CN101045944B - 检测六种腹泻致病菌的基因芯片、制备方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测六种腹泻致病菌的基因芯片，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA或cDNA片段。上述芯片和样品处理试剂、杂交、显色试剂、说明书组成检测试剂盒。本发明方法能在短时间内分析大量的腹泻样本，快速准确地获取样品中的信息，检测效率是传统检测手段的数十倍。本发明提供了一整套芯片的制备、杂交、显色过程。芯片可大规模生产，无污染。此发明质量、精度、效率，比传统检测方法均有提高，加工、操作、使用简便。

Description

检测六种腹泻致病菌的基因芯片、制备方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域和医学诊断领域，具体涉及检测六种腹泻致病菌的基因芯片、芯片的制备方法和检测用试剂盒。

背景技术

本发明所述的六种腹泻致病菌包括：

志贺氏菌(Shigella flexneri)(以下简写为SD)

出血性大肠杆菌O157：H7(Enterohemorrhagic E.coli O157:H7)(以下简写为EHEC)

侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli)(以下简写为EIEC)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(以下简写为VP)

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(以下简写为VC)

沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(以下简写为SB)

肠道新发病原微生物感染对人类健康、社会安定及经济发展危害严重。近30年来新发现的病原体已达30余种，其中，食源性病原性细菌引发的传染病疫情和中毒事件不胜枚举，已经成为当前世界上不断增多的公共卫生问题之一。据WHO的资料，在2000年的1年内，全世界就有210万人死于以感染性腹泻为主的食源性疾病。1994年美国由于冰激凌污染而引发沙门菌病的暴发，患病人数高达22.4万人。肠出血性大肠杆菌O157:H7引起了世界震惊，1996年日本在几个城市中的流行造成上万人感染，13人死亡。O139群霍乱弧菌造成新型霍乱流行，曾带给人类以巨大的惊恐。在突如其来的新发传染病面前，人群没有的免疫力，一时也往往找不到有效的检测、预防、治疗和控制的办法，因而新发传染病较已知的传染病不仅对人类健康而且对社会安定及经济发展都具有更大的危害性。

采用的传统的方法诸如依靠细菌培养，生化反应，血清凝集等根本无法满足快速的要 求。生物传感器、生物芯片、实时荧光PCR、酶联免疫分析、时间分辨荧光分析等先进的核酸检测技术和免疫检测技术的出现实现了病原体的快速诊断，使检测时间缩短到几小时甚至几分钟，并大大提高了检测灵敏度。

核酸检测技术具有灵敏、特异等优点，其中以生物芯片技术应用最为突出。目前，已有用基因芯片检测病原微生物的实验室研究结果报道，但还没有到实用阶段。芯片实验室(微流路)技术在国外的研究起步较早，取得了一些实用化的产品，如Livermore实验室研制出了电池驱动的手持式PCR仪，并已有多篇有关病原菌、毒素、病毒检测的文献报道。美国CombiMatrix公司通过微阵列技术已经可以同时检测毒素、病毒和细菌，2004年，美国国防部投资CombiMatrix公司590万美元来开发用于生物战剂检测的技术，其目标是要把微电子和微流路技术整合起来，研制出小型、价廉、高灵敏且自动化的检测生物战剂(针对炭疽、鼠疫、毒素等)的系统。美军目前正在进行芯片实验室诊断技术用于生物战剂报警器的研究，研究与采样器直接相连的芯片实验室，以缩短生物战剂检测与报警的时间。

核酸探针技术包括三部分，即待测核酸，固相载体(硝酸纤维素膜)和用同位素，酶，荧光标记的核酸探针。核酸探针技术有原位杂交(直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应)，斑点杂交(将待测的核酸或细胞裂解物，经过变性后直接点到固相膜上)，Southern杂交等，方法是将标记好的探针与模板经过变性、复性、按照碱基配对原则，如果模板核酸与探针核酸同源互补则结合，具有高度的特异性。利用酶底物反应或放射自显影可见预期条带。探针技术敏感性高，检测一个单基因需104拷贝，能检测低至10-13gDNA。特异性强，可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物。(参见蔡宝祥，家畜传染病院学，25，2005)。

基因芯片技术是在核酸杂交，测序的基础上发展起来的，把已知序列的探针有序地固定在膜上，每个点就代表某个特定基因，然后将样本中的靶基因进行生物素标记，与基因芯片进行杂交，来对基因序列及功能进行研究。基因芯片技术包括四个基本技术环节：芯片制备，样品制备，生物分子反应及信号的检测与分析。在整个过程中，基因芯片就犹如一面超高倍率放大镜，映射出待检物基因结构与正常基因结构上的细微差异，从而诊断出疾病。

总的来说，基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。基因芯片技术具有高度并行性、多样性、微型化和自动化这四大特点。高度并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，效率大为提高；多样性则提供了多种样品测定；微型化的好处在于对样品的需要量非常少，而且还能节省试剂用量，降低成本；自动化使得人力投入减少并保证了质量。同时，它还具有操作简便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势，它集中了现在所有病毒诊断技术的优点，降低了假阳性和假阴性的问题，提高了特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测六种腹泻致病菌的基因芯片，以弥补传统的检测方法技术存在的不足。本发明的检测方法操作方便，克服了现有检测方式单一和费时费力的问题，可有效快速解决六种腹泻致病菌的检测问题，具有高效性、特异性、灵敏性的特点，提高了现有的检测效率。

本发明的更进一步的目的是提供检测六种腹泻致病菌的的基因芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供用于检测六种腹泻致病菌的试剂盒。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：检测六种腹泻致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，其特征在于：芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA或cDNA片段。

所述的从志贺氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的碱基序列；从出血性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的碱基序列；从侵袭性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从副溶血性弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从霍乱弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的碱基序列；从沙门氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具 有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的碱基序列。

所述的从志贺氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：15或SEQID NO：16所示的碱基序列；从出血性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的碱基序列；从侵袭性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的碱基序列；从副溶血性弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示的碱基序列；从霍乱弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的碱基序列；从沙门氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的碱基序列。

制备所述的检测六种腹泻致病菌的基因芯片的方法，包括以下的步骤：

(1)探针的设计：根据所述的志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列作为探针，它们分别具有如权利要求2或3所述的碱基序列；

