CN103764850B

CN103764850B - 毒素产生性艰难梭菌的检测方法

Info

Publication number: CN103764850B
Application number: CN201280042806.6A
Authority: CN
Inventors: 久保田博之; 牧野博; 酒井隆史; 石川英司; 大石宪司
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: JP5961171B2; US9388474B2; EP2752496B1; US20140212879A1; KR20140054023A; EP2752496A1; JPWO2013031973A1; CN103764850A; KR101990163B1; EP2752496A4; WO2013031973A1

Abstract

本发明提供一种能够特异性地且以高灵敏度检测毒素产生性艰难梭菌（C.difficile）的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的毒素产生性艰难梭菌的检测方法。1）包括由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。2）包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。

Description

毒素产生性艰难梭菌的检测方法

技术领域

本发明涉及用于检测毒素产生性艰难梭菌（Clostridiumdifficile）的寡核苷酸和使用该寡核苷酸的毒素产生性艰难梭菌的检测方法。

背景技术

艰难梭菌（C.difficile）是产生对于人为病原性的菌体外毒素的芽胞形成革兰氏阳性杆菌。由该菌引起的C.difficile相关性腹泻症（CDAD）近年来成为很大的问题（非专利文献1）。即，抗生素或抗癌剂等的过度使用使正常的肠内细菌菌群受到损害，结果使增殖的C.difficile产生毒素TcdA和TcdB，发生腹泻等症状。已知C.difficile出现在感染的人的粪便中，经由器物或手等到达人的口或粘膜而感染。

C.difficile的病原性主要是由属于LargeClostridialToxin（LCTs）家族的2种毒素TcdA和TcdB造成的，C.difficile的各菌株根据它们的毒素产生性的不同，大致分为TcdA产生TcdB产生型（A+B+）、TcdA非产生TcdB产生型（A-B+）以及毒素非产生型（A-B-）。另外，C.difficile的毒素产生体系据认为由tcdA和tcdB、以及编码它们的调节因子的tcdC,tcdR,tcdE构成的病原性座位形成，有报告当对毒素的产生进行负调控的tcdC缺陷时，毒素TcdA和TcdB产生亢进。

因此，仅选择性地检测毒素产生性C.difficile（A+B+和A-B+），在CDAD等的C.difficile感染症（Clostridiumdifficileinfection：CDI）在临床诊断上很重要。

以往，对于毒素产生性C.difficile的检测，报告了几条以毒素基因tcdA和tcdB为靶标的引物，能够使用这些引物从粪便提取DNA中检测该基因（非专利文献2－4、专利文献1）。

然而，由于C.difficile在健康人肠道的菌数水平低，所以为了使用PCR检测粪便中的毒素产生株，需要构建具有更高的特异性和检测灵敏度这两者的检测体系，在该点上，可以说还不充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003－164282号公报

非专利文献

非专利文献1：Rupnik,M.,M.H.Wilcox,andD.N.Gerding.,NatRevMicrobiol.20097:526-36

非专利文献2：Belanger,S.D.,M.Boissinot,N.Clairoux,F.J.Picard,andM.G.Bergeron.,JClinMicrobiol.200341:730-4

非专利文献3：Houser,B.A.,A.L.Hattel,andB.M.Jayarao.,FoodbornePathogDis.20107:719-26.

非专利文献4：Sloan,L.M.,B.J.Duresko,D.R.Gustafson,andJ.E.Rosenblatt.,JClinMicrobiol.200846:1996-2001

发明内容

发明所要解决的课题

本发明涉及提供能够特异性地且以高灵敏度检测毒素产生性C.difficile的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的毒素产生性C.difficile的检测方法。

用于解决课题的方法

本发明的发明人等鉴于上述课题，发现通过将20个菌株的tcdA基因序列、22个菌株的tcdB基因序列、以及作为索氏梭菌（Clostridiumsordelii）的毒素基因tcsL、作为诺氏梭菌（Clostridiumnovyi）的毒素基因tcnA和作为产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的毒素基因tcpL的碱基序列一起比对，设计得到特定的寡核苷酸，使用该寡核苷酸扩增tcdA基因和tcdB基因并测定，由此，能够特异性地且以优异的灵敏度检测毒素产生性的C.difficile。

本发明涉及以下的1）～10）。

1）包括由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。

2）由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。

3）上述2）的寡核苷酸探针，其中，在寡核苷酸的5'末端结合有荧光物质，在3'末端结合有猝灭物质。

4）具备上述1）的引物对和上述3）的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。

5）包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。

6）由序列号6所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。

7）上述6）寡核苷酸探针，其中，在寡核苷酸的5'末端结合有荧光物质，在3'末端结合有猝灭物质。

8）具备上述5）的引物对和上述7）的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。

9）一种毒素产生性C.difficile的检测方法，其包括：以从人粪便提取的DNA为模板，使用上述4）或8）的寡核苷酸组分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。

