JP5965843B2 - 微生物核酸および必要に応じて追加のウイルス核酸を選択的に富化し単離するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸、さらには必要に応じてウイルスの混合物を液体中に含む試料から、微生物核酸、必要に応じて追加としてウイルス核酸を、選択的に蓄積および／または単離するための方法に関し、また、微生物細胞および高等真核生物細胞、遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、場合によってさらにはウイルスの混合物を液体中に含む試料から、より具体的には細胞内微生物核酸、さらには細胞外微生物核酸、必要に応じて追加としてウイルス核酸を、選択的に蓄積および／または単離するためのキットにも関する。

分子生物学による解析法および診断法は、従来の方法とは対照的に、病原体を極めて迅速に検出し、したがって、迅速に診断することを可能とするので、より具体的には、ヒト医学または獣医学において、感染または疾患に対する遺伝的な素因を検出するのにますます重要となりつつある。病原体の迅速な検出および迅速な診断は、同様に、標的化療法を早期の段階で開始することを可能とし、したがって、より具体的に、生命を脅かす感染症例において、患者の死亡率を決定的に低下させることができる。したがって、例として述べると、敗血症患者の致死率は、現在でもなお２０〜５０％の範囲にあり、敗血症は、病因の入院患者の最も一般的な死亡原因である。この状況は特に、診断法が比較的時間を要することの結果であり、これは、治療の開始を不可避的に遅延させる。従来は、微生物の増殖が達成され、その後対応するコロニーが検出されうるように、患者から取得される、病原体（複数可）を含有する試料を、適切な条件下で培養する、すなわち、適切な培地で増殖させることにより、この種の感染症の検出を達成する。しかし、この培養法は一般に、数日間（約３〜７日間）を要する。さらに、血液の培養物を調製することによっても検出できない病原体は数多い。これは、より具体的には、ウイルスの診断にあてはまる。

したがって、最新の診断法は、病原性核酸（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ））の特異的な検出に焦点を当てる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、極めて低量の核酸であっても指数関数的に増殖させることを数時間以内に可能とするので、この手法は、例えば、敗血症の診断において、多大な時間の節約を伴う形でヒト血液試料中の微生物ＤＮＡを検出することを可能とし、罹患する患者の生存の可能性を決定的に増大させる。

病原体の種類に依存するが、検出される核酸の大部分は、細胞内に存在し（「細胞内核酸」）、さもなければ感染試料中に遊離で循環している（「細胞外核酸」）。細胞内核酸の単離を可能とするためには、まず、これらの核酸を細胞から放出させてから、これらを精製し、ＰＣＲ法を用いて増幅し、かつ／または解析することができる。例えば、敗血症患者に由来する血液試料など、微生物細胞および高等真核生物細胞の混合物を含む試料から、微生物ＤＮＡを検出するときのさらなる問題はまた、該細胞を溶解させると、試料中に存在する微生物細胞から、解析される微生物核酸が放出されるだけでなく、高等真核生物から取得される試料におけるその数が一般に微生物細胞の数より何倍も多い高等真核生物細胞から、大量の真核生物核酸もまた放出されるという事実でもある。したがって、この種の混合試料から取得される核酸調製物は、試料中に存在するすべての細胞型の核酸混合物を含む。ヒト敗血症患者に由来する血液試料中のヒトＤＮＡに対する微生物ＤＮＡの比の平均は、約１／２×１０^９であり、したがって、微生物ＤＮＡを検出するためのその後の増幅法は、非特異的な増幅産物の形成を結果としてもたらすことが極めて多く、これは、その後の診断を複雑にする場合もあり、また、誤診断をもたらす場合もある。

先行技術では、このような試料中に存在する細胞に適する細胞破壊（細胞溶解）法によりこの問題を回避する各種の手法が既に施されている。例えば、特許文献１は、微生物細胞だけでなく、高等真核生物細胞もまた含む混合試料から、微生物核酸を選択的に単離することを可能とする方法について記載している。比較的低濃度のカオトロピック剤を含む弱溶解緩衝液を用いると、ヒト血液試料中に天然の形で大量に存在する高等真核生物細胞は破壊される一方、これらもまた被験試料中に存在する微生物細胞は当初のまま依然として完全性を維持する。この方法は、カオトロピック条件下では、微生物細胞が、真核生物細胞と比べてより安定であるという事実を利用している。得られた溶解物は、溶解により放出された真核生物細胞成分、さらには完全な微生物細胞を含み、その後これに適切なヌクレアーゼを添加すると、その真核生物ＤＮＡは分解される一方、細胞内微生物ＤＮＡは、完全である微生物細胞内で消化から保護される。その後の遠心分離により、（少なくとも部分的に）分解された真核生物ＤＮＡを含む溶解物から、微生物細胞をペレットとして取り出すことができる。次のステップでは、このようにして得られた微生物細胞を、さらなる破壊にかけ、微生物細胞内ＤＮＡを放出させる。しかし、この方法の欠点は、ウイルス核酸、および遊離の循環核酸、より具体的には、試料の液体成分中、血液試料の場合には、例えば、血漿中に存在する細胞外微生物核酸が、先行するヌクレアーゼによる消化のために不可避的に失われることである。これは、より具体的には、血漿中に存在する核酸、より具体的には、遊離の循環核酸が、重要な予後診断マーカーであることを示しているより最近の知見（Ａ． Ｒｈｏｄｅｓら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ、２００６年、１０巻：Ｒ６０）に関連する欠点である。より具体的に述べると、敗血症では、患者が、血漿中で遊離の循環核酸の含有量の大きな増大を示し、上記含有量を、該患者の疾患の進行および死亡率を予測するための独立した指標として用いることができる（例えば、Ｍ． Ｅ． Ｂｏｕｇｎｏｕｘら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９９年、３７巻、９２５〜９３０頁； Ｌ． Ｍｅｔｗａｌｌｙら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００８年、５７巻、１２６９〜１２７２頁； Ｋ． Ｓａｕｋｋｏｎｅｎら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、２００８年、５４巻（６号）、１０００〜１００７頁； Ｙ． Ｋ． Ｔｏｎｇら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ、２００６年、３６３巻（１〜２号）、１８７〜１９６頁を参照されたい）。

