JP2006141292A

JP2006141292A - 微生物の破砕・核酸抽出方法、この方法を用いたキット、及びその製造方法

Info

Publication number: JP2006141292A
Application number: JP2004336245A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Ezaki; 孝行江崎; Takakore Kimoto; 考是木本
Original assignee: AMR KK; Gifu University NUC
Current assignee: AMR KK; Gifu University NUC
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2006-06-08

Abstract

【課題】遺伝子検査のための検体処理を行うに際し、従来法では十分に破砕・核酸抽出を行い難かったカビ・グラム陽性菌等の菌類を含む微生物を、簡便、迅速、かつ高効率に破砕し、その核酸を抽出する方法等を提供することにより、少数の微生物に対しても遺伝子検出感度を上げる方法等を提供すること。
【解決手段】微生物の有無を確認するための検体に、検体溶解処理用液を混合して処理液とし、この処理液と大小２種類の大きさのジルコニアビーズとを空き空間容量を充分に確保したチューブに混合し、このチューブに物理的衝撃を加えて細胞破砕処理を行う。この破砕処理後の処理液に、界面活性剤を含む溶液を混合、加熱処理し、フェノール／クロロホルム処理を行った後に、上清を回収し、エタノール沈殿処理により核酸を回収する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物を効率よく破砕し、その核酸を抽出する方法等に関するものである。

細菌、カビ等の微生物の細胞を破砕する技術の現状は、次の（１）〜（３）の通りである。すなわち、（１）細胞の破砕にガラスビーズ、又はジルコニウム（Zirconium）ビーズを使用した破砕方法は既に研究者の間では一般的に実施されており、ガラスビーズキットは国外では既に販売されている。（２）米国においては、２種類の粒子サイズの異なった小さなガラスビーズとテトラフルオロエチレンで表面をコートした大きな磁性ビーズを混在させて破砕する製品が販売されている。（３）ガラスビーズより密度が高いジルコニウムビーズはガラスより破砕効率が良いというのは周知の事実で、破砕キットが日本国内で販売（例：安井機器、大阪）されている。
これらの技術は大量の菌を使用して破砕する技術として認識されており、臨床材料のような微量に病原体が存在する材料については、物理的破砕法を導入したキットは販売されていない。

上記従来法とその問題点については、次の通りである。カビ、グラム陽性菌のように細胞壁が強固な細胞については、グラム陰性菌に適用される界面活性剤を用いた方法では、十分な RNA/DNA の回収ができない。そこで特定の Achromopeptidaseや Labiase, Lysozymeといったグラム陽性菌を溶解する酵素が使用されるが、これらの酵素は特定の構造をもった菌種には有効であるが、すべての微生物にたいしては有効ではない。

そこで微生物の細胞から RNA/DNA を同時に抽出する方法として、高濃度のGuanidium塩、及び SDS、 Triton x100などの界面活性剤の存在下で細胞を変性させる方法が使われている。これらの方法は、グラム陰性菌には極めて有効であるが、グラム陽性菌やカビには十分な溶菌効果を発揮できない。
そこでどの菌にも有効な方法として物理的な破砕方法が開発され、超音波破砕や、ガラスビーズによる破砕が推奨されてきた。特にガラスビーズは DNAを吸着することから破砕後、ビーズに破砕した菌の DNAを吸着させて精製する方法が一般に利用されている。

しかしながら、ガラスビーズを用いても、黄色ブドウ球菌、芽胞を形成する菌、或いはカビの細胞を効率良く破砕することは困難であり、しかもこの方法は菌が大量にある場合の破砕方法であって、臨床材料に微量に存在する黄色ブドウ球菌や芽胞を形成する菌、あるいはカビの細胞を効率良く破砕することはできず、遺伝子検査の感度を上げる障害になっていた。
更に、ある病気が発生した場合に、その原因となる微生物を特定するのに際しては、病原微生物が不明な状態から同定を開始しなければならない。従って、標的候補として遺伝子増幅可能なプライマーセットを網羅的に準備しておき、病原微生物の核酸を抽出した後に、これを増幅反応液中に添加してＰＣＲ等遺伝子増幅反応を行うことになる。こうした場合、病原微生物毎の核酸抽出効率に差があるために、混入数が同程度であっても、ある病原微生物では検出できるが、別の病原微生物では、検出できないといった事態が起こり得る。すると、不明な病原微生物を特定しようとする場合、その微生物の破砕及び核酸抽出操作を一律に行えないことになってしまう。これでは、広く網羅的に病原微生物を特定できる遺伝子操作の可能性に対して、足枷をはめることになってしまう。この様な事態を少なくし、菌種が異なったとしても、高い効率で微生物を破砕し、核酸を抽出可能な方法を確立することが望ましい。

基礎研究では、上記問題への対策として、検体容量を大きくすることが可能であるものの、単に検体容量を大きくすると取り扱いの簡便さが失われてしまうという欠点が生じる。すなわち、検体容量が大きくなると、遠心濃縮するにしても機械が大掛かりなものとなり、簡便な微量高速遠心機では扱いきれなくなる。その結果、多数の検体を扱うにはたいへん不向きになってしまう。また、ＰＣＲの反応液量は今や 25μL以下なので、あまりに大量の検体容量からその液量までに濃縮するには操作が煩雑になることは避けられない。臨床検査では、扱う検体容量の多さや操作の煩雑さは運用コスト増にもつながるため、これを避けることが望まれる。そこで、検体容量の増加をできるだけ回避しつつ、核酸の抽出効率を上げ、最終的な遺伝子検出感度を上げる事が望まれている。

この問題に対処する為、これまで多くの試みが為されている。その一つとして、ガラスビーズよりも密度の高いジルコニウムを用いる方法が開発されてきている。 Hurley, S. S.らは核酸抽出のフェノールとジルコニウムビーズを加え、激しく震盪して細胞壁の物理的破砕を行うことを組み合わせた方法を記載している（非特許文献１）。彼女らが使用したのはバイオスペック・プロダクツ社のＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒという機械で震盪させるもので、１.５ｍＬのスクリューキャップ付チューブにミコバクテリア属の菌の５０％懸濁液を５００〜６００マイクロリットル、及び等量のトリス−ＥＤＴＡ飽和フェノール溶液を加え（即ち１.０〜１.２ｍＬになる）、これに直径０.１ｍｍのジルコニウムビーズをチューブに満たし、３分間振盪後、遠心して水層のＤＮＡを回収するものである。

これは、バイオスペック・プロダクツ社のＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒの使用法を基に容器を遠心チューブにし、フェノール溶液を加える改良を施したもので、基のバイオスペック・プロダクツ社（http://www.biospec.com/）の操作方法では、２ｍＬスクリューキャップ付バイアルに１／２〜３／４量のビーズを詰め、残りの空間をバッファーと検体で埋め、できるだけ空気を除くとされている。ビーズの粒径は、細菌には０.１ｍｍ、酵母には０.５ｍｍ、植物や動物組織片には１.０ｍｍか２.５ｍｍのものが適切なサイズと書かれている。）

また、Shah, J. S. らは、グアニジンチオシアン酸塩で熱処理してジルコニアビーズで物理的破砕を行っている（非特許文献２）。この論文では、０.５ｇの酸化ジルコニウム（ジルコニア）ビーズが入ったプロセシング・チューブ内に、２５０μＬの検体と４００μＬの５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、１００ｍＭトリスｐＨ７.８、４０ｍＭＥＤＴＡ、１.０％Ｓａｒｋｏｓｙｌが入ったプロセシング・バッファーを容れて、又はその２倍量（合計約１.６ｍＬ）で、ＧＥＮＥ−ＴＲＡＫＳａｍｐｌｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒという機械を使って、６分間振盪させている。彼らはこの方法で、コピー数の多いＲＮＡを抽出することに成功している。