10）一种人粪便中的C.difficile中毒素产生性C.difficile和／或非毒素产生性C.difficile的存在比率的计算方法，其包括：以从人粪便提取的DNA为模板，使用上述4）和／或8）的寡核苷酸组、以及以下表示的（a）的引物对或具备（a）的引物对和（b）的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组，分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。

（a）包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。

（b）由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针，其中，在该寡核苷酸的5'末端结合有荧光物质，在3'末端结合有猝灭物质。

发明的效果

根据本发明的寡核苷酸和毒素产生性C.difficile的检测方法，能够特异性地且以高灵敏度检测粪便中的毒素产生性C.difficile。因此，根据本发明，能够简易且准确地进行毒素产生性C.difficile感染症的诊断，而且能够容易地调查健康成人的粪便中的毒素产生性C.difficile株的检出频率。另外，通过同时测定C.difficile的总菌数，就能够对于粪便中的C.difficile算出毒素产生性C.difficile或非毒素产生性C.difficile的存在比率。

附图说明

图1在TaqManPCR法中对于靶标菌的反应性（A：tcdA-F/R/P、B：tcdB-F/R/P）

图2在TaqManPCR法中对粪便中的靶标菌的检测灵敏度（A：tcdA-F/R/P、B：tcdB-F/R/P）

具体实施方式

本发明的引物对包括：（1）用于扩增tcdA基因的引物对和（2）用于扩增tcdB基因的引物对。

（1）用于扩增tcdA基因的引物对包括作为由序列号1所示的碱基序列（5'-CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT-3'（tcdA-F））构成的寡核苷酸的第一引物、和作为由序列号2所示的碱基序列（5'-AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGC-3'（tcdA-R））构成的寡核苷酸的第二引物。第一引物能够在PCR（聚合酶链式反应）等核酸扩增反应中作为正向引物使用，第二引物能够在核酸扩增反应中作为与第一引物组合的反向引物使用。

C.difficile的各菌株被大致分为TcdA产生TcdB产生型（A+B+）、TcdA非产生TcdB产生型（A-B+）和毒素非产生型（A-B-），但已知tcdA毒素基因的有无和TcdA毒素产生的有无不一定一致。在使用现有公知的用于扩增tcdA基因的引物时，大多情况下不仅检测到A+B+型株，而且也检测到A-B+型株，在该方法中，无法仅检测到TcdA毒素产生菌（参照实施例2（3））。对此，在使用本发明的包括第一和第二引物的引物对的情况下，如表3所示，仅A+B+型株中的tcdA被扩增，A-B+型株中的tcdA没有扩增。即，在使用本发明的用于扩增tcdA基因的引物对时，能够可靠地仅检测到TcdA毒素产生性C.difficile、即A+B+型株（参照实施例2（2）和（3））。

（2）用于扩增tcdB基因的引物对包括作为由序列号4所示的碱基序列（5'-TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3'（tcdB-F））构成的引物的第三引物、和作为由序列号5所示的碱基序列（5'-CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3'（tcdB-R））构成的引物的第四引物。第三引物能够在核酸扩增反应中作为正向引物使用，第四引物能够在核酸扩增反应中作为与第三引物组合的反向引物使用。

通过使用该引物对，能够可靠地扩增tcdB基因，能够可靠地检测TcdB毒素产生性C.difficile、即A+B+型株和A-B+型株（表3）。

本发明的寡核苷酸探针包括：（1）与tcdA基因特异性地杂交的探针、和（2）与tcdB基因特异性地杂交的探针。

（1）与tcdA基因特异性地杂交的探针为由序列号3所示的碱基序列（5'－TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG－3'（tcdA-P））构成的寡核苷酸（第一探针），与由包括上述第一和第二引物的引物对的扩增范围特异性地结合。另外，（2）与tcdB基因特异性地杂交的探针为由序列号6所示的碱基序列（5'－TTTKCCAGTAAAATCAATTGCTTC－3'（tcdB-P））构成的寡核苷酸（第二探针），与由包括上述第三和第四引物的引物对的扩增范围特异性地结合。

这样的寡核苷酸探针通过将5'末端侧用FAM（羧基荧光素，carboxyfluorescein）、TET（四氯羧基荧光素，tetrachlorocarboxyfluorescein）等荧光物质修饰，将3'末端用TAMRA（羧基四甲基罗丹明，carboxytetramethylrhodamine）、BHQ-1（黑洞猝灭剂-1，blackholequencher-1）等猝灭物质修饰，例如能够作为用于进行实时PCR的修饰寡核苷酸（所谓的Taqman探针）使用。