(2)探针的合成：将设计的寡核苷酸探针进行人工合成，采用PAGE方式纯化。

(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的目的探针点膜，再经交联、存膜即得芯片，其中点膜后的样品点直径在50μm-2000μm。

所述的用于检测六种腹泻致病菌的试剂盒，主要包括：权利要求1、2或3所述的基因芯片、待测样品处理试剂、杂交、显色试剂和说明书。

有益效果

本发明方法能在短时间内分析大量的腹泻样本，快速准确地获取样品中的信息，检测效率是传统检测手段的数十倍。

本发明提供了一整套六种腹泻致病菌检测探针的制备方法，方法简便。

本发明提供了一整套芯片的制备、杂交、显色过程。

本发明提供了完整的探针排布，优化方案。此方案依据实例调整，具有合理性。

芯片可大规模生产，无污染。此发明质量、精度、效率，比传统检测方法均有提高，加工、操作，使用简便。

附图说明

图1为腹泻致病菌芯片点样布局设计示意图；

图2为检测腹泻临床样本芯片布局示意图；

图3为临床样本PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图4为杂交显色阴性对照结果；

图5为杂交显色阳性对照结果；

图6为杂交显色临床样本检测结果；

为进一步说明本发明用于检测六种腹泻致病菌的基因芯片及其检测方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

具体实施方式

实施例1

六种腹泻致病菌探针设计与合成

1.1六种腹泻致病菌探针设计

通过文献检索及美国国家生物信息中心(NCBI)的比对获得六种腹泻致病菌基因探针。首先我们要明确芯片上需要什么样的探针才能检测出样本里的致病菌。根据文献检索可以得到各种致病菌的特异基因序列，在NCBI数据库中比对，根据志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列输入软件PrimoMultiplex 3.4 Multiplex PCR Primer Design，设定好参数，运行程序，(5’PRIMER 0-2003’PRIMER-200-0 TM：57℃ TM Formula Nearest N ％GC 50 ANYCheck primer-primerdimmer Avoid backgroung priming Multiplex PCR 5 Specificity Medium其余参数为默认值.)选取长度合适的计算结果，最终作为致病菌探针片段。

以下是检测六种腹泻致病菌的所需探针序列以及阳性内参探针序列。

1、志贺氏菌(OShigella flexneri)

S.flexner invasion plasmid antigen H(ipaH)gene.

SEQ ID NO：1CGAGGCATTG CTTTTAACAG ACTCTCCCAG TGCTTTCAGA ATCAAGAAGC AGTATTAAAT

TTATCAGACC TAAATTTGAC GTCTCTTCCC GAATTACCAA AGCATATTTC TGCTTTGATT

GTAGAAAATA ATAAATTAAC ATCATTGCCA AAGCTGCCTG CATTTCTTAA AGAACTTAAT

GCTGATAATA ACAGGCTTTC TGTGATACCA GAACTTCCTG AGTCATTAAC AACTTTAAGT

GTTCGTTCTA ATCAACTGGA AAACCTTCCT GTTTTGCCAA ACCATTTAAC ATCATTATTT

GTTGAAAATA ACAGGCTATA TAACTTACCG GCTCTTCCCG AAAAAT

PCR扩增SEQ ID NO：1序列引物

SEQ ID NO：29 Sense：     5′CGAGGCATTGCTTTTAAC 3′

SEQ ID NO：30 Anti-sense：5′ATTTTTCGGGAAGAGC   3′

SEQ ID NO：15 TTGAC GTCTCTTCCC GAATTACCAA AGCATATTTC TGCTTTGATT

GTAGAAAATA ATAA

SEQ ID NO：2TTCGCTGTTG CTGCTGATGC CACTGAGAGC TGTGAGGACC GTGTCGCGCT CACATGGAAC

AATCTCCGGA AAACCCTCCT GGTCCATCAG GCATCAGAAG GCCTTTTCGA TAATGATACC

GGCGCTCTGC TCTCCCTGGG CAGGGAAATG TTCCGCCTCG AAATTCTGGA GGACATTGCC CGGGATAAAG

TCAGAACTCT CCATTTTGTG GATGAGATAG AAGTCTACCT GGCCTTCCAG ACCATGCTCG CAGAGAAACT

TCAGCTCTCC ACTGCCGTGA AGGAAATGCG TTTCTATGGC GTGTCGGGAG TGACAGCAAA TGACCTCCGC

ACTGCCGAAG CTATGGTCAG AAGCCGTGAA GAGAATGAA

PCR扩增SEQ ID NO：2序列引物

SEQ ID NO：31 Sense：     5′TTCGCTGTTGCTGCTGATG    3′

SEQ ID NO：32 Anti-sense：5′TTCATTCTCTTCACGGCTTCT  3′

SEQ ID NO：16 GTGA AGGAAATGCG TTTCTATGGC GTGTCGGGAG TGACAGCAAA TGA

2、出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic E.coli O157:H7)

Eschericia coli serotype O157:H7 O antigen gene cluster.

