master Mix | 10 |
| Primer 1, 10 μΜ | 0,8 |
| Primer 2, 10 μΜ | 0,8 |
| Primer 3, 10 μΜ | 0,8 |
| h2o | 6,6 |
| Matryca DNA Babesia (2-200ng/1 μΙ) | 1 |
Reakcja przebiegała w probówkach polipropylenowych (PP) o podwyższonej przejrzystości o pojemności 200 μΙ do stosowania w reakcjach PCR, wolnych od DNaz i RNaz. Amplifikację przeprowadzano w 45 cyklach z redukcją temperatury hybrydyzacji o 0,2°C w każdym cyklu, w następujących warunkach:
| Cykl | Warunki |
| Preinkubacja | Hołd @ 98°C, 2min, Os |
| Amplifikacja | Step 1 @ 98°C, hołd 10s |
| Step 2 @ 63°C, hołd 30s | |
| Step 3 @ 72°C, hołd 30s, acquiring to Cyclmg A ([Green]) | |
| Analiza topnienia | Melt (70-90°C), hołd secs on the 1st step, hołd 3 secs on next steps, Melt A ([HRM]) |
Krzywe topnienia uzyskane w wyniku przeprowadzonego doświadczenia przedstawiono na rysunku (fig. 2). Wyniki eksperymentu przeprowadzonego według wynalazku można analizować w postaci znormalizowanej, co przedstawiono na fig. 3. Po zakończeniu reakcji otrzymane amplikony (dla B. microti - 407 pz, B. divergens oraz B. canis - 381 pz) wizualizowano po przeprowadzeniu elektroforezy na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny z użyciem 4% agarozy (Prona), pozwalającej zaobserwować różnice między uzyskanymi produktami amplifikacji. Zdjęcie żelu przedstawiono na fig. 4.
Uzyskane wyniki wskazują na użyteczność zastosowanego sposobu amplifikacji do wykrywania i różnicowania DNA pierwotniaków Babesia z gatunków: B. microti, B. divergens, B. canis w próbach klinicznych i środowiskowych.
Przykład 3. Wykrywanie i identyfikacja DNA Babesia w materiale genetycznym wyizolowanym z prób krwi pobranej od 5 psów z babeszjozą rozpoznaną klinicznie i potwierdzoną badaniem mikroskopowym.
Próby badane zawierały DNA wyizolowane z krwi psów, z potwierdzoną babeszjozą. Reakcję przeprowadzono w mieszaninie o objętości całkowitej 25 μΙ przy użyciu zestawu odczynników jak w Przykładzie 2 w następujących warunkach:
| Składniki | Dodawana objętość (μΙ/reakcję) |
| 2X Master Mix | 12,5 |
| Primer 1, 10 μΜ | 1 |
| Primer 2, 10 μΜ | 1 |
| Primer 3, 10 μΜ | 1 |
| H2O | 8,5 |
| Matryca DNA (DNA całkowite 50-100ng/1 μΙ) | 1 |
PL 230 445 Β1
Reakcję przeprowadzono w warunkach opisanych wcześniej w Przykładzie 2. Wyniki reakcji przedstawiono na fig. 5, gdzie: próby zawierające DNA wyizolowane z krwi 5 psów chorych na babeszjozę oznaczono linią ciągłą, kontrola pozytywna zawierająca DNA B. microti odpowiada krzywej kropkowanej (.....), a B. canis - kreskowanej Analiza porównawcza uzyskanych krzywych dla prób badanych z krzywymi kontrolnymi prób zawierających referencyjne DNA Babesia wskazuje, że czynnikiem etiologicznym wykrytych inwazji jest gatunek B. canis.
Uzyskane wyniki wskazują na użyteczność zastosowanego sposobu amplifikacji do wykrywania i różnicowania DNA pierwotniaków B. microti i B. canis w próbach klinicznych.
LISTA SEKWENCJI <110> NIZP PZH <120> Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki objawowej i bezobjawowej babeszj ozy <130> PK/3I04/AGR <160> 3 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> Starter 1 <400> i tgacctaaac cctcaccaga gtaac 25
| <210> | 2 |
| <211> | 25 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
| <220> <223> | Starter 2 |
| <400> | 2 |
gaatctaaac ccttcccaga gtatc
| <210> | 3 |
| <211> | 23 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
<220>
<223> Starter 3 <400> 3 gctttcgcag tagttcgtct tta
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, znamienny tym, że obejmuje następujące etapya) amplifikacji kwasów nukleinowych w jednej reakcji, z zastosowaniem starterów: Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3;b) detekcji; oraz ewentualniec) identyfikacji.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo stosowany jest jeden lub więcej innych starterów.