即，经修饰的第一探针与由上述第一引物和第二引物构成的引物对一起，能够作为用于利用实时PCR通过扩增、测定tcdA基因的寡核苷酸组使用，经修饰的第二探针与由上述第三引物和第四引物构成的引物对一起，能够作为用于利用实时PCR扩增、测定tcdB基因的寡核苷酸组使用。

本发明的寡核苷酸，除了由上述序列号1～6所示的碱基序列构成的寡核苷酸以外，还包括由与该各碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸。即，包括：由与序列号1和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号3所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针、由与序列号4和序列号5所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号6所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。

另外，由在序列号1～6所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列中缺失、取代、添加或插入1或2个碱基的碱基序列构成的、且分别与由序列号1～6所示的碱基序列或其互补序列构成的寡核苷酸具有作为引物或探针相同的功能的寡核苷酸，也同样作为本发明的寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸能够通过公知的化学合成法容易地制造。

本发明的上述各引物对优选与上述各寡核苷酸探针一起使用，以从人粪便提取的DNA作为模板进行核酸扩增反应，测定该扩增产物，由此能够分别检测TcdA毒素产生性C.difficile和TcdB毒素产生性C.difficile。

其中，该检测中包括C.difficile的有无的判定和C.difficile的定量。此外，定量包括菌数的定量。

通过使用本发明的上述各引物对、优选与上述各寡核苷酸探针一起使用，能够测定粪便中的TcdA毒素产生性C.difficile和TcdB毒素产生性C.difficile的菌数，通过将它们与C.difficile特异性的引物或探针组合，一同测定C.difficile的总菌数，能够算出粪便中（肠内）的C.difficile的详细情况、即毒素产生性C.difficile（A+B+型的菌数、A-B+型的菌数、或A+B+型和A-B+型的菌数的总和）、或非毒素产生性C.difficile（A-B-型的菌数）相对于C.difficile的总菌数（A+B+型、A-B+型和A-B-型的菌数的总和）的存在比率。

作为该对于C.difficile特异性的引物、探针，可以列举以下所示的（a）的引物对或具有（a）的引物对和（b）的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。

这里，（a）的引物对包括：作为由序列号7所示的碱基序列（5'－GCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGT－3'（CD16SrRNA-F））构成的寡核苷酸的第五引物、和作为由序列号8所示的碱基序列（5'－GTACTGGCTCACCTTTGATATTYAAGAG－3'（CD16SrRNA-R））构成的寡核苷酸的第六引物。第五引物能够在核酸扩增反应中作为正向引物使用，第六引物能够在核酸扩增反应中作为与第五引物组合的反向引物使用。

（b）的寡核苷酸探针为由序列号9所示的碱基序列（5'－TGCCTCTCAAATATATTATCCCGTATTAG－3'（CD16SrRNA-P））构成的寡核苷酸（第三探针），与由上述第五和第六引物构成的引物对的扩增范围特异性地结合。该寡核苷酸探针通过用FAM、TET等荧光物质修饰5'末端侧、用TAMRA、BHQ-1等猝灭物质修饰3'末端，能够作为例如用于进行实时PCR的修饰寡核苷酸（所谓Taqman探针）使用。

此外，由在序列号7～9所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列中缺失、取代、添加或插入1或2个碱基的碱基序列构成的、且分别与由序列号7～9所示的碱基序列或其互补序列构成的寡核苷酸具有作为引物或探针相同的功能的寡核苷酸，同样作为上述（a）和（b）寡核苷酸。

作为调查微生物的存在或存在量等的被检体，可以列举例如：结膜拭子液、牙石、牙垢、喀痰、咽拭子液、唾液、鼻涕、肺胞清洗液、胸水、胃液、胃清洗液、尿、宫颈管粘液、阴道分泌物、皮肤病灶、粪便、血液、腹水、组织、脊髓液、关节液、患处拭子液等来自机体的试样、食品、医药品、化妆品、食品-医药品-化妆品的中间处理物、微生物培养液、植物、土壤、活性污泥、废水这样的存在含有微生物可能性的对象。作为来自被检体的试样，只要是能够反映被检体的微生物的存在或存在量的试样就没有特别限定，可以列举例如：包含被检体所含的核苷酸的混合物或包含DNA的混合物，但从用于PCR法的观点考虑，优选包含被检体所含的DNA的混合物。

从人粪便中提取DNA能够利用与以往的制备基因组DNA时同样的手法进行，例如，能够从被检体的全部或一部分中，根据需要利用提取、分离、纯化方法进行前处理，之后利用适当公知的方法获得。根据需要，也可以利用过滤、离心分离、色谱等公知的方法进行前处理，然后使用例如“在玻璃珠等的存在下进行搅拌的物理破碎法”、“CTAB法”、“苯酚氯仿法（PC法）”、“磁珠法”、“硅胶柱法”等通用方法或者组合这些方法的手法进行提取而获得，另外也可以使用市售的试剂盒进行。

