JP2003164282A

JP2003164282A - 微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット

Info

Publication number: JP2003164282A
Application number: JP2001365153A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Ezaki; 孝行江崎
Original assignee: RAKAN KK; Gifu University NUC
Current assignee: RAKAN KK; Gifu University NUC
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2003-06-10

Abstract

(57)【要約】【課題】複数種類の下痢症状及び食中毒の原因菌とな
る微生物を検出対象として、微生物の遺伝子を共通の条
件で増幅させて検出することができる微生物の検出方
法、及びその方法に用いられるプライマーセットを提供
する。【解決手段】ＰＣＲ法の増幅反応における温度サイク
ル条件を予め一定条件に設定するとともに、設定された
温度サイクル条件下で、標的とされる遺伝子領域が増幅
されるように設計されたプライマーセットを、検出対象
とする複数種類の微生物のそれぞれについて準備する工
程と、検出対象とされる少なくとも１種類の微生物を含
むと思われる試料につき、準備された複数種類のプライ
マーセットをそれぞれに用いて、設定された共通の温度
サイクル条件下で増幅反応を行う工程とを備える。ま
た、高感度の検出を目的とする場合には、ネステッドＰ
ＣＲ法を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の遺伝子を
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で増幅して検出する
微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセッ
トに関するものであり、特に、人体に食中毒などを引き
起こす原因菌となる微生物の遺伝子を対象として共通の
条件で増幅させる微生物の検出方法、及び微生物の検出
用プライマーセットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、細菌などの微生物を検出し同定
するためには、選択培地による分離培養、顕微鏡による
形態観察、あるいは培養菌を用いた生理学的性状や薬剤
感受性などの試験が行われる。しかし、培養を前提とす
るこれらの手法は、培養が困難なレジオネラなどの場合
には適用することが困難である。また、培養時間が必須
であり、その他にも時間のかかる操作が含まれることか
ら、結果が得られるまでには通常数日間を要し、培養期
間が長い結核菌などの場合は数週間という期間が必要と
なる。このような時間的な制約は、赤痢や敗血症などの
急性感染症を引き起こす病原体や薬剤耐性菌など、迅速
な同定が求められる場合においては、大きな障害となっ
ている。

【０００３】そこで、近年では、遺伝子を分析すること
によって微生物を検出し同定する遺伝子検査法が、臨床
検査の現場などに広く導入されつつある。この遺伝子検
査法では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を組み合
わせて微生物の遺伝子を増幅させることにより、検出感
度を飛躍的に向上させることができる。しかも、培養期
間を待つ必要がないため短時間で結果を得ることがで
き、培養困難な微生物も検出対象とすることができる。
ＰＣＲ法では、プライマーと呼ばれる一対のＤＮＡ断片
を必要とし、増幅したい遺伝子領域の５'末端部分に相
当する塩基配列（センス側）と、３'末端部分に相当す
る相補的な塩基配列（アンチセンス側）とを用いる。し
たがって、ある微生物に特異的な遺伝子を標的とするプ
ライマーを用いて増幅すれば、その微生物を同定するこ
とも可能である。

【０００４】ＰＣＲ法の増幅反応は、ＤＮＡの熱変性、
プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長反応
のそれぞれの温度条件で反応液をインキュベートするこ
とによって進行し、この三つのステップからなる温度サ
イクルを繰り返すことで所望の増幅産物が得られる。増
幅反応の至適条件は使用するプライマーの種類によって
異なり、中でも温度サイクルのアニーリング条件はプラ
イマーの塩基配列や鎖長に大きく影響される。したがっ
て、ＰＣＲ法により高感度で目的とする増幅産物を得る
には、プライマーの至適条件を予備実験などによって確
認し、その条件に基づいて増幅反応を行うことが重要と
される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ところで、微生物の検
出試験は、特定の微生物の検出を目的とする以外に、不
特定の微生物の検出、あるいは複数種類の微生物の同時
検出を目的として行われることが多い。このような試験
においてＰＣＲ法を適用する場合には、広範囲の微生物
の間、例えば細菌全般に普遍的な遺伝子を標的とするプ
ライマー（ユニバーサルプライマー）や、検出対象とす
る各微生物に特異的な遺伝子を標的とする複数種類のプ
ライマーが用いられる。しかし、ユニバーサルプライマ
ーを用いる方法は、増幅反応の段階で微生物を特定する
ことができないため、同定のための後操作が必要とな
る。一方、複数種類のプライマーを用いる方法は、増幅
反応の段階である程度の種の特定が可能であるが、各プ
ライマーについて温度サイクル条件を設定する必要が生
じる。

【０００６】ＰＣＲ法における温度サイクルの制御は、
一般に、反応液を入れた容器をＰＣＲ装置（サーマルサ
イクラー）を用いて加熱又は冷却し、反応液の温度を設
定された温度サイクル条件に基づき変動させることによ
り行われる。ところが、ＰＣＲ装置では基本的に一種類
の温度サイクル条件しか制御することができないため、
異なる温度サイクル条件を設定しようとする場合には、
それぞれの増幅反応を順次行う必要があった。このた
め、複数種類のプライマーセットを用いる場合には、た
とえ試料が一種類のみであっても、それぞれの増幅反応
を同時に行うことが困難であり、迅速性というＰＣＲ法
による利益を十分に享受することができなかった。ま
た、プライマー毎に異なる温度サイクル条件を適用する
必要があることから、その操作が煩雑であり、温度サイ
クル条件の設定ミスなどの誤操作を誘発する要因にもな
っていた。

【０００７】近年に入り、病原性大腸菌Ｏ−１５７など
による微生物に起因する大規模な食中毒事件が発生して
いる。このような場合、対象となる微生物種を特定し、
さらに該微生物種に対応した適切な治療及び処置を迅速
に行なう必要があった。また、大腸菌以外にも、ボツリ
ヌス菌やサルモネラ菌などの微生物によって激痛を伴う
下痢症状を引き起こすことがあった。そのため、特に、
これらの微生物の検出を速やかに行なえるＰＣＲ法に基
づいた微生物の検出方法、及び該ＰＣＲ法に用いるプラ
イマーセットが求められていた。

【０００８】そこで、本発明は、上記実情に鑑み、複数
種類の微生物を検出対象とし、特に人体に対し、下痢症
状を含む食中毒の原因菌となる各微生物の遺伝子を共通
の条件で増幅させて検出することができる微生物の検出
方法、及びその方法に用いられるプライマーセットの提
供を課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明に
係る微生物の検出方法は、所定の分類範囲において特異
的かつ普遍的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標的と
するプライマーを用いて、前記分類範囲に属する前記微
生物の前記遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法
の増幅反応における温度サイクル条件を予め一定条件に
設定するとともに、その設定条件下で、標的とされる前
記遺伝子が増幅されるように設計されたプライマーセッ
トを、検出対象とする複数種類の前記微生物のそれぞれ
について調整する工程と、検出対象とされる前記微生物
のうち少なくとも一つを含む試料について、調整された
前記プライマーセットをそれぞれ用いて、設定された前
記温度サイクル条件に基づいて増幅反応を行なう工程と
を備え、下記の表１及び表２の（Ａ）〜（ＨＨ）からな
るイ群、及び表３及び表４の（ａ）〜（ｈｈ）からなる
ロ群より選択される複数種類のプライマーセットを用い
たものである。

【００１０】

【表１】

【００１１】

【表２】

【００１２】

【表３】

【００１３】

【表４】

【００１４】ここで「微生物」とは顕微鏡的な大きさの
生物を意味し、細菌や菌類、原生動物、ウイルスなどを
含む。また「分類範囲」とは、ある特定の種類に分類さ
れる微生物の集まりをいい、例えば、下位の種（specie
s）から属（genus）、科（family）などの上位に向かう
階層的な微生物の分類体系における、種としての大腸
菌、属としてのエロモナス属、あるいはより上位の階層
での菌類、などを挙げることができる。また、各表中
の”spp”は、その属に属するすべての種を示し、”gro
up”は、その種に属する株の集まりを示している。