ＷＯ２００９／０１５４８４Ａ１はまた、内因性細胞だけでなく、微生物もまた含む体液から、微生物核酸を単離するための方法についても説明している。該文献に記載される方法は、２つのレベルからなる溶解法を含む。第１のステップでは、適切な条件下において、血液細胞を選択的に溶解させる一方、微生物細胞は依然として完全性を維持する。その後、完全な微生物細胞をペレットとして取り出すために、溶解させた試料を遠心分離する。このペレットを洗浄した後で、さらなる溶解により、このペレット中に存在する微生物細胞から、微生物核酸を放出させることができる。微生物細胞および高等真核生物細胞のこの種の混合試料を含む生物学的試料から、微生物細胞を単離するための同様の原理に基づく方法はまた、特許文献２、特許文献３、および特許文献４においても記載されている。しかし、これらの文献に記載されている方法は、細胞外微生物ＤＮＡを単離するための手段については１つとして言及していない。

全血の混合試料に由来するヒトＤＮＡから、細胞内微生物ＤＮＡを分離するさらなる手法が、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＶＹＯＯキットの基礎をなしている。混合試料中に存在する異なる細胞を機械的に溶解させた後で、まず、該試料の全ＤＮＡを単離する。次のステップでは、微生物病原体の非メチル化ＤＮＡに結合する固相結合抗体により、試料中の微生物ＤＮＡを蓄積する一方、メチル化ヒトＤＮＡは結合させない。その後のステップでは、結合させた微生物ＤＮＡを固相から溶出させ、最後に、得られた溶出物からこれを沈殿させなければならない。この方法を用いると、細胞内微生物核酸および細胞外微生物核酸の両方を蓄積しうるが、抗体により官能化された固相への結合による蓄積は少量であり、また、その後の沈殿においても、相当量の微生物ＤＮＡが失われる。さらなる欠点は、この方法でもまた、ウイルス核酸が精製されないことである。加えて、該方法は、極めて時間を要する。

国際公開第２００６／０９２２７８号 国際公開第９７／０７２３８号 国際公開第２００６／０８８８９５号 国際公開第２００８／０１７０９７号

したがって、本発明の目的は、微生物細胞および高等真核生物細胞、さらには遊離の循環核酸の混合物を液体中に含む試料から、微生物核酸を選択的に蓄積および／または単離するための方法であって、短時間で同じ試料から、細胞内核酸および細胞外核酸の両方、より具体的には微生物核酸を蓄積および／または単離することを可能とする方法を提供することであった。

本発明に従う方法により、この目的を達成する。したがって、本発明は、微生物細胞および高等真核生物細胞、さらには遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸の混合物を液体中に含む試料から、微生物核酸を選択的に蓄積および／または単離する方法であって、
１．該遊離の循環核酸、より具体的には該細胞外核酸など、該試料の液体成分中に溶解している物質を含めた、この液体成分を、該試料の固体成分、より具体的には細胞成分から実質的に分離するステップと、
２．該固体試料成分中に存在する該真核生物細胞を、該微生物細胞を同時に溶解させることなく、選択的に溶解させるステップと、
３．ステップ２で得られた溶解物の液体成分中に溶解している物質を含めた、この液体成分から、該微生物細胞を含めた、固体成分を実質的に分離するステップと、
４．ステップ３で得られた固体成分を再懸濁させるステップと、
５．ステップ４で得られた懸濁物中に存在する該微生物細胞を溶解させるステップと、
６．ステップ１で得られた液体成分から、該遊離の循環核酸、より具体的には該細胞外微生物核酸を精製および／もしくは濃縮し、かつ／またはステップ５で得られた溶解物から、該細胞内微生物核酸を精製および／もしくは濃縮するステップと
を含む方法を提供する。

試料が、微生物細胞および高等真核生物細胞、ならびに遊離の循環核酸だけでなく、ウイルスも含むとすれば、該ウイルスは、該方法のステップ１で取り出される、試料の主に液体成分中に存在するはずなので、必要に応じてさらに、ステップ６において追加として、さもなければ同時に、ウイルス核酸を蓄積および／または単離することも可能であり、したがってこれらも同様に、該高等真核生物細胞から効果的に除去することができる。

本方法のステップ６により、細胞外核酸および細胞内核酸の両方、より具体的には微生物核酸を精製することが特に好ましい。これは、ステップ１による液体成分を、ステップ５による溶解物と混合することと同時に、またはこれと別個に、これと相次いで、もしくはこの後に実施することができる。

本発明に従う方法を用いて、微生物細胞だけでなく、高等真核生物細胞および遊離の循環核酸も含む混合試料から、細胞内微生物核酸および細胞外微生物核酸の両方を単離および蓄積することができる。細胞内核酸および／または細胞外核酸を、互いに独立して、または対応する画分を混合した後に併せて、精製および濃縮することが可能である。所望の場合は、該方法がまた、微生物核酸の選択的な蓄積および／または単離に加えて、高等真核生物核酸の選択的な蓄積および／または単離も可能とする。単離される核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方であることが可能であり、これらの各々は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。微生物細胞を検出する場合は、核酸がＤＮＡであることが好ましいのに対し、ウイルスを検出する場合は、ウイルスの種類（ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス）に応じて、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が対象となる。