为了得到PCR高检测灵敏度，希望获得高浓度的DNA，而另一方面，来自粪便的核酸提取液中混杂有妨碍PCR的物质，因此，希望获得尽可能地去除了这些妨碍物质的高纯度的DNA。为了该目的，特别优选使用能够提取高浓度且高纯度的DNA的FastDNASPINKitforFeces（MPBiomedicals）。

作为核酸扩增法，没有特别限定，可以举出利用PCR法的原理的公知的方法。可以列举例如：PCR法、LAMP（环介导等温扩增，Loop-mediatedisothermalAMPlification）法、ICAN（等温嵌合引物起始的核酸扩增，IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids）法、RCA（滚环扩增，RollingCircleAmplification）法、LCR（连接酶链式反应，LigaseChainReaction）法、SDA（链置换扩增，StrandDisplacementAmplification）法等。

另外，在核酸扩增反应后的扩增产物的检测中，可以使用能够特异性地识别扩增产物的公知的手段。例如，能够使放射性同位素、荧光物质、发光物质等标记物与在扩增反应的过程中摄取的dNTP作用，检测该标记物。作为观察摄取了被标记的dNTP的扩增产物的方法，只要是用于检测上述标记物的本技术领域中公知的方法则可以为任意方法。例如，在作为标记物使用放射性同位素的情况下，能够利用例如液体闪烁计数器、γ－计数器等测定放射活性。另外，在作为标记物使用荧光的情况下，能够使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测该荧光。

在本发明中，作为核酸扩增法，从迅速性和定量性的方面出发，优选使用实时监测解析PCR扩增量的实时PCR。另外，作为实时PCR，可以列举在本技术领域通常使用的方法，例如TaqMan探针法、嵌入剂法和环状探针法等，而在本发明中，特别优选使用TaqMan探针法。

TaqMan探针法为在PCR反应体系中加入5'末端用荧光物质（FAM等）修饰、3'末端用猝灭物质（TAMRA等）修饰后的寡核苷酸（TaqMan探针）的方法。

在本发明中，如上所述，被修饰的第一探针和第二探针能够作为TaqMan探针使用，它在PCR反应的退火步骤中与模板DNA特异性地杂交，但由于探针上存在猝灭物质，所以即使照射激发光也会抑制荧光的发生。在延伸反应步骤时，通过TaqDNA聚合酶具有的5'→3'核酸外切酶活性，与模板杂交的TaqMan探针被分解，则荧光物质从探针游离，猝灭物质的抑制被解除而发出荧光。

PCR的条件没有特别限定，只要将每个PCR装置设定为最佳条件即可，可以列举例如以下的条件。

1）双链DNA变为单链DNA的热变性：通常以93～95℃左右、通常加热10秒钟～1分钟左右。

2）退火：通常以50～60℃左右、通常加热10秒钟～1分钟左右。

3）DNA延伸反应：通常以70～74℃左右、通常加热30秒钟～5分钟左右。

其中，退火和DNA延伸反应可以不分开而同时进行。

通常通过进行上述1）～3）的反应30～50个循环左右，能够将目的tcdA基因和tcdB基因扩增到能够检测的程度。

另外，从灵敏度的观点出发，上述Taqman探针在反应液中的浓度优选为100～1000nM左右。

另外，在利用在PCR反应体系中加入通过与双链DNA结合而发出荧光的试剂（荧光嵌入剂）的嵌入剂法的情况，作为荧光嵌入剂，例如在SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold、噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭、PICOGREEN等公知的试剂的存在下进行PCR，测定伴随靶标序列的扩增而增加的荧光强度即可。

实时PCR能够使用将热循环仪和分光荧光光度计一体化的实时PCR专用装置例如ABIPRISM7900HTsequencedetectionsystem（AppliedBiosystems）进行。

DNA量的测定能够通过以下方法进行。首先，将浓度已知的标准DNA溶液阶段性稀释得到的溶液进行PCR，以该初始的DNA量为横轴，将以其为模板的PCR的扩增产物量达到一定量时的循环数（thresholdcycle；Ct值）绘制在纵轴上，制作标准曲线。对于未知浓度的试样也在同样的条件下进行反应，求出Ct值，根据该值和标准曲线求出试样中目的DNA量。