【００１５】したがって、請求項１の発明の微生物の検
出方法によれば、ある微生物に特異的な遺伝子を標的と
するプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、目的とする増
幅産物の生成を確認することにより、その試料中に当該
微生物が含まれるか否かを判定する。これは、何らかの
微生物が混入している試料には、必然的に当該微生物に
由来する遺伝子ＤＮＡが含まれるという原理に基づいて
いる。ここで、ＰＣＲ法では、複数種類のプライマーセ
ットを用いてそれぞれに増幅反応を行う。各プライマー
セットは、予め設定された一定の温度サイクル条件下に
おいて、増幅反応が好適に進行するように設計されたも
のであり、特にアニーリングの温度条件が共通するよう
にその塩基配列や鎖長が設計されている。これによっ
て、広範囲の微生物を検出対象としながら、増幅条件に
おける温度サイクル条件を共通化できる微生物の検出系
が構築される。

【００１６】そこで、表１乃至表４に示すように、特に
人体に対し、下痢症状を引き起こす要因となるものを検
出対象とし、これらの対象微生物の検出を目的とする複
数種類のプライマーセットが用意される。これらのプラ
イマーセットを組み合わせることで、広範囲の微生物が
検出対象として網羅される。これらのプライマーセット
はまた、一定の温度サイクル条件において標的とする遺
伝子を増幅させるように設計されている。具体的には、
表１及び表２に示すイ群の各プライマーは４５〜５５℃
の温度範囲において、表３及び表４に示すロ群の各プラ
イマーは５５〜６５℃の温度範囲において、それぞれに
標的とする微生物の遺伝子に好適にアニーリングするよ
うに、その塩基配列や鎖長が設計されている。なお、同
一の対象微生物でも、プライマーセットの標的となる対
象遺伝子が異なる場合には、それぞれの対象遺伝子に対
応したプライマーセットが個々に設計されている（例え
ば、Clostridium botulinumなど）。

【００１７】請求項２の発明にかかる微生物の検出方法
は、請求項１に記載の微生物の検出方法において、前記
イ群より選択されるプライマーセットとともに、前記ロ
群より選択されるプライマーセットをネステッドプライ
マーとして用いるものである。

【００１８】ここで、ネステッドプライマーとは、ネス
テッドＰＣＲ（Nested-PCR）法において用いられるもの
であり、第一段階の増幅産物を鋳型とし、その最初に用
いたプライマーより内側に設定した別のプライマーに相
当するものである。そして、このネステッドプライマー
を用いて第二段階の増幅反応を行なうものであり、ネス
テッドプライマーは、二段階ＰＣＲ法とも呼ばれてい
る。

【００１９】したがって、請求項２の微生物の検出方法
によれば、請求項１の微生物の検出方法の作用に加え、
表１及び表２に示すプライマーセットと表３及び表４に
示すプライマーセットをネステッドプライマーとして併
用してネステッドＰＣＲ法を行うことにより、検出の感
度や特異性がより一層向上する。

【００２０】請求項３にかかる微生物の検出用プライマ
ーセットは、請求項１に記載の各群より選択される複数
種類のプライマーセットで構成されるものである。

【００２１】したがって、請求項３の微生物の検出用プ
ライマーセットは、複数種類の病原性微生物を検出対象
とするプライマーセットとして機能する。すなわち、こ
れらのプライマーセットを用いることにより、請求項１
に記載の発明の作用を奏する。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物の検出方法は、所定の分類範囲において
特異的かつ普遍的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標
的とするプライマーを用いて、前記分類範囲に属する前
記微生物の前記遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）法により増幅して検出するものである。さらには、
ＰＣＲ法の増幅反応における温度サイクル条件を予め一
定条件に設定するとともに、その設定条件下で、標的と
される遺伝子が増幅されるように設計されたプライマー
セットを、検出対象とする複数種類の前記微生物のそれ
ぞれについて調整する工程と、検出対象とされる微生物
のうち少なくとも一つを含む１種類を含むと思われる試
料につき、準備された複数種類のプライマーセットをそ
れぞれ用いて、設定された前記温度サイクル条件に基づ
いて増幅反応を行なう工程とを備えることにより、複数
種類の微生物を検出対象として、共通の条件で増幅反応
を行わせることを可能とするものである。

【００２３】なお、本発明の微生物の検出方法は、微生
物に由来する遺伝子ＤＮＡが、試料中に一定の基準を超
えて存在しているか否かを判定するものである。すなわ
ち、ＰＣＲ法による増幅反応の後、試料中にその遺伝子
を鋳型とする増幅産物が生成していれば、当該微生物が
含まれる「陽性」と判定し、一方、増幅産物が生成して
いなければ、当該微生物は含まれない「陰性」と判定す
る。その判定の基準、すなわち増幅反応の感度は、検出
の目的や検体の種類などに応じて調整することができ
る。具体的には、増幅反応のサイクル数や使用するプラ
イマー量を調整することや、後述するネステッドＰＣＲ
法を適用することなどによって行うことができる。ま
た、本方法では、検出対象とされる微生物に特異的な塩
基配列を含む領域を標的とするプライマーセットを用い
て、その微生物の遺伝子を特異的に増幅させるため、微
生物の同定、すなわち、微生物の属する所定の分類範囲
を増幅反応の段階で特定することができる。

【００２４】本方法の特徴の一つは、ＰＣＲ法の温度サ
イクル条件を予め一定条件に設定するとともに、設定さ
れた温度サイクル条件に適するプライマーを、検出対象
とする複数種類の微生物について設計することにある。
ＰＣＲ法の温度サイクル条件とは、増幅反応におけるＤ
ＮＡの熱変性による一本鎖化、プライマーのアニーリン
グ、及びポリメラーゼ伸長からなる増幅反応の各ステッ
プの温度条件をいう。この中で、熱変性及び伸長反応の
温度条件は、主にTaqポリメラーゼの種類によって設定
されるが、アニーリングの温度条件は主にプライマーの
種類によって設定される。詳しくは、通常アニーリング
温度はプライマーＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）値を基準に
設定され、Ｔｍ値から５℃程度下げた値を設定すること
が多い。したがって、本発明では、アニーリング温度を
多種類のプライマーで汎用可能な温度領域内に設定する
とともに、その設定されたアニーリング温度に適するＴ
ｍ値を逆算して、その値に近似するＴｍ値を持つような
プライマーを設計するという手順を踏まえるとよい。

【００２５】検出対象とする微生物の種類は、測定しよ
うとする試料の種類などに応じて選定し、例えば、その
測定対象の試料に存在し得る各種微生物を広く網羅する
ようにして選定することが好ましい。本方法に供する試
料には特に制限はないが、人体に対して下痢症状を引き
起こす要因となる微生物を検出することを目的とするた
めに、喀痰、血液、及び糞便などの各種臨床試料を生体
試料として用いることが可能であり、特に糞便を試料と
して利用することが好適である。

【００２６】本方法で用いるプライマーの設計に際して
は、上述したようにそのＴｍ値に留意する必要がある。
Ｔｍ値は正確には実験により求められるが、プライマー
の塩基配列から推算することが可能であり、例えば、Ａ
又はＴを２℃、Ｇ又はＣを４℃として合計を求める方法
がよく用いられている。検出対象とする各微生物につい
て、特異的な塩基配列を持つ標的遺伝子から、目標とす
るＴｍ値を有するプライマーを選択するのは意外と難し
いが、プライマーの鎖長を変えることで、そのＴｍ値を
ある程度調整することができる。なお、この他にも一般
的なプライマーの条件を満たす必要がある。具体的に
は、１５〜３０塩基程度の鎖長を有すること、センスプ
ライマーとアンチセンスプライマーのＴｍ値が近似する
こと、プライマーが二次構造をとったり自己アニールを
起こすような自己相補的配列を含まないこと、二本のプ
ライマー同士がアニールしてプライマーダイマーを形成
しないこと、部分的にＧＣリッチあるいはＡＴリッチな
塩基配列が連ならないようにすること、などが挙げられ
る。

【００２７】本方法で用いるプライマーは、常法にした
がって調製すればよい。例えば、ＤＮＡ合成装置などを
用いて所定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成した
後、液体クロマトグラフィーなどによって精製して調製
することができる。

【００２８】また、本方法では、ネステッドＰＣＲ法を
用いて増幅反応を行うことが好ましい。ネステッドＰＣ
Ｒ法は二段階ＰＣＲ法とも呼ばれ、第１段階の増幅産物
を鋳型とし、その最初に用いたプライマーセットより内
側に設定した別のプライマー（ネステッドプライマー）
を用いて、第２段階の増幅反応を行うものである。ま
た、このネステッドＰＣＲ法を適用する場合には、第１
段階と第２段階のそれぞれの温度サイクル条件を異なら
せて増幅反応を行うとよい。具体的には、第１段階のア
ニーリング温度は４５〜５５℃、好ましくは４８〜５５
℃の範囲内で設定するとともに、第２段階のアニーリン
グ温度は５５〜６５℃、好ましくは５５〜６２℃の範囲
内で設定するとよい。この場合、第１段階では、プライ
マーがアニーリングしやすい比較的穏やかな条件に設定
されることから、標的遺伝子を確実に捕捉して感度を優
先した増幅反応を行うことができる。一方、第２段階で
は、プライマーが非相補的な配列にアニーリングしにく
いストリンジェントな条件に設定されることから、特異
性を優先させた増幅反応を行うことができる。