しかし、ＲＮＡを抽出する方法は、ＤＮＡを抽出する方法に比べると、簡便性と安定性に欠けたものと成らざるを得ない。一方、ＲＮＡより取り扱い易いものの、個体に１コピーしかないＤＮＡに関しては該論文の目的外で記載されていない。同じＧＥＮＥ−ＴＲＡＫ社の１９９１年の論文（非特許文献３）では、ＤＮＡを抽出しているが、０.２ｍＬのトリス−マグネシウム−塩化カリウムのバッファーに懸濁した検体、０.１ｍＬの０.１ｍｍガラスビーズ、１０μＬのＳＤＳ、および約２００μＬの上述バッファー飽和フェノールを、５００μＬのマイクロ遠心チューブ一杯に容れ、それを２ｍＬチューブに入れてＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒで振盪している。

また、特開平５−６８５５３（特許文献１）では、ガラスビーズの存在下で超音波処理する方法を開示されている。しかし、その実施例は、菌数７×１０^８／ｍＬの溶液を１ｍＬ使用して行われたものであり、少ない菌数に対する抽出効率を示したものではない。更に、ガラスビーズを用いた微生物破砕方法が開示されているものの、十分に満足のできる効果を上げられるものは知られていない（特許文献２、３）。

しかし、一方で破砕効率を上げるために、大小２種類の破砕用物体を添加する例もある（ QBIOGENE: http://qbiogene.com/technical/protocols/fastprep/, FastDNA^R Kit、FastRNA^R Pro Blue Kit、FastRNA^RPro Red Kit、及び http://qbiogene.com/fastprep/lysing_tubes.shtml）。

しかしながら、上記各方法によっても、黄色ブドウ球菌、芽胞を形成する菌、或いはカビの細胞を効率良く破砕することは困難であり、遺伝子検査の感度を上昇させるための障害であることに変わりがなかった。
特にジルコニウムは、ＤＮＡの吸着能力がガラスビーズに比べると非常に低いことから、従来のガラスビーズとは異なるＤＮＡの精製方法が必要となる。また、非常に高い感度が必要となる臨床検査では、従来のジルコニウムを用いた方法を更に改良する必要があった。

特開平５−６８５５３号公報特開平１０−４９４９号公報特開２００１−１７１６８号公報 J. Clin. Microbiol. 25 (11) 2227-2229(1987） J. Clin. Microbiol. 33 (2) 322-328(1995） Weisburg, W. G.ら、Journal of Bacteriology. Vol.173, ｐ.697-703

本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子検査のための検体処理を行うに際し、従来法では十分に破砕・核酸抽出を行い難かったカビ・グラム陽性菌等の菌類を含む微生物を、簡便、迅速、かつ高効率に破砕し、その核酸を抽出する方法等を提供することにより、少数の微生物に対しても遺伝子検出感度を上げる方法等を提供することである。
更に、本発明によれば、核酸抽出効率を上げることで、病原微生物が解らない段階であっても、一定量の検体を処理し、遺伝子増幅法で検出可能なレベルまで効率良く核酸抽出できるので、遺伝子診断の有用性が高められる。

課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果

本発明者らは、鋭意検討の結果、微生物からの核酸抽出操作中において、微生物の種類により効率が著しく変化する細胞破砕の段階を飛躍的に上昇させることに成功し、少ない病原体数でも遺伝子検出感度を上げることに成功した。
特に、下記５つの要件が、微生物を効率良く破砕し、その核酸抽出効率を増加させることを見出した。
すなわち、（１）処理液（検体に、必要に応じて検体溶解処理用液を混合した液）とビーズとを混合し、物理的衝撃を加えて破砕処理を行う際に、細胞破砕用ビーズとして、通常サイズの大きさのものと、それよりも大きい約４ｍｍ〜約７ｍｍのサイズのものとの少なくとも二種類を用いる（以下、「要件（１）」という）。

（２）物理的衝撃を加える際には、処理液／ビーズの容量比が１よりも小さくなる状態とする（すなわち、ビーズ容量が処理液容量よりも大きくなる状態とする）（以下、「要件（２）」という）。
（３）処理液及びビーズを加えた合計容量が、容器の全容量（以下、「容器容量」という）の少なくとも３／８以下とし、細胞破砕処理時の容器の空間容量（容器容量−処理液及びビーズの合計容量）を容器容量の５／８以上にする（以下、「要件（３）」という）。

（４）処理液とビーズとを混合して、物理的衝撃を加える際には、実質的に界面活性剤を含ませない状態とする（以下、「要件（４）」という）。「実質的に」とは、検体中に内在性の界面活性剤成分があったとしても無視できるほど、使用する試薬類から界面活性剤を持ち込まないことにより、実質的に界面活性剤を含ませない条件で、細胞破砕処理を行うことが可能である。数値的な限定条件を示すことは困難であるが、いわゆる遺伝子工学的に用意された試薬を用いることにより、実質的に界面活性剤を含ませない上程で、細胞破砕処理を行うことが可能である。
（５）上記要件（４）を実施する際には、細胞破砕後に、界面活性剤を添加し、核酸抽出操作を行う（以下、「要件（５）」という）。
以上５つの要件は、一つを用いた場合であっても従来の方法に比べて有効であるが、二つ以上を任意に組み合わせて実施することもできる。

これらの改良を加えた結果、微生物からの核酸の抽出効率が、従来の方法に比較すると、約１０００倍〜１００００倍にも上昇した。本発明に係る核酸抽出法、細胞破砕用ビーズ充填容器キット、及び細胞破砕用ビーズ充填容器を含めた核酸抽出キットの詳細を以下に説明する。
本発明において、微生物とは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌を含む細菌、ウィルス、カビ、細菌・ウィルス等の宿主細胞である動物細胞、及びヒト細胞を含む。

細胞破砕とは、細胞内容物が外部に取り出せる程度に細胞壁を破壊することを意味する。但し、その指標は、便宜上ＤＮＡ又はＲＮＡの核酸を抽出した回収率で見積もる。一般的に、本発明の属する技術分野においては、ビーズによる細胞破砕は、容器容量が２ｍＬ程度の容器で行うのが効率が良いとされていることから、本明細書中に記載された数値は、特に断らない限り、このスケールで打ち出されたものである。本発明の実施において、スケールを変更する場合には、当業者であれば、適当な修正、変更を加えることは、極めて容易に行えるであろう。

物理的衝撃とは、検体とビーズとを物理的に接触させる結果として、細胞を破砕させることを意味しており、具体的には、検体とビーズとを混合した容器全体を震盪する方法、又は検体とビーズとを混合した容器を超音波処理する方法が含まれる。
検体とは、特定の微生物の有無を確認するために用いられるものであり、例えば、便、喀痰、血液、土壌、水、食品、咽頭擦過物、結膜擦過物、尿道分泌物、耳漏、分泌液、髄液、関節液、腹水などが含まれる。

検体溶解処理用液とは、検体の種類に応じて、適当に添加される溶液のことを意味している。この検体溶解処理用液には、必要に応じて、消化酵素（タンパク分解酵素、多糖類分解酵素を含む）や変性剤（グアニジン塩を含む）などを含有させることが好ましい。但し、要件（４）を共に満足させるためには、実質的に界面活性剤を含まないことが好ましい。

次に、要件（１）について、詳細に説明する。処理液にビーズを加え、物理的衝撃を加えて細胞を破砕する際のビーズの大きさは、通常サイズのものは、約０.１ｍｍ〜約０.２ｍｍ程度である。本発明では、通常サイズのものに、約４ｍｍ〜約７ｍｍのより大きなビーズを少なくとも１個加える。こうして、二種類の大きさのものを用いることで、細胞の破砕効果が顕著に高くなる。
また、ビーズの種類としては、ガラス、ガーネット、ジルコニアなどを用いることができる。大小二種類のビーズの種類は、同種のものでも良く、異種のものでも良い。また、上記種類のうち、大小二種類共に、ジルコニアビーズを用いることが特に好ましい。後述する実施例では、直径５ｍｍのジルコニアビーズを加えることにより、核酸の抽出効率（抽出後のＤＮＡのＰＣＲによる検出感度）が２桁以上も上昇した。