- 3. Sposób według zastrz. 1-2, znamienny tym, że na etapie amplifikacji kwasów nukleinowych hybrydyzację starterów przeprowadza się w temperaturze w zakresie 55-63°C.
- 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że etap amplifikacji kwasów nukleinowych przeprowadzany jest metodą klasycznej reakcji PCR, multipleks PCR, Real-time PCR.
- 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że etap detekcji prowadzi się z zastosowaniem technik wybranych z analizy właściwości fizycznych uzyskanych produktów amplifikacji, korzystnie analizy krzywych topnienia, uzyskanych produktów amplifikacji, w wysokiej rozdzielczości (HRM), technik detekcji z wykorzystaniem sond molekularnych, sekwencjonowania produktów amplifikacji, analizy wielkości i/lub masy produktów amplifikacji, różnic w migracji konformerów produktów amplifikacji, amplifikacji i/lub analizy polimorfizmu miejsc restrykcyjnych.
- 6. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że etap identyfikacji prowadzi się w oparciu o analizę porównawczą danych uzyskiwanych dla prób badanych z wynikami uzyskiwanymi dla kontroli dostosowanymi do konkretnej metody detekcji.
- 7. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienny tym, że zarówno etap amplifikacji kwasów nukleinowych jak i etap detekcji przeprowadzane są w jednym naczyniu.
- 8. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-7, znamienny tym, że etap amplifikacji kwasów nukleinowych prowadzony jest metodą Real-time PCR a etap detekcji prowadzony jest za pomocą analizy krzywych topnienia, uzyskanych produktów amplifikacji, w wysokiej rozdzielczości (HRM) z jednoczesnym etapem identyfikacji.
- 9. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-8, znamienny tym, że próbki zawierające kwasy nukleinowe zostały uzyskane z tkanek ludzi i/lub zwierząt, w tym pajęczaków, korzystnie z krwi ludzi i/lub zwierząt.
- 10. Starter do zastosowania w sposobie wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe jak określony w dowolnym z zastrz. 1-8, znamienny tym, że ma sekwencję SEQ ID NO: 1 lub sekwencję SEQ ID NO: 2 lub sekwencji SEQ ID NO: 3.
- 11. Zastosowanie startera Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 i Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3 do wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, korzystnie w próbkach uzyskanych z tkanek ludzi i/lub zwierząt, w tym pajęczaków, korzystnie z krwi ludzi i/lub zwierząt.
- 12. Zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia babeszjozą lub nosicielstwa babeszjozy, służący do wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, w tym w szczególności B. microti, B. venatorum, B. canis i/lub B. divergens w próbkach zawierających kwasy nukleinowe, znamienny tym, że obejmuje starter Primer 1 o sekwencji SEQ ID NO: 1 i starter Primer 2 o sekwencji SEQ ID NO: 2 oraz starter Primer 3 o sekwencji SEQ ID NO: 3 oraz korzystnie odczynniki do reakcji PCR.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412309A PL230445B1 (pl) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozy |
| PCT/IB2016/052655 WO2016181297A1 (en) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Method of detection and/or identification of protozoa of genus babesia, primer for use in this method and kit for use in methods of diagnosis of symptomatic and asymptomatic babesiosis |
| EP16730486.4A EP3294909B1 (en) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Method of detection and/or identification of protozoa of genus babesia, primer for use in this method and kit for use in methods of diagnosis of symptomatic and asymptomatic babesiosis |
| PL16730486T PL3294909T3 (pl) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki objawowej i bezobjawowej babeszjozy |
| ES16730486T ES2736399T3 (es) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Procedimiento de detección y/o identificación de protozoos del género Babesia, un cebador para su uso en el presente procedimiento y un kit para su uso en procedimientos de diagnóstico de babesiosis sintomática y asintomática |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412309A PL230445B1 (pl) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL412309A1 PL412309A1 (pl) | 2016-11-21 |
| PL230445B1 true PL230445B1 (pl) | 2018-10-31 |
Family
ID=56137468
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL412309A PL230445B1 (pl) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozy |
| PL16730486T PL3294909T3 (pl) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki objawowej i bezobjawowej babeszjozy |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL16730486T PL3294909T3 (pl) | 2015-05-12 | 2016-05-10 | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki objawowej i bezobjawowej babeszjozy |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3294909B1 (pl) |
| ES (1) | ES2736399T3 (pl) |
| PL (2) | PL230445B1 (pl) |