另外，菌数的定量能够通过算出与供于标准曲线制作用的DNA量相当的菌数值，以与DNA量的测定同样的程序进行。首先，测定标准DNA溶液的制备中使用的菌株的纯培养菌液中的菌数，从这些已知菌数实施DNA的提取，能够得到与提取后的DNA溶液（标准DNA溶液）所含的DNA量相当的菌数值。因此，由于能够算出与供于PCR的初始的DNA量相当的菌数值，所以通过制作将横轴换算成菌数值的标准曲线，能够同样地算出未知浓度的试样中所含的目的微生物的菌数值。

这样，“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的（与DNA量相当的）菌数”，使用已知的标准DNA溶液和未知浓度的DNA试样进行PCR，达到一定PCR扩增产物量时进行“PCR循环数”（Ct值）的对比，就能够求出浓度未知试样中的“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的菌数”。其中，在这样的对比中，从简便性的方面出发，优选使用表示作为PCR的模板的“目的微生物的菌数”与“Ct值”的相关关系的标准曲线。这样的标准曲线通常以目的微生物的菌数作为横轴、以Ct值作为纵轴而绘制制作的。制作标准曲线时使用的微生物可以使用模式株等公知菌株。

另外，被检体中的目的微生物DNA量例如能够通过可与目的微生物DNA特异性地杂交的核酸片段与被检体试样的杂交效率的信息求出。

这样，根据本发明的方法，能够特异性地检测TcdA毒素产生性C.difficile和TcdB毒素产生性C.difficile（实施例2），另外如果每1g粪便存在10³个以上的C.difficile则能够检测其DNA（实施例3），能够实现高灵敏度的检测。

此外，通过组合使用对C.difficile特异性的引物组、寡核苷酸探针，测定C.difficile的总菌数，能够准确地掌握粪便中（肠内）的C.difficile的详细情况（毒素产生性和非毒素产生性C.difficile相对于总菌数的存在比率），能够对于C.difficile感染症的诊断、临床研究等作出贡献。实施例

实施例1毒素产生性C.difficile的检测

[I]材料和方法

（A）使用菌株和培养条件

C.difficileDSM1296T从DeutscheSammlungvonMikroorganizmenundZellkulturenGmbH（DSMZ,Germany）购买，ATCC43255、43596、43598、700057从AmericanTypeCultureCollection（USA）购买，NTCT13307、13366从HealthProtectionAgency（UK）购买，CCUG20309、37780、37785从CultureCollectionUniversityofGoteborg（Sweden）购买。C.difficile以外的Clostridium属菌种全部从DSMZ购买。

所有的菌株使用1%葡萄糖添加改良GAM培养基（日水制药），在厌氧条件下以37℃培养24小时。菌液中的菌数测定通过DAPI染色法进行。

（B）TaqManPCR反应

使用ABI7900HT系统进行TaqManPCR。PCR使用TakaraExTaqHotStartVersion（Takara）和Ampdirectplus（shimadzu）。反应液组成为2×Ampdirectplus、引物F/R0.2μM、TaqMan探针0.2μM、RoxReferenceDye、ExTaqDNApolymerase0.4Units和模板DNA溶液5μL，总量设为20μL。以95℃30秒将Taq酶活化后，进行95℃5秒、56℃50秒的循环50次。

（C）DNA提取用粪便样品的制备

将使用RNAlater制备的10%粪便悬浊液（w/v）2mL（含有200mg粪便）进行离心分离，除去上清1mL。添加磷酸缓冲生理食盐水（PBS（-））1mL，用旋涡搅拌器（vortex）搅拌后，将离心分离得到的全部上清用倾析除去。添加PBS（-）1mL，用旋涡搅拌器搅拌后，除去离心分离得到的全部上清。将所得到的粪便颗粒在用于DNA提取之前保存于-80℃。

（D）DNA的提取

从培养菌液提取DNA按照松木等的方法（Matsuki,T.,K.Watanabe,J.Fujimoto,Y.Kado,T.Takada,K.Matsumoto,andR.Tanaka.2004.QuantitativePCRwith16SrRNA-gene-targetedspecies-specificprimersforanalysisofhumanintestinalbifidobacteria.Appl.Environ.Microbiol.70:167-173）进行。