次に、要件（２）について説明する。従来の方法では、ビーズを用いて細胞破砕を行う場合には、処理液容量がビーズ容量よりも多くなっている。しかし、本発明者らの検討によれば、処理液容量の絶対値を小さくした方が、細胞の破砕効率が良いことを見出した。具体的な目安としては、処理液容量がビーズ容量よりも小さくすることが好ましい。しかしこれは、必ずしも処理液容量がビーズ容量より大きくなってはいけないということではない。後述する実施例では処理液容量が２００μＬ以下の領域では、ビーズ容量が減った場合であっても、従来法（すなわち、処理液容量が１ｍＬ〜６００μＬ程度で細胞破砕を行う方法）に比べると、高い核酸抽出効率を確保できた。処理液容量が少ない場合には、処理液中の微生物がビーズに衝突する頻度が大きくなるためではないかと考えられる。

次に、要件（３）について説明する。この要件は、処理液及びビーズを加えた合計容量を小さくすることにより、細胞破砕時の容器の空間容量を大きくすることを示している。具体的には、空間容量として、容器容量の５／８以上、好ましくは２／３以上、更に好ましくは３／４以上、更に好ましくは４／５以上を確保する。空間容量を大きく確保することにより、物理的衝撃を加える際に、細胞破砕用のビーズが、容器の中で極めて動きやすい状態となるので、細胞破砕効果が向上するものと考えられる。空間容量を容器容量の３／４以上確保するには、処理液にビーズを加えた合計容量を容器容量の１／４以下、より好ましくは１／５以下とする必要がある。

ここで、処理液にビーズを加えた合計容量が容器容量の１／４以下、又は１／５以下という条件を設定する際に、要件（２）と要件（３）とを共に満足させるためには、処理液の容量が容器容量の１／８以下、又は１／１０以下とする必要がある。何故ならば、要件（２）の処理液容量がビーズ容量を越えないという条件を満足させようとすると、処理液容量にビーズ容量を加えた合計容量が容器容量の１／４以下、又は１／５以下の更に半分以下の量とする必要があるからである。この条件を一般的に使用されている２ｍＬの容量容器に当てはめると、１／８は２５０μＬ、１／１０は２００μＬとなる。これが処理液容量の目安である。この容量が細胞破砕用ビーズの容量を下回る（要件（２））には、ビーズ容量の最低値として、２００μＬ程度が必要となる。

更に、要件（１）を満足させるためには、大小二種類のビーズとして以下の容量を用いる。具体的には、直径が約０.２ｍｍのジルコニアビーズ０.５ｇの容量は約１４０μＬ程度であり、直径が約５ｍｍのジルコニアビーズの容量は約６５μＬである。大小のビーズ容量を合わせると、約２００μＬ程度となる。この程度のビーズ容量を用い、処理液容量が約２００μＬ程度のものを混合して、破砕処理することが望ましい。

次に、要件（４）について説明する。物理的衝撃を加えて破砕処理を行う際には、実質的に、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ザルコシル等の界面活性剤を含ませないことが好ましい。界面活性剤は、分子内に親水性原子団と疎水性原子団とを備えた両親媒性物質であり、少量で界面又は表面の諸性質を変化させる性質を有し、基本的には、石鹸の類である。物理的衝撃を加える際に、界面活性剤が存在すると、微生物が、ビーズ同士及び／又はビーズと容器壁とに挟まれたときに、表面を滑りやすくしてしまうため、破砕効率が下がっていると考えられる。後述する実施例では、物理的衝撃を加える際に、実質的に界面活性剤を含ませない状態としておくことで、従来法に比べると、細胞破砕効率が１０倍〜１００倍に上昇したことから、要件（４）の効果が明らかである。

次に、要件（５）について説明する。要件（４）を満足させて細胞破砕処理を行った後に、界面活性剤を加えてから、通常の核酸抽出操作を続けることを示している。具体的には、フェノール／クロロホルム抽出法を用いることができるが、この方法に限られず、他の方法を用いても良い。界面活性剤は、次に行うフェノール／クロロホルム抽出を行う際、核酸とそれに結合するタンパクとを解離させるのにも役立ち、これを除くことは核酸の抽出効率を下げることにつながる。従って、細胞破砕処理の後、フェノール／クロロホルム抽出の前に界面活性剤を加える。細胞破砕処理後の処理液（以下、「細胞破砕液」という）とフェノール／クロロホルムを激しく混合すると、フェノールは殆ど水とは混ざらず分離し、且つタンパクを変性させ、水層とフェノール層との中間層に変性タンパクを生じさせる。フェノール層が酸性でなければ、即ち中性〜弱アルカリ性の範囲で、核酸は水層に抽出される。クロロホルムはフェノールと水の分離を高める。イソアミルアルコールをフェノール／クロロホルムに少量加えることが好ましい。これは、イソアミルアルコールの消泡作用により、フェノールと水の分離を助けるためである。

界面活性剤を含む溶液（以下、「界面活性剤溶液」という）の容量と処理液及びビーズを合わせた容量との合計が、容器容量の４／２０〜７／２０程度となることが望ましい。上記の範囲を満足させるには、要件（２）と要件（３）とを満足させるための条件において、処理液にビーズを加えた合計容量が容器容量の１／６に設定した場合に、界面活性剤溶液の容量は、容器容量の４／２０にするためには１／３０、７／２０にするためには１１／６０となる。界面活性剤溶液を加えて容器容量の４／２０〜７／２０にするということは、フェノール／クロロホルム混合液を等量加えて核酸を抽出するので、フェノール／クロロホルム混合液を加えたときには、全体の容量が容器容量の２／５〜７／１０になることを意味する。フェノール／クロロホルム混合液を加えて激しく混合し、タンパク変性、核酸抽出を行うに適した量は容器容量の半分から半分強程度である。この量が多すぎると容器の空間容量が少なくなり、激しく混合する際に、混合が不十分となり、タンパク変性効果が弱くなる可能性がある。

従って、加える界面活性剤溶液の容量は、２ｍＬ容器を用いる場合には、１／３０〜１１／６０、即ち約７０μＬ〜約３５０μＬ（好ましくは、１００μＬ〜２００μＬ）となる。更に、処理液とビーズとを加えた容量を少なく抑えることにより、加える界面活性剤溶液の容量を増加することが可能になる。界面活性剤溶液の容量を増加させると、フェノール／クロロホルムと共に激しく混合した後に上層の水層を回収する際、水層が多くなり、中間層の変性タンパクが混入してしまうのを防ぐという効果がある。従って、処理液容量を少なくし、界面活性剤の容量を多くする方が、操作上有利になる。また、フェノール／クロロホルム混液を添加する場合には、細胞破砕用ビーズが完全に浸漬する程度の量を加えることが好ましい。

界面活性剤溶液の容量は、フェノール／クロロホルム抽出後の水層の回収に影響する。微量な検体を小さな容量で処理した場合、余りに水層の全量が少ないために、核酸が含まれる水層を分離することが非常に困難となる事態が生じ得る。容器の全容量が、約２ｍＬのものを用いる場合、水層を分離する際には、中間層を吸い込むことなく０.２ｍＬ以上を回収しやすい設定とすることが好ましい。検体の処理量を極力少量に抑えると水層量が少なくなるが、新たに界面活性剤を含む溶液を加えなかった場合には、実質的に水層を回収することが不可能となることもあり得る。そこで、界面活性剤を含む溶液を加えて水層量をマイクロピペットで回収し易い量とする為には、約２ｍＬ容器で液の高さ（深さ）が、最低でも３.５ｍｍ程度となることが好ましい。代表的な２ｍＬ容器の内径は、８.３ｍｍ〜９.２ｍｍの範囲であることから、０.２ｍＬの界面活性剤溶液を加えた場合の高さ上昇は、３.０ｍｍ〜３.７ｍｍになる。界面活性剤を含む溶液を加える容量を、２ｍＬ容器の深さ（３９ｍｍ〜４３ｍｍ）の４／２０（最大８.６ｍｍ）以下に抑えることにより、処理液とビーズを加えた容量（約１／１０〜約１／４、即ち２ｍＬ容器中の０.２ｍＬ〜０.５ｍＬ）に加えて、界面活性剤を含む溶液を０.２ｍＬ程度（約４ｍｍの深さ）から０.４ｍＬ程度（処理液とビーズを加えた容量が少ない、０.２ｍＬの場合；約８.５ｍｍの深さ）に制限することで、処理液、ビーズ及び界面活性剤溶液を加えた容量合計が０.４ｍＬ〜０.７ｍＬ程度となり、後のフェノール／クロロホルム処理、及び水層分離処理を円滑に行うことができる。

