CN105861651A - 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105861651A
CN105861651A CN201610209902.5A CN201610209902A CN105861651A CN 105861651 A CN105861651 A CN 105861651A CN 201610209902 A CN201610209902 A CN 201610209902A CN 105861651 A CN105861651 A CN 105861651A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
pcr
template
amplification
iac
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610209902.5A
Other languages
English (en)
Inventor
姚大伟
杨伦
杨德吉
赵艳兵
肖霞
许家荣
洪玉方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201610209902.5A priority Critical patent/CN105861651A/zh
Publication of CN105861651A publication Critical patent/CN105861651A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测患病犬是否感染巴贝斯虫的检测试剂盒，特别是含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒。该检测试剂盒包括上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，扩增内标质粒pMD‑IAC，标准阳性模板质粒pMD‑18S rRNA，标准阴性模板，空白模板，PCR反应液2×Taq PCR Mix，无菌水。该试剂盒的主要特点是在犬巴贝斯虫PCR检测体系中加入扩增内标，可以用来指示假阴性现象，排除因反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性。

Description

一种含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一种检测患病犬是否感染巴贝斯虫的检测试剂盒，特别是含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒。
背景技术
犬巴贝斯虫病是由梨形虫目、巴贝斯科、巴贝斯属的虫体寄生于犬的红细胞内引起的一种犬严重的血液原虫疾病，由蜱叮咬吸血传播。犬巴贝斯虫病常规的病原学诊断是血液涂片染色镜检，是作出诊断的主要依据。但是急性感染或初次感染巴贝斯虫后，自然康复或通过药物治疗后康复的犬，此时血液中的原虫血症太低以致于不能在光学显微镜下检测到虫体，PCR技术为准确地诊断感染早期的病犬和带虫犬提供了敏感性高、特异性好的诊断方法。而且PCR技术具有操作简便，试剂容易获得，检测速度快的优点，结合序列分析，限制性酶切片段长度多态性分析或嵌套式PCR可以对虫体种类进行鉴定。在PCR检测过程中为了防止假阳性结果的产生，在检测样品的同时设置阴性对照、空白对照，检测假阳性结果。在防止假阴性结果的产生方面通常设置阳性对照。然而许多假阴性结果的产生是体系中存在PCR抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活造成的，单纯的靠阳性对照发现不了这些问题的存在。
扩增内标(internal amplification control，IAC)是添加到PCR反应体系中和目标基因非同源的但可以同时扩增的一段人工构建的DNA序列或者是一段看家基因序列，可以用来指示假阴性现象。如果反应体系中没有IAC，检测到阴性结果可能是由于反应体系中没有目标基因，也可能是由于反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活等原因造成的假阴性结果。如果反应体系中加入IAC，无论在反应体系中有无目标基因出现，扩增内标的信号总会出现，如果扩增内标无信号说明PCR反应失败，因此加入IAC可以有效的解决假阴性的现象。
本发明在犬巴贝斯虫PCR反应体系中加入扩增内标，能够有效的避免假阴性现象的产生。
发明内容
本发明提供一种检测患病犬是否感染巴贝斯虫的检测试剂盒，特别是含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒。本发明所要解决的技术问题是能够避免犬巴贝斯PCR检测过程中的假阴性结果。
本发明通过以下方案实现：
1.一种含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，包括上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，扩增内标质粒pMD-IAC，标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA，标准阴性模板，空白模板，PCR反应液2×Taq PCR Mix，无菌水。
2.扩增内标质粒pMD-IAC，是在pMD19-T Simple Vector载体中插入鸡的基因片段IAC。其构建方法是：采用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以鸡的基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后再以得到的PCR产物为模板，采用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行PCR扩增，扩增产物为IAC。引物SEQ ID NO：5 5′端含有SEQ ID NO：1序列，3′端含有SEQ ID NO：3部分序列，引物SEQ ID NO：6 5′端含有SEQ ID NO：2序列，3′端含有SEQ ID NO：4部分序列。以扩增内标质粒pMD-IAC为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR扩增，扩增产物的大小为150bp。
3.标准阳性模板为质粒pMD-18S rRNA，是在pMD19-T Simple Vector载体中插入犬巴贝斯虫18S rRNA基因序列。以标准阳性模板为质粒pMD-18S rRNA为模板，利用SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2进行PCR扩增，扩增产物的大小为339bp。
4.标准阴性模板为健康犬基因组DNA。
5.空白模板为无菌水。
6.含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒的使用方法为：
设立4个反应体系①待检样品PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，扩增内标质粒pMD-IAC(105copies/uL)1uL，样品DNA5uL，补加水至25uL。②阳性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA(105copies/uL)1uL，补加水至25uL。③阴性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，标准阴性模板5uL，补加水至25uL。④空白对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，补加水至25uL。
取PCR扩增产物7μL，采用质量比2.0％的琼脂糖凝胶含0.005％GOLDView，0.5×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果。
结果判断：①阳性对照泳道中含有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp；阴性对照泳道中含有1个条带，大小为150bp；空白对照泳道中没有条带。阳性对照，阴性对照，空白对照不符合上述结果判断检测结果无效，重新进行检测。②上述阳性对照，阴性对照，空白对照结果正常的情况下，待检样品泳道中只有150bp的条带判断为阴性；有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp判断为阳性；没有150bp的条带判断为无效，重新进行检测。