SEQ ID NO：3 ACGATTTCTT TCCGACACCA GAGTTAGAAA AGGAATTAAA AGCAATAATA AATAGAATAC

AGGGAATAAA GCATCAAGAC TTATTTTATG GAGAACGGTT ACATAAACAA GTATTTGGAG ACATGGGAGC

AAATTTTTTA TCAGTTACTA CGTATGGAGC AGAACTGTTA GTTTTTTTTG GTTTTCTCTG TGTATTCATT

ATCCCTTTAG GGATATATAT ACCTTTTTAT CTTTTAAAGA GAATGAAAAA AACCCATAGC TCGATAAACT

GCGCATTCTA TTCATATATC ATTATGATTT TATTGCAATA CTTAGTGGCT  GGGAAT

PCR扩增SEQ ID NO：3序列引物

SEQ ID NO：33 Sense：     5′ACGATTTCTTTCCGACACCAG   3′

SEQ ID NO：34 Anti-sense：5′ATTCCCAGCCACTAAGTATTGC  3′

SEQ ID NO：17 TCAAGAC TTATTTTATG GAGAACGGTT ACATAAACAA GTATTTGGAG ACATGGGAGC

AA

SEQ ID NO：4CTTATTCAAG AGGTGTTTCC TGAAGGGTTA AGATCTCTAT CTTTGATTAC TTCGGGTTAT

GTAAA TATG ATATGGGGGG AGTATCTTCA AAAAAAAGAA TTTTAAGAGA TAAAGAGCTT GCCAAAATTA

TGTTTGAAAA AAATAAAAAA AACCTTATTA AGTTTATTCC AATTTCAATA ATCAAAATTT TATTCCCTGA

ACGTTTAAGA AGAGTATTGC GGAAAATGCA ATATATTTGT CTAACTTTAT TCTTCATGAA GAATAGTTCA

CCATATGATA ATGAATAAAA TCAAAAAA T ACTTAAATTT TGCACTTTAA AAAAATATGA TAC

PCR扩增SEQ ID NO：4序例引物

SEQ ID NO：35 Sense：     5′CTTATTCAAGAGGTGTTTCCTGA 3′

SEQ ID NO：36 Anti-sense：5′GTATCATATTTTTTTAAAGTGC  3′

SEQ ID NO：18TTCCCTGA ACGTTTAAGA AGAGTATTGC GGAAAATGCA ATATATTTGT

CTAACT

3、侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli)

Escherichia coli serotype O143 VirB gene.

SEQ ID NO：5 GGAGATTGAT GGTAGAATTG AAATTCTGGA TGGCACTCGT AGAAGAGCAT CTGCAATATA

TGCAGGAGCA GATCTTGAAG TTCTATATTC AAAAGAATAT ATATCTACTC TTGATGCCAG

AAAACTAGCA AACGATATAC AAACAGCAAA AGAGCATAGC ATCCGAGAAC TTGGTATTGG

TCTTAATTTT  CTGAAAGTAT  CAGGGATGTC  CTATAAAGAC ATAGCCAAAA AAGAGAATCT

GTCTCGCGCG AAAGTCACTC  GTGCCTTTCA GGCAGCAAGC  GTTCCACAGG AAATAATATC

TCT

PCR扩增SEQ ID NO：5序列引物

SEQ ID NO：37 Sense：     5′GGAGATTGATGGTAGAATTG 3′

SEQ ID NO：38 Anti-sense：5′AGAGATATTATTTCCTGTGG 3′

SEQ ID NO：19 AAC TTGGTATTGG TCTTAATTTT CTGAAAGTAT CAGGGATGTC CTATAAAGAC ATAGC

SEQ ID NO：6 CCAAGATTTA ACCTTCGTCA ACCAAAAAAC GAATGTACGC GATCAAGAAT CCCTAACAGA

AGAATCATTA GCCGATATCA TAAAAACTAT AAAGCTACAA CAATTCTTCC CTGTAATAGG AAGGGAGATT

GATGGTAGAA TTGAAATTCT GGATGGCACT CGTAGAAGAG CATCTGCAAT ATATGCAGGA GCAGATCTTG

AAGTTCTATA TTCAAAAGAA TATATATCTA CTCTTGATGC CAGAAAACTA GCAAACGATA TACAAACAGC

AAAAGAGCAT AGCATCCGAG AACTTGGTAT

PCR扩增SEQ ID NO：6序列引物

SEQ ID NO：39 Sense：     5′CCAAGATTTAACCTTCGTCAACC  3′

SEQ ID NO：40 Anti-sense：5′ATACCAAGTTCTCGGATGCTATG 3′

SEQ ID NO：20 TGTAATAGG AAGGGAGATT GATGGTAGAA TTGAAATTCT GGATGGCACT CGTAGAAGAG

4、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)

Vibrio parahaemolytiCus tdh gene encoding thermostable direct hemolysin gene.

SEQ ID NO：7 TGTACTGAGG GATCCCCTCA GAAATCTGCC AGTGCATAGC CACCTTTTAA TAGTTGCGTA

GCTAGAACCA CCGCCGCAGC TAAGAGCTGT TGAGTTGTTA TCTCGTAGTC TGGTCGTCTG

AGGACTTCCA TTCCTAATCG AATGGTAGAC AGGACATTTC TATTTCTGAC TGTATTCGCT

TGAAAGTGCC TTTCCCATCC TTGGCTTTGC GCATGTATCC CTGCCAGCCA AAACATAAGT

TGCAGCATTA GGGCTATCA

PCR扩增SEQ ID NO：7序列引物

SEQ ID NO：41 Sense：     5′TGTACTGAGGGATCCCCTCAG 3′

SEQ ID NO：42 Anti-sense：5′TGATAGCCCTAATGCTGCAAC 3′

SEQ ID NO：21 CTAATCG AATGGTAGAC AGGACATTTC TATTTCTGAC TGTATTCGCT

TGAAAGTGCC

SEQ ID NO：8 CGTAGTCTGG TCGTCTGAGG ACTTCCATTC CTAATCGAAT GGTAGACAGG ACATTTCTAT

TTCTGACTGT ATTCGCTTGA AAGTGCCTTT CCCATCCTTG GCTTTGCGCA TGTATCCCTG CCAGCCAAAA

CATAAGTTGC AGCATTAGGG CTATCAGCAA AATAATATCG AACCTTTTGG AAAACTAGTG CGACTTTGAC

GTAGGCCTAA TCCGTAAGCG GGACTCTTTA AGTCTCGGAA GGTTTCTTCT ATCTCCATCA GCCTTTGCG

SEQ ID NO：22 GAAT GGTAGACAGG ACATTTCTAT TTCTGACTGT ATTCGCTTGA AAGTGCCTTT CCCAT

PCR扩增SEQ ID NO：8序列引物

SEQ ID NO：43 Sense：     5′CGTAGTCTGGTCGTCTGAGGG 3′

SEQ ID NO：44 Anti-sense：5′CGCAAAGGCTGATGGAGATAG 3′

5、霍乱弧菌(vibrio cholerae)

Vibrio cholerae strain 1322-69 CtxA(ctxA)gene.