【００２９】続いて、本発明の微生物の検出方法を、臨
床試料として糞便より採取される試料を測定対象とする
微生物の検出系に具体化した一実施形態に基づいて、下
痢症状を引き起こす下痢起因性の微生物の特定を行なう
ための微生物検出系の構築を試みた。

【００３０】その具体的手段は、表１乃至表４に示す複
数種類のプライマーセットをそれぞれに用いて、一定条
件下でＰＣＲ法の増幅反応を行なうものである。さら
に、本実施形態ではネステッドＰＣＲ法を適用し、表１
及び表２の（Ａ）〜（ＨＨ）を第一段階の増幅反応にお
ける外側のプライマーとして用いるとともに、表３及び
表４の（ａ）〜（ｈｈ）を第二段階の増幅反応における
内側のネステッドプライマーとして用いる。これらのプ
ライマーセットが標的とする遺伝子、及びその増幅産物
の鎖長を下記の表５乃至表７に示す。

【００３１】

【表５】

【００３２】

【表６】

【００３３】

【表７】

【００３４】各プライマーセットの標的は、リボゾーム
ＲＮＡ（rRNA）、熱ショックタンパク質（HSP）をコー
ドする遺伝子、及びボツリヌス毒素及び腸管毒素などの
種々の毒素（toxin）などをコードする遺伝子をそれぞ
れ対象としている。

【００３５】次いで、表１乃至表４に示すプライマーセ
ットが検出対象とする各微生物について説明する。な
お、以下の説明では便宜上、プライマーセット(Ａ)〜
(ＨＨ)のみを表記しているが、ネステッドプライマーの
セット(ａ)〜(ｈｈ)を組み合わせて用いる場合を含むも
のとする。

【００３６】プライマーセット(Ａ)は、エロモナス・ヒ
ドロフィラ（Aeromonas hydrophila）の細菌を検出対象
とし、プライマーセット(Ｂ)は、エロモナス（Aeromona
s）属を検出対象とする。エロモナス属の細菌は、淡水
中の常在菌であり、運動性のあるグラム陰性棹菌であ
り、エロモナス・ヒドロフィラ及びエロモナス・ソブリ
ア（A. sobria)は、食中毒の原因菌となっている。さら
に、日和見感染症として、敗血症、創傷感染、心内膜炎
などを引き起こすこともある。

【００３７】プライマーセット(Ｃ)は、バシラス・セレ
ウス（Bacillus cereus group）群を検出対象とする。
バシラス・セレウスは、毒素型食中毒を起こし、下痢、
腹痛を伴う下痢型と、吐気及び嘔吐を伴う嘔吐型の二つ
のタイプがある。

【００３８】プライマーセット（Ｄ）は、バクテロイデ
ス・フラジリス（Bacteroides fragilis）を検出対象と
する。バクテロイデス・フラジリスは、糞便中の最優勢
菌群であり、腹腔内感染症や敗血症を起こす。

【００３９】プライマーセット（Ｅ）は、カンピロバク
ター・ジェジュニ（Campylobacterjejuni）の細菌を検
出対象とし、プライマーセット（Ｆ）は、カンピロバク
ター・ジェジュニ／コリ（Campylobacter jejuni/col
i）の細菌を検出対象とし、プライマーセット（Ｇ）
は、カンピロバクター（Campylobacter）属の細菌を検
出対象とするものである。これらの微生物は、下痢や食
中毒の起因菌となり、特に、小児集団食中毒や乳幼児下
痢症の原因菌となる。これらは、感染後に腸管粘膜へ侵
入し、下痢、発熱、腹痛、嘔吐などの症状を起こす。ま
た、カンピロバクター・ジェジュニ／コリは、主に牛、
鶏、豚などが保菌しているため、これらが感染源となる
ことが多い。

【００４０】プライマーセット（Ｈ）は、クロストリジ
ウム・ボツリナム（Clostridium botulinum，ボツリヌ
ス菌）の細菌を検出対象とするものである。ボツリヌス
菌は、嫌気性で増殖し、神経毒による食中毒を引き起こ
す（ボツリヌス中毒）。ボツリヌス毒素は腸管から吸収
され、筋肉の麻痺を起こす。特に、死亡率が高い場合も
あり、早期治療を必要とするものである。

【００４１】プライマーセット（Ｉ）は、クロストリジ
ウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）の細菌を
検出対象とするものであり、プライマーセット（Ｊ）
は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium di
fficile）の細菌を検出対象とするものである。クロス
トリジウム・ブチリカムは、グラム陽性偏性嫌気性細菌
であり、その神経毒素産生性株は、食中毒を引き起こ
す。一方、クロストリジウム・ディフィシレは、リンコ
マイシンやクリンダマイシンなどの抗生物質投与後に起
こる偽膜性大腸炎の原因菌となる。抗生物質の投与によ
る大腸細菌叢の乱れによるものであり、症状は腹痛、下
痢、発熱、及び白血球増加が見られる。

【００４２】プライマーセット（Ｋ）は、クロストリジ
ウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringen
s，ウェルシュ菌）の細菌を検出対象とするものであ
り、耐熱性の芽胞が生存し、かつ酸素のない腸管に入っ
て嫌気性菌に増殖し、生体内毒素を産生するものであ
る。これにより、ガス壊疽や食中毒の原因菌となる。

【００４３】プライマーセット（Ｌ）は、クリプトスポ
リジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）の原生
動物を検出対象とするものであり、水系の汚染を感染源
として下痢を特徴とするクリプトスポリジウム症を起こ
す病原虫として知られている。プライマーセット（Ｍ）
は、エントアメーバ・ヒストリティカ（Entamoeba hist
olytica，赤痢アメーバ）の原生動物を検出対象とする
ものであり、下痢、粘血便の赤痢様症状を呈する。原虫
は、血行性に転移し、肝、肺、脳に腫瘍を作ることがあ
る。

【００４４】プライマーセット（Ｎ）は、腸管凝集付着
性大腸菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli(Eag
gEC)））の細菌を検出対象とするものであり、プライマ
ーセット（Ｏ）は、腸管組織侵入性大腸菌（エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli(EIEC)））の細菌を検出対
象とするものであり、プライマーセット（Ｐ）は、腸管
出血性大腸菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli
(EHEC)））の細菌を検出対象とするものであり、プライ
マーセット（Ｑ）は、毒素原性大腸菌（エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli(ETEC)）の細菌を検出対象とす
るものであり、プライマーセット（Ｒ）は、大腸菌（Es
cherichia coli）の病原因子の一つであるインティミン
（intimin（接着因子））産生遺伝子（eaeA）を検出対
象とする。大腸菌は、ヒトや動物の腸管に存在する常在
菌であり、糞便中に含まれている。さらに、詳しく説明
すると、腸管凝集付着性大腸菌は、遷延性下痢、発熱、
腹痛、悪心、嘔吐の症状を呈し、腸管組織侵入性大腸菌
は、粘血便、発熱、嘔気、腹痛、嘔吐の症状を呈し、腸
管出血性大腸菌は、血便、腹痛、嘔吐、嘔気、発熱の症
状を呈し、毒素性大腸菌は水様性下痢、腹痛、発熱、嘔
吐の症状を呈することがある。

【００４５】プライマーセット（Ｓ）は、ギアルディア
・ランブリア（Giardia lamblia group，ランブル鞭毛
虫）の原生動物を検出対象とするものであり、脂肪性の
下痢、栄養不良、胆嚢炎など症状を起こす。また、プラ
イマーセット（Ｔ）は、リステリア・モノサイトゲネス
（Listeria monocytogenes）の細菌を検出対象とするも
のであり、成人では日和見感染を起こす。症状は、髄膜
炎、敗血症、心内膜症、肺炎を呈することがあり、致命
率の高い細菌である。プライマーセット（Ｕ）は、プレ
ジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloide
s）の細菌を検出対象とするものであり、淡水中に常在
し、淡水魚などを通じて経口感染を起こし、急性胃腸炎
の原因となる。