本发明在犬巴贝斯虫PCR检测体系中加入扩增内标，可以用来指示假阴性现象，排除因反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性。
附图说明
附图1以犬巴贝斯虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物PCR扩增结果。泳道1为空白对照；泳道2为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增结果，339bp；泳道3为DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
附图2以扩增内标质粒pMD-IAC为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物PCR扩增结果。泳道1为DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2为空白对照；；泳道3为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增结果，150bp。
附图3以犬巴贝斯虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物PCR扩增结果。泳道1为空白对照；泳道2为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8扩增结果，1700bp；泳道3为DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
附图4以标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物PCR扩增结果。泳道1为DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增结果，339bp；泳道3为空白对照。
附图5试剂盒实际待检样品检测结果。第1泳道待样品检测结果为阴性；第2泳道待检样品检测结果为阳性；第3泳道为空白对照；第4泳道为标准阴性对照；第5泳道为标准阳性对照；第6泳道为DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
具体实施方式
以下实施例中应用的仪器与试药包括：
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，纯度质粒小提试剂盒，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DH5α感受态细胞，2×Taq PCR Mix，购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1：犬巴贝斯虫PCR检测引物
针对犬巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计引物：上游引物：SEQ ID NO：15′-gtcttgtaattggaatgatggtgac-3′；下游引物：SEQ ID NO：25′-atgcccccaaccgttcctatta-3′，该引物对能够以犬巴贝斯虫基因组DNA为模板，扩增出339bp的PCR片段。25uL PCR反应体系；2×TaqPCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，样品DNA 5uL，补加水至25uL。PCR反应程序：预变性94℃，3min。变性94℃，15s；退火65℃，15s，每个循环降1℃；延伸72℃，30s；10个循环。变性94℃，15s；退火55℃，15s；延伸72℃，30s；25个循环。最后延伸72℃，5min。取PCR扩增产物7μL，采用质量比2.0％的琼脂糖凝胶含0.005％GOLDView，0.5×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果，泳道中能看到339bp的电泳条带(如附图1所示)。
实施例2：扩增内标质粒pMD-IAC构建
无菌采集鸡血液，EDTA抗凝。按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取鸡基因组DNA。设计上游引物SEQ ID NO：35′-TTGCCTTAGGactgtaag-3′和SEQ ID NO：45′-CCTCTATCAGcatccatc-3′，以提取的鸡基因组DNA为模板，扩增的PCR产物长度为103bp，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收103bp的PCR片段。设计引物SEQ ID NO：5 5′-gtcttgtaattggaatgatggtgac-TTGCCTTAGG-3′和SEQ ID NO：65′-atgcccccaaccgttcctatta-CCTCTATCAG-3′。引物SEQ ID NO：5 5′端含有SEQ ID NO：1序列，3′端含有SEQ ID NO：3部分序列，引物SEQ ID NO：6 5′端含有SEQ ID NO：2序列，3′端含有SEQ ID NO：4部分序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6能够以103bp的PCR产物为模板进行PCR扩增，扩增产物为IAC，片段长度为150bp。将扩增产物IAC进行琼脂糖凝胶电泳，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收IAC。
将IAC片段连接至pMD19-T Simple Vector，构建成标准阳性模板质粒pMD-IAC，然后转化DH5α感受态细胞，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG培养基平板(内含Ampiciline 0.1mg·mL-1，X-Gal 0.04mg·mL-1，IPTG 0.024mg·mL-1)，挑选白色菌落进行采用引物SEQ ID NO：1和SEQID NO：2进行PCR鉴定。将含有pMD-IAC质粒的阳性克隆接种LB液体培养基(内含Ampiciline 0.1mg/mL)，37℃培养过夜，采用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，TE溶解后用Nanodrop测定DNA浓度，计算质粒的拷贝数，分装后-70℃保存备用。
采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2以扩增内标质粒pMD-IAC为模板，进行PCR扩增，能扩增出150bp的PCR片段，电泳结果如附图2所示。
实施例3：标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA
针对犬巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计引物：上游引物：SEQ ID NO：7 5′-aacctggttgatcctgccagtagtcat-3′；下游引物：SEQ ID NO：8 5′-gaatgatccttccgcaggttcacctac-3′，该引物对能够以犬巴贝斯虫基因组DNA为模板，扩增出1700bp的PCR片段。反应体系和反应程序基本同实施例1，将实施例1中“延伸72℃，30s”改为“延伸72℃，90s”。电泳结果如附图3所示。
无菌采集犬巴贝斯虫病病犬的血液，EDTA抗凝。按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取血液中总的DNA。采用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1700bp的PCR产物。然后将1700bp的PCR产物连接至pMD19-T Simple Vector，构建成标准阳性模板质粒pMD-18SrRNA，然后转化DH5α感受态细胞，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG培养基平板(内含Ampiciline0.1mg·mL-1，X-Gal 0.04mg·mL-1，IPTG 0.024mg·mL-1)，挑选白色菌落进行采用引物SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2进行PCR鉴定。将含有pMD-18S rRNA质粒的阳性克隆接种LB液体培养基(内含Ampiciline 0.1mg/mL)，37℃培养过夜，采用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，TE溶解后用Nanodrop测定DNA浓度，计算质粒的拷贝数，分装后-70℃保存备用。
