TWI637060B - 檢測小焦蟲的引子對、套組及方法 - Google Patents

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Abstract

一種檢測小焦蟲( Babesia gibsoni)的引子對、套組及方法，引子對具有一順向引子及一逆向引子，套組具有一引子對及一探針，其中，順向引子的序列如序列編號1所示，逆向引子的序列如序列編號2所示，探針的序列如序列編號3所示。

Description

檢測小焦蟲的引子對、套組及方法
本案係關於一種檢測焦蟲的引子對、套組及方法，尤指一種檢測小焦蟲的引子對、套組及方法。
全世界有許多種類的焦蟲( Babesia spp.)可感染犬隻，其中以犬焦蟲( Babesia canis)，又稱大焦蟲，以及小焦蟲( Babesia gibsoni)最常見。小焦蟲主要分布在亞洲，包含日本、韓國、台灣及馬來西亞，近年來發現小焦蟲也廣泛分布在非洲、中東、巴西、北美洲及澳洲。小焦蟲是一種寄生於宿主紅血球內的原生動物寄生蟲，並造成犬隻患有焦蟲病。此疾病主要經由壁蝨而自然傳播， 但許多報告也顯示了經由狗咬及輸血的傳播途徑，以及傳染至發展中胎兒的傳播途徑。小焦蟲感染通常發生在犬隻，且由於造成的急性型疾病常引發嚴重的臨床症狀，例如發燒、血小板過低、再生性貧血、脾腫大甚至死亡，故近年在臨床上已被視為嚴重問題。此外，被感染的動物也可能成為慢性帶原者，並經由壁蝨傳染至其他動物。因此，為了控制小焦蟲感染，必須要有快速且準確的診斷，並接續即時且有效的治療，以及慢行帶原者的預防。
由於大焦蟲及小焦蟲的治療方法不同，因此需要快速且正確診斷出小焦蟲感染，以免延誤病情。然而，小焦蟲並不容易診斷。目前用於小焦蟲診斷的方法包括血液抹片、血清診斷及分子診斷，但前述方法皆有其限制。
雖然獸醫師可透過Giemsa染色法直接從血液抹片上判斷病原，但此方法不容易區別出大焦蟲及小焦蟲，且此方法有賴受過良好訓練及經驗豐富的技術人員，才能做出正確判斷。此外，此方法要採用新鮮的檢體，以保持生物活性及型態，故檢體須迅速進行處理。
血清診斷有助於辨識小焦蟲抗體的存在，然而血清診斷無法區分出急性感染及慢性感染。血清診斷的限制更在於交叉反應，尤其在不同的焦蟲種類之間，使得檢測的專一性不佳，以及在年輕或免疫抑制的犬隻上，或是在免疫轉換發生前的感染初期，都可能產生偽陰性的檢測結果。
目前診斷小焦蟲較佳的方式之一便是分子診斷，尤其是利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)進行檢測。聚合酶連鎖反應是一種更靈敏且更具專一性的技術，提供了診斷焦蟲症(babesiosis)的另一替代方案，而18S rRNA的基因序列即被用來分辨各種種類的焦蟲及相關原生動物。舉例而言，由引子設計有限公司(Primerdesign Ltd.)所提供的焦蟲檢測套組(canine babesiosis 18S ribosomal RNA (18S) gene genesig standard kit)可用來檢測犬隻所感染的焦蟲症，然而，此套組也無法區別大焦蟲及小焦蟲的感染。
因此，為了能選擇適當的治療方式以避免延誤病情，實有必要提供一種能專一地檢測出小焦蟲的技術方案。
本案之一實施例的目的在於提供一種用以檢測小焦蟲( Babesia gibsoni)的引子對，具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出小焦蟲感染，進而選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
本案之一實施例的另一目的在於提供一種用以檢測小焦蟲的套組，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出小焦蟲感染，進而選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
本案之一實施例的又一目的在於提供一種用以檢測小焦蟲的方法，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出小焦蟲感染，進而選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
為達上述目的，本案之一實施例提供一種用以檢測小焦蟲的引子對，包含一順向引子或其互補序列及一逆向引子或其互補序列，其中，順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
承上，本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的引子對，其中，順向引子及逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
又，本案之一實施例為提供一種用以檢測小焦蟲的套組，包含一順向引子或其互補序列、一逆向引子或其互補序列及一探針，其中，順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’；逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
另外，本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的套組，探針的序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。
本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的套組，順向引子、逆向引子及探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