【００４６】プライマーセット（Ｖ）は、サルモネラ属
（Salmonella spp.）の細菌を検出対象とするものであ
り、プライマーセット（Ｗ）は、サルモネラ・タイフィ
（Salmonella typhi，チフス菌）の細菌を検出対象とす
るものである。サルモネラ属菌は、２つの臨床病型に分
けられ、いずれも経口感染する。チフス菌またはパラチ
フス菌によって発症するチフス症（腸チフス・パラチフ
ス）は、敗血症を起こし、高熱、バラ疹、腫瘍などの症
状を呈する。一方、上記以外に属するサルモネラ属は、
発熱、下痢、腹痛などを伴う急性胃腸炎症状を呈する食
中毒の原因菌となる。プライマーセット（Ｘ）は、シゲ
ラ・フレクスネリ（Shigella flexneri，フレクスナー
赤痢菌）の細菌を検出対象とするものであり、粘血性の
便や、発熱、膿、しぶり腹などの症状を呈する。

【００４７】プライマーセット（Ｙ）は、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus，黄色ブ
ドウ球菌）の細菌を検出対象とするものであり、黄色ブ
ドウ球菌は主な症状として、化膿性炎症、食中毒、ブド
ウ球菌性皮膚剥脱症候群、毒素性ショック症候群などを
引き起こす。プライマーセット（Ｚ）は、トロフェリマ
・ウィッペリ（Tropheryma whippelii(Whipple's Disea
se））の細菌を検出対象とするものであり、トロフェリ
マ・ウィッペリは、膠原病の一種であるWhipple diseas
eの原因菌とされるものである。

【００４８】プライマーセット（ＡＡ）は、ビブリオ・
コレラ（Vibrio cholerae，コレラ菌）の細菌を検出対
象とするものであり、プライマーセット（ＢＢ）は、ビ
ブリオ・コレラ／ミミカス（Vibrio cholerae/mimicu
s）の細菌を検出するものであり、プライマーセット
（ＣＣ）は、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvial
is)の細菌を検出対象とするものであり、プライマーセ
ット（ＤＤ）は、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibr
io parahaemolyticus，腸炎ビブリオ）の細菌を検出対
象とするものであり、プライマーセット（ＥＥ）は、ビ
ブリオ・パラヘモリティカス群（Vibrio parahaemolyti
cus group）の細菌を検出対象とするものであり、プラ
イマーセット（ＦＦ）は、ビブリオ属（Vibrio spp.）
の細菌を検出対象とするものである。コレラ菌は、激し
い水様性の下痢を発症する。また、ビブリオ・ミミカス
及びビブリオ・フルビアリスは、海水や河水中に存在
し、魚介類を介して食中毒を起こす原因菌となる。さら
に、腸炎ビブリオは、海水中に生息する好塩菌であり、
汚染された魚介類を経口摂取することにより発症し、下
痢、腹痛、嘔吐、発熱などの症状を引き起こす。

【００４９】プライマーセット（ＧＧ）は、エルシニア
・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）の
細菌を検出対象とするものであり、プライマーセット
（ＨＨ）は、エルシニア・エンテロコリティカ群（Yers
inia enterocolitica group）の細菌を検出対象とする
ものである。エルシニア・エンテロコリティカは、豚や
犬などの腸管に分布し、急性胃腸炎（食中毒）、終末回
腸炎、腸管膜リンパ節炎、虫垂炎、結節性紅斑、関節
炎、敗血症などを引き起こす。

【００５０】次いで、上記の各プライマーセットを用い
る微生物の検出方法の操作手順を、図１を参照しながら
説明する。本実施形態では、図１に示すように、ＤＮＡ
の抽出、ＰＣＲ法（ネステッドＰＣＲ）による増幅反
応、及び増幅産物の検出の三段階によって、微生物の検
出操作を行う。すなわち、ＰＣＲ増幅反応を主として、
その前後の工程で必要な処理を行う。

【００５１】まず、ＰＣＲの実施に先立ち、試料中に含
まれる（と思われる）微生物の細胞から、遺伝子ＤＮＡ
を抽出するための操作が行われる。具体的には、タンパ
ク質分解酵素（プロテアーゼ）処理や変性剤などによっ
て化学的に細胞を破壊し、あるいはビーズや超音波処理
などによって物理的に細胞を破壊することなどにより、
ＤＮＡを抽出する。

【００５２】続いて、ネステッドＰＣＲ法による二段階
の増幅反応が行われる。第１段階では、先にＤＮＡを抽
出した試料について、表１及び表２に示す外側のプライ
マーセット(Ａ)〜(ＨＨ)をそれぞれに用いて増幅反応を
行う。詳しくは、図１に示すように、反応液Ｒ１ａ，Ｒ
１ｂ，Ｒ１ｃ…には、 (Ａ)，(Ｂ)，(Ｃ)…のプライマ
ーセットが添加されており、これらの反応液を共通の温
度サイクル条件Ｔ１下で制御することによって増幅反応
を行う。ここで温度サイクル条件Ｔ１は、そのアニーリ
ング温度が４５〜５５℃、好ましくは４８〜５５℃の範
囲内で設定される。

【００５３】次の第２段階では、第１段階の各反応液Ｒ
１ａ，Ｒ１ｂ，Ｒ１ｃ…を一部採取し、これを試料とし
て、表３及び表４に示す内側のプライマー（ネステッド
プライマー）のセット(ａ)〜(ｈｈ)をそれぞれに用い
る。詳しくは、反応液Ｒ２ａ，Ｒ２ｂ，Ｒ２ｃ…には、
(ａ)，(ｂ)，(ｃ)…のプライマーセットが添加されて
おり、これらの反応液を共通の温度サイクル条件Ｔ２下
で制御することによって、再度増幅反応を行う。ここで
温度サイクル条件Ｔ２は、そのアニーリング温度が５５
〜６５℃、好ましくは５５〜６２℃の範囲内で設定され
る。

【００５４】このように、複数種類のプライマーセット
を用いることにより、各プライマーセットについて特異
性の高い検出が可能となる。また、温度サイクル条件Ｔ
１，Ｔ２が、各プライマーセット間で共通化されている
ことから、その増幅反応を同時に行わせることができ、
検出操作の能率を向上させることができる。

【００５５】生成した増幅産物の検出は、電気泳動法又
はハイブリダイゼーション法により行う。電気泳動法で
は、エチジウムブロマイドなどにより泳動後のゲルを染
色し、表５乃至表７に示す鎖長を持つ増幅産物を検出す
ることにより、目的とする遺伝子が増幅されているかを
確認することができる。また、ハイブリダイゼーション
法では、その増幅産物に特異的なＤＮＡプローブを用い
ることによって検出することができる。

【００５６】以上のように、本実施形態の微生物の検出
方法によれば、広範囲の微生物を検出対象としながら、
複数種類のプライマーセットを用いて共通の条件下で同
時に増幅させることができる。また、ネステッドＰＣＲ
を適用することによって、きわめて高感度の検出が可能
であり、およそ１０〜１００cell／ｍｌという低濃度の
微生物の遺伝子を捕捉することができる。これらについ
ては、後述する実施例における実験結果によって証明す
る。

【００５７】本実施形態の微生物の検出方法は、前述し
たように生体試料中の微生物の存在（汚染）を検出する
といった目的に、特に好適に用いることができる。すな
わち、微生物の特定を特に迅速に行なう必要が有る場合
に、対象となる微生物の同定をきわめて簡便な操作によ
って調べることができる。

【００５８】ところで、上述した実施形態では、高感度
の検出を必要としない場合、例えば、微生物が高濃度に
含まれる試料について、その同定を主目的とするような
場合は、通常のＰＣＲ法による一段階のみの増幅反応で
十分である。したがって、まず第１段階の外側の増幅反
応を行い、ここで目的とする微生物の遺伝子が良好に増
幅されていると判断されれば、その後の第２段階を省略
しても差し支えない。この場合は、表５乃至表７におけ
る外側の増幅産物の鎖長を基に確認することによって、
目的とする増幅産物の確認を行うことができる。

【００５９】また、(Ａ)〜(ＨＨ)及び(ａ)〜(ｈｈ)のい
ずれか一方の組み合わせのプライマーセットにより、通
常の（一段階のみの）ＰＣＲ法を行うようにしてもよ
い。この場合、いずれの組み合わせのプライマーセット
を用いるかによって、温度サイクル条件を変更する必要
がある。すなわち、前者の場合はそのアニーリング温度
を４５〜５５℃の範囲内で、後者の場合は５５〜６５℃
の範囲内で設定する。