こうして、上記課題を解決するための第１の発明に係る微生物の細胞処理方法は、微生物の有無を確認するための検体と検体溶解処理用液を混合した処理液と、ビーズとを容器に混合し、この容器に物理的衝撃を加えて、前記微生物の細胞を破砕処理する方法であって、前記処理液とビーズとを加えた合計容量が、前記容器の全容量の少なくとも３／８以下とし、細胞破砕処理時の容器の空間容量を容器の全容量の５／８以上としたことを特徴とする。
上記発明においては、前記細胞破砕処理時には、前記処理液の容量が、前記ビーズの容量よりも小さいことが好ましい。また、前記細胞破砕処理時には、前記容器内には、実質的に界面活性剤を含ませない状態とすることが好ましい。

また、前記ビーズは、大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズを同時に用いることが好ましい。このときには、大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズは、同じ材質からなるものであることが好ましい。または、大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズは、異なる材質からなるものでも良い。更に、大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズのうち、より小さいビーズについては多数使用する一方、より大きいビーズについては、１個だけ使用することがより好ましい。
また、第１の発明において、前記ビーズの材質の比重は、５以上であることが好ましい。ガラスビーズは比重が約２.５、アルミナのそれは３〜４、ジルコニアでは５.５〜６強、ステンレススチールでは７.９前後、タングステン・カーバイドは約１５、金およびタングステン単独では１９.３であるが、基本的にビーズは、柔らかくない限り、重いほうが破砕効果は高くなる。第１の発明の効果は、少なくとも比重５以上のジルコニアビーズで確認されている。

第２の発明に係る核酸抽出方法は、第１の発明に係る方法で前記微生物の細胞壁を破砕し、その微生物の核酸を抽出することを特徴とする。
また、第１の発明に係る方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、界面活性剤を添加し、前記微生物の核酸を抽出することが好ましい。また、第１の発明に係る方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、前記ビーズが存在する状態で界面活性剤を添加し、フェノール／クロロホルム混液を混合することが好ましい。また、第１の発明に係る方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、前記容器中に界面活性剤を加え、その容器中にフェノール／クロロホルム混液を前記ビーズが浸漬するまで添加することが好ましい。

第２の発明においては、添加する界面活性剤を含む溶液の容量は、前記処理液及びビーズを加えたときの容量が前記容器の全容量の４／２０〜７／２０であることが好ましい。
第３の発明に係る細胞破砕用キットは、第１の発明に係る方法を用いることを特徴とする。このキットにおいて、大小２種類のビーズを用いる方法を使用する場合には、前記２種類以上のビーズを封入した容器を備えることが好ましい。また、少なくとも１種類のビーズの材質の比重が５以上であることが好ましく、前記ビーズが、ジルコニウム、ジルコニア（酸化ジルコニウム）、ステンレススチール又はタングステンであることがより好ましい。

第４の発明に係るキットの製造方法は、第３の発明に係るキットであることを特徴とする。この場合に、前記ビーズを容器の全容量の７％〜１５％として封入することが好ましい。
第５の発明に係る核酸抽出キットは、第２の発明に係る核酸抽出方法を用いることを特徴とする。この場合に、前記検体溶解処理用液には、実質的に界面活性剤を含まないことが好ましい。また、少なくとも、（１）ビーズを封入した容器、（２）検体溶解処理用液、（３）界面活性剤を含む溶液、及び（４）フェノール／クロロホルムを含む混合液を、それぞれ独立して備えることが好ましい。

第６の発明に係るキットの製造方法は、第５の発明に係るキットであることを特徴とする。
こうして、本発明によれば、従来法では十分に破砕・核酸抽出を行い難かったカビ・グラム陽性菌等の菌類を含む微生物を、簡便、迅速、かつ高効率に破砕する方法、キット等を提供できる。また、その方法を用いて、抽出効率の良好な核酸抽出方法、キット等を提供できる。こうして、本発明の方法によれば、遺伝子検査を行うに際し、多種類の微生物を含み得る検体に対して、少数の微生物であっても、非常に高感度な遺伝子検出を行うことが可能となる。

次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

図１には、本発明を適用して、細胞を破砕し、核酸を抽出するための基本操作手順を示した。図中最上段の「Ｂ）」は、液体状の検体にライシスバッファーを混合して細胞破砕工程に進むスキームを示し、次段の「Ａ）」は、沈殿状の検体にライシスバッファーを混合して細胞破砕工程に進むスキームを示している。つまり、「Ａ）」又は「Ｂ）」のいずれかの前処理は、検体の種類に応じて選択的である。なお、図１は、通常の生物工学分野で使用されるチューブ（容器の全容量が、約５００μＬ〜約２ｍＬ）を使用して、本発明を実施する方法を示すものであり、当業者であれば、この方法を適当に拡大・又は縮小して実施できる。

微生物の有無を確認するための検体については、必要に応じて前処理しておくことが好ましい。この前処理は、従来の微生物検体からの核酸抽出方法にも用いられていたもので実施することができる。前処理は、多くの場合に、微生物を濃縮する微生物濃縮工程が含まれる。具体的な前処理方法としては、例えば検体を遠心チューブに入れて遠心沈降させる（なお、沈殿の生成を促進させるために、ポリエチレングリコール等の沈殿促進剤を添加する場合がある）、酵素処理して分散させる（特に、喀痰検体の場合に有効な方法となる）、フィルターを用いて遠心濾過して濃縮する方法等がある。

検体が懸濁液等のように沈殿処理を要する場合には、容量２ｍＬのチューブに検体を入れた後、約１５，０００ｒｐｍにて、約３分間〜約１０分間の遠心処理を行い、上清を除いてから、次の処理「Ａ）」に移る。なお、沈殿促進剤を添加した場合には、約１５分間〜約２０分間程度まで、遠心時間を延長することもできる。また、検体が微生物の浮遊液或いは混入液の場合には、約２００μＬの検体を次の処理「Ｂ）」に用いる。

こうして、適当な前処理を施した沈殿（図中「Ａ」））、又は液体（図中「Ｂ」））に、１５０μＬのライシスバッファーを加え、よく混ぜて懸濁させる。ライシスバッファーは、本発明の検体溶解処理用液に該当しており、検体中の微生物を溶解、或いは変性させるために添加される。ライシスバッファーには、例えばグアニジンチオシアン酸塩等の変性剤、ラビアーゼ（Labiase）・リゾチーム（Lysozyme）等の酵素、メルタプトエタノール等の還元剤、ｐＨ調整用の塩（例えば、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液など）が含まれている。なお、本発明を実施するに際しては、ライシスバッファー中には、実質的に界面活性剤を含ませないことが好ましい。

次に、検体とライシスバッファーを混合した処理液を細胞破砕用のチューブに移す。ここで処理液は、約１５０μＬ〜約３５０μＬの容量となっている。チューブには、大小二種類のビーズが添加されている。チューブは、本発明における容器に該当しており、その全容量は約２ｍＬである。また、二種類のビーズの材質は、いずれも比重が５以上のジルコニア（酸化ジルコニウム）である。小ビーズの大きさは、約０.１ｍｍ〜約０.２ｍｍ程度のものであり、チューブには約５００ｍｇ（容量として約１４０μＬ程度）が含まれている。また、大ビーズの大きさは、約４ｍｍ〜約７ｍｍのものであり、チューブには１個のみ（重量として約２００ｍｇ〜約１１００ｍｇ、容量として約３０μＬ〜約２００μＬ）が含まれている。つまり、チューブ中には、約１８０μＬ〜約３５０μＬのビーズが含まれている。なお、本発明の実施においては、処理液の容量が、ビーズの容量よりも小さくなるように設定することが好ましい。