从粪便颗粒提取DNA使用FastDNASPINKitforFeces（MPBiomedicals）。提取法的详细内容如下所示。

在装有200mg粪便颗粒的2.0mL试管（tube）中，添加LysingMatrixE、Sodiumphosphatebuffer（磷酸钠缓冲液）825μL和Pre-lysissolution275μL，用旋涡搅拌器搅拌10-15s。除去以14,000×g离心分离5min得到的上清，添加磷酸钠缓冲液978μL和MTbuffer122μL进行搅拌。用FastPreplevel6.0剧烈振荡45s，以14,000×g离心分离15min。将上清回收至新的2.0mL试管，添加Proteinprecipitatesolution（蛋白沉淀溶液）250μL，剧烈振荡并混合。在4℃静置10min后，以14,000×g离心分离2min，将上清回收至15mL试管中。添加Bindingmatrixsolution1mL轻柔混合后，在室温孵育5min。除去以14,000×g离心分离2min得到的上清后，添加1mLWashbuffer-1，通过吹打轻柔地使颗粒重悬。将悬浮液约600μL移至SPINfiltertube，除去以14,000×g离心分离1min后的滤过液（Flow-through）。将剩余的悬浮液再次移至SPINfiltertube，除去以14,000×g离心分离1min后的滤过液。添加0.5mLWashbuffer-2，通过吹打轻柔地使过滤器上的基质重悬后，除去以14,000×g离心分离2min后的滤过液。再次以14,000×g离心分离2min，将过滤器移至新的1.9mLcatchtube。添加TES100μL，轻轻敲打使基质悬浮，回收以14,000×g离心分离2min得到的滤过液。

[II]引物和探针的设计

以C.difficile的毒素基因tcdA和tcdB为靶标，分别按照以下的程序设计特异性的引物和探针。使用从数据库取得的20个菌株的tcdA基因序列（＊1）和22个菌株的tcdB基因序列（＊2），利用ClustalX进行同源性检索（比对）。TcdA和TcdB被分类为LargeClostridialToxin（LCTs），与一部分梭状芽胞杆菌（Clostridium）属细菌产生的LCTs具有很高的同源性。因此，作为对照，将索氏梭菌的tcsL[X82638]、诺氏梭菌的tcnA[Z48636]、产气荚膜梭菌的tcpL[AB262081]的基因序列一并用于比对。比对的结果，靶标毒素基因与其他基因的同源性高，而且tcdA和tcdB在两者的碱基序列间具有约60％的同源性，由此用引物制作用软件没能发现对于tcdA和tcdB各自的靶标毒素基因的特异性的碱基序列。因此，通过目测确认比对结果，通过试错，选择对于靶标基因特异性的且被认为在菌株间保守性高的区域，设计了引物和探针（表1）。

＊1tcdA基因的GenBankaccessionno.：M30307,NC_009089,NC_013316,NC_013315,AJ011301,NZ_ADVM01000023,NZ_ABHF02000018,NZ_ABHE02000016,NZ_ABFD02000006,NZ_ABHD02000008,NZ_ABHG02000011,NZ_ABKK02000013,NZ_AAML04000007,NZ_ABKL02000008,FN668941,FN668375,FN665652,FN665653,FN665654,Y12616,AJ132669

＊2tcdB基因的GenBankaccessionno.：M30307,Z23277,AJ011301,NC_009089,NC_013316,NC_013315,AF217292,NZ_ABHF02000018,NZ_ADVM01000023,NZ_ADNX01000011,NZ_ABHE02000016,NZ_ABHD02000008,NZ_ABFD02000006,NZ_ABKL02000008,NZ_ABKK02000013,NZ_ABHG02000011,NZ_AAML04000007,FN668941,FN668375,FN665652,FN665653,FN665654

[表1]

[III]引物和探针的特异性

（1）C.difficile菌株的毒素产生性的确认

使用利用免疫色谱法的毒素检测试剂盒Keul-o-testClostridiumdifficileComplete（BioGenTechnologies），研究C.difficile10个菌株的毒素产生性。

使用BHI液体培养基，将各菌株在厌氧条件下以37℃培养4天。将培养上清按照试剂盒的操作说明书操作，通过特异性条带的有无来判断TcdA和TcdB的毒素产生。其结果，如下述表2所示，确认了均显示毒素产生性。

[表2]

（2）TaqManPCR法的特异性（1）

使用C.difficile10个菌株（A+B+型5个菌株、A-B+型2个菌株、A-B-型3个菌株）、Clostridium属10个菌种和肠内菌12个菌种，研究本发明的引物和探针试剂盒（tcdA-F/R/P和tcdB-F/R/P）的特异性。使用从纯培养菌体提取的DNA溶液，每个反应供给相当于10⁵个的量，以上述（B）的条件进行TaqManPCR，确认扩增信号的有无。将结果表示在表3中。

[表3]

a)na:不适用

b)+：检测出信号，-:未检测出信号(Ct值50以上)，nt:未检测

由表3可知，DSM1296^T株中，tcdA和tcdB两者的扩增信号被检测到，与毒素产生性一致。同样，在其他的菌株中也确认到与毒素产生性一致的扩增信号。另一方面，在非靶标菌株中完全没有检测到信号，引物二聚体的信号也完全没有观察到。