SEQ ID NO：9 GGCATACAGT CCTCATCCAG ATGAACAAGA AGTTTCTGCT TTAGGTGGGA TTCCATACTC

CCAAATATAT GGATGGTATC GAGTTCATTT TGGGGTGCTT GATGAACAAT TACATCGTAA TAGGGGCTAC

AGAGATAGAT ATTACAGTAA CTTAGATATT GCTCCAGCAG CAGATGGTTA TGGATTGGCA GGTTTCCCTC

CGGAGCATAG AGCTTGGAGG GAAGAGCCGT

PCR扩增SEQ ID NO：9序列引物

SEQ ID NO：45 Sense：     5′GGCATACAGTCCTCATCCAGG 3′

SEQ ID NO：46 Anti-sense：5′ACGGCTCTTCCCTCCAAG  3′

SEQ ID NO：23 TT TGGGGTGCTT GATGAACAAT TACATCGTAA TAGGGGCTAC AGAGATAGA

SEQ ID NO：10 CGGGCAGATT CTAGACCTCC TGATGAAATA AAGCAGTCAG GTGGTCTTAT

GCCAAGAGGA CAGAATGAGT ACTTTGACCG AGGTACTCAA ATGAATATCA ACCTTTATGA TCATGCAAGA

GGAACTCAGA CGGGATTTGT  TAGGCACGAT  GATGGATATG TTTCCACCTC AATTAGTTTG

AGAAGTGCCC ACTTAGTGGG TCAAACTATA TTGTCTGG

PCR扩增SEQ ID NO：10序列引物

SEQ ID NO：47 Sense：     5′CGGGCAGATT CTAGACCTC 3′

SEQ ID NO：48 Anti-sense：5′CCAGACAATATAGTTTGAC  3′

SEQ ID NO：24 ATGAGT ACTTTGACCG AGGTACTCAA ATGAATATCA ACCTTTATGA TCATGC

SEQ ID  NO：11 ACCCAACATG TTTAACGTTA ATGATGTATT AGGGGCATAC AGTCCTCATC

CAGATGAACA AGAAGTTTCT GCTTTAGGTG GGATTCCATA CTCCCAAATA TATGGATGGT ATCGAGTTCA

TTTTGGGGTG CTTGATGAAC AATTACATCG TAATAGGGGC TACAGAGATA GATATTACAG TAACTTAGAT

ATTGCTCCAG CAGCAGATGG  TTATGGATTG GCAGGTTTCC C

PCR扩增SEQ ID NO：11序列引物

SEQ ID NO：49 Sense：     5′ACCCAACATGTTTAACG  3′

SEQ ID NO：50 Anti-sense：5′GGGAAACCTGCCAATCC  3′

SEQ ID NO：25 GGGC TACAGAGATA GATATTACAG TAACTTAGAT ATTGCTCCAG CAGCAGATG

6、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)

Salmonella typhimurium activator of invasion gene expression HilA(hilA)gene.

SEQ ID NO：12ACATGGACGG CTCCCTCGTA CGCTCAGAAA AGAAAGTCAA TATTCCGCCA

ACTGGACCAG GTATGGGGCG ACGCGGAAGT TAACGAAGAA TCTCTTACCC GCTGTATTTA TGCCTTACGA

C

PCR扩增SEQ ID NO：12序列引物

SEQ ID NO：51 Sense：     5′ACATGGACGGCTCCCTCG  3′

SEQ ID NO：52 Anti-sense：5′GTCGTAAGGCATAAATAC  3′

SEQ ID NO：26 A CGCTCAGAAA AGAAAGTCAA TATTCCGCCA ACTGGACCAG GTATGG

SEQ ID NO：13CGGTCGTAGT GGTGTCTCCG CCAGCGCCGC AACCTACGAC TCATACATTG

GCGATACTTC CTTTTCAGAT GCAGGATCAG GTTCAATCCG AGAGTCTGCA TTACTCTATC GTGAAGGGAT

TATCGCAGTA TGCGCCCTTT GGCCTGAGCG TGCTGCCGGT GACCATTACG AAGAACTGCC

GC

PCR扩增SEQ ID NO：13序列引物

SEQ ID NO：53 Sense：     5′CGGTCGTAGTGGTGTCTCC  3′

SEQ ID NO：54 Anti-sense：5′GCGGCAGTTCTTCGTAATG  3′

SEQ ID NO：27 GGATCAG GTTCAATCCG AGAGTCTGCA TTACTCTATC GTGAAGGGAT TATCGCAGTA

TGC

SEQ ID NO：14 GTGTAATTAT CAGACCATTA ACCATGAAGA TATAATAAGC AGCATTTACA

CCCCAAAAAA ATGCAGTAAG ATAGCTACAA AACTAATCTC TATTGCAATG AGGCCAAGTT AAATATGTAA

ATATTTAGAT GCCCGGCGCT GACTCTCTCT GCACCAGGAT ATACGGCAGC GTCCATTCGA

TAATCA

PCR扩增SEQ ID NO：14序列引物

SEQ ID NO：55 Sense：     5′GTGTAATTATCAGACCATTAAC 3′

SEQ ID NO：56 Anti-sense：5′TGATTATCGAATGGACGCTGC  3′

SEQ ID NO：28 AGTT AAATATGTAA ATATTTAGAT GCCCGGCGCT GACTCTCTCT GCACCAGGAT

将上述致病菌片段输入软件Primo Multiplex 3.4 Multiplex PCR Primer Design，设定好参数，运行程序，(5’PRIMER 0-2003’PRIMER-200-0TM：57℃TM Formula NearestN ％GC 50 ANYCheck primer-primet dimmer Avoid backgroung priming Multiplex PCR5 Specificity Medium其余参数为默认值.)选取长度合适的计算结果，最终作为病毒探针片段。

1.2探针的合成

合成的过程

目前，oligo DNA合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’向3’方向延伸，而是由3’端开始。具体的反应步骤如下：

保护基(Deblocking)

用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。

活化(Activation)

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

连接(Coupling)

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

封闭(Capping)

缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

氧化(Oxidation)