又，本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的套組，探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
又，本案之另一實施例為提供一種用以檢測小焦蟲的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增小焦蟲的核酸分子，並採用一順向引子或其互 補序列、一逆向引子或其互補序列、及一探針，其中順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
承上，本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的方法，所採用之探針的序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅體。
第1圖顯示順向引子、逆向引子及探針對應於ITS1基因序列的位置。
第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的DNA序列。
第3A圖及第3B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。
體現本案特徵與優點的一些實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上為說明之用，而非用以限制本案。
本案之一實施例係利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，簡稱Real-time PCR)，又稱定量聚合酶鏈鎖反應(Quantitative polymerase chain reaction，簡稱為Q-PCR)來進行小焦蟲(Babesia gibsoni)的檢測，且採用探針偵測系統(probe-based detection)。首先，具有專一性的順向引子、逆向引子及探針會雜合到小焦蟲的目標DNA上，探針的5’端接上報導染劑，3’端接上淬滅體。在PCR擴增反應過程中，探針會被切割，使得報導 染劑與淬滅體分離，即可偵測到報導染劑所發出的螢光。在一實施例中，報導染劑為FAM螢光基團，淬滅體為BHQ1基團。
在此試驗中的目標DNA為小焦蟲的ITS1(Internal Transcribed Spacer 1)基因(基因庫登錄號為KT033509.1)中的一段可變區域(variable region)，其包含對小焦蟲具有特異性的序列。本案之一實施例之PCR引子及探針係利用Primer3軟體所設計，且依GC含量及不含髮夾結構(hairpin structure)之基礎進行選擇。第1圖顯示所採用的順向引子、逆向引子及探針對應於ITS1基因序列的位置，其中，順向引子起始於基因序列第4個位置，探針起始於基因序列第74個位置，逆向引子起始於基因序列第95位置。利用此順向引子、逆向引子及探針的組合將可擴增小焦蟲DNA而得出大小為92-bp的擴增子(amplicon)片段。第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的DNA序列，其中，順向引子(序列編號1)大小為18-mer，逆向引子(序列編號2)大小為18-mer，探針(序列編號3)大小為18-mer。
為確認所採用的PCR引子及探針對小焦蟲具有專一性，利用美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)提供的Primer-BLAST系統對前述包含順向引子及逆向引子的引子對及探針進行比對，結果顯示沒有其他相近的物種具有與本案設計的引子對及探針完全相同的序列。此結果也顯示本案之一實施例的引子對及探針的專一性相當高，能用來擴增及檢測小焦蟲的ITS1基因。其中，本案之一實施例的引子對及探針只能用來擴增及檢測小焦蟲的ITS1基因。
因此，本案之一實施例提供了一種用以檢測小焦蟲的引子對，包含一順向引子或其互補序列及一逆向引子或其互補序列，其中，順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
此外，本案之一實施例同時提供一種用以檢測小焦蟲的套組，包括一順向引子或其互補序列、一逆向引子或其互補序列，其中，順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。本案之一實施例的用以檢測小焦蟲的套組更包括一探針，探針的序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。
另外，本案之一實施例提供一種用以檢測小焦蟲的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增小焦蟲的核酸分子，並採用一順向引子或其互補序列、一逆向引子或其互補序列、及一探針，其中順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
在本案之一實施例提供的用以檢測小焦蟲的方法，所採用之探針的序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。
在另一些實施例中，由於引子對可專一地檢測小焦蟲，故只要是位於順向引子及逆向引子序列位置之間的序列，皆可設計為探針序列，因此，本案提供之檢測小焦蟲的套組或方法亦可不限制採用前述的探針序列，且探針可選擇雜合至DNA的任一股上，故相同位置的互補序列皆可做為探針序列。因此，與前述探針序列互補的序列亦可做為本案之探針序列。
以下將說明利用本案之一實施例設計之引子對及探針進行小焦蟲的檢測。