こうして、チューブに処理液とビーズとを混合した後、フタをし、約７０℃（場合により、約９０℃まで上昇させてもよい）にて、約１０分間程度の加熱処理を行うことにより、微生物の溶菌を促進させる。なお、対象とする核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても、次に行う破砕処理操作を行う限り、約７０℃の加熱処理で、十分な抽出処理が行えることが確認されている。また、微生物として、グラム陽性菌のみを対象とするＤＮＡ抽出の場合には、約９０℃で加熱処理を行うことが好ましい。

加熱処理の後、念のためにフタをしっかり締め直し、チューブ全体に物理的衝撃（例えば、機械的な震盪処理）を加えることにより、微生物の破砕処理を行う。細胞破砕処理時には、処理液とビーズとの合計容量は、約３３０μＬ〜約７００μＬとされており、容器の全容量（２ｍＬ）の約３／２０〜約７／２０を占めている。約６０秒間の物理的衝撃（具体的には、 multibeads shocker（安井器械）を用いる場合には、２５００ｒｐｍ、６０秒間、Fast Prep（フナコシ）を用いる場合には、強度４.５、６０秒間、Smart Smash（トミー）を用いる場合には、５０００ｒｐｍ、６０秒間）を加える。なお、ボルテックスミキサーにて６０秒間の処理を行った場合でも、ＲＮＡ抽出処理、又はグラム陰性菌のＤＮＡ抽出処理を行うことは可能であるが、グラム陽性菌の核酸抽出効率は減少することがある。

物理的衝撃を加えた後、フタを外して、約２００μＬの界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）を含む溶液を添加し、再度フタを締めた後、約７０℃〜約９０℃にて約１０分間の加熱処理を行う。
その後、フタを外して、細胞破砕液に約４００μＬのフェノール混合液（本発明におけるフェノール／クロロホルム混液に該当する）を混合し、再度フタをしっかり閉めて約１分間振盪又は混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間の遠心処理を行い、タンパク質を変性させ中間層に集める。フェノール混合液は、フェノール：クロロホルム＝約０.８〜約１.２（好ましくは、約１）の比率（ｖ／ｖ）で混合させたものであり、好ましくは約１／４０〜約１／６０（好ましくは、約１／４９）のイソアミルアルコールを添加したものを用いる。すなわち、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混液とすることが、より好ましい。

次に、上層（水層）を滅菌した別のチューブに回収する。こうして、核酸（粗精製物）の抽出処理を完了するが、場合に応じて、エタノール沈殿処理を２回行うことにより、核酸の精製度を向上させる。具体的には、粗精製核酸抽出物に、約１ｍＬの９９％エタノールを添加し、適当に振盪後、１５，０００ｒｐｍ、３分間の遠心処理を行い、上清部分を除く（１回目のエタノール沈殿処理）。更に、沈殿に７０％エタノールを添加し、適当に振盪後、再度１５，０００ｒｐｍ、３分間の遠心処理を行う（２回目のエタノール沈殿処理）。上清を除いた後、適当な溶液（例えば、ＤＥＰＣ（Diethyl Pyrocarbonate）処理水、又はTris-EDTA溶液（10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）））に懸濁する。

本発明による細胞破砕用キットおよび核酸抽出用キットを作製するには、次のようにすることが好ましい。これらの方法は、本発明を実施するための事例として提示するものでは、本発明の技術的範囲を限定するものではない。

直径０.２ｍｍ程度の小ジルコニアビーズ、及び直径５ｍｍ程度の大ジルコニアビーズ（１個）をｐＨ１.５〜２の酸で９０℃以上で熱処理して、核酸を分解する。熱処理は、１２１℃、２０分間のオートクレーブ（以下、「オートクレーブ処理」という）で行うこともできる。以降の操作は、クリーンルーム又はクリーンベンチ等、無菌的条件で行うことが望ましい。

次いで、酸で熱処理したジルコニアビーズをジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水で洗浄する。ＤＥＰＣ処理水は、密閉可能な蓋付容器に、超純水及びＤＥＰＣを０.１％になるように加え、混合して３７℃に２時間から１晩静置後、蓋を弛めてオートクレーブすることでＤＥＰＣの残存物を分解して使用する。ＤＥＰＣ処理はＲＮａｓｅを不活化させる操作であり、ＤＥＰＣの代わりにジメチルピロカーボネートを使用しても良く、また、洗浄には他の方法でＲＮａｓｅを不活化させた水を用いても良い。

洗浄したジルコニアビーズを乾熱滅菌機で１６０℃以上で乾燥させ、必要に応じて、更にクリーンベンチ内で乾燥させる。乾燥させた０.２ｍｍ程度のジルコニアビーズを約０.５ｇ又は約１４０μＬ、２ｍＬ容量の遠心可能なスクリューキャップ付容器（以下、「遠心チューブ」という）に容れる。この操作は、０.２ｍｍ程度のジルコニアビーズが０.５ｇ入る柄付容器・用具に擦り切りで掬い取る、又は注ぐ（落とす）、乃至吸引して一定量取ったものを遠心チューブに入れることにより行う。これに直径５ｍｍ程度のジルコニアビーズを１個加え、蓋を閉めて、ジルコニアビーズ充填チューブを作製することができる。

検体溶解処理用液は、尿素、グアニジンチオシアン酸塩やチオシアン酸ナトリウム等カオトロピック塩、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸、グリシン、コハク酸、酢酸、塩化アンモニウム、四ホウ酸ナトリウム、２ -メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ムラミダーゼ、リゾチーム、プロナーゼ、サチリシン、セミアルカリプロテアーゼ、塩化ナトリウム、酢酸カリウムのうち、少なくとも２つ以上を含むもので構成する。これらは再蒸留水、または超純水若しくはＤＥＰＣ処理水に溶解し、滅菌容器又は準無菌容器に無菌的に容れて製造する。準無菌容器とは滅菌されてはいないが、清潔な環境で無菌的に準ずる操作で作られた容器を意味する。分注に使用する器具類も滅菌されたものを使用する（以降の操作についても、同様である）。検体溶解処理用液は基本的に遮光して保存する。

界面活性剤を含む溶液は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム）、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ザルコシル、サポニン、３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、塩化ベンザルコニウムまたはこれらの類似誘導体からなるもの、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸、グリシン、コハク酸、酢酸のなかから、少なくとも１つまたは２つ以上含み、これ又はこれらは再蒸留水、または超純水若しくはＤＥＰＣ処理水に溶解して、滅菌容器又は準無菌容器に無菌的に分注して製造する。

フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を含む混合液は、従来から行われている作製方法により作成することができる。一例を挙げれば、フェノールを６０℃の水浴で加温融解し、０.５Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を加えて良く撹拌し、静置後、フェノール層と分離して上層に来る水層だけを出来るだけ除く。次に０.１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を加えて良く撹拌し、クロロホルム、イソアミルアルコールを加えて更に撹拌する。静置後、フェノール層と水層が分離したら、０.１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を少量容れておいた滅菌容器又は準無菌容器に、フェノール層のみを無菌的に分注して製造する。先に容れておく０.１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０の量は、容器中で高さ４ｍｍ〜５ｍｍ程度になる量から容れるフェノール層の量の１／５程度、またはそれ以上入れば良い。これはフェノール層が空気に触れて酸化しないようにするためであり、保存中に水が蒸発してフェノール層を空気と遮断するのに足りなくならない量が入っていれば良い。

フェノールを加温融解した時に、８−ヒドロキシキノリンを最終濃度０.０５％になるように加えることが、酸化防止する上でも、フェノール層が黄色に着色して水層と見分けやすくなる点からも好ましい。又、フェノール層の酸化が進むと黄色から褐色更には赤身を帯びる様になるので使用すべきでない指標になる。尚、クロロホルム、イソアミルアルコールを加えるタイミングを、分離する０.５Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０を除く前に早めても良いし、０.１Ｍトリス塩酸ｐＨ８.０をフェノール層に加えて良く撹拌する工程を省略しても良い。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）混液を、ＲＮＡの抽出専用にする場合には、ＲＮＡの分解を防ぐために、加えるトリス塩酸のｐＨを７.４〜７.６程度に下げても良い。また、ＤＮＡ専用にする場合はｐＨを８.３〜８.８まで上げても良い。フェノールとクロロホルム／イソアミルアルコールを別に分けて、破砕処理液及びＳＤＳ溶液と混合、遠心、上清回収する操作を２度に分けるようにしても良い。通常はこれらを一緒にした１度の操作で充分である。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）混液は遮光して冷蔵保存する。