本発明に従う方法により得られた核酸は、その後、ＰＣＲ反応および／またはハイブリダイゼーション反応など、高度に特異的な方法および高感度な方法により検出することができる。ヒトｇＤＮＡを枯渇させることにより、極めて大量の投入容量を用いることができ、結合させた核酸を、極めて少量の溶出容量中に同時に溶出させることができる。したがって、溶出容量に対する投入容量の比がこのように大きいことの結果として、極めて高い感度が得られる。ヒトｇＤＮＡを枯渇させなければ、その後、ＰＣＲに対する阻害が生じうるので、この投入／溶出比が可能となることはないであろう。該方法はなお、顆粒球またはマクロファージから、貪食された微生物細胞を放出させ、かつこれらを検出することもまた可能とする。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸の混合物を液体中に含む試料から、微生物核酸を選択的に蓄積および／または単離する方法であって、
１．該遊離の循環核酸、より具体的には該細胞外核酸など、該試料の液体成分中に溶解している物質を含めた、この液体成分を、該試料の固体成分、より具体的には細胞成分から実質的に分離するステップと、
２．該固体試料成分中に存在する該真核生物細胞を、該微生物細胞を同時に溶解させることなく、選択的に溶解させるステップと、
３．ステップ２で得られた溶解物の液体成分中に溶解している物質を含めた、この液体成分から、該微生物細胞を含めた、固体成分を実質的に分離するステップと、
４．ステップ３で得られた該固体成分を再懸濁させるステップと、
５．ステップ４で得られた懸濁物中に存在する該微生物細胞を溶解させるステップと、
６．ステップ１で得られた該液体成分から、該遊離の循環核酸、より具体的には該細胞外微生物核酸を精製および／もしくは濃縮し、かつ／またはステップ５で得られた溶解物から、上記細胞内微生物核酸を精製および／もしくは濃縮するステップと
を含む方法。
（項目２）
上記高等真核生物細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を表わす、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記試料が、体液、その濃縮物もしくは希釈溶液、またはスワブにより取得された再懸濁細胞材料、好ましくは血液または血液濃縮物である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記微生物細胞が、細菌細胞および／または真菌細胞である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
項目１に記載の手順ステップ１および／または３における上記固体成分からの上記液体成分の実質的な分離が、上記試料の遠心分離、濾過、および／またはデカンテーションにより達成される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
１．チオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴ）、過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、尿素、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック物質と、
２．脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と、
３．トリス、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質と
を含む混合物（緩衝液１）を添加した後の上記試料におけるこれらの物質の濃度が、（１）好ましくはグアニジニウムを含むカオトロープ０．１〜２Ｍ；（２）界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤０．５〜５％（ｗ／ｖ）；および（３）緩衝剤物質２〜５０ｍＭ、好ましくは４〜１０ｍＭであって、好ましくはｐＨ８．０であるように、これらの物質を含む該混合物中で、項目１に記載の手順ステップ２による上記真核生物細胞の選択的溶解を実施する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
項目１に記載の手順ステップ５における上記微生物細胞の溶解を、緩衝剤溶液の存在下において、少なくとも部分的には機械的に、好ましくは、粒子、好ましくはガラスビーズを用いる、特に好ましくはサイズが４００〜６００μｍの範囲にあるガラスビーズを用いる、上記試料の機械的ホモジナイズにより実施する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記緩衝剤溶液（緩衝液２）が、
１．トリス−ＨＣｌ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質と、
２．金属イオン、より具体的には、二価金属イオンの、少なくとも１つの錯化剤、好ましくはＥＤＴＡと、
３．脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と、
４．必要に応じて、Ｒｅａｇｅｎｔ ＤＸおよびＳＩＬＦＯＡＭ ＳＲＥを含む群から選択されることが好ましい発泡抑制剤と
を含み、
ｐＨが６〜１０、好ましくは７．０〜９．０であり、
該緩衝剤溶液の有する物質は、より具体的には、機械的溶解の間では、（１）緩衝剤物質が２〜２０ｍＭ、（２）錯化剤が０．１〜５ｍＭ、（３）界面活性剤が０．１〜５％（ｗ／ｖ）、および（４）必要に応じて、発泡抑制剤が０．１〜１％（ｖ／ｖ）の濃度で、ｐＨ８．０で存在する、項目７に記載の方法。
（項目９）
項目１に記載の手順ステップ５における上記微生物細胞の上記溶解を、少なくとも部分的には、項目１に記載の手順ステップ４からの上記懸濁物に、または項目７もしくは８から結果として得られる溶解物に、プロテイナーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫと、
１．チオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴ）、過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、尿素、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック物質、
２．脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、
３．トリス、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質、ならびに
４．必要に応じて、項目１に記載の手順ステップ１からの上記液体成分
を含み、
緩衝剤溶液（緩衝液３）の有する物質が、より具体的には、該溶解の間では、（１）カオトロープ１〜５Ｍ、（２）界面活性剤５〜２０％（ｗ／ｖ）、および（３）緩衝剤物質２０〜１００ｍＭの濃度で存在し、より具体的には、ｐＨ８．０で存在する該緩衝剤溶液を添加し、得られた混合物をインキュベートすることにより実施する、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸、より具体的には、細胞外微生物核酸の混合物だけでなく、ウイルスも液体中に含む試料から、ウイルス核酸を蓄積および／または単離することもさらに含み、項目１に記載の手順ステップ１における上記試料の上記液体成分と併せた上記固体試料成分から該ウイルスを取り出す、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目１に記載の手順ステップ１において取り出され、上記細胞外核酸、好ましくは微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む上記液体成分を、項目１に記載の手順ステップ５において得られ、項目１に記載の手順ステップ６により上記細胞内微生物核酸が精製および／または濃縮される前の該細胞内微生物核酸を含む上記溶解物と混合する、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
項目１に記載の手順ステップ１において得られ、上記細胞外微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む上記液体成分、ならびに項目１に記載の手順ステップ５において得られ、上記細胞内微生物核酸を含む上記溶解物を、互いに独立して精製および／または濃縮する、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
項目１に記載のステップ６による、上記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸の精製および濃縮が、
６ａ）項目１に記載の手順ステップ５からの上記溶解物に、および適当な場合は、ステップ１からの上記液体成分に、（１）直鎖状または分枝状のＣ _１ 〜Ｃ _４ アルコール、好ましくはイソプロパノールと、（２）（１）３〜６Ｍのカオトロープ、（２）１０〜３０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（３）５０〜１５０ｍＭの緩衝剤物質を含み、より具体的にはｐＨ８．０である、項目９に記載の緩衝液３との、好ましくは２０〜７０％の緩衝液３に対して、３０〜８０％の直鎖状または分枝状のＣ _１ 〜Ｃ _４ アルコールの比による混合物を含むことが好ましい溶液（結合緩衝液）を添加し、結果として得られる混合物をインキュベートするステップと、
６ｂ）上記試料を、適切なクロマトグラフィー装置、好ましくは、上記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を、吸着、特に好ましくはシリカベースの吸着により選択的に結合させるためのクロマトグラフィー装置にアプライするステップと、
６ｃ）必要に応じて、上記結合させた微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を、１回以上にわたり洗浄するステップと、
６ｄ）必要に応じて、上記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を溶出させるステップと
を含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、さらには追加として任意のウイルスの混合物を液体中に含む試料から、細胞内微生物核酸、さらには遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、および追加として任意のウイルス核酸を、選択的に蓄積および／または単離するためのキットであって、
１．（１）０．２〜４Ｍの、好ましくはグアニジニウムを含むカオトロープ；（２）０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤；および（３）２〜１００ｍＭの緩衝剤物質を含み、好ましくはｐＨ８．０である、項目６に記載の第１の緩衝液と、
２．（１）５〜５０ｍＭの緩衝剤物質、（２）０．５〜１０ｍＭの錯化剤、（３）０．２〜１０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（４）必要に応じて、０．１〜３％（ｖ／ｖ）の発泡抑制剤を含み、ｐＨ８．０である、項目８に記載の少なくとも１つの第２の緩衝液、ならびに／または（１）３〜１０Ｍのカオトロープ、（２）１０〜４０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（３）４０〜２００ｍＭの緩衝剤物質を含み、より具体的にはｐＨ８．０である、項目９に記載の少なくとも１つの第２の緩衝液と、
３．直径が４００〜６００μｍの範囲にあることが好ましく、直径が５００μｍであることが特に好ましいガラスビーズと
を含むキット。
（項目１５）
上記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を精製および／または濃縮するためのクロマトグラフィー装置、好ましくは、該微生物核酸およびウイルス核酸を、吸着、特に好ましくはシリカベースの吸着により選択的に結合させるためのクロマトグラフィー装置をさらに含み、また、結合緩衝液、好ましくは項目１３に記載の結合緩衝液、必要に応じて１つ以上の洗浄緩衝液、必要に応じて溶出緩衝液、ならびに必要に応じて蓄積および／または単離された核酸を検出するためのさらなる構成要素もさらに含む、項目１４に記載のキット。