【００６０】また、(Ａ)〜(ＨＨ)（又は(ａ)〜(ｈｈ)）
の５７種類全てのプライマーセットを同時に使用する必
要はない。その都度、必要とされるプライマーセットを
取捨選択して使用すればよく、あるいは他種類の微生物
を検出するためのプライマーセットをさらに組み合わせ
ても構わない。

【００６１】本実施形態の微生物の検出方法を行ううえ
で必要な成分を、予めセットしたキットとして商業的に
供給することができる。例えば、表１乃至表４に示す各
プライマーセットを別々の容器の内部に予め付着させ、
この状態でユーザーに供給する。この場合、ユーザーは
試料とともにＰＣＲ反応に必要な酵素（Taqポリメラー
ゼ）やｄＮＴＰなどを含む緩衝液（ＰＣＲ反応液）をこ
の容器に入れ、ＰＣＲ装置にセットするだけでよい。Ｐ
ＣＲ反応液としては、市販されている様々なＰＣＲキッ
トからユーザーが適宜選択して用いることができる。

【００６２】なお、本発明の微生物の検出方法は、上述
した実施形態に限定されるものではなく、請求項に記載
された範囲を逸脱しない限りにおいて変更が可能であ
る。例えば、プライマーセットは標的とする微生物の遺
伝子を特異的に検出可能であれば、異なる塩基配列を持
つものであってもよい。また、例えば、検出対象とする
微生物は、検出の目的や測定しようとする試料の種類
（環境試料及び生体試料）などに応じて任意に選択すれ
ばよい。すなわち、本発明に基づく方法論は、プライマ
ーの塩基配列や微生物の種類、測定試料などに制限はな
く、あらゆるものを対象として適用可能である。ただ
し、測定に供する試料の種類によっては、増幅反応を阻
害するような不純物が反応液に混入する可能性がある。
このような場合は、ＰＣＲの実施に先立ち、試料から核
酸成分を抽出するとともに不純物を除去する前処理を入
念に施すことで、本発明の特徴である高い検出感度を維
持することができる。

【００６３】また、例えば、ホットスタートＰＣＲやリ
アルタイムＰＣＲ、マイクロプレートＰＣＲ、キャピラ
リーＰＣＲなど、他種類のＰＣＲの変法・改良法を、試
験の目的に応じて適宜利用してもよい。これによって、
本発明の応用範囲を様々な分野に広げることができる。

【００６４】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明はこの実施例で示す方法に限定されるも
のではない。本実施例では、表１乃至表４に示すプライ
マーセットの性能を確認するための試験を行った。供試
試料としてのプライマーセットは、表１乃至表４の塩基
配列を持つＤＮＡ断片を、定法にしたがって調製して用
いた。また、供試微生物としては、下記の表８及び表９
に示す基準株を用いた。これらを菌種に合わせた培地で
培養し、対数増殖期の菌体を滅菌超純水にて希釈して、
所定の濃度の菌液を調製した。

【００６５】

【表８】

【００６６】

【表９】

【００６７】実験の操作手順は、図１に示すようにＤＮ
Ａの抽出、ＰＣＲ反応、増幅産物の検出の各工程の順序
にしたがって行った。以下、各工程毎にその条件を記
す。

【００６８】ＤＮＡの抽出は、各微生物の菌液５００μ
ｌに、糞便中の非病原性微生物の代用として、E. Coli
ＤＨ５αの菌液を終濃度１０⁸cell／ｍｌになるように
添加し、１２０００×ｇにて１０分間遠心分離した。そ
して、上清を取り除いた後の沈さに、０．１ｍｍ径ガラ
スビーズ１００ｍｇおよび１ｍｍ径ジルコニアビーズを
１粒添加し、FastPrep mixer（フナコシ株式会社）を用
いて、speed=5.5,time=30の破砕条件にて物理的に細胞
を破砕した。

【００６９】そして、アクロモバクター属性溶菌酵素
（アクロモペプチターゼ）を終濃度５００μｇ／ｍｌに
なるように添加し、５５℃にて２０分間インキュベート
後、さらにＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を終濃度
２％、蛋白質分解酵素（proteinaseK）を終濃度５０μ
ｇ／ｍｌになるように添加し、５５℃にて２０分間イン
キュベートした。

【００７０】そして、１００℃で３分間加熱し、氷上で
１分間冷却後、塩化ナトリウムを終濃度２．５Ｍになる
ように添加し、よく懸濁したのち、室温にて２０分間静
地した。さらに、１２０００×ｇにて１０分間遠心分離
し、上清を除去後、ビーズに滅菌水１００μｌを添加・
攪拌したものを次工程のＰＣＲの試料として用いた。

【００７１】ＰＣＲ法による増幅反応は、ＰＣＲキット
としてHotStarTaq DNA polymerase（株式会社キアゲ
ン）を用いて行った。反応液の組成は、第１段階の増幅
反応の場合、１０μｌの試料に、４μｌの１０×ＰＣＲ
緩衝液（ｐＨ８．７）と、プライマーセット（終濃度
０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（同０．２５ｍＭ）、Taqポリ
メラーゼ（同０．０１２５unit／μｌ）、及びＭｇＣｌ
₂（同１．５ｍＭ）の各成分とを加え、全液量が２０μ
ｌとなるように滅菌超純水で希釈して調製した。また、
第２段階の増幅反応の場合は、第１段階の増幅反応によ
る反応液を１μｌ採取して試料とし、第１段階の増幅反
応と同様の組成の反応液を調製して用いた。

【００７２】ＰＣＲ装置として、GeneAmp PCR System 9
700（PERKIN ELMER Corporation）を用いて、次に示す
温度サイクル条件にて制御することにより行った。第１
段階の温度サイクルは、熱変性：９４℃／２０秒，アニ
ーリング：５０℃／３０秒，伸長反応：７４℃／４０秒
で行い、第２段階の温度サイクルは、アニーリングを６
０℃／３０秒に変更して行った。また、この温度サイク
ルを、第１段階及び第２段階のそれぞれについて３０サ
イクル繰り返して増幅反応を行った。

【００７３】ＰＣＲにより得られた増幅産物は、１％ア
ガロースゲルを用いた電気泳動法により泳動した後、エ
チジウムブロマイドにより染色してその鎖長を確認し
た。なお、各増幅産物の鎖長は表５乃至表７に示す数値
を基準とした。

【００７４】本実施例では、微生物の検出感度及び特異
性をそれぞれ確認するための試験を行った。検出感度の
試験は、表８及び表９に示す各微生物の基準株につい
て、２×１０⁷〜２cell／ｍｌ（ＰＣＲ反応液として１
０⁷〜１cell／ｍｌ）となるように段階希釈した菌液を
調製し、これを試料として、上記各工程の手順にしたが
って検出操作を行った。その実験の結果を表１０乃至表
１２に示す。ここで、それぞれの表中に菌数は”cell/
ｍｌ”の単位で示してある。また、各項目の”○”は、
検出有りを示し、”×”は、不検出を示している。表１
０乃至表１２から明らかな示されるように、ネステッド
ＰＣＲ法を用いることにより、検出感度を飛躍的に向上
させることが可能であり、いずれの微生物においても、
１０〜１００cell／ｍｌレベルでの検出が可能であっ
た。

【００７５】

【表１０】

【００７６】

【表１１】

【００７７】

【表１２】

【００７８】また、特異性の試験は、表８及び表９に示
す各微生物について同様に検出操作を行った。その実験
の結果を表１３乃至表１９に示す。ここで、表中のそれ
ぞれに項目に付された”○”は検出有りを示し、”×”
は不検出を示す。さらに、”−”は未検討のものを示し
ている。これにより、(Ａ)〜(ＨＨ）の各プライマーセ
ットを用いることによって、特異性の高い検出が可能な
ことが示された。すなわち、本発明に微生物検出用のプ
ライマーセットは、微生物の属、群、及び種のレベルで
特異的に検出することが可能であること、などが確認で
きた。なお、表中の”ＡＮ”は、検出の際に使用した各
プライマーセットのそれぞれの配列番号を示している。