首先，取200μl以EDTA保存的待測全血樣品進行DNA萃取，其係利用Qiagen提供的萃取套組QIAamp DNA Blood Mini Kit來萃取，並溶在100μl的沖提緩衝液中。接著進行即時聚合酶鏈鎖反應，其係利用Bio-Rad即時聚合酶鏈鎖反應機器(CFX96)來執行。PCR反應混合物中包含10μl的KAPA Fast probe universal master mix，250nM的順向引子及逆向引子，及250nM的探針，其中，順向引子的序列包括5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’， 逆向引子的序列包括5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’，以及探針的序列包括5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。將3 µl的萃取DNA模板加入至每一反應管中，並使總體積達20 µl。PCR循環條件先95°C 3分鐘，接著進行95°C 3秒鐘的變性(denaturation)及60°C 20秒鐘的黏合(annealing)及延伸(extension)，重複40個循環。
正控制組(positive control)係為具有小焦蟲254-bp的ITS1基因片段的選殖載體(PUC57 System)。將此重組DNA質體製備一系列十倍稀釋液，分別為1.25 x 10, 1.25 x 10 2, 1.25 x 10 3, 1.25 x 10 4, 1.25 x 10 5, 1.25 x10 6, 1.25 x 10 7copies/µl的稀釋液。每一稀釋液係進行三次重複(triplicate)分析，以測定小焦蟲DNA偵測的下限，以及即時聚合酶鏈鎖反應擴增的線性關係及效率。
第3A圖及第3B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。第3A圖顯示不同拷貝數的質體樣本的擴增曲線，可看出本案的檢測方法具有相當高的靈敏度。第3B圖顯示本案的檢測方法具有相當好的線性關係，其R 2為0.996，非常接近最佳理論值1.0，因此，本案的檢測方法可進行定量分析，用以估計基因的拷貝數，進而估計臨床樣本中原蟲寄生(parasitemia)的百分比。
綜上所述，本案之一實施例提供一種檢測小焦蟲的方法，其係利用即時聚合酶鏈鎖反應及具有特異性的引子對及探針來進行偵測。本案之一實施例提供之方法具有高靈敏性，可在無臨床症狀的感染案例中檢測到低原蟲寄生量。本案之一實施例提供之方法更具有高專一性，可區別出焦蟲之不同種類，而這對於小焦蟲的治療非常重要，因為犬焦蟲及小焦蟲的治療方法不同，因此需要快速且正確診斷出小焦蟲感染，以免延誤病情。此外，相較於其他小焦蟲診斷方法，本案之一實施例之方法較省時省力，故適合用來進行高通量篩選。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
＜110＞ 台達電子國際（新加坡）私人有限公司 ＜120＞ 檢測小焦蟲的引子對、套組及方法 ＜160＞ 3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成引子 ＜400＞ 1 ttgaaacttg tcgagctg 18 ＜210＞ 2 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成引子 ＜400＞ 2 tggaatcttc cacgactg 18 ＜210＞ 3 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成探針 ＜400＞ 3 ccgaggcaac acgcgatc 18

Claims (7)

  1. 一種用以檢測小焦蟲(Babesia gibsoni)的引子對，包括：一順向引子，其序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’；及一逆向引子，其序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的引子對，其中該順向引子及該逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
  3. 一種用以檢測小焦蟲(Babesia gibsoni)的套組，包括：一順向引子，其序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’；一逆向引子，其序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’；及一探針，其序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該順向引子、該逆向引子及該探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
  6. 一種用以檢測小焦蟲(Babesia gibsoni)的方法，包括利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增小焦蟲(Babesia gibsoni)的核酸分子，並採用一順向引子、一逆向引子、及一探針，其中該順向引子的序列為5’-TTGAAACTTGTCGAGCTG-3’，該逆向引子的序列為5’-TGGAATCTTCCACGACTG-3’，該探針的序列為5’-CCGAGGCAACACGCGATC-3’。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
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NCBI GenBank: KT033509.1(公開日:2016/1/16).

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