図１は、得られたＤＮＡの総量（すなわち、ヒトＤＮＡと真菌ＤＮＡとの総和であり、ヒトＤＮＡが大部分を表わす）であって、単離真菌ＤＮＡおよび単離真菌細胞（遊離ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＤＮＡ、さらには、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓおよびＩ． ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの細胞）をスパイクしたヒト全血試料から、４つの異なる方法Ａ〜Ｄ（実施例１を参照されたい）において取得されたＤＮＡ総量を示す図である。試料Ａの元になる試料量は、全血５００μｌとした；試料Ｂには、１ｍｌの全血を用いた。試料ＣおよびＤでは、出発試料量を、それぞれ、全血５ｍｌおよび１０ｍｌとし、ここで、試料Ｃでは、液体成分（血漿成分）を除去した後に残存する、ヒト核酸を枯渇させた固体試料成分だけを処理および精製する一方、試料Ｄでは、クロマトグラフィーにより精製する前に、溶解させた微生物細胞を、細胞外微生物核酸を含み、本発明に従う方法のステップ１において取り出された、該試料の液体成分と混合した。試料ＡおよびＢは、ヒトｇＤＮＡを枯渇させずに、従来の方法により処理したものであり、したがって、ヒトｇＤＮＡの含有量が高量である一方、試料ＣおよびＤにおけるヒトｇＤＮＡの含有量は明確に低量であったが、試料ＣおよびＤの試料容量は、試料ＡおよびＢの試料容量の５〜２０倍であった。 図２は、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲによる、図１で示した試料Ａ〜Ｄの微生物ＤＮＡの増殖結果を、得られたＣＴ値により示す図である（実施例１を参照されたい）。 図３は、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲによる細菌ＤＮＡの増殖結果を示す図であり、該ＤＮＡは、単離細菌ＤＮＡおよび単離細菌細胞（遊離Ｓ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＤＮＡ、さらには、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓの細胞）をスパイクしたヒト全血試料から、３つの異なる方法Ａ、Ｂ、およびＤ（実施例２を参照されたい）において取得された。試料Ａの元になる試料量は、全血５００μｌとした；試料Ｂには、１ｍｌの全血を用いた。試料Ｄでは、出発試料量を、全血１０ｍｌとし、ここでは、クロマトグラフィーにより精製する前に、溶解させた微生物細胞を、細胞外微生物核酸を含み、本発明に従う方法のステップ１において取り出された、該試料の液体成分と混合した。本発明に従い処理された試料ＤのＣＴ値はまた、細菌ＤＮＡを単離する場合においても明確に低値である。 図４は、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲまたはマルチプレックスリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲにより、本発明に従う方法を用いて得られたウイルス核酸の増殖結果（黒色バーとして表示する）を、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に基づくデオキシリボ核酸、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に基づくリボ核酸について、ウイルス核酸を検出するための市販のキットを用いて取得された核酸（白色バー）と比較して示す図である（実施例３を参照されたい）。 図５は、実施例４において、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲにより処理された試料の微生物ＤＮＡの増殖結果を、得られたＣＴ値により示す図である（実施例４を参照されたい）。第１のバーの対は、全Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞から単離されたＤＮＡについて得られたＣＴ値を示し、第２のバーの対は、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓから単離されたＤＮＡ（遊離ＤＮＡ）のＣＴ値を示し、第３のバーの対は、Ｓ． ｐｙｒｏｇｅｎｅｓから単離されたＤＮＡ（遊離ＤＮＡ）のＣＴ値を示し、右側のバーの対は、全Ｅ． ｃｏｌｉ細胞から単離されたＤＮＡのＣＴ値を示す。各場合では、左側のバーが、１９．５％イソプロパノールの場合における結果を示し、右側のバーが、４２％イソプロパノールの場合における結果を示す。

本発明の目的では、「選択的な蓄積および／または単離」という用語が、微生物細胞、遊離の循環核酸、場合によってウイルス、および高等真核生物細胞を含む混合試料から、再現可能な形で核酸を提供することを可能とする方法であって、上記核酸が、該試料中に存在する該微生物細胞だけに由来するか、または主にこれらに由来し、これらには細胞外微生物核酸が含まれ、さらにはウイルス由来の任意の核酸も含まれるが、同時に、該試料中の高等真核生物細胞に由来する核酸の比率は顕著に低減される方法を意味すると理解される。

本発明の目的では、高等真核生物細胞とは、例えば、植物または動物において存在する細胞など、進化のレベルが高等である真核生物細胞を意味すると理解される。この種の多細胞生物は、とりわけ、単一の高等真核生物細胞が、それ自体では、生命に不可欠な生化学機能および代謝機能のすべてを果たすことがなく、特化を介して、１つ以上の機能を果たすように適応している、細胞分化を特色とする。この文脈における高等真核生物細胞という用語は、組織内で組織されている細胞、および個別の細胞、例えば、ヒトを含めた哺乳動物の体液中、またはその排出生成物中、例えば、血液中、リンパ液中、脳脊髄液中、尿中、糞便中、または唾液中で生じる、精子細胞または血液細胞の両方を含む。高等真核生物細胞は、哺乳動物細胞、特に好ましくはヒト細胞であることが好ましい。また、水溶液、例えば、緩衝液中の試料の懸濁物またはスラリーも、本方法の出発物質として利用される。