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

实施例2

芯片制备

得到纯化的合成探针片断后，配置探针溶液，准备芯片点样。

芯片制作：

1、切膜：选用合适的硝酸纤维素膜或尼龙膜，于切膜机中准确裁剪成方形芯片。规格1.5cm×1.5cm。

2、贴膜：将芯片用胶固定于芯片方皿中，使之紧贴皿底，放置，待胶凝固，用一15.0×15.0mm方形模具轻压芯片，使之紧贴芯片方皿底部，放置2分钟，使胶凝固，芯片平整地贴于芯片方皿底部，并在芯片方皿的边框上作一定向标志或编号。

3、点膜：对探针分布进行合理布局，设阳性、阴性对照点。再将已配制好的探针溶液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时已吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作1-3次，点样完毕。

4、存膜：点样完毕，将点好的芯片紫外交联10min，封装4℃保存。

5、芯片布局

芯片定性控制主要指从芯片制备到样本处理，到杂交扫描各环节的监控，目前主要的控制系统有：

(1)阴性对照：健康人血清；其检测指标应为六种探针均不显色。

(2)阳性对照：六种腹泻致病菌检测基因克隆质粒模板同比例混合液(溶于健康人血清)，其检测指标为六种腹泻致病菌探针均显色。

(3)阴性内参：(置乱DNA序列探针，监控非特异性杂交显色过程)

(4)阳性内参：对于本实验中的腹泻致病菌的检测，可以使用改造过的一段其它基因片段，在腹泻致病菌扩增引物的同时可以扩增该序列片段，在样本抽提时加入检测体系中，用于监控核酸抽提，PCR扩增，标记，芯片制备，芯片杂交。

(5)杂交监控：(用生物素点于芯片上，监控显色过程)

(6)空白点：是不含任何基因片段的空白点样液，作为芯片制备过程中的污染监控指标。

本实验中采用1倍的点样buffer。

设计的阳性内参PCR扩增序列及探针

SEQ ID NO：57 ACAGTCAATA CCCGCTACGC GCGTCTGAGT TCAACTTGGT TGAGCCGTTA

AACTGCATTC AGATTCGCCA GCTTCGGATT GCTACAGTGG GTCGATATCT GAGAACATCA CGACGTCGAT

ATGGGTCTTT CTACCCTCGA GGTGGCGCGA TGAAGGTTTT TCATCTACTC AGACCGCTGA TCCCT

腹泻致病菌芯片点样布局设计见附图1：

1、2为SD探针；3、4为SB探针；5、6为VP探针；7、8为EHEC探针；9、10为V探针；11、12为EIEC探针

：阴性内参：(置乱DNA序列探针，监控非特异性杂交显色过程)

*：阳性内参：(设计模板、探针及引物，模板混合于PCR反应液中，引物混合于引物混合液中。监控除样品处理外，PCR及杂交、显色全过程)

◆：杂交监控：(用生物素点于芯片上，监控显色过程)

◇：空白：(采用1倍的点样buffer)

实施例3

样本处理

1)样品采集

病人排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便数处(液状粪便则取絮状物)，放于1.5ml无菌离心管中，对不易获取粪便者或婴幼儿，可用肛拭采集。将拭子前端用无菌甘油水湿润然后插入肛门约4-5cm(幼儿约2-3cm)处，轻轻旋转擦取表面粘液后退出置于1.5ml 无菌离心管内送检。

2)样品处理；

1、取适量粪便1.5ml无菌离心管，加入适量灭菌生理盐水至1ml，振匀后600g离心1-3min。取上清液。

2、将上清液12000g离心3-5min，弃上清液，加入200-500μl生理盐水，12000g离心5-10min。取上清液。

3、加入50-100μl裂解液，95-100℃，10min。12000g离心5-10min。取上清液，待检测。样品存放：制备的样品在2℃-8℃条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融。

实施例4

待测样品的扩增标记

取101处理后的样本为模板进行PCR扩增标记，反应体系为 

以上试剂混合均匀，置热盖PCR仪中，进行30-40个热循环扩增。程序如下：

实施例5

杂交显色与结果阅读

4.1预杂交在装有基因芯片的方形小皿边上写上样品编号。向小皿中加入300-450μl预杂交液，置杂交仪上，于30-40℃，预杂交10-40min，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

4.2杂交将样本中提取的核酸经PCR扩增，取扩增产物20-60μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸5-30min使变性，-20℃骤冷5-10min。加入350-450μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于35-58℃振荡杂交20-90min，振荡频率：IV。吸去杂交液。

4.3洗涤分别用2×SSC和0.1×SSC洗涤液各300-450μl将杂交芯片洗涤2-4次，每次2-6min，洗涤时振荡，吸去余液。

4.4封闭向杂交芯片中加入300-450μl封闭液，置杂交仪上，于40℃封闭10-40min，振荡频率：IV，吸去封闭液。

4.5酶联取350-450μl洗涤液(酶联缓冲液)中，加入3μl AV-AP(最好用SAv-AP)，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于30-45oC酶联反应10-50min，振荡频率：IV。吸去反应液，用洗涤液300-450μl将杂交芯片洗涤2-5次，每次2-8min，吸去洗涤液。

4.6显色加入显色液显色(400μl底物液+2μl BCIP+2μlNBT)，置杂交仪上，避光、常温或30-45oC显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

4.7用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

4.8于芯片阅读仪上阅读结果。

*洗涤时，加入洗涤液后，振荡数分钟，吸去洗液。

结果阅读：

1.将芯片放入芯片阅读仪内。

2.设置基因点阵、分辨率、阴性上限、阳性上限、模板设置等项。

3、观察结果，调整后打印结果。

实施例6

试剂盒组成

1.1样本处理试剂

本试剂包括：1、生理盐水：121℃±2℃，高压灭菌20min；2、裂解液

1.2杂交试剂

1)、20×SSC：NaCl 17.55％；柠檬酸三钠*2H2O 8.82％；PH＝7.0

2)、1M PBS：NaCl 0.8％；KCl  0.02％；Na2HPO 4*12H2O 0.144％；KH2PO 4*12H2O0.024％；PH＝6.4

3)、0.1M EDTA：EDTA 3.72％

4)、预杂交液：取甲酰胺(DMF)50ml；20×SSC 25ml；50×Denhartds 10ml；鱼精DNA(10mg/ml)5ml；1M PBS(PH＝6.4)5ml；0.1M EDTA 5ml

