TWI597366B - 檢測犬焦蟲的引子對、套組及方法 - Google Patents

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Description

檢測犬焦蟲的引子對、套組及方法
本案係關於一種檢測焦蟲的引子對、套組及方法，尤指一種檢測犬焦蟲的引子對、套組及方法。
全世界有許多種類的焦蟲( Babesia spp.)可感染犬隻，其中以犬焦蟲( Babesia canis)，又稱大焦蟲，以及小焦蟲( Babesia gibsoni)最常見。犬焦蟲( Babesia canis)是一種原生動物寄生蟲，會感染犬隻的紅血球而造成貧血症狀。犬焦蟲主要是經由棕色犬璧蝨(brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus)而傳播， 且為最常見的梨形蟲(piroplasm)感染之一。棕色犬璧蝨適合生長在溫暖的氣候，因此南亞、東南亞、日本、南韓、中國華北地區、大洋洲、歐洲、及美國都是犬焦蟲感染的流行範圍。
由於犬焦蟲及小焦蟲的治療方法不同，因此需要快速且正確診斷出犬焦蟲感染，以免延誤病情。然而，犬焦蟲並不容易診斷。目前用於犬焦蟲診斷的方法包括血液抹片、血清診斷及分子診斷，但前述方法皆有其限制。
雖然獸醫師可透過Giemsa染色法直接從血液抹片上判斷病原，但此方法不容易區別出大焦蟲及小焦蟲，且此方法有賴受過良好訓練及經驗豐富的技術人員，才能做出正確判斷。此外，此方法須採用新鮮的檢體，以保持生物活性及型態，故檢體必須迅速進行處理。
血清診斷則有助於辨識犬焦蟲抗體的存在，然而血清診斷無法區分出急性感染及慢性感染。血清診斷的限制更在於交叉反應，尤其在不同的焦蟲種類之間，使得檢測的專一性不佳，以及在年輕或免疫抑制的犬隻上，或是在免疫轉換發生前的感染初期，都可能產生偽陰性的檢測結果。
而診斷犬焦蟲最佳的方式便是分子診斷，尤其是利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)進行檢測。聚合酶連鎖反應是一種更靈敏且更具專一性的技術，提供了診斷焦蟲症(babesiosis)的另一替代方案，而18S rRNA的基因序列即被用來分辨各種種類的焦蟲及相關原生動物。舉例而言，由引子設計有限公司(Primerdesign Ltd)所提供的焦蟲檢測套組(canine babesiosis 18S ribosomal RNA (18S) gene genesig standard kit)可用來檢測犬隻所感染的焦蟲症，然而，此套組也無法區別大焦蟲及小焦蟲的感染。
因此，為了能選擇適當的治療方式以避免延誤病情，實有必要提供一種能專一地檢測出犬焦蟲的方法。
本案的目的在於提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的引子對，以選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
本案的另一目的在於提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的套組，以選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
本案的又一目的在於提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的方法，以選擇適當的治療方式，避免延誤病情。
為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。該順向引子及該逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。 該順向引子、該逆向引子及該探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。又，該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬焦蟲( Babesia canis)的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。 該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)來擴增犬焦蟲( Babesia canis)的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。
本案係利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，簡稱Real-time PCR)，又稱定量聚合酶鏈鎖反應(Quantitative polymerase chain reaction，簡稱為Q-PCR)來進行犬焦蟲的檢測，且採用探針偵測系統(probe-based detection)。首先，具有專一性的順向引子、逆向引子及探針會雜合到犬焦蟲的目標DNA上，探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，3’端接上淬滅體(quencher)。在PCR擴增反應過程中，探針會被切割，使得報導染料與淬滅體分離，即可偵測到報導染料所發出的螢光。在一實施例中，報導染料為FAM螢光基團，淬滅體為BHQ1基團。
在此試驗中的目標DNA為犬焦蟲( Babesia canis)的18S rRNA基因(基因庫登錄號為 KP896299.1)中的一段可變區域(variable region)，其包含對犬焦蟲具有特異性的序列。本案之PCR引子及探針係利用Primer3軟體所設計，且依GC含量及不含髮夾結構(hairpin structure)之基礎進行選擇。第1圖顯示所採用的順向引子、逆向引子及探針對應於18S rRNA基因序列的位置，其中，順向引子起始於基因序列第6個位置，探針起始於基因序列第69個位置，逆向引子起始於基因序列第93位置。利用此順向引子、逆向引子及探針的組合將可擴增犬焦蟲DNA而得出大小為88-bp的擴增子(amplicon)片段。第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的基因序列，其中，順向引子(序列編號1)大小為18-mer，逆向引子(序列編號2)大小為19-mer，探針(序列編號3)大小為22-mer。
為確認所採用的PCR引子及探針對犬焦蟲具有專一性，利用美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)提供的Primer-BLAST系統對前述包含順向引子及逆向引子的引子對及探針進行比對，結果顯示沒有其他相近的物種具有與本案設計的引子對及探針完全相同的序列。
此外，為進一步瞭解本案的引子對及探針的專一性資訊，利用DNA並列比對工具(DNA alignment tool)與其他相似序列進行分析。第3圖即顯示多種焦蟲物種的18S rRNA序列比對，由圖中可見，針對犬焦蟲( Babesia canis)序列而言，順向引子位於第195至212鹼基對的位置，探針位於第237至258鹼基對的位置，逆向引子位於第264至282鹼基對的位置。在這些片段中，沒有其他相近的物種具有完全相同的序列，此結果顯示本案的引子對及探針的專一性相當高，且只能用來擴增及檢測犬焦蟲的18S rRNA基因。
因此，本案提供了一種用以檢測犬焦蟲的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。本案同時提供一種用以檢測犬焦蟲的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。另一方面，本案亦提供一種用以檢測犬焦蟲的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬焦蟲的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