解析される試料は、微生物細胞、遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、場合によってウイルス、および高等真核生物細胞の混合物を流体中に含む。試料は、天然環境、例えば、植物、動物、またはヒトに由来することが好ましい。試料は、哺乳動物、特に好ましくはヒトに由来する、穿刺液、脳脊髄液、リンパ液、滑液、腹水または胸膜液、骨髄、血液、より具体的には全血、精液、尿、糞便、唾液、および気管支肺胞洗浄液、これらの濃縮物もしくは希釈液、またはスワブにより取得された細胞物質の再懸濁物を含む体液であることが好ましい。試料は、血液、または血小板濃縮物もしくは赤血球濃縮物などの血液濃縮物であることが特に好ましい。

本発明の目的では、微生物細胞とは、天然においてそれ自体が単一の細胞としてまたは細胞クラスターとして存在する多様な生物群を指し、したがって、天然において単一の細胞としては存在せず、もっぱら細胞が特化している多細胞生物の構成要素として存在する高等真核生物細胞とは異なる。本発明の目的では、「微生物細胞」という用語は、とりわけ、原核生物細胞、例えば、細菌または古細菌を意味すると理解されるが、また、微細藻類（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｌｇａｅ）、酵母、真菌、または原虫などの下等真核生物の細胞も意味すると理解される。好ましい実施形態では、微生物細胞が、細菌細胞および／または下等真菌細胞である。

本明細書における「細菌」という用語は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌、より具体的には、属であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉｏａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、およびＶｉｂｒｉｏの細菌を含む。

それらの核酸が本発明に従う方法により蓄積および／または単離されうる真菌細胞とは、より具体的には、属であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｋｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ａｌｔｅｎａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｈｅｌｍｉｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ、Ｈｅｍｉｓｐｏｒａ、Ｐｈｏｍａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、およびＴｈｉｅｌａｖｉａの真菌、より具体的には、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、 Ａ． ｔｅｒｅｕｓ、Ａ． ｎｉｇｅｒ、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ． ｈｏｍｅｇａｄｕｓ、Ａ． ｆｌａｖｕｓ、Ｂ． ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ． ｒｈａｎａｒｕｍ、Ｃ． ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｃ． ｃｏｒｅｂｉｏｂｉｄｅｓ、Ｃ． ｒｅｇａｔｕｍ、およびＣ． ｄｉｏｓｐｙｒｉに由来する細胞である。

さらには、属であるＣａｎｄｉｄａの病原性酵母、例えば、Ｃ． ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ． ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ． ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ． ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ． ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉなどの核酸も蓄積および／または単離することができ、同様に、藻類に由来する核酸、例えば、Ｅｕｇｌｅｎａの種、Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓの種、Ｔｒａｃｈｅｌｏｍｏｎａｓの種、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｎｉｔｒａ、Ｃｅｒａｔｉｕｍ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、またはＥｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａに由来する核酸、または、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、好ましくはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｅｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓなどの原虫に由来する核酸も蓄積および／または単離することができる。

さらにまた、例えば、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＤＮＡ、ならびに／またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡなどのウイルス核酸も、必要に応じて、本発明に従う方法により蓄積および／または単離することができる。

本発明に従う方法は、特定の試料容量に制約されず、μｌ範囲の試料容量およびこれとは異なってより多い試料容量、例えば、５０ｍｌまたは１００ｍｌのいずれも処理することが可能であり、よって、本方法で用いられる、以下で言及される試薬および溶液の量および容量、ならびに同様に個々の手順ステップの持続時間を、適当な場合、当業者に公知の基準に従い、試料量に適切な形で適合させる。試料容量は、１〜２０ｍｌ、より好ましくは２〜１５ｍｌ、および特に好ましくは３〜８ｍｌの範囲であることが好ましい。

例えば、本発明に従う方法の手順ステップ１および３における固体成分から、試料中に存在する遊離の循環核酸、および追加として任意のウイルスなど、それらの液体成分に溶解している物質を含めた液体成分を、例えば、濾過、遠心分離、またはデカンテーションにより分離することができる。手順ステップ１における固体成分から、該液体成分を、手順ステップ３における方法と同じ方法により分離することもでき、異なる方法により分離することもできる。全血試料を遠心分離することにより該試料から血漿を取得するための、先行技術において公知である方法に従い、本発明に従う方法の手順ステップ１および／または３における固体成分から、該液体成分を分離することが好ましい。試料は、２〜３０分間にわたり、より好ましくは５〜２０分間にわたり、および特に好ましくは１０〜１５分間にわたり遠心分離することが好ましい。試料は、２０００〜１０，０００ｇの範囲の加速度、好ましくは５０００ｇの加速度で遠心分離することが好ましい。試料を遠心分離することにより、本発明に従う方法の手順ステップ１および手順ステップ３の両方における固体成分から、該液体成分を分離する場合、該遠心分離の加速度および持続時間は、２つの手順ステップにおいて同じ場合もあり、異なる場合もある。例えば、全血試料を処理する場合は、５０００ｇ±５００ｇで１０分間にわたる遠心分離を介する第１の手順ステップにおいて、固体試料成分、より具体的には血液細胞および微生物細胞から、血漿中で遊離して循環する核酸、より具体的には微生物核酸、および存在する場合はウイルスを含めた血漿を除去することができる。遠心分離された試料の上清を除去し、その後、微生物細胞を同時に溶解させることなしに、固体試料成分中、すなわち、ペレット中に存在する真核生物細胞を選択的に溶解させた後で、その液体成分に溶解している物質を含めた、このステップで得られた液体成分（溶解物）、より具体的には、放出された真核生物細胞成分を、例えば、５０００±５００ｇで１５分間にわたる、さらなる遠心分離ステップによって、微生物細胞を含めた固体成分から分離することができる。

遠心分離後、この目的で当業者に公知である任意の方法により、例えば、上清をデカントするかまたはピペッティングで除くことにより、上清を固定成分から除去することができる。

本発明に従う方法の手順ステップ２における真核生物細胞の選択的溶解は、
１．チオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴ）、過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、尿素、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック物質と、
２．特に、脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と、
３．トリス、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質と
を含む混合物（緩衝液１）において実施することが好ましい。