5)、杂交液：取甲酰胺45ml；20×SSC 25ml；50×Denhartds 2ml；鱼精DNA(10mg/ml)2ml；1M PBS(PH＝6.4)2ml；20％硫酸葡聚糖钠25ml

6)、1M Tris-HCl(PH＝7.5)；0.19％MgCl2；0.05％(Triton X-100体积比)；NaCl 5.8％；

7)、封闭液：称取3g BSA溶于70ml蒸馏水中，加入10ml 1M Tris-HCl PH＝7.5(配制试剂6)

8)、酶联液：0.1M Tris-HCl(PH＝7.5)；2mM MgCl2；0.05％Triton X-100(体积比)；1.0M NaCl；

9)、底物溶液：Tris-HCl 0.1M PH＝9.5；MgCl 25mM；NaCl 0.1M；

10)、洗涤液：

(1)、2×SSC配方：配制250ml

量取20×SSC 25ml加入10％SDS 2.5ml，加蒸馏水至250ml；

(2)、0.1×SSC配方：配制250ml

量取20×SSC 1.25ml加入10％SDS 2.5ml，加蒸馏水至250ml；

11)、5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸(BCIP)：称取10mg BCIP溶于200μl DMF中

12)、氮蓝四唑(NBT)：称取15mg NBT溶于200μl 70％DMF中

1.3其它试剂

RCR阴性对照    1ml×1管

PCR阳性对照    1ml×1管

1.4PCR mix混合液

1.5Taq酶(5U/μl)

1.6点好探针的芯片，18张

1.7采样工具：注射器；棉拭子；1.5ml EP管

1.4操作说明书

实施例7

应用试剂盒检测腹泻临床样本实验

一：样本处理

1)样品采集

病人排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便(液状粪便则取絮状物)，放于1.5ml无菌离 心管中，对不易获取粪便者或婴幼儿，可用肛拭采集。将拭子前端用无菌甘油水湿润然后插入肛门约4-5cm(幼儿约2-3cm)处，轻轻旋转擦取表面粘液后退出置于1.5ml无菌离心管内送检。

2)样品处理：

1、取适量粪便1.5ml无菌离心管，加入适量灭菌生理盐水至1ml，振匀后600g离心1-3min。取上清液。

2、将上清液12000g离心3-5min，弃上清液，加入200-500μl生理盐水，12000g离心5-10min。取上清液。

3、加入50-100μl裂解液，95-100℃，10min。12000g离心5-10min。取上清液，待检测。样品存放：制备的样品在2℃-8℃条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融。

二：临床样本PCR标记

PCR体系

实验过程中设阴性对照和阳性对照

阴性对照：为无任何模板的PCR体系

阳性对照：为加入六种腹泻致病菌及阳性内参模板混合物的PCR体系

PCR扩增程序

94℃    5min

52℃    35s    38次循环

72℃    45s

72℃    10min

4℃

2、1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果见附图3；

M：50bp DNA Ladder

1：阴性对照

2：阳性对照

3：临床样本

三：检测腹泻临床样本杂交实验

1、探针点膜

取6μl探针加入5μl 10％的海藻糖

芯片探针排布见附图2

1-2：阳性内参探针(设计模板、探针及引物，模板混合于PCR反应液中，引物混合于引物混合液中。监控除样品处理外，PCR及杂交、显色全过程)

3-4：SD探针

5-6：SB探针

7-8：VP探针

9-10：EHEC探针

11-12：VC探针

13-14：EIEC探针

*：阴性内参：(置乱DNA序列探针，监控非特异性杂交显色过程)

◇：空白：17，采用1倍的点样buffer。

2、探针固定

把点好样的芯片放入紫外交联仪中紫外照射10min。

3、PCR标记产物变性：

PCR循环后的产物置电磁炉中100℃水浴加热变性10分钟，然后迅速放入-20℃冰箱中骤冷10分钟。

4、杂交：

4.1预杂交：

在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号，向小皿中加入300μl预杂交液，置杂交仪 上，于40℃预杂交25分钟，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

4.2杂交：

取经PCR扩增的标记物30μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸10分钟使变性，然后迅速置-20℃冰箱中骤冷20分钟。加入400μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于53℃振荡杂交1hr，振荡频率：IV。用真空泵吸去杂交液。

4.3洗涤：

分别用2×SSC，和0.1×SSC，洗涤液各300μl，将杂交芯片洗涤2次，洗涤时振荡，吸去余液。

4.4封闭：

向杂交芯片中加入400μl封闭液，置杂交仪上，于40℃封闭30min，振荡频率：IV，吸去封闭液。

4.5酶联：

取350μl酶联缓冲液，按1∶1200的比例加入SAv-AP，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于40oC酶联反应30min，振荡频率：IV。吸去反应液，用酶联缓冲液300μl将杂交芯片洗涤3次，吸去洗涤液。

4.6显色：

加入显色液显色(400μl底物液+2μl BCIP+2μlNBT)，置杂交仪上，避光、30oC显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