在另一些實施例中，由於本案之引子對可專一地檢測犬焦蟲，故只要是位於順向引子及逆向引子序列位置之間的序列，皆可設計為探針序列，因此，本案提供之檢測犬焦蟲的套組或方法亦可不限制採用前述的探針序列，且探針可選擇雜合至DNA的任一股上，故相同位置的互補序列皆可做為探針序列。例如，與前述探針序列互補的序列5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’ (序列編號4)亦可做為本案之探針序列。
因此，本案亦提供了一種用以檢測犬焦蟲的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。另一方面，本案亦提供一種用以檢測犬焦蟲的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬焦蟲的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
以下將以實例說明利用本案設計之引子對及探針進行犬焦蟲的檢測。首先，取200 μl以EDTA保存的待測全血樣品進行DNA萃取，其係利用Qiagen提供的萃取套組QIAamp DNA Blood Mini Kit來萃取，並溶在100 μl的沖提緩衝液中。接著進行即時聚合酶鏈鎖反應，其係利用Bio-Rad即時聚合酶鏈鎖反應機器(CFX96)來執行。PCR反應混合物中包含10 µl的KAPA Fast probe universal master mix，250 nM的順向引子及逆向引子，及 250 nM的探針，其中，順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。將3 µl的萃取DNA模板加入至每一反應管中，並使總體積達20 µl。PCR循環條件則先95°C 3分鐘，接著進行95°C 3秒鐘的變性(denaturation)及60°C 20秒鐘的黏合(annealing)及延伸(extension)，重複40個循環。
正控制組(positive control)係為具有犬焦蟲456-bp的18S rRNA的基因片段的選殖載體(RBC Cloning System)。將此重組DNA質體製備一系列十倍稀釋液，分別為1.25 x 10, 1.25 x 10 2, 1.25 x 10 3, 1.25 x 10 4, 1.25 x 10 5, 1.25 x10 6, 1.25 x 10 8copies/µl的稀釋液。每一稀釋液係進行二次重複分析，以測定犬焦蟲DNA偵測的下限，以及即時聚合酶鏈鎖反應擴增的線性關係及效率。
第4A圖及第4B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。第4A圖顯示不同拷貝數的質體樣本的擴增曲線，可看出本案的檢測方法具有相當高的靈敏度。第4B圖顯示本案的檢測方法具有相當好的線性關係，因此，本案的檢測方法可進行定量分析，用以估計基因的拷貝數，進而估計臨床樣本中原蟲寄生(parasitemia)的百分比。
綜上所述，本案提供一種檢測犬焦蟲的方法，其係利用即時聚合酶鏈鎖反應及具有特異性的引子對及探針來進行偵測。本案提供之方法具有高靈敏性，可在無臨床症狀的感染案例中檢測到低原蟲寄生量。本案提供之方法更具有高專一性，可區別出焦蟲之不同種類，而這對於犬焦蟲的治療非常重要，因為犬焦蟲及小焦蟲的治療方法不同，因此需要快速且正確診斷出犬焦蟲感染，以免延誤病情。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
無
第1圖顯示順向引子、逆向引子及探針對應於18S rRNA基因序列的位置。 第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的基因序列。 第3圖顯示多種焦蟲物種的18S rRNA序列比對。 第4A圖及第4B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。
＜110＞ 台達電子國際（新加坡）私人有限公司 ＜120＞ 檢測犬焦蟲的引子對、套組及方法 ＜160＞ 4   ＜210＞ 1 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 合成引子   ＜400＞ 1 tagtttgaaa cccgcctt                     18       ＜210＞ 2 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 合成引子   ＜400＞ 2 gatgggtcag aaacttgaa                  19     ＜210＞ 3 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 合成探針   ＜400＞ 3 catcgctaaa tgcgattcgc ca              22     ＜210＞ 4 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 合成探針   ＜400＞ 4 tggcgaatcg catttagcga tg              22

Claims (9)

  1. 一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的引子對，其中該順向引子及該逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
  3. 一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該順向引子、該逆向引子及該探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
  6. 一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬焦蟲( Babesia canis)的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
  8. 一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，該逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及該探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
  9. 一種用以檢測犬焦蟲( Babesia canis)的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)來擴增犬焦蟲( Babesia canis)的核酸分子，且所採用之順向引子的序列為5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’， 逆向引子的序列為5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探針的序列為5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
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