【００７９】

【表１３】

【００８０】

【表１４】

【００８１】

【表１５】

【００８２】

【表１６】

【００８３】

【表１７】

【００８４】

【表１８】

【００８５】

【表１９】

【００８６】

【発明の効果】請求項１に記載の発明に係る微生物の検
出方法によれば、複数種類の微生物の遺伝子を共通の温
度サイクル条件で増幅することができる。そして、増幅
産物の生成の有無によって微生物の存在を確認すること
ができるとともに、その同定が増幅反応のレベルで可能
である。また、増幅反応の操作を共通化できるため、測
定操作の簡便性や経済性の点でも有利である。特に、人
体に下痢症状などの食中毒の原因菌となる多種類の病原
性微生物を対象とする検出系を構築することができる。
この検出系では各微生物を高感度で検出することがで
き、しかもその検出操作を迅速かつ簡便に行うことがで
きる。

【００８７】請求項２に記載の発明に係る微生物の検出
方法によれば、請求項１に記載の発明の効果に加え、病
原性微生物の検出系において、その感度や特異性をさら
に向上させることができる。

【００８８】請求項３に記載の発明に係る微生物の検出
用プライマーセットによれば、これらのプライマーセッ
トを用いて病原性微生物の検出系を構築することによ
り、請求項１または２に記載の発明の効果を奏すること
ができる。

【００８９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RAKAN Co., Ltd. Gifu University <120> Method for detecting microorganisms. <130> P01108 <140> <141> <160> 228 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas hydrophila <400> 1 gcgtctgaca gcgaagtg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas hydrophila <400> 2 tgactgtgtc catcgtgc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas spp. <400> 3 gggaaagtag cttgctac 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas spp. <400> 4 ctttcctcct cgctgaaa 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacillus cereus group <400> 5 caaaatctat gaatgcct 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacillus cereus group <400> 6 ctcttaattt agttaattct tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacteroides fragilis <400> 7 cgaagacggt gtatgtgatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacteroides fragilis <400> 8 cgcccagtat atgacctagt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni <400> 9 gatgtacact agttgttggg 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni <400> 10 aagctagcac cctcatat 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni/coli <400> 11 acgatgaagc ttctagct 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni/coli <400> 12 agtttaatgg ttaagcca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter spp. <400> 13 gtatagttaa tctgccctac 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter spp. <400> 14 tattccttag gtaccgtca 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 15 agttagagct agaaaaactg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 16 acttgaaatt aaagaattca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 17 ctgtaaggct aatacagatt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 18 aatactaagt tagggttttt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 19 ttcagatcct gttgataata 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 20 tcaaaagtat taattggagt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 21 ggtattattt tgaaaatgat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 22 ggttttaaca atacttctga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 23 tctttaattt ctacagcaat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 24 ttattaagca tttagttagc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 25 ttataatgat cctgttaatg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 26 atctggagta 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 32 tatatccata aggaaatgga at 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 33 cttttatgga acaatgtatt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 34 ataaatttcc caaccacaat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium butyricum <400> 35 gttgtcaaga attttataaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium butyricum <400> 36 aatagtatgt cttggctacc 20 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 37 gtctttcaag tcaggagt 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 38 actcttgcga gcgtactt 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 39 agaagagtta ataaaactcg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 40 tcactatcat accacagttt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 41 gtcagagaat actgtagtcg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 42 ttgctgattc tactacagtt 20 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 43 taacacgtgg gtaacctg 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 44 tccttgggta ccgtcatt 18 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 45 tttaagtgat ggattatatg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 46 tcagagatat taccatgaga 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 47 ctgctgtaca agctgctatc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 48 caacagcaga cacattcaag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Entamoeba histolytica <400> 49 tcaagagaaa gaatgttgta 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Entamoeba histolytica <400> 50 cctactcctc ctttactttt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 51 ctggcgaaag actgtatcat 20 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 52 caatgtatag aaatccgctg tt 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 53 gaacgatatc ctcatcgcct 20 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 54 atcgctttca ggtcgcgagt gacggc 26 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EIEC) <400> 55 tatatctact cttgatgcca 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EIEC) <400> 56 ttttatttct tcctttaata 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 57 tgtcagaggg atagatcc 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 58 aaatcccctc tgtatttg 18 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 59 tggagttcag tggtaataca 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 60 tgtattactt tcccataatg 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 61 cagatatatg gatggtatcg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 62 ctgcctctta acttttgatt 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 63 tctgtattgt ctttttcacc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 64 agcaggatta caacacaatt 20 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 65 ccggaggtaa tatgaaga 18 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 66 atttattcaa caaagcaaca 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 67 aacattgatt atgcttagtg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 68 tagtcagttt attcgtgtga 20 <210> 69 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Giardia lamblia group <400> 69 gacgctctcc ccaagga 17 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Giardia lamblia group <400> 70 gaattaccgc ggctgctg 18 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 71 atcgataagt atatacaagg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 72 attccatctt tccactaatg 20 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 73 taccaatagc acaacaaa 18 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 74 ctggatatgt taggctcg 18 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Plesiomonas shigelloides <400> 75 taacacagag gagcttgc 18 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Plesiomonas shigelloides <400> 76 atgccactag gtattaact 19 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 77 gccatgctgt tcgatgatat 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 78 ttactcactc cctgaatctg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 79 ttctacattg acagaatcct 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 80 tcacctttga taaacttcat 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella typhi <400> 81 attaggttat ttcagcataa 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella typhi <400> 82 tttactatat ccttacggtt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Shigella flexneri <400> 83 taaatggaga aattatttca 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Shigella flexneri <400> 84 atggtcatat tgctaccatt 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 85 gcaatcttaa acaaatctat 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 86 tatttttcct gtaaataacg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 87 gaaaatatga aagttttgta 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 88 aataaatttt taccatcttc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 89 gatgatcatt atgtatcagc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 90 gttcttgagc tgttacactt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 91 atttaacatt cttattgcat 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 92 atcttatagg gtaaacatct 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 93 atcttaggca aatttattat 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 94 ttatataaac caaattttcc 20 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 95 ttgctccctg tgattagt 18 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 96 gccaaaagag gtttacaa 18 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 97 ccctaacttt gggataac 18 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 98 tttctgcagg taccgtca 18 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae <400> 99 gaggtactca aatgaatatc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae <400> 100 attactcatc gatgatcttg 20 <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae/mimicus <400> 101 taaccattgg aaacgatg 18 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae/mimicus <400> 102 aatgattaag gtattaactt 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio fluvialis <400> 103 cagcgacaac attgaacctt 20 <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio fluvialis <400> 104 agctaacgtc aaaagata 18 <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus <400> 105 ggaaacgagt tatctgaa 18 <210> 106 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus <400> 106 gtcaaatgat ggtgctat 18 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus group <400> 107 gttctgatga gatattgttt 20 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus group <400> 108 tatatccata aggaaatgga at 22 <210> 109 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio spp. <400> 109 taaccattgg aaacgatg 18 <210> 110 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio spp. <400> 110 cttaacaaac cacctgca 18 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica <400> 111 gtgagtaatg tctgggaaac t 21 <210> 112 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica <400> 112 gtaacgtcaa tccaacaa 18 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica group <400> 113 ataccgcata acgtcttc 18 <210> 114 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica group <400> 114 taacgtcaat ccaacaac 18 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas hydrophila <400> 115 tgctggcgac gctgattg 18 <210> 116 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas hydrophila <400> 116 tcttgcctgc ctgcatgc 18 