4.7终止显色：

用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

5、结果观察见附图

附图4：阴性对照附图5：阳性对照附图6：临床样本

SEQUENCE LISTING

<110>北京爱普益生物科技有限公司

<120>检测六种腹泻致病菌的基因芯片、制备方法及试剂盒

<130>SGF

<160>57

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>346

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>1

cgaggcattg cttttaacag actctcccag tgctttcaga atcaagaagc agtattaaat      60

ttatcagacc taaatttgac gtctcttccc gaattaccaa agcatatttc tgctttgatt     120

gtagaaaata ataaattaac atcattgcca aagctgcctg catttcttaa agaacttaat     180

gctgataata acaggctttc tgtgatacca gaacttcctg agtcattaac aactttaagt     240

gttcgttcta atcaactgga aaaccttcct gttttgccaa accatttaac atcattattt     300

gttgaaaata acaggctata taacttaccg gctcttcccg aaaaat                    346

<210>2

<211>369

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>2

ttcgctgttg ctgctgatgc cactgagagc tgtgaggacc gtgtcgcgct cacatggaac      60

aatctccgga aaaccctcct ggtccatcag gcatcagaag gccttttcga taatgatacc     120

ggcgctctgc tctccctggg cagggaaatg ttccgcctcg aaattctgga ggacattgcc     180

cgggataaag tcagaactct ccattttgtg gatgagatag aagtctacct ggccttccag     240

accatgctcg cagagaaact tcagctctcc actgccgtga aggaaatgcg tttctatggc     300

gtgtcgggag tgacagcaaa tgacctccgc actgccgaag ctatggtcag aagccgtgaa     360

gagaatgaa                                                             369

<210>3

<211>326

<212>DNA

<213>出血性大肠杆菌

<400>3

acgatttctt tccgacacca gagttagaaa aggaattaaa agcaataata aatagaatac      60

agggaataaa gcatcaagac ttattttatg gagaacggtt acataaacaa gtatttggag     120

acatgggagc aaatttttta tcagttacta cgtatggagc agaactgtta gttttttttg     180

gttttctctg tgtattcatt atccctttag ggatatatat acctttttat cttttaaaga     240

gaatgaaaaa aacccatagc tcgataaact gcgcattcta ttcatatatc attatgattt     300

tattgcaata cttagtggct gggaat                                          326

<210>4

<211>333

<212>DNA

<213>出血性大肠杆菌

<400>4

cttattcaag aggtgtttcc tgaagggtta agatctctat ctttgattac ttcgggttat     60

gtaaaatatg atatgggggg agtatcttca aaaaaaagaa ttttaagaga taaagagctt    120

gccaaaatta tgtttgaaaa aaataaaaaa aaccttatta agtttattcc aatttcaata    180

atcaaaattt tattccctga acgtttaaga agagtattgc ggaaaatgca atatatttgt    240

ctaactttat tcttcatgaa gaatagttca ccatatgata atgaataaaa tcaaaaaaat    300

acttaaattt tgcactttaa aaaaatatga tac                                 333

<210>5

<211>303

<212>DNA

<213>侵袭性大肠杆菌

<400>5

ggagattgat ggtagaattg aaattctgga tggcactcgt agaagagcat ctgcaatata     60

tgcaggagca gatcttgaag ttctatattc aaaagaatat atatctactc ttgatgccag    120

aaaactagca aacgatatac aaacagcaaa agagcatagc atccgagaac ttggtattgg    180

tcttaatttt ctgaaagtat cagggatgtc ctataaagac atagccaaaa aagagaatct    240

gtctcgcgcg aaagtcactc gtgcctttca ggcagcaagc gttccacagg aaataatatc    300

tct                                                                  303

<210>6

<211>300

<212>DNA

<213>侵袭性大肠杆菌

<400>6

ccaagattta accttcgtca accaaaaaac gaatgtacgc gatcaagaat ccctaacaga     60

agaatcatta gccgatatca taaaaactat aaagctacaa caattcttcc ctgtaatagg    120

aagggagatt gatggtagaa ttgaaattct ggatggcact cgtagaagag catctgcaat    180

atatgcagga gcagatcttg aagttctata ttcaaaagaa tatatatcta ctcttgatgc    240

cagaaaacta gcaaacgata tacaaacagc aaaagagcat agcatccgag aacttggtat    300

<210>7

<211>259

<212>DNA

<213>副溶血性弧菌

<400>7

tgtactgagg gatcccctca gaaatctgcc agtgcatagc caccttttaa tagttgcgta     60

gctagaacca ccgccgcagc taagagctgt tgagttgtta tctcgtagtc tggtcgtctg    120

aggacttcca ttcctaatcg aatggtagac aggacatttc tatttctgac tgtattcgct    180

tgaaagtgcc tttcccatcc ttggctttgc gcatgtatcc ctgccagcca aaacataagt    240

tgcagcatta gggctatca                                                 259

<210>8

<211>269

<212>DNA

<213>副溶血性弧菌

<400>8

cgtagtctgg tcgtctgagg acttccattc ctaatcgaat ggtagacagg acatttctat     60

ttctgactgt attcgcttga aagtgccttt cccatccttg gctttgcgca tgtatccctg    120

ccagccaaaa cataagttgc agcattaggg ctatcagcaa aataatatcg aaccttttgg    180

aaaactagtg cgactttgac gtaggcctaa tccgtaagcg ggactcttta agtctcggaa    240

ggtttcttct atctccatca gcctttgcg                                      269

<210>9

<211>230

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>9

ggcatacagt cctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc     60

ccaaatatat ggatggtatc gagttcattt tggggtgctt gatgaacaat tacatcgtaa    120

taggggctac agagatagat attacagtaa cttagatatt gctccagcag cagatggtta    180

tggattggca ggtttccctc cggagcatag agcttggagg gaagagccgt               230

<210>10

<211>218

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>10

cgggcagatt ctagacctcc tgatgaaata aagcagtcag gtggtcttat gccaagagga     60

cagaatgagt actttgaccg aggtactcaa atgaatatca acctttatga tcatgcaaga    120

ggaactcaga cgggatttgt taggcacgat gatggatatg tttccacctc aattagtttg    180

agaagtgccc acttagtggg tcaaactata ttgtctgg                            218

<210>11

<211>231

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>11

acccaacatg tttaacgtta atgatgtatt aggggcatac agtcctcatc cagatgaaca     60

agaagtttct gctttaggtg ggattccata ctcccaaata tatggatggt atcgagttca    120

ttttggggtg cttgatgaac aattacatcg taataggggc tacagagata gatattacag    180

taacttagat attgctccag cagcagatgg ttatggattg gcaggtttcc c             231

<210>12

<211>121

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>12

acatggacgg ctccctcgta cgctcagaaa agaaagtcaa tattccgcca actggaccag     60

gtatggggcg acgcggaagt taacgaagaa tctcttaccc gctgtattta tgccttacga    120

c                                                                    121

<210>13

<211>182

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>13

cggtcgtagt ggtgtctccg ccagcgccgc aacctacgac tcatacattg gcgatacttc     60

cttttcagat gcaggatcag gttcaatccg agagtctgca ttactctatc gtgaagggat    120

tatcgcagta tgcgcccttt ggcctgagcg tgctgccggt gaccattacg aagaactgcc    180

gc                                                                   182

<210>14

<211>186

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>14

gtgtaattat cagaccatta accatgaaga tataataagc agcatttaca ccccaaaaaa     60

atgcagtaag atagctacaa aactaatctc tattgcaatg aggccaagtt aaatatgtaa    120

atatttagat gcccggcgct gactctctct gcaccaggat atacggcagc gtccattcga    180

taatca                                                               186

<210>15

<211>59

<212>DNA

<213>致贺氏菌

<400>15

ttgacgtctc ttcccgaatt accaaagcat atttctgctt tgattgtaga aaataataa      59

<210>16

<211>47

<212>DNA

<213>致贺氏菌

<400>16

gtgaaggaaa tgcgtttcta tggcgtgtcg ggagtgacag caaatga                   47

<210>17

<211>59

<212>DNA

<213>出血性大肠杆菌

<400>17

tcaagactta ttttatggag aacggttaca taaacaagta tttggagaca tgggagcaa      59

<210>18

<211>54

<212>DNA

<213>出血性大肠杆菌

<400>18

ttccctgaac gtttaagaag agtattgcgg aaaatgcaat atatttgtct aact           54

<210>19

<211>58

<212>DNA

<213>侵袭性大肠杆菌

<400>19

aacttggtat tggtcttaat tttctgaaag tatcagggat gtcctataaa gacatagc       58

<210>20

<211>59

<212>DNA

<213>侵袭性大肠杆菌

<400>20