ＤＥＰＣ処理水は、０.１％ＤＥＰＣ水を容器に分注し、蓋をしっかり締めて１回以上転倒させた後、３７℃に２時間以上静置させる。その後、蓋を弛めてオートクレーブ処理し、無菌的に取り出して蓋を閉めて製造する。細胞破砕用キットとは、前述のように製造した、２種類のビーズを充填したチューブ（ビーズ充填チューブ）、又は該ビーズ充填チューブおよび検体溶解処理用液を含むキットであり、検体溶解処理用液が遮光されていれば室温保存が可能である。核酸抽出用キット（ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キット）とは、該ビーズ充填チューブ、検体溶解処理用液、界面活性剤を含む溶液、およびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合液を含むキットであり、キット全体では冷蔵保存が必要である。これに上清回収する１.５〜２.０ｍＬ遠心チューブやエタノールを含んでも良いが、エタノール沈殿を行う為のエタノールはユーザーが自前で用意できるだろう。キット全体では冷蔵保存が必要である。しかし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合液を単独で遮光して冷蔵保存すれば、残りは、検体溶解処理用液を遮光する限り、室温保存で良い。

ライシスバッファー（溶解液：本発明における検体溶解処理用液に該当する）の液量がＤＮＡ抽出効率に与える影響の確認試験
グラム陽性球菌（Staphylococcus aureus）、グラム陽桿菌（Bacillus subtilis, Mycobacterium avium）、グラム陰性桿菌（Salmonella typimurium）、及び酵母（カビ類の一種であるCandida albicans）をそれぞれ所定の濃度に培養し、懸濁液とした（括弧内はここで使用した菌種名である）。これを遠心して、沈殿としたものにライシスバッファーの液量を１００、２００、４００、６００、８００、及び１０００μＬに変化させて混合し、ビーズ入りチューブ（全容量２ｍＬ）に移した。ビーズとして、約０.２ｍｍ径のジルコニアビーズを約０.３ｇと、約５ｍｍ径のジルコニアビーズ１個を用いた。

チューブに蓋をし、約７０℃にて１０分間加熱処理後、蓋をしっかりと閉め直し、 multibeads shocker（安井器械）を用いて、２５００ｒｐｍ、６０秒間の破砕処理を行った。卓上ミニ遠心機で蓋に付いた処理液を落とし、これに、２００μＬのＳＤＳ含有溶液を混合し、更に約１０分間、約７０℃にて加熱処理を行った。その後、４００μＬのフェノール／クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を混合し、ボルテックスミキサーにて約６０秒間混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心した。上澄み液を２００μＬ回収して、別のチューブに移し、１ｍＬの９９％エタノールを用いて１回目の沈殿処理（１５，０００ｒｐｍ、３分間）を行った後、沈殿に７０％のエタノールを加えて２回目の沈殿処理を行った（１５，０００ｒｐｍ、３分間）。抽出したＤＮＡを１００μＬの蒸留水に懸濁し、濃度を計測した。
結果を表１に示した。

表１中の「Ａ値」（菌種名の横に示す数値）は、ＤＮＡ抽出操作に用いた菌体量（Ａｘ１０^８ｃｆｕ／ｔｕｂｅ）を示している。また、「Ｎ．Ｄ．」は、計測限界以下を示す。
表より、本実施形態の方法は、各種の細胞（グラム陽性菌、グラム陰性菌、及び酵母）から良好に核酸（ＤＮＡ）を抽出できることが確認された。また、最初に用いるライシスバッファーの液量が少ない方が、菌体からの核酸の抽出効率が良好であることが確認された。この時、ＤＮＡの回収を確認できたライシスバッファーの容量は最大で６００μＬであり、０.２ｍｍ径のジルコニアビーズ０.３ｇと５ｍｍ径のジルコニアビーズの容量は合わせて約１５０μＬなので、合計約７５０μＬとなり、２ｍＬ容器の空き空間は容器容量の８分の５になる。すべての菌でＤＮＡの回収を確認できたライシスバッファーの容量は、２００μＬであり、０.２ｍｍ径のジルコニアビーズと５ｍｍ径のジルコニアビーズと合計すると約３５０μＬとなり、２ｍＬ容器の空き空間は容器容量の１００分の８３になる。

ビーズ量がＤＮＡ抽出効率に与える影響の確認試験
次に、小さいビーズとして、約０.２ｍｍ径のジルコニアビーズを約０.６ｇ使用したことを除き、上記実施例１と同じ操作を行い、小さいビーズ量がＤＮＡ抽出効率に与える影響を確認した。
結果を表２に示した。

表２中の「Ａ値」、及び「Ｎ．Ｄ．」は、表１と同じ意味であるため、説明を省略する。
表１及び表２を比較すると、いずれの方法においても、良好に菌体の核酸を抽出できたことが確認された。このことから、小さいビーズの使用量は、全容量２ｍＬのチューブ当り、約０.３ｇ〜約０.６ｇにおいて、特に核酸の抽出効率に影響を与えることなく、良好に使用できることが分かった。また、この時ＤＮＡの回収を確認できたライシスバッファーの容量も実施例１同様、最大で６００μＬであり、０.２ｍｍ径のジルコニアビーズ０.６ｇと５ｍｍ径のジルコニアビーズの容量は合わせて約２３０μＬなので、合計約８３０μＬとなり、２ｍＬ容器の空き空間は容器容量の１００分の５９になる。すべての菌でＤＮＡの回収を確認できたライシスバッファーの容量は、２００μＬであり、０．２ｍｍ径のジルコニアビーズ０.６ｇと５ｍｍ径のジルコニアビーズの容量は合わせて約２３０μＬなので、合計約４３０μＬとなり、２ｍＬ容器の空き空間は容器容量の１００分の７９になる。

細胞破砕処理時における界面活性剤の有無が破砕効率に与える影響の確認試験
次に、グラム陽性球菌の Staphylococcus aureus（S.aureus）を用いて、細胞破砕処理時における界面活性剤の有無が細胞の破砕効率、及び核酸抽出効率に与える影響を確認した。２.３個／ｍＬ〜２.３ｘ１０^９個／ｍＬの濃度に調製した S.aureus を用い、以下の４種類の異なる条件で細胞破砕処理、及び核酸抽出処理を行った後に、ＤＮＡを１００μＬの蒸留水に懸濁し、ＤＮＡ濃度の計測、及びＰＣＲ法による遺伝子増幅実験を行った。

（１）各菌体溶液１ｍＬを遠心分離した後、上清を除いた沈殿に１５０μＬのライシスバッファー、及び２００μＬのＳＤＳを混合し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、大小２種類のジルコニアビーズ（約０.２ｍｍ径ビーズを２ｍＬチューブ当り約０.５ｇ、及び約５ｍｍ径ビーズを１個）を用いて、実施例１と同様に細胞破砕処理を行い、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理、及びエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを抽出した。
（２）各菌体溶液１ｍＬを遠心分離した後、上清を除いた沈殿に１５０μＬのライシスバッファーを混合し、熱処理（７０℃、１０分間）の後、大小２種類のジルコニアビーズ（上記（１）と同じ組合せ）を用いて、実施例１と同様に細胞破砕処理を行った後に、２００μＬのＳＤＳを添加し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理、及びエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを抽出した。

（３）上記（１）において、ＳＤＳに代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた以外は、同じ処理を行い、ＤＮＡを抽出した。
（４）上記（２）において、ＳＤＳに代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた以外は、同じ処理を行い、ＤＮＡを抽出した。
（１）〜（４）の処理によって抽出されたＤＮＡは、１００μＬの蒸留水に懸濁し、紫外吸光度（２６０ｎｍ）によりＤＮＡ濃度を測定した後、ＰＣＲ法による遺伝子増幅処理を行った。
なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、 S. aureus の１６ＳｒＤＮＡ部分（約４１４ｂｐ）を増幅するためのユニバーサルプライマーを使用した。ＰＣＲの条件は、９２℃、２０秒間の熱変性の後、５５℃、２０秒間のアニーリング、７２℃、３０秒間の合成反応を１サイクルとし、これを３５サイクル行った。また、ＰＣＲには、タカラＥＸＴａｑ；コードＲＲ００１Ａを用い、全量が２０μＬの試験系を用いた。
結果を表３に示した。