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas spp. <400> 117 ataacagttg gaaacgactg 20 <210> 118 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Aeromonas spp. <400> 118 ggctgcatca gggtttcc 18 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacillus cereus group <400> 119 ctgttacttg ggatacgaaa gt 22 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacillus cereus group <400> 120 tctattagtt gttgtgcata ct 22 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacteroides fragilis <400> 121 cgaactcggt ttatgcagtt 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Bacteroides fragilis <400> 122 ccgaagccgt attcacatta 20 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni <400> 123 catctcagta atgcagctaa cg 22 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni <400> 124 gcaccctcat atctctataa gg 22 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni/coli <400> 125 cctgcttaac acaagttgag 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter jejuni/coli <400> 126 cgtcagaatt cttccctaag 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter spp. <400> 127 cggtgtagga tgagactata 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Campylobacter spp. <400> 128 ccagtgtgac tgatcatcct 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 129 gccagagaga tattatggcg 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 130 ttccccagcg ttagtactat 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 131 atcaagttcc cggtaacggt 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 132 ttgaatcttg aagcgctgat 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 133 cactagctaa tgagcctgaa 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 134 gggtatatct gtcgaaagtc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 135 aagtctgcaa gatggattgg 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 136 cccagtaaag cttaattcct 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 137 caagtaccat tccatttcct 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 138 accattctca gcatcattct 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 139 gattttcatc cgcctacttc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 140 tccctcctga aagattatta 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 141 ctctactaac cgcaaccagt 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 142 acggatgcag tcgatgatag 20 <210> 143 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 143 ctaattttct ttcacaagat agtg 24 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 144 tatatccata aggaaatgga at 22 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 145 ctaattttct ttcacaagat agtg 24 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 146 tatatccata aggaaatgga at 22 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 147 gattatgcaa aatagtttta g 21 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium botulinum <400> 148 tttctcaacc aaaaataaat tg 22 <210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium butyricum <400> 149 caagattttc atccgcgcct ac 22 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium butyricum <400> 150 gcatcaccaa tatggaattg 22 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 151 ctcttgaaac tgggagactt ga 22 <210> 152 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 152 taacccccga acacctag 18 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 153 cttcaagcag aaatagagca 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 154 gcccattgtt ttatgtattc 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 155 tctggtagaa ataaagcctt 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium difficile <400> 156 gtgtttatca aaaatgcatt 20 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 157 cgcataatgt tgaaagatgg c 21 <210> 158 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 158 acgcatcgtc gccttggt 18 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 159 ggagatggtt ggatattagg 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Clostridium perfringens <400> 160 ggaccagcag ttgtagatac 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 161 atggtgagca atcctctgcc 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 162 ccgaggagat ggttatcctt 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Entamoeba histolytica <400> 163 gcacaaattg gaaaagaagc 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Entamoeba histolytica <400> 164 tcacaccatg cttgatgaca 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 165 tagggttagg gcagtatata 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 166 ctctcgagca tcaacatcag 20 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 167 tgccatcaac acagtatatc c 21 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EaggEC) <400> 168 agtccttcca tgacacgaag 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EIEC) <400> 169 caaaagagca tagcatccga 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EIEC) <400> 170 cgcgattgga aatagagata 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 171 ctacggctta ttgttgaacg 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 172 gaggttccac tatgcgacat 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 173 cactgtcaca gcagaagcct 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(EHEC) <400> 174 gccagttatc tgacattctg 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 175 cagggaatat agagaccggt 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 176 gtgctcagat tctgggtctc 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 177 cgctcaggat gctaaaccag 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli(ETEC) <400> 178 attcatgctt tcaggaccac 20 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 179 ctgtattgtc tttttcacct t 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 180 agacatcatc agaatcagaa c 21 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 181 tgatagctat cagaatcgcc 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli <400> 182 caagaggtgc cgaacctaaa 20 <210> 183 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Giardia lamblia group <400> 183 ccctgctagc cggacacc 18 <210> 184 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Giardia lamblia group <400> 184 atgtgcgggc cgtctctc 18 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 185 ataccacgga gatgcagtga 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 186 cttgattagt cattcctggc 20 <210> 187 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 187 catccatggc accaccaa 18 <210> 188 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Listeria monocytogenes <400> 188 cggcacattt gtcactgc 18 <210> 189 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Plesiomonas shigelloides <400> 189 gataactacg ggaaactgta gc 22 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Plesiomonas shigelloides <400> 190 ccagtgtgac tggtcattct 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 191 aaatcgcctc cagctgatcc 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 192 gcgaatgaga cgcttaagcg 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 193 ttgaagccga tgccggtgaa 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella spp. <400> 194 gcgcagcatc cgcatcaata 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella typhi <400> 195 tcatcatttc tggcctccga 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Salmonella typhi <400> 196 cgcatcgaaa acagcaataa 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Shigella flexneri <400> 197 caacaaaggg actatttccg 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Shigella flexneri <400> 198 agccatcata accataaccg 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 199 ttttacagat cattcgtggt 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 200 tgatcggcac ttttttctct 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 201 tatgataatg ttcgagtcga 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 202 cccgaacagt aatacttcta 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 203 tgtagataaa tttttggcac 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 204 caaagtggtt tccttcatgt 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 205 ctcctttaaa cgttaaagcc 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 206 ccatttcttt tgaattgaag 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 207 ttttcacagg tcatccatgg 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Staphylococcus aureus <400> 208 cggtcaatcg gttattatca 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 209 cctaactttg ggataacttc 20 <210> 210 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 210 ggctacccgt cgatgcctt 19 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 211 ataccaaata cgacccatga 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Tropheryma whippelii (Whipple Disease) <400> 212 gtaccgtcac tttcgcttct 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae <400> 213 tgcaagagga actcagacgg 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae <400> 214 cccacctaaa gcagaaactt 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae/mimicus <400> 215 taataccgca taacctcgca 20 <210> 216 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio cholerae/mimicus <400> 216 gctgcatcag gcttgcgc 18 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio fluvialis <400> 217 atgcctggga aattgccctg 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio fluvialis <400> 218 gatacctcct tcctcactgc 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus <400> 219 tgatagcttc ggcttaaaga 20 <210> 220 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus <400> 220 ccaccttcct cacggctg 18 <210> 221 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus group <400> 221 tatatccata aggaaatgga at 22 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio parahaemolyticus group <400> 222 gctacagaat tataggaatg ttg 23 <210> 223 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio spp. <400> 223 aacgatggct aataccgc 18 <210> 224 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Vibrio spp. <400> 224 catcaggctt gcgcccat 18 <210> 225 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica <400> 225 taccgcataa cgtcttcg 18 <210> 226 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica <400> 226 gttattggcc ttcctcct 18 <210> 227 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica group <400> 227 ataacgtctt cggaccaa 18 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Primer Sequence for Yersinia enterocolitica group <400> 228 aacgtattaa gttattggcc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態における微生物の検出操作
の概要を示す説明図である。