（3）引物和探针的特异性（2）

比较在上述专利文献1中记载的引物组（J）中用于扩增tcdA的引物（序列39/40）与本申请发明的上述引物tcdA-F/R/P的特异性。

即，研究专利文献1的引物组（序列39/40）对于C.difficile10个菌株（A+B+型5个菌株、A-B+型2个菌株、A-B-型3个菌株）的反应性。使用从纯培养菌体中提取的DNA溶液，将每个反应相当于10⁵个的量供于PCR。PCR使用HotStartTaqDNApolymerase（HotStartTaqDNA聚合酶）（株式会社QIAGEN），反应液组成为10×PCRbuffer、引物F/R0.4μM、dNTP0.25mMeach、RoxReferenceDye、SYBRGreenI、TaqDNApolymerase0.25Units和模板DNA溶液5μL，总量设为20μL。以94℃20秒、50℃30秒、74℃40秒为一个循环进行45个循环的反应条件进行PCR，所得到的Ct值如果在标准菌株（DSM1296T）的Ct值±3.3的范围内则判断为“+”，如果为45以上则判断为“-”。

对于上述（2）得到的tcdA-F/R/P的反应性，也按照相同的判断基准进行评价。将这些结果表示在表4中。

[表4]

判断标准：+：Ct值在标准菌株（DSM1296T）的Ct值±3.3的范围内

-：Ct值为45以上

对于专利文献1的引物组（J）（序列39/40）而言，显示在A+B+株以外，在A-B+株中也确认到扩增，与之相对，本发明的tcdA-F/R/P显示对A-B+株没有扩增，仅对A+B+株能够可靠地扩增。

接着，为了确认在靶标菌株间没有反应性的差异，分别制作了各靶标菌株的标准曲线进行比较。其结果，均能够以Ct值2以内（换算为菌数为4倍以内）的差异（图1）检测出供试的靶标菌株。这些结果表明，本发明的方法能够特异性地且准确地仅检测出靶标的产生毒素的菌株。

实施例2毒素产生性C.difficile的检测（添加回收试验）

为了验证粪便中的毒素产生性C.difficile的检测下限值，使用没有检测到内源性的C.difficile的3人的粪便样品，实施添加回收试验。

选择预先确认了不存在内源性的C.difficile的健康成人3人的粪便样品，将产生TcdA和TcdB两者的C.difficileDSM1296^T株的纯培养菌体在粪便中以每1g为10⁸,10⁷,10⁶,10⁵,10⁴,10³个的方式添加。其中，添加菌数根据DAPI计数的测定菌数进行调整。

按照上述（C）和（D）的方法进行DNA提取，分别使用提取DNA原液和2倍稀释液5μL，以上述（B）的条件进行TaqManPCR。作为标准曲线制作用的标准品，PBS（-）每10mL添加10⁸个（对应于每1g粪便为10⁸个），与粪便样品同样地提取。将提取的标准DNA以10倍系稀释至10⁵倍的总计6种DNA溶液5μL供给PCR，制作标准曲线，用于粪便添加样品的菌数计算。

其结果，对于tcdA-F/R/P和tcdB-F/R/P任意一个而言，都能够在每1g粪便中检测到10³个（图2）。这样，根据本发明的方法，能够以细菌DNA作为靶标进行高灵敏度的检测，能够对毒素产生性C.difficile特异性地且高灵敏度（检测下限值：每1g粪便为10³个）进行定量。实施例3在肠内作为内源菌生存的菌株的检测

[I]材料和方法

（1）CD16SrRNA-F/R/P的制作

制作用于测定C.difficile总菌数的引物组CD16SrRNA-F和CD16SrRNA-R，进一步设计了在其扩增范围新设计了探针的TaqMan探针CD16SrRNA-P（表5）。

[表5]

引物/探针名	序列(5'-3')	序列号
			CD16SrRNA-F	GCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGT	7
CD16SrRNA-R	GTACTGGCTCACCTTTGATATTYAAGAG	8
			CD16SrRNA-P	FAM-TGCCTCTCAAATATATTATCCCGTATTAG-TAMRA	9

（2）粪便DNA样品

从日本的养老院入住者和员工102名采集的粪便中，将利用选择培养法确认分离了C.difficile的16个检体的粪便DNA用于本分析。

（3）选择培养法

将冻结便融解后，悬浮于9倍容量的厌氧输送培养基。将其与等量的98%乙醇混合，在室温孵育30分钟。将乙醇处理液0.1ml涂抹于环丝氨酸头孢西丁甘露醇琼脂（Cycloserinecefoxinmannitolagar）（CCMA），将本培养基在37℃厌氧培养24小时。对于在培养基上检测到的菌落，计算从性状和革兰氏染色性推测为C.difficile的菌落的数量。