采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2以标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA为模板，进行PCR扩增，能扩增出339bp的PCR片段，电泳结果如附图4所示。
实施例4：标准阴性模板的制备
无菌采集健康犬的血液，EDTA抗凝。按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取血液中总的DNA。采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR扩增，无PCR扩增产物。
实施例5：扩增内标质粒pMD-IAC添加量的优化
在25uL的PCR反应体系中加入2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，不同拷贝数的标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA和扩增内标质粒pMD-IAC，补加水至25uL。标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA的拷贝数分别为：108-104/25uL反应体系和扩增内标质粒pMD-IAC拷贝数分别为：108-104/25uL反应体系，二者进行全面试验优化，共计25个PCR反应条件优化。确定不影响标准阳性模板质粒pMD-18S rRNAPCR扩增的情况下扩增内标质粒pMD-IAC的最佳添加量。结果显示扩增内标质粒pMD-IAC的添加量为106/25uL反应体系，105/25uL反应体系，104/25uL反应体系均不影响标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA的PCR扩增。
实施例6：试剂盒进行犬巴贝斯虫PCR检测
采集临床上可疑犬血液0.5mL，取0.1mL血液按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，最终用50uL的水溶解DNA。
待检样品PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2各0.5uL，扩增内标质粒pMD-IAC(105copies/uL)1uL，样品DNA 5uL，补加水至25uL。
阳性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2各0.5uL，标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA(105copies/uL)1uL，补加水至25uL。
阴性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2各0.5uL，标准阴性模板5uL，补加水至25uL。
空白对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2各0.5uL，补加水至25uL。
PCR反应程序同实施例1，反应结束后取PCR扩增产物7μL，采用质量比2.0％的琼脂糖凝胶含0.005％GOLDView，0.5×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果。
结果判断：①标准阳性对照泳道中含有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp；标准阴性对照泳道中含有1个条带，大小为150bp；空白对照泳道中没有条带。阳性对照，阴性对照，空白对照不符合上述结果判断检测结果无效，重新进行检测。②上述标准阳性对照，标准阴性对照，空白对照结果正常的情况下，待检样品泳道中只有150bp的条带判断为阴性；有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp判断为阳性；没有150bp的条带判断为无效，重新进行检测。

Claims (8)

1.一种含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，包括上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，扩增内标质粒pMD-IAC，标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA，标准阴性模板，空白模板，2PCR反应液2×Taq PCR Mix，无菌水。
2.权利要求1所述的含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增内标质粒pMD-IAC，是在pMD19-T Simple Vector载体中插入鸡的基因片段IAC，以扩增内标质粒pMD-IAC为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR扩增，扩增产物的大小为150bp。
3.权利要求2所述的扩增内标质粒pMD-IAC，其特征在于，所述的鸡的基因片段IAC的获得方法为：采用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以鸡的基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后再以得到的PCR产物为模板，采用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行PCR扩增，扩增产物为IAC。
4.权利要求3所述的鸡的基因片段IAC，其特征在于，所述的SEQ ID NO：5的5′端含有SEQ ID NO：1序列，3′端含有SEQ ID NO：3部分序列；SEQ ID NO：6的5′端含有SEQ ID NO：2序列，3′端含有SEQ ID NO：4部分序列。
5.权利要求1所述的含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，其特征在于所述标准阳性模板为质粒pMD-18S rRNA，是在pMD19-T Simple Vector载体中插入犬巴贝斯虫18SrRNA基因序列，以标准阳性模板为质粒pMD-18S rRNA为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQID NO：2进行PCR扩增，扩增产物的大小为339bp。
6.权利要求1所述的含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，其特征在于所述标准阴性模板为健康犬基因组DNA。
7.权利要求1所述的含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，其特征在于所述空白模板为无菌水。
8.权利要求1所述的含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的使用方法为：
设立4个反应体系①待检样品PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，扩增内标质粒pMD-IAC(105copies/uL)1uL，样品DNA5uL，补加水至25uL。②阳性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，标准阳性模板质粒pMD-18S rRNA(105copies/uL)1uL，补加水至25uL。③阴性对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，标准阴性模板5uL，补加水至25uL。④空白对照PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各0.5uL，补加水至25uL。
取PCR扩增产物7μL，采用质量比2.0％的琼脂糖凝胶含0.005％GOLDView，0.5×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果。
结果判断：①阳性对照泳道中含有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp；阴性对照泳道中含有1个条带，大小为150bp；空白对照泳道中没有条带。阳性对照，阴性对照，空白对照不符合上述结果判断检测结果无效，重新进行检测。②上述阳性对照，阴性对照，空白对照结果正常的情况下，待检样品泳道中只有150bp的条带判断为阴性；有2个条带，一个条带大小为339bp，另一个条带大小为150bp判断为阳性；没有150bp的条带判断为无效，重新进行检测。