本発明の目的では、「溶解」という用語は、細胞の核酸を囲む膜および／または細胞壁の少なくとも部分的な破壊により、細胞を少なくとも部分的に破壊し、それらを周囲の培地から分離するための方法を意味すると理解される。これらの構造を少なくとも部分的に破壊することにより、タンパク質および核酸などの細胞成分が、周囲の液体に放出される。本発明の目的では、高等真核生物細胞の選択的溶解とは、微生物細胞は溶解させずに、混合試料中の高等真核生物細胞だけを溶解させ、したがって、溶解後には、真核生物細胞の細胞内核酸だけが混合物中に存在する一方、微生物細胞の細胞内核酸は、それらを囲む細胞壁により引き続き保護される方法を指す。この選択的溶解のステップでは、試料中に存在する高等真核生物細胞のうちで溶解させる細胞が、５０％を超え、より好ましくは７５％を超え、なおより好ましくは９０％を超え、および最も好ましくは９８％を超えるのに対し、微生物細胞のうちで溶解させる細胞は、好ましくは５０％未満であり、より好ましくは２０％未満であり、なおより好ましくは１０％未満であり、最も好ましくは１％未満であることが好ましい。この種の選択条件は、例えば、用いられる溶解緩衝液の成分、該溶解緩衝液中の該成分の濃度、および試料溶液中の溶解緩衝液の全濃度を介して調整することができ、これは、当業者に公知であり、以下で列挙される例により明確化される。

カオトロピック物質とは、水中の規則的な水素結合に干渉する能力を有する化合物を指す。水構造物に対する干渉は、水溶液のエントロピーを増大させ、この溶液中の非極性物質の溶解性を増大させる。結果として、疎水性相互作用が極小化され、タンパク質の変性および細胞壁／形質膜の溶解がもたらされる。カオトロピック物質は、例えば、ホフマイスター順列において見出される。特に有用な物質は、例えば、既に言及したグアニジニウム化合物、さもなければ過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、または尿素である。本発明の目的で好ましい過塩素酸アルカリは、過塩素酸ナトリウムおよび過塩素酸カリウムであり、好ましいヨウ化アルカリは、ヨウ化ナトリウムおよびヨウ化カリウムである。

本発明の目的では、界面活性剤とは、少なくとも１つの親水性部分と、少なくとも１つの疎水性部分とを特色とする、有機界面活性物質を意味すると理解される。本発明の目的では、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアニオン性界面活性剤、四級テトラアルキルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムクロリドなどのカチオン性界面活性剤、例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）などの両性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤、またはこれらの混合物を用いることができる。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、または各種の非イオン性界面活性剤の混合物であることが好ましい。本発明の目的では、非イオン性界面活性剤は、例えば、Ａｒｌａｃｅｌ ８３、Ｓｐａｎ ６５、Ｓｐａｎ ８０、またはＳｐａｎ ８５の商標名で市販されている、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタンなど、脂肪酸のソルビタンエステル、対応するラウレート、パルミテート、ステアレート、またはこれらの混合物；例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０またはＴｗｅｅｎ ８５の商標名で市販されている、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、セスキオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、対応するラウレート、パルミテート、ステアレート、またはこれらの混合物；例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、またはこれらの混合物、例えば、Ｂｒｉｊ ５８またはＢｒｉｊ ９８の商標名で市販されている、エイコサエチレングリコールヘキサデシルエーテルなど、脂肪酸アルコールのポリオキシエチレンエーテル；例えば、直鎖状または分枝状のＣ_８アルキル残基を有するアルキルフェノールポリグリコールエーテル、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−５２０またはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０の商標名で市販されている、例えば、９〜１０の酸化エチレン単位を有する、ポリエチレングリコール［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］エーテルなど、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル；さらには、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃの商標名で市販されている、酸化エチレンおよび酸化プロピレンのブロックコポリマーである「ポロキサマー」であることが特に好ましい。上記の物質において、分子量が中程度の脂肪酸および脂肪アルコールならびに高分子量の脂肪酸および脂肪アルコール、すなわち、それぞれ、８〜１２個および１３〜３０個の炭素原子を有する脂肪酸および脂肪アルコールを、互いに独立して用いることが好ましい。これらの脂肪酸および脂肪アルコールは、飽和脂肪酸および飽和脂肪アルコールの場合もあり、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪アルコールの場合もある。界面活性剤は、溶解緩衝液中の個々の化合物の混和性、および該溶解緩衝液の試料との混和性の両方を増大させる。さらに、界面活性剤はまた、細胞の細胞壁構造物または形質膜構造物の破壊も能動的に達成しうる。

本発明の目的では、緩衝剤物質とは、溶液中において、反応または外部からの添加を介して、プロトンが放出されるのか、または消費されるのかに応じて、プロトンを受容または放出することによって、上記緩衝剤物質を含む溶液のｐＨを一定に保つ、酸およびその共役塩基による系を指す。したがって、本発明の目的では、緩衝剤物質を、溶媒および実質的な緩衝剤物質だけでなく、例えば、塩、界面活性剤、およびカオトロピック剤など、さらなる物質もまた含みうる緩衝剤溶液（また、緩衝液とも称する）と区別すべきである。本発明の目的では、緩衝剤溶液のｐＨを６〜１０の範囲、より好ましくは７〜９の範囲、最も好ましくは８に安定化させる緩衝剤物質が好ましい。本発明の目的ではまた、両性緩衝剤物質、すなわち、同じ分子内に、少なくとも１つの酸性基と、少なくとも１つの塩基性基とを保有し、したがって、酸としても塩基としても反応しうる化合物も好ましい。

特に好ましい実施形態では、本発明に従う緩衝液１を添加した後における試料中の緩衝剤成分濃度が、（１）カオトロープ、好ましくは、上に記載した、グアニジニウムを含むカオトロープ０．１〜２Ｍ、好ましくは０．２〜１Ｍ、より好ましくは０．４〜０．８Ｍの；（２）界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤０．５〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１．８〜３％（ｗ／ｖ）；および（３）最も好ましくはｐＨ８．０において緩衝剤物質２〜５０ｍＭ、好ましくは４〜３０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭであるように、該緩衝液を、溶解緩衝液１として、溶解させる試料に添加する。溶解液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）においてこの種の濃度に到達するために、好ましい実施形態では、以下の濃度を有する緩衝液を用いる：（１）好ましくはグアニジニウムを含むカオトロープ０．２〜４Ｍ、好ましくは０．４〜３Ｍ、より好ましくは２Ｍ；（２）界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）；および（３）ｐＨが好ましくは６．０〜１０．０の範囲にあり、より好ましくは７．０〜９．０の範囲にあり、最も好ましくは８．０である緩衝剤物質２〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭ。