【符号の説明】

Ｒ１ａ，Ｒ１ｂ，Ｒ１ｃ，… ＰＣＲ反応液（第１段
階）Ｒ２ａ，Ｒ２ｂ，Ｒ２ｃ，… ＰＣＲ反応液（第２段
階）Ｔ１温度サイクル条件（第１段階）Ｔ２温度サイクル条件（第２段階）

フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA12 HA19 HA20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ05 QR08 QR32 QR42 QR62 QS25 QS34 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】所定の分類範囲において特異的かつ普遍
的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標的とするプライ
マーを用いて、前記分類範囲に属する前記微生物の前記
遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の増幅反応
における温度サイクル条件を予め一定条件に設定すると
ともに、その設定条件下で、標的とされる前記遺伝子が
増幅されるように設計されたプライマーセットを、検出
対象とする複数種類の前記微生物のそれぞれについて調
整する工程と、検出対象とされる前記微生物のうち少なくとも一つを含
む試料について、調整された前記プライマーセットをそ
れぞれ用いて、設定された前記温度サイクル条件に基づ
いて増幅反応を行なう工程とを備え、下記の（Ａ）〜（ＨＨ）からなるイ群、及び（ａ）〜
（ｈｈ）からなるロ群より選択される複数種類の前記プ
ライマーセットを用いた微生物の検出方法。イ群：（Ａ）エロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophi
la）を検出するための配列番号１及び配列番号２に示す
塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｂ）エロモナス（Aeromonas）属を検出するための配
列番号３及び配列番号４に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット、（Ｃ）バシラス・セレウス（Bacillus cereus group）
群を検出するための配列番号５及び配列番号６に示す塩
基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｄ）バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragi
lis）を検出するための配列番号７及び配列番号８に示
す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｅ）カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter
jejuni）を検出するための配列番号９及び配列番号１０
に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｆ）カンピロバクター・ジェジュニ／コリ（Campylob
acter jejuni/coli）を検出するための配列番号１１及
び配列番号１２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライ
マーセット、（Ｇ）カンピロバクター（Campylobacter）属を検出す
るための配列番号１３及び配列番号１４に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｈ）クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium bo
tulinum)を検出するための配列番号１５乃至配列番号３
４に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｉ）クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium bu
tyricum）を検出するための配列番号３５及び配列番号
３６に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｊ）クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium
difficile）を検出するための配列番号３７乃至配列番
号４２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｋ）クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostr
idium perfringens）を検出するための配列番号４３乃
至配列番号４６に示す塩基配列をそれぞれに持つプライ
マーセット、（Ｌ）クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporid
ium parvum）を検出するための配列番号４７及び配列番
号４８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｍ）エントアメーバ・ヒストリティカ（Entamoeba hi
stolytica）を検出するための配列番号４９及び配列番
号５０に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｎ）腸管凝集付着性大腸菌（Escherichia coli(EaggE
C)）を検出するための配列番号５１乃至配列番号５４に
示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｏ）腸管組織侵入性大腸菌（Escherichia coli(EIE
C)）を検出するための配列番号５５及び配列番号５６に
示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｐ）腸管出血性大腸菌（Escherichia coli(EHEC)）を
検出するための配列番号５７乃至配列番号６０に示す塩
基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｑ）毒素原性大腸菌（Escherichia coli(ETEC)）を検
出するための配列番号６１乃至配列番号６６に示す塩基
配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｒ）大腸菌（Escherichia coli）の病原因子の一つで
あるインティミン（intimin（接着因子））産生遺伝子
（eaeA）を検出するための配列番号６７及び配列番号６
８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｓ）ギアルディア・ランブリア（Giardia lamblia）
を検出するための配列番号６９及び配列番号７０に示す
塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｔ）リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monoc
ytogenes）を検出するための配列番号７１乃至配列番号
７４に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｕ）プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas sh
igelloides）を検出するための配列番号７５及び配列番
号７６に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｖ）サルモネラ（Salmonella）属を検出するための配
列番号７７乃至配列番号８０に示す塩基配列をそれぞれ
に持つプライマーセット、（Ｗ）サルモネラ・タイフィ（Salmonella typhi）を検
出するための配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基
配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｘ）シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）を
検出するための配列番号８３及び配列番号８４に示す塩
基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（Ｙ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococc
us aureus）を検出するための配列番号８５乃至配列番
号９４に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（Ｚ）トロフェリマ・ウィッペリ（Tropheryma whippel
ii(Whipple Disease））を検出するための配列番号９５
乃至配列番号９８に示す塩基配列をそれぞれに持つプラ
イマーセット、（ＡＡ）ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）を検出
するための配列番号９９及び配列番号１００に示す塩基
配列をそれぞれに持つプライマーセット、（ＢＢ）ビブリオ・コレラ／ミミカス（Vibrio cholera
e/mimicus）を検出するための配列番号１０１及び配列
番号１０２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマー
セット、（ＣＣ）ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）
を検出するための配列番号１０３及び配列番号１０４に
示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット、（ＤＤ）ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parah
aemolyticus group）群を検出するための配列番号１０
５及び配列番号１０６に示す塩基配列をそれぞれに持つ
プライマーセット、（ＥＥ）ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parah
aemolyticus）を検出するための配列番号１０７及び配
列番号１０８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマ
ーセット、（ＦＦ）ビブリオ（Vibrio）属を検出するための配列番
号１０９及び配列番号１１０に示す塩基配列をそれぞれ
に持つプライマーセット、（ＧＧ）エルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia e
nterocolitica）を検出するための配列番号１１１及び
配列番号１１２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライ
マーセット、（ＨＨ）エルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia e
nterocolitica group）群を検出するための配列番号１
１３及び配列番号１１４に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット。ロ群：（ａ）エロモナス・ヒドロフィラを検出するための配列
番号１１５及び配列番号１１６に示す塩基配列をそれぞ
れに持つプライマーセット、（ｂ）エロモナス属を検出するための配列番号１１７及
び配列番号１１８に示す塩基配列をそれぞれに持つプラ
イマーセット、（ｃ）バシラス・セレウスを検出するための配列番号１
１９及び配列番号１２０に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット、（ｄ）バクテロイデス・フラジリスを検出するための配
列番号１２１及び配列番号１２２に示す塩基配列をそれ
ぞれに持つプライマーセット、（ｅ）カンピロバクター・ジェジュニを検出するための
配列番号１２３及び配列番号１２４に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｆ）カンピロバクター・ジェジュニ／コリを検出する
ための配列番号１２５及び配列番号１２６に示す塩基配
列をそれぞれに持つプライマーセット、（ｇ）カンピロバクター属を検出するための配列番号１
２７及び配列番号１２８に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット、（ｈ）クロストリジウム・ボツリナムを検出するための
配列番号１２９乃至配列番号１４８に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｉ）クロストリジウム・ブチリカムを検出するための
配列番号１４９及び配列番号１５０に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｊ）クロストリジウム・ディフィシレを検出するため
の配列番号１５１乃至配列番号１５６に示す塩基配列を
それぞれに持つプライマーセット、（ｋ）クロストリジウム・パーフリンジェンスを検出す
るための配列番号１５７乃至配列番号１６０に示す塩基
配列をそれぞれに持つプライマーセット、（ｌ）クリプトスポリジウム・パルブムを検出するため
の配列番号１６１及び配列番号１６２に示す塩基配列を
それぞれに持つプライマーセット、（ｍ）エントアメーバ・ヒストリティカを検出するため
の配列番号１６３及び配列番号１６４に示す塩基配列を
それぞれに持つプライマーセット、（ｎ）腸管凝集付着性大腸菌を検出するための配列番号
１６５乃至配列番号１６８に示す塩基配列をそれぞれに
持つプライマーセット、（ｏ）腸管組織侵入性大腸菌を検出するための配列番号
１６９及び配列番号１７０に示す塩基配列をそれぞれに
持つプライマーセット、（ｐ）腸管出血性大腸菌を検出するための配列番号１７
１乃至配列番号１７４に示す塩基配列をそれぞれに持つ
プライマーセット、（ｑ）毒素原性大腸菌を検出するための配列番号１７５
乃至配列番号１８０に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット、（ｒ）大腸菌の病原因子の一つであるインティミン産生
遺伝子を検出するための配列番号１８１及び配列番号１
８２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセッ
ト、（ｓ）ギアルディア・ランブリアを検出するための配列
番号１８３及び配列番号１８４に示す塩基配列をそれぞ
れに持つプライマーセット、（ｔ）リステリア・モノサイトゲネスを検出するための
配列番号１８５乃至配列番号１８８に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｕ）プレジオモナス・シゲロイデスを検出するための
配列番号１８９及び配列番号１９０に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｖ）サルモネラ属を検出するための配列番号１９１乃
至配列番号１９４に示す塩基配列をそれぞれに持つプラ
イマーセット、（ｗ）サルモネラ・タイフィを検出するための配列番号
１９５及び配列番号１９６に示す塩基配列をそれぞれに
持つプライマーセット、（ｘ）シゲラ・フレクスネリを検出するための配列番号
１９７及び配列番号１９８に示す塩基配列をそれぞれに
持つプライマーセット、（ｙ）スタフィロコッカス・アウレウスを検出するため
の配列番号１９９乃至配列番号２０８に示す塩基配列を
それぞれに持つプライマーセット、（ｚ）トロフェリマ・ウィッペリを検出するための配列
番号２０９乃至配列番号２１２に示す塩基配列をそれぞ
れに持つプライマーセット、（ａａ）ビブリオ・コレラを検出するための配列番号２
１３及び配列番号２１４に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット、（ｂｂ）ビブリオ・コレラ／ミミカスを検出するための
配列番号２１５及び配列番号２１６に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット、（ｃｃ）ビブリオ・フルビアリスを検出するための配列
番号２１７及び配列番号２１８に示す塩基配列をそれぞ
れに持つプライマーセット、（ｄｄ）ビブリオ・パラヘモリティカスを検出するため
の配列番号２１９及び配列番号２２０に示す塩基配列を
それぞれに持つプライマーセット、（ｅｅ）ビブリオ・パラヘモリティカス群を検出するた
めの配列番号２２１及び配列番号２２２に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット、（ｆｆ）ビブリオ属を検出するための配列番号２２３及
び配列番号２２４に示す塩基配列をそれぞれに持つプラ
イマーセット、（ｇｇ）エルシニア・エンテロコリティカを検出するた
めの配列番号２２５及び配列番号２２６に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット、（ｈｈ）エルシニア・エンテロコリティカ群を検出する
ための配列番号２２７及び配列番号２２８に示す塩基配
列をそれぞれに持つプライマーセット。
【請求項２】前記イ群より選択されるプライマーセッ
トとともに、前記ロ群より選択されるプライマーセット
をネステッドプライマーとして用いることを特徴とする
請求項１に記載の微生物の検出方法。
【請求項３】請求項１に記載の各群より選択される複
数種類のプライマーセットで構成されることを特徴とす
る微生物の検出用プライマーセット。