表３中、ＤＮＡが計測できたサンプルについては、ＰＣＲ処理を行わなかった。また、「Ｎ．Ｄ．」は、計測限界以下を示し、ＰＣＲ法による「＋」は増幅バンドが認められたことを、「−」は増幅バンドが認められなかったことをそれぞれ示す。
表より、ビーズを用いた細胞破砕処理を行う際に、界面活性剤が存在する場合には、界面活性剤が存在しない場合に比べて、核酸の抽出効率が１０倍〜１００倍程度も低下することが分かった。また、ＳＤＳとＴｒｉｔｏｎＸ−１００では、いずれの界面活性剤を用いた場合にも、ほぼ同等の結果を示したことから、界面活性剤の種類による大きな影響は認め難かった。但し、ＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅試験においては、ＳＤＳを用いた場合には、２３個／ｍＬの濃度で増幅バンドが検出できた一方、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた場合には、２３個／ｍＬの濃度では増幅バンドが検出されなかったことから、菌体の種類によっては、界面活性剤の種類に応じて、検出感度が変わるのかも知れない。

大小２種類のビーズがＤＮＡ抽出効率に与える影響の確認試験
次に、 S.aureus を用いて、大小２種類のビーズが細胞の破砕効率、及び核酸抽出効率に与える影響を確認した。２.３個／ｍＬ〜２.３ｘ１０^９個／ｍＬの濃度に調製した S.aureus を用い、以下の２種類の異なる条件で細胞破砕処理、及び核酸抽出処理を行った後に、ＤＮＡを１００μＬの蒸留水に懸濁し、ＤＮＡ濃度測定、及びＰＣＲ法による遺伝子増幅実験を行った。また、陰性コントロールとして、菌体を含まない溶液を用いて、下記（１）及び（２）の処理を行い、ＤＮＡ濃度、及びＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅処理を行った。

（１）各菌体溶液１ｍＬを遠心分離した後、上清を除いた沈殿に１５０μＬのライシスバッファーを混合し、熱処理（７０℃、１０分間）の後、１種類のジルコニアビーズ（約０.２ｍｍ径ビーズを２ｍＬチューブ当り約０.５ｇ）を用いて、実施例１と同様に細胞破砕処理を行った後に、２００μＬのＳＤＳを添加し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理、及びエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを抽出した。
（２）上記（１）において、ジルコニアビーズとして、２種類のもの（約０.２ｍｍ径ビーズを２ｍＬチューブ当り約０.５ｇ、及び約５ｍｍ径ビーズを１個）を用いた以外は、同じ処理を行い、ＤＮＡを抽出した。

（１）及び（２）の処理によって抽出されたＤＮＡは、１００μＬの蒸留水に懸濁し、紫外吸光度（２６０ｎｍ）により濃度を測定した後、ＰＣＲ法による遺伝子増幅処理を行った。なお、ＰＣＲ法は、実施例３と同じであるため、記載を省略する。
結果を表４に示した。

表４中の「Ｎ．Ｄ．」、並びにＰＣＲ法による「＋」、及び「−」の意味は、表３と同じである。
表より、１種類のみ（約０.２ｍｍ径）のジルコニアビーズを用いた場合には、２.３ｘ１０^３個／ｍＬの菌体濃度までにしかＰＣＲ法による遺伝子増幅バンドが認められなかったが、大小２種類のジルコニアビーズを用いた場合には、２.３ｘ１０個／ｍＬの菌体濃度までバンドが認められた。このことより、大小２種類のジルコニアビーズを用いることにより、１種類のみ（約０.２ｍｍ径）のビーズを用いる場合に比べると、約１００倍以上の検出感度の向上が認められることが分かった。

ビーズを用いた細胞破砕処理がＤＮＡ抽出効率に与える影響の確認試験
次に、 S.aureus を用いて、ビーズを用いた細胞破砕処理が、ＤＮＡ抽出効率に与える影響を確認した。２.３個／ｍＬ〜２.３ｘ１０^９個／ｍＬの濃度に調製した S.aureus を用い、以下の２種類の異なる条件を用いて、核酸抽出処理を行った後に、ＤＮＡを１００μＬの蒸留水に懸濁し、ＤＮＡ濃度測定、及びＰＣＲ法による遺伝子増幅実験を行った。また、陰性コントロールとして、菌体を含まない溶液を用いて、下記（１）及び（２）の処理を行い、ＤＮＡ濃度測定、及びＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅処理を行った。

（１）各菌体溶液１ｍＬを遠心分離した後、上清を除いた沈殿に１５０μＬのライシスバッファーを混合し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、２種類のジルコニアビーズ（約０.２ｍｍ径ビーズを２ｍＬチューブ当り約０.５ｇ、約５ｍｍ径ビーズを１個）を用いて、実施例１と同様に細胞破砕処理を行った後に、２００μＬのＳＤＳを添加し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理、及びエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを抽出した。

（２）上記（１）において、ジルコニアビーズを用いた細胞破砕処理を行わず、ライシスバッファーの混合・加熱処理（７０℃、１０分間）の後、２００μＬのＳＤＳを添加し、加熱処理（７０℃、１０分間）の後、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理、及びエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを抽出した。
（１）及び（２）の処理によって抽出されたＤＮＡは、１００μＬの蒸留水に懸濁し、紫外吸光度（２６０ｎｍ）により濃度を測定した後、ＰＣＲ法による遺伝子増幅処理を行った。なお、ＰＣＲ法は、実施例３と同じであるため、記載を省略する。結果を表５に示した。

表５中の「Ｎ．Ｄ．」、並びにＰＣＲ法による「＋」、及び「−」の意味は、表３と同じである。
表より、ジルコニアビーズを用いない場合（Ｌｙｓｉｓのみ）には、２.３ｘ１０^９個／ｍＬの菌体濃度のみにおいて、ＤＮＡ濃度が計測され（２６.７ｎｇ／μＬ）、２.３ｘ１０^５個／ｍＬの菌体濃度までにおいて、ＰＣＲ法による遺伝子増幅バンドが認められた。一方、大小２種類のジルコニアビーズを用いた場合には、２.３ｘ１０^８個／ｍＬの菌体濃度までＤＮＡ濃度が計測され（３.７ｎｇ／μＬ）、２.３ｘ１０個／ｍＬの菌体濃度までＰＣＲ法による遺伝子増幅バンドが認められた。このことより、大小２種類のジルコニアビーズを用いることにより、ビーズを用いない場合に比べて、約１００００倍以上の検出感度の向上が認められることが分かった。

ビーズを用いた細胞破砕処理の後、フェノール／クロロホルム抽出処理の際のビーズの有無がＤＮＡ抽出効率に与える影響の確認試験
次に S.aureus を用いて、ビーズを用いた細胞破砕処理の後、フェノール／クロロホルム混液を用いたタンパク除去処理を行う際に、ビーズの除去又は非除去が、ＤＮＡ抽出効率に与える影響を確認した。２.３個／ｍＬ〜２.３ｘ１０^９個／ｍＬの濃度に調製した S.aureus を用い、以下の２種類の異なる条件を用いて、核酸抽出処理を行った後に、ＤＮＡを１００μＬの蒸留水に懸濁し、ＤＮＡ濃度測定、及びＰＣＲ法による遺伝子増幅実験を行った。また、陰性コントロールとして、菌体を含まない溶液を用いて、下記（１）及び（２）の処理を行い、ＤＮＡ濃度測定、及びＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅処理を行った。