本発明に従う方法の手順ステップ３における固体成分からの液体成分の分離であって、遠心分離により達成されることが好ましい分離については、既に上に記載した。液体成分を除去した後に残る容量の液体中に固体成分を分散させる目的で、例えば、この液体中で試料を短時間にわたり振とうすることにより、該液体成分から除去された該固体成分、特に微生物細胞を含む、この分離で得られるペレットを、本発明に従う方法のステップ４において再懸濁させる。あるいはまた、振とう前または振とうの間において、該試料に少量の水、適切な緩衝剤溶液、または他の適切な溶媒を供給することもできる。また、ペレットを、適切な洗浄液、例えば、溶解緩衝液中で洗浄する中間的なステップも導入することができる。

本発明に従う方法の手順ステップ５における微生物細胞は、原則として、当業者に公知であり、該微生物細胞の細胞壁および／または形質膜を少なくとも部分的に破壊し、細胞内に存在する細胞成分、より具体的には核酸を、周囲の液体に放出させるのに適する任意の方法を用いて溶解させることができる。先行技術では、例えば、融解および凍結の反復、リソスタフィン、リチカーゼ、またはリゾチームなどの酵素による処理、適切な濃度のカオトロピック物質または界面活性剤などの化学的薬剤の添加など、多様な種類の微生物細胞に対する複数の方法が記載されている。同時に実施することもでき、逐次的に実施することもできる、各種の溶解法を溶解手段の適合性に応じて組み合わせることが、特に極めて有効である。本発明に従う方法の手順ステップ５における微生物細胞の少なくとも部分的な溶解は、機械的に達成することが好ましい。適切な機械的方法は、例えば、フレンチプレス、細胞ミル、または乳鉢による微生物細胞の処理、さらには超音波処理を含む。適切な粒子、より具体的にはビーズ、好ましくはガラスビーズを用いる試料の機械的ホモジナイズにより、本発明に従う方法の手順ステップ５において微生物を溶解させることが特に好ましい。この溶解では、微生物細胞を含む試料とガラスビーズとの機械的混合を、例えば、実験室用のボルテックス装置であるＱＩＡＧＥＮ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｌｙｓｅｒ、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ装置など、この試料を水平方向および／または垂直方向に振とうする装置内で実施することが好ましい。試料の機械的ホモジナイズは、追加として、溶解特性も示しうる緩衝剤溶液の存在下で実施することが好ましい。特に好ましい実施形態では、緩衝剤溶液、より具体的には溶解特性を有する緩衝液の存在下で、サイズが４００〜６００μｍの範囲にあるガラスビーズを用いることにより、本発明に従う方法の手順ステップ５において、微生物細胞を溶解させる。

さらに、溶解特性も呈示する、上記の機械的溶解において用いるのに適する緩衝剤溶液（緩衝液２）は、
１．トリス−ＨＣｌ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質と、
２．二価金属イオンの、少なくとも１つの錯化剤、好ましくはＥＤＴＡと、
３．脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と、
４．必要に応じて、Ｒｅａｇｅｎｔ ＤＸ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＲＥ（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および類似の適切な発泡抑制剤を含む群から選択されることが好ましい発泡抑制剤と
を含み、ｐＨが６〜１０の範囲にあり、好ましくは７〜９の範囲にあり、最も好ましくは８であることが好ましい。

本発明の目的では、緩衝剤物質および界面活性剤という用語の意味、さらには好ましい実施形態については、溶解緩衝液１についての上記で既に説明した。緩衝液１について言及した実施形態は、緩衝液２の成分としても同様に好ましく、緩衝液２に用いられる非イオン性界面活性剤は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の商標名で市販されている、直鎖状または分枝状のＣ_８アルキル残基を有するアルキルフェノールポリグリコールエーテルなど、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテルであることが特に好ましい。

さらに、緩衝液２は、錯化剤、より具体的には二価金属イオンの錯化剤を含む。金属イオンおよびより具体的には二価金属イオンを錯体化することが可能なすべての物質、例えば、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、またはＥＤＴＡがこの目的に適し、ＥＤＴＡが好ましい。

必要に応じて、緩衝液２は追加として発泡抑制剤も含んでよいが、それにより、機械的溶解の間に、試料が過剰に発泡し、極端な場合、試料が試料容器から望ましくない形で漏れ出て物質が失われることを防止することができ、さらにまた、とりわけ、体積の増加によるその後の試料処理の複雑化についてもそれを防止することができる。本発明の目的では、例えば、市販の発泡抑制剤であるＲｅａｇｅｎｔ ＤＸ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＲＥ（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が好ましい。溶解緩衝液が発泡抑制剤を含む場合、この阻害剤は、該緩衝液の全組成に基づき、０．１〜１％（ｖ／ｖ）の百分率で存在することが好ましい。

また溶解特性も有利に呈示する緩衝液２は、（１）緩衝剤物質、（２）錯化剤、（３）界面活性剤、および（４）必要に応じて、Ｒｅａｇｅｎｔ ＤＸなどの発泡抑制剤を含み、ｐＨが７．０〜９．０の範囲にあることが特に好ましい。各々の緩衝液成分は、機械溶解の間では、（１）緩衝剤物質２〜２０ｍＭ、好ましくは４〜１５ｍＭ、より好ましくは５〜１０ｍＭ、（２）錯化剤０．１〜５ｍＭ、好ましくは１〜４ｍＭ、より好ましくは２〜３ｍＭ、（３）界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤０．１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１．８〜２％（ｗ／ｖ）、および（４）必要に応じて、発泡抑制剤０．１〜１％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．３〜０．９％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．５〜０．７％（ｖ／ｖ）の濃度で、好ましくは７．０〜９．０の範囲内、より好ましくは８．０のｐＨで存在することが好ましい。この種の溶解条件をもたらす適切な緩衝剤溶液は、好ましくは、（１）５〜５０ｍＭ、好ましくは８〜２５ｍＭ、より好ましくは１０〜２０ｍＭの緩衝剤物質、（２）０．５〜１０ｍＭ、好ましくは１〜８ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭの錯化剤、（３）０．２〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１．２〜２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（４）必要に応じて、０．１〜３％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．２〜２％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．５〜１％（ｖ／ｖ）の、例えば、Ｒｅａｇｅｎｔ ＤＸなどの発泡抑制剤を含み、好ましくはｐＨが７．０〜９．０の範囲内、より好ましくは、８．０である。

上記の溶解法が、微生物細胞の完全な溶解をもたらさず、その微生物細胞の部分的な溶解をもたらすに過ぎないことが実際には生じうるので、好ましい実施形態ではさらに、溶解液を用いて実施することが好ましい下流の溶解法も施される。しかしまた、あらかじめ機械的溶解を実施することなく、適切な溶解液により微生物細胞を直接溶解させることも可能である。