tgtaatagga agggagattg atggtagaat tgaaattctg gatggcactc gtagaagag      59

<210>21

<211>57

<212>DNA

<213>副溶血性弧菌

<400>21

ctaatcgaat ggtagacagg acatttctat ttctgactgt attcgcttga aagtgcc        57

<210>22

<211>59

<212>DNA

<213>副溶血性弧菌

<400>22

gaatggtaga caggacattt ctatttctga ctgtattcgc ttgaaagtgc ctttcccat      59

<210>23

<211>51

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>23

tttggggtgc ttgatgaaca attacatcgt aataggggct acagagatag a              51

<210>24

<211>52

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>24

atgagtactt tgaccgaggt actcaaatga atatcaacct ttatgatcat gc             52

<210>25

<211>53

<212>DNA

<213>霍乱弧菌

<400>25

gggctacaga gatagatatt acagtaactt agatattgct ccagcagcag atg            53

<210>26

<211>47

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>26

acgctcagaa aagaaagtca atattccgcc aactggacca ggtatgg                   47

<210>27

<211>60

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>27

ggatcaggtt caatccgaga gtctgcatta ctctatcgtg aagggattat cgcagtatgc     60

<210>28

<211>54

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>28

agttaaatat gtaaatattt agatgcccgg cgctgactct ctctgcacca ggat           54

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

cgaggcattg cttttaac                                                           18

<210>30

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

atttttcggg aagagc                                                             16

<210>31

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

ttcgctgttg ctgctgatg                                                          19

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

ttcattctct tcacggcttc t                                                       21

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

acgatttctt tccgacacca g                                                       21

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

attcccagcc actaagtatt gc                                                      22

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

cttattcaag aggtgtttcc tga                                                    23

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

gtatcatatt tttttaaagt gc                                                     22

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

ggagattgat ggtagaattg                                                        20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

agagatatta tttcctgtgg                                                        20

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

ccaagattta accttcgtca acc                                                    23

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

ataccaagtt ctcggatgct atg                                                    23

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

tgtactgagg gatcccctca g                                                         21

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

tgatagccct aatgctgcaa c                                                         21

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

cgtagtctgg tcgtctgagg g                                                         21

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

cgcaaaggct gatggagata g                                                         21

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

ggcatacagt cctcatccag g                                                         21

<210>46

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

acggctcttc cctccaag                                                             18

<210>47

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

cgggcagatt ctagacctc                                                            19

<210>48

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

ccagacaata tagtttgac                                                            19

<210>49

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

acccaacatg tttaacg                                                              17

<210>50

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

gggaaacctg ccaatcc                                                              17

<210>51

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

acatggacgg ctccctcg                                                             18

<210>52

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

gtcgtaaggc ataaatac                                                             18

<210>53

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

cggtcgtagt ggtgtctcc                                                            19

<210>54

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

gcggcagttc ttcgtaatg                                                  19

<210>55

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

gtgtaattat cagaccatta ac                                              22

<210>56

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

tgattatcga atggacgctg c                                               21

<210>57

<211>185

<212>DNA

<213>阳性内参

<400>57

acagtcaata cccgctacgc gcgtctgagt tcaacttggt tgagccgtta aactgcattc     60

agattcgcca gcttcggatt gctacagtgg gtcgatatct gagaacatca cgacgtcgat    120

atgggtcttt ctaccctcga ggtggcgcga tgaaggtttt tcatctactc agaccgctga    180

tccct                                                                185

Claims (4)

1.检测六种腹泻致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，其特征在于：芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA或cDNA片段；所述的从志贺氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的碱基序列；从出血性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的碱基序列；从侵袭性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从副溶血性弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从霍乱弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：9、SEQID NO：10或SEQ ID NO：11所示的碱基序列；从沙门氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的碱基序列。

2.如权利要求1所述的检测六种腹泻致病菌的基因芯片，其特征在于：所述的从志贺氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的碱基序列；从出血性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：17或SEQID NO：18所示的碱基序列；从侵袭性大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的碱基序列；从副溶血性弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示的碱基序列；从霍乱弧菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的碱基序列；从沙门氏菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段是SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27或SEQ ID NO：28所示的碱基序列。

3.制备权利要求1所述的检测六种腹泻致病菌的基因芯片的方法，其特征是包括以下的步骤：

(1)探针的设计：根据所述的志贺氏菌、出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列作为探针，它们分别是如权利要求1或2所述的碱基序列；

(2)探针的合成：经过保护、活化、连接、封闭和氧化五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基、纯化、定量合成后处理即可得到符合要求的寡核苷酸片段；

(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的目的探针点膜，再经交联、存膜即得芯片，其中点膜后的样品点直径在50μm-2000μm。

4.用于检测六种腹泻致病菌的试剂盒，其特征是包括：权利要求1或2所述的基因芯片、样品处理试利、杂交试剂、显色试剂和说明书。

Images