CN201610209902.5A 2016-04-01 2016-04-01 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法 Pending CN105861651A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610209902.5A CN105861651A (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610209902.5A CN105861651A (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105861651A true CN105861651A (zh) 2016-08-17

Family

ID=56628143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610209902.5A Pending CN105861651A (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105861651A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107779519A (zh) * 2016-08-25 2018-03-09 台达电子国际（新加坡）私人有限公司 检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法
CN109136398A (zh) * 2018-09-15 2019-01-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法
CN110551839A (zh) * 2019-08-21 2019-12-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测试剂盒及检测方法
CN111534625A (zh) * 2020-06-29 2020-08-14 天津拓瑞医药科技有限公司 一种吉氏巴贝斯虫pcr检测方法
CN113215293A (zh) * 2021-06-23 2021-08-06 成都大熊猫繁育研究基地 一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101045943A (zh) * 2007-04-26 2007-10-03 上海交通大学 添有扩增内标的沙门氏菌pcr检测方法
CN104293903A (zh) * 2014-03-20 2015-01-21 河南科技大学 用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101045943A (zh) * 2007-04-26 2007-10-03 上海交通大学 添有扩增内标的沙门氏菌pcr检测方法
CN104293903A (zh) * 2014-03-20 2015-01-21 河南科技大学 用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107779519A (zh) * 2016-08-25 2018-03-09 台达电子国际（新加坡）私人有限公司 检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法
CN109136398A (zh) * 2018-09-15 2019-01-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法
CN110551839A (zh) * 2019-08-21 2019-12-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测试剂盒及检测方法
CN111534625A (zh) * 2020-06-29 2020-08-14 天津拓瑞医药科技有限公司 一种吉氏巴贝斯虫pcr检测方法
CN113215293A (zh) * 2021-06-23 2021-08-06 成都大熊猫繁育研究基地 一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法
CN113215293B (zh) * 2021-06-23 2022-09-13 成都大熊猫繁育研究基地 一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861651A (zh) 一种含扩增内标的犬巴贝斯虫pcr检测试剂盒及使用方法
CN103966358B (zh) 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN105018489B (zh) 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒
CN104152584B (zh) 羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒
CN103224995B (zh) 一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米pcr检测试剂盒及其应用
CN106103715A (zh) 沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用
CN104195266A (zh) 检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量pcr试剂盒
CN107475456A (zh) 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒
CN108034767A (zh) 鉴别血清i型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒
CN108004350A (zh) 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量pcr检测引物
CN101748214B (zh) 鸡白痢－伤寒沙门氏菌pcr检测方法及其中的核酸和引物对
CN104152582B (zh) 牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
CN101045944B (zh) 检测六种腹泻致病菌的基因芯片、制备方法及试剂盒
CN105219837B (zh) 一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒
CN103333903A (zh) 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒
CN106148565A (zh) 一种锦鲤疱疹病毒cpa检测引物及应用
CN102373302B (zh) 羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN101942528B (zh) 一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针
CN104513854B (zh) 一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用
CN102634605A (zh) 检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒
CN101514373A (zh) 实时荧光定量pcr快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒
CN105087831A (zh) 牡蛎疱疹病毒i型检测引物、方法与应用
CN102618635B (zh) 鼠伤寒沙门氏菌的特异性fq-pcr检测方法
CN107502681A (zh) 一种a组轮状病毒快速实时荧光rt‑pcr检测试剂盒
CN103045762A (zh) 一种检测牛白血病病毒前dna的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160817