（4）DNA提取法

在2mL旋盖试管中的标准曲线用菌液200μL或大便10倍稀释液中，加入0.3g的玻璃珠（φ0.1mm）、300μL的Tris-SDS溶液（混合250mL的200mMTris-HCl、80mMEDTA,pH9.0和50mL的10%SDS进行制备）、500μL的Tris-EDTA缓冲液饱和苯酚（Tris-EDTAbufferSaturatedPhenol）。

将加入样品的试管设置于振荡破碎机（FastPrepFP120）。以功率水平5.0剧烈振荡30秒钟，破碎菌体。取出试管，以15,000rpm离心分离5分钟。

将上清400μL移至新的2mL旋盖试管。加入400μL的苯酚/氯仿/异戊醇（Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol）（25:24:1），装于FastPrepFP120。以功率水平4.0剧烈振荡45秒，以15,000rpm离心分离5分钟。

在新的1.5mL试管中移入250μL的上清。加入25μL的3M乙酸Na（pH5.4）进行混合。

加入300μL的异丙醇。以15,000rpm离心分离5分钟。用倾析除去上清。加入500μL的70%乙醇，（不进行搅拌的状态）再次以15,000rpm离心分离5分钟。用倾析除去上清。

去掉盖，边以60℃的干式恒温器（heatblockincubator）加热约30分钟边使其干燥。加入Tris-EDTA缓冲液，搅拌使其均匀溶解。在-30℃冷冻保存。

（5）TaqManPCR反应

用与实施例1[I]（B）同样的方法进行。

[II]结果

16个检体中，从8个检体检测到了毒素产生株（表6）。这8个检体中，在7个检体中，利用TapManPCR法得到的C.difficile的总菌数（CD16SrRNA-F/R/P）、TcdA产生性C.difficile的菌数（tcdA-F/R/P）和TcdB产生性C.difficile的菌数（tcdB-F/R/P）相等，由此可知，在肠内A+B+型的毒素产生株存在占优势地位。

在检测到毒素产生株的8个检体中的1个检体（S-09）中，C.difficile的总菌数，相比于毒素产生性C.difficile的菌数，以对数值为1.5以上大幅增高，由此可知，除了能够判别非毒素产生性C.difficile最占优势（在肠内最占优势地存在），还能够检测到不最占优势的毒素产生性C.difficile。

即，由于通过组合CD16SrRNA-F/R/P、tcdA-F/R/P和tcdB-F/R/P使用，能够利用TaqManPCR法测定C.difficile的总菌数（A+B+型、A-B+型和A-B-型的菌数的总和）、TcdA产生性C.difficile（A+B+型）的菌数和TcdB产生性C.difficile的菌数（A+B+型和A-B+型的菌数的总和），所以能够准确的掌握粪便中（肠内）的C.difficile的详细情况（总菌数、毒素产生性和非毒素产生性C.difficile相对于总菌数的比率），能够对于C.difficile感染症的诊断、临床研究等作出贡献。

[表6]

Claims

1.包括由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对。

2.由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。

3.如权利要求2所述的寡核苷酸探针，其特征在于：

在寡核苷酸的5'末端结合有荧光物质，在3'末端结合有猝灭物质。

4.一种实时PCR用的寡核苷酸组，其特征在于：

其具备权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的寡核苷酸探针。

5.包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对。

6.由序列号6所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。

7.如权利要求6所述的寡核苷酸探针，其特征在于：

8.一种实时PCR用的寡核苷酸组，其特征在于：

其具备权利要求5所述的引物对和权利要求7所述的寡核苷酸探针。

9.权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的寡核苷酸探针、以及权利要求5所述的的引物对和权利要求7所述的寡核苷酸探针在毒素产生性艰难梭菌的检测用寡核苷酸组的制造中的使用，其特征在于：

所述寡核苷酸组具备权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的寡核苷酸探针、和/或权利要求5所述的引物对和权利要求7所述的寡核苷酸探针，

所述毒素产生性艰难梭菌的检测包括以从人粪便提取的DNA为模板，使用所述寡核苷酸组分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。

10.权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的寡核苷酸探针、以及权利要求5所述的的引物对和权利要求7所述的寡核苷酸探针在人粪便中的艰难梭菌中的毒素产生性艰难梭菌和/或非毒素产生性艰难梭菌的存在比率的计算用寡核苷酸组的制造中的使用，其特征在于：

人粪便中的艰难梭菌中的毒素产生性艰难梭菌和/或非毒素产生性艰难梭菌的存在比率的计算包括以从人粪便提取的DNA为模板，使用所述寡核苷酸组、以及以下所示的(a)的引物对或具备(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组，分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序，

(a)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对；

(b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针，其中，在该寡核苷酸的5'末端结合有荧光物质，在3'末端结合有猝灭物质。