特に微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸の精製および濃縮が、プロテアーゼによる消化を包含することは特に有利なので、この消化を、上記の溶解ステップと組み合わせることが好適でありうる。しかしまた、プロテアーゼ消化を別の手順ステップにおいて実施することも可能であり、例えば、機械的溶解と組み合わせて実施することもでき、後続の精製工程および／または濃縮工程において実施することもできる。

手順ステップ５に対応する微生物細胞の溶解を最適化するためには、プロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ、および溶解緩衝液（緩衝液３）を、手順ステップ４からの懸濁物、または上記の先行する機械的溶解から結果として得られる溶解物に添加することにより、少なくとも部分的に溶解を達成することが有利であり、これは、適当な場合、同様に少なくとも部分的に溶解性である緩衝液により支援される。緩衝液３は、
１．チオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴ）、過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、尿素、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック物質と、
２．脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪酸アルコールのポリオキシアルキレンエーテル、アルキルフェノールのポリオキシアルキレンエーテル、ポロキサマー、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが特に好ましい、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と、
３．トリス、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの混合物が好ましい、少なくとも１つの緩衝剤物質と
を含むことが好ましい。

得られた混合物を、好ましくは４５°〜７０℃で５〜４０分間にわたり、より好ましくは５０〜６５℃で１０〜２０分間にわたり、特に好ましくは６０℃で１５分間にわたりインキュベートして、プロテアーゼを活性化させる。この目的では、試料を、試料容量の４０〜１５０％、好ましくは７０〜１１０％、およびより具体的には９０％である容量の緩衝液３、ならびに容量が、試料容量の１〜３０％、好ましくは５〜２０％、および特に好ましくは１０％であるプロテアーゼ溶液、好ましくは、例えば、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）として市販されている、＞６００ｍＡＵ／ｍｌ（ＡＵ：アンソン単位）であるプロテイナーゼＫ溶液と混合することが好ましい。例えば、特に好ましい実施形態では、５ｍｌの試料に、４ｍｌの緩衝液３および０．５ｍｌのプロテアーゼ溶液を添加する。

溶解の間では、緩衝剤溶液のうちの上記の物質が、より具体的には、（１）カオトロープが１〜５Ｍ、（２）界面活性剤が５〜２０％（ｗ／ｖ）、および（３）緩衝剤物質が２０〜１００ｍＭの濃度で、より具体的にはｐＨ８．０で存在する場合に、特に良好な結果が達成される。

この種の溶解条件をもたらす適切な緩衝液は、（１）３〜１０Ｍ、好ましくは４〜８Ｍ、より好ましくは４．５〜６Ｍのカオトロープ、（２）１０〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１５〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２０〜２５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（３）４０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭ、より好ましくは７０〜１００ｍＭの緩衝剤物質を含み、より具体的にはｐＨが８．０である。

特に好ましい実施形態では、上記の緩衝液３を、手順ステップ１からの液体成分にあらかじめ添加した。

本発明に従う方法の好ましい実施形態では、細胞内微生物核酸および遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸の両方、および追加として、特に好ましくは、ウイルス核酸を、蓄積および／または単離する。

この目的では、本発明に従う方法の手順ステップ１において取り出され、遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む液体成分を、手順ステップ５において得られ、本発明に従う方法の手順ステップ６において精製および／または濃縮される前の細胞内微生物核酸を含む溶解物と混合することができる。この場合、本発明に従う方法の手順ステップ１において取り出され、遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む液体成分を、それを取り出した直後に上記の緩衝液３に添加し、その中でこれを保存しうることが好ましい。次いで、その後、上記の通り、任意選択の上流の機械的溶解ステップにおいて得られ、細胞内微生物核酸を含む溶解物を、溶解を最適化する目的でこの混合物に添加することができる。

あるいは、本発明に従う方法の手順ステップ１において得られ、遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む液体成分、ならびに手順ステップ５において得られ、細胞内微生物核酸を含む溶解物を、互いに独立して精製および／または濃縮することもできる。手順ステップ１で得られた液体成分がまた、ウイルスも含み、ウイルス核酸の単離が所望される場合は、この液体成分を、該ウイルス核酸を放出させるさらなるステップにさらにかけることが好ましい。この目的のための方法は、当業者に公知であり、化学溶解および／またはプロテイナーゼ消化を含むことが典型的である。

各々の場合の個別の試料混合物における、手順ステップ４からの懸濁物または上記の先行する機械的溶解の結果として得られる溶解物、および手順ステップ１において得られた液体成分の両方に、プロテアーゼ消化のためのプロテーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ、より具体的には緩衝液の形態であるプロテイナーゼＫを添加することができる。あるいは、機械的溶解による溶解物、および手順ステップ１からの液体成分を、必要に応じて、緩衝液３と組み合わせて混合してから、プロテアーゼを含有する緩衝液を添加することもできる。

プロテアーゼを含有する緩衝液を、機械的溶解による溶解物だけに添加することも同様に可能である。次いで、その後、手順ステップ１による液体成分に由来する細胞外核酸を、下流の化学的溶解による溶解物中に存在する細胞内核酸と共に、以下で説明される、さらなるステップ６ａ〜６ｄに従い、併せて（混合して）精製および／濃縮することもでき、互いに独立して精製および／濃縮することもできる。

本発明に従う方法のステップ６における、微生物核酸およびウイルス核酸の精製および／または濃縮は、以下のステップ：
６ａ）手順ステップ５からの溶解物に、（１）直鎖状または分枝状のＣ_１〜Ｃ_４アルコール、より具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、またはｔｅｒｔ−ブタノール、好ましくはイソプロパノールと、（２）緩衝液３に対応する緩衝液との、好ましくは、緩衝液３の容量２０〜７０％に対して、直鎖状または分枝状のＣ_１〜Ｃ_４アルコールの容量３０〜８０％の比による混合物を含むことが好ましい混合物（結合緩衝液）を添加し、結果として得られる混合物をインキュベートするステップと、
６ｂ）該試料を、適切なクロマトグラフィー装置、好ましくは、微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を、吸着、特に好ましくはシリカベースの吸着により選択的に結合させるためのクロマトグラフィー装置にアプライするステップと、
６ｃ）必要に応じて、該結合させた微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を、１回以上にわたり、好ましくは（１）チオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴ）、過塩素酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、およびこれらの混合物を含む群から選択されることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック物質、（２）直鎖状または分枝状のＣ_１〜Ｃ_４アルコール、好ましくはエタノール、ならびに（３）濃度が２〜４Ｍの範囲にあることが好ましい、少