（２）上記（１）において、フェノール／クロロホルム混液によるタンパク質除去処理を行う前に、ジルコニアビーズを除去し、それ以降は、同様の処理を行った。
（１）及び（２）の処理によって抽出されたＤＮＡは、１００μＬの蒸留水に懸濁し、紫外吸光度（２６０ｎｍ）により濃度を測定した後、ＰＣＲ法による遺伝子増幅処理を行った。なお、ＰＣＲ法は、実施例３と同じであるため、記載を省略する。結果を表６に示した。

表６中の「Ｎ．Ｄ．」、並びにＰＣＲ法による「＋」、及び「−」の意味は、表３と同じである。
表より、フェノール／クロロホルム処理の前にジルコニアビーズを除去した場合には、２.３ｘ１０^９個／ｍＬの菌体濃度のみにおいて、ＤＮＡ濃度が計測され（６０.７ｎｇ／μＬ）、２.３ｘ１０^３個／ｍＬの菌体濃度までにおいて、ＰＣＲ法による遺伝子増幅バンドが認められた。一方、ジルコニアビーズを除去することなく、フェノール／クロロホルム処理を行った場合には、２.３ｘ１０^８個／ｍＬの菌体濃度までＤＮＡ濃度が計測され（３.７ｎｇ／μＬ）、２.３ｘ１０個／ｍＬの菌体濃度までＰＣＲ法による遺伝子増幅バンドが認められた。このことより、フェノール／クロロホルム処理を行う際には、細胞破砕処理に用いたジルコニアビーズを除去することなく、チューブ内に存在させておく方が、ビーズを除去した場合に比べて、約１００倍以上の検出感度の向上が認められることが分かった。

＜実施例のまとめ、及び考察＞
上記各実施例より、以下（１）〜（６）のことが判明した。
（１）本実施例の方法によれば、各種の細胞（グラム陽性菌、グラム陰性菌、及び酵母）から良好に核酸（ＤＮＡ）を抽出できることが確認された。また、最初に用いるライシスバッファーの液量が少なく、ビーズ容量を考慮した容器の空き空間容量が容器容量の２分の１以上且つ大きい方が、菌体からの核酸の抽出効率が良好である。
（２）大小２種類のビーズを用いて、細胞破砕処理を行う場合において、小さいビーズの使用量は、全容量２ｍＬのチューブ当り、約０.３ｇ〜約０.６ｇにおいて、特に核酸の抽出効率に影響を与えることなく、良好に使用できる。

（３）ビーズを用いた細胞破砕処理を行う際に、界面活性剤が存在する場合には、界面活性剤が存在しない場合に比べて、核酸の抽出効率が１０倍〜１００倍程度も低下する。
（４）大小２種類のジルコニアビーズを用いることにより、一般的に用いられる約０.２ｍｍ径の小ビーズのみを用いる場合に比べると、約１００倍以上の検出感度の向上が認められる。

（５）大小２種類のジルコニアビーズを用いることにより、ビーズを用いない場合に比べて、約１００００倍以上の検出感度の向上が認められる。
（６）フェノール／クロロホルム処理を行う際には、細胞破砕処理に用いたジルコニアビーズを除去することなく、チューブ内に存在させておく方が、ビーズを除去した場合に比べて、約１００倍以上の検出感度の向上が認められる。

従来にも、大小２種類の破砕用物体を添加する例が認められる（ QBIOGENE（前出））。しかし、この例では、小さい物体は、ビーズではなくガーネットの破片様の尖った物質であることに加え、大小２種類の破砕用物体が同一材質から形成されたものではなかった。本実施例によれば、大小２種類のビーズを用い、特にそれらが同じジルコニアから形成された場合には、各種菌体から良好に核酸を抽出できることが確認された。

また、従来例には、ビーズを容器の半分まで入れる方法がある（バイオスペック・プロダクツ社、 Mini-BeadBeator）。この例では、検体およびフェノールを入れて震盪し、該検体およびフェノールの合計量を容器の半分として、容器に残りの空間容量を作らない但し書き付きの方法による。しかしながら、実際に検証したところ、この方法では余り破砕効果が良くない。一方、本実施例のフェノール／クロロホルム処理の前に破砕処理を行い、容器の空き空間を充分にとる方法によれば、破砕効果が非常に高い。更にフェノール／クロロホルム処理の際には、全容量が容器容量（２ｍＬ）の約７／１０程度以下に収まるので、激しく混合することが可能となり、タンパク変性効果も良好にできる。

また、従来例においては、ビーズではないガーネット・マトリクスが入った２.０ｍＬチューブに、使用時に１／４インチのセラミック粒子を使用時に加えるものがある（FastDNA^R Kit）。しかしながら、裏を返せば、これは予めガーネット・マトリクスとセラミック粒子とを共にチューブに入れておくことは、輸送に堪えないことを示唆しており、使用感の良好なキットを調製することは困難である。一方、本実施例によれば、細胞破砕処理用のチューブに、大小２種類のジルコニアビーズを封入した状態で、キットとすることができるので、微生物の核酸抽出を行おうとする者に対して、使用感の良好なキットを提供することができる。

本実施形態において、微生物の破砕処理、及び核酸抽出処理を行うための操作フローを説明する図である。

Claims

微生物の有無を確認するための検体と検体溶解処理用液を混合した処理液と、ビーズとを容器に混合し、この容器に物理的衝撃を加えて、前記微生物の細胞を破砕処理する方法であって、
前記処理液とビーズとを加えた合計容量が、前記容器の全容量の少なくとも３／８以下とし、細胞破砕処理時の容器の空間容量を容器の全容量の５／８以上としたことを特徴とする微生物の細胞破砕処理方法。
前記細胞破砕処理時には、前記処理液の容量が、前記ビーズの容量よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の細胞破砕処理方法。
前記細胞破砕処理時には、前記容器内には、実質的に界面活性剤を含ませない状態とすることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞破砕処理方法。
前記ビーズは、大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズを同時に用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞破砕処理方法。
大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズは、同じ材質からなるものであることを特徴とする請求項４に記載の細胞破砕処理方法。
大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズは、異なる材質からなるものであることを特徴とする請求項４に記載の細胞破砕処理方法。
大きさ及び重さが異なる少なくとも二種類以上のビーズのうち、より小さいビーズについては多数使用する一方、より大きいビーズについては、１個だけ使用することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の細胞破砕処理方法。
前記ビーズの材質の比重は、５以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞破砕処理方法。
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法で前記微生物の細胞壁を破砕し、その微生物の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、界面活性剤を添加し、前記微生物の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、前記ビーズが存在する状態で界面活性剤を添加し、フェノール／クロロホルム混液を混合することを特徴とする核酸抽出方法。
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法で前記微生物の細胞壁を破砕した後、前記容器中に界面活性剤を加え、その容器中にフェノール／クロロホルム混液を前記ビーズが浸漬するまで添加することを特徴とする核酸抽出方法。
請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載の方法において、添加する界面活性剤を含む溶液の容量は、前記処理液及びビーズを加えたときの容量が前記容器の全容量の４／２０〜７／２０であることを特徴とする核酸抽出方法。
請求項１〜８のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする細胞破砕用キット。
請求項４〜７のいずれかに記載の方法を用いると共に、前記二種類以上のビーズを封入した容器を備えることを特徴とする細胞破砕用キット。
少なくとも１種類のビーズの材質の比重が５以上であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の細胞破砕用キット。
前記ビーズが、ジルコニウム、ジルコニア（酸化ジルコニウム）、ステンレススチール、又はタングステンであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞破砕用キット。
請求項１４〜請求項１７のいずれかに記載のキットの製造方法。
前記ビーズを容器の全容量の７％〜１５％として封入したことを特徴とする請求項１４〜請求項１８のいずれかに記載のキットの製造方法。
請求項９〜１３のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする核酸抽出キット。
前記検体溶解処理用液には、実質的に界面活性剤を含まないことを特徴とする請求項２０に記載の核酸抽出キット。
少なくとも、（１）ビーズを封入した容器、（２）検体溶解処理用液、（３）界面活性剤を含む溶液、及び（４）フェノール／クロロホルムを含む混合液を、それぞれ独立して備えたことを特徴とする請求項２０または２１に記載の核酸抽出キット。
請求項２０〜２２のいずれかに記載のキットを製造する方法。