| WO (1) | WO2016181297A1 (pl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3635140B1 (en) * | 2017-06-07 | 2023-05-31 | Gen-Probe Incorporated | Detecting babesia species nucleic acid in a sample |
| US10760137B2 (en) * | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| CN109439782B (zh) * | 2018-12-20 | 2021-09-03 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法 |
| CN111534625A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-08-14 | 天津拓瑞医药科技有限公司 | 一种吉氏巴贝斯虫pcr检测方法 |
| CN112553357A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-26 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种马梨形虫病巢式pcr检测引物组、试剂盒及其应用 |
| CN115058520A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-16 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120015360A1 (en) * | 2009-12-07 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of babesia bioagents |
| WO2014197607A1 (en) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | The Regents Of The University Of California | Detection of tick-borne diseases |
-
2015
- 2015-05-12 PL PL412309A patent/PL230445B1/pl unknown
-
2016
- 2016-05-10 PL PL16730486T patent/PL3294909T3/pl unknown
- 2016-05-10 WO PCT/IB2016/052655 patent/WO2016181297A1/en active Application Filing
- 2016-05-10 EP EP16730486.4A patent/EP3294909B1/en not_active Not-in-force
- 2016-05-10 ES ES16730486T patent/ES2736399T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3294909A1 (en) | 2018-03-21 |
| PL3294909T3 (pl) | 2019-12-31 |
| ES2736399T3 (es) | 2019-12-30 |
| PL412309A1 (pl) | 2016-11-21 |
| WO2016181297A1 (en) | 2016-11-17 |
| EP3294909B1 (en) | 2019-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gioia et al. | Highly sensitive multiplex PCR for simultaneous detection and discrimination of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in canine peripheral blood | |
| Sundar et al. | Molecular diagnosis of visceral leishmaniasis | |
| PL230445B1 (pl) | Sposób wykrywania i/lub identyfikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia, starter do zastosowania w tym sposobie i jego zastosowanie oraz zestaw do stosowania w sposobach diagnostyki zarażenia i nosicielstwa babeszjozy | |
| Lin et al. | Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis | |
| Zhang et al. | Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method | |
| d'Oliveira et al. | Detection of Theileria annulata in blood samples of carrier cattle by PCR | |
| Lau et al. | Specific, sensitive, and rapid diagnosis of active toxoplasmosis by a loop-mediated isothermal amplification method using blood samples from patients | |
| Abbasi et al. | Evaluation of PCR procedures for detecting and quantifying Leishmania donovani DNA in large numbers of dried human blood samples from a visceral leishmaniasis focus in Northern Ethiopia | |
| Andreadou et al. | A novel non-amplification assay for the detection of Leishmania spp. in clinical samples using gold nanoparticles | |
| da Silva et al. | Diagnosis of human visceral leishmaniasis by PCR using blood samples spotted on filter paper | |
| Koltas et al. | A comparative analysis of different molecular targets using PCR for diagnosis of old world leishmaniasis | |
| Montalvo et al. | Direct Leishmania species typing in Old World clinical samples: evaluation of 3 sensitive methods based on the heat-shock protein 70 gene | |
| Matsuu et al. | Development of a SYBR green real-time polymerase chain reaction assay for quantitative detection of Babesia gibsoni (Asian genotype) DNA | |
| Siddiki et al. | Molecular characterization of Eimeria spp. from chicken by Polymerase Chain Reaction based on species-specific SCAR markers | |
| Ramírez et al. | The laboratory diagnosis in Toxoplasma infection | |
| Souza et al. | Prevalence of Plasmodium falciparum and P. vivax in an area of transmission located in Para State, Brazil, determined by amplification of mtDNA using a real-time PCR assay | |
| KR101312465B1 (ko) | 말라리아의 원인인 삼일열 원충과 열대열 원충의 감염 진단을 위한 유전자 검사용 프라이머, 이의 검사 방법과 검사 키트 | |
| TWI637060B (zh) | 檢測小焦蟲的引子對、套組及方法 | |
| Mirahmadi et al. | Evaluation of multiplex/nested polymerase chain reaction and loop-mediated isothermal amplification for malaria diagnosis in southeastern Iran | |
| TW201809280A (zh) | 檢測犬焦蟲的引子對、套組及方法 | |
| Maharana et al. | Direct PCR-RFLP based detection and differentiation of Anaplasma species in naturally infected goats of eastern Haryana, India | |
| Suzuki et al. | A highly sensitive and specific conventional molecular diagnosis for Leishmania infantum chagasi based on a single copy gene | |
| Motavallihaghi et al. | First molecular evidence of Theileria lestoquardi in small ruminants in northern Iran | |
| Çulha et al. | Investigation of Sensitivity of Rapid Diagnosis Tests in Patients with Suspected Malaria | |
| RU2338789C2 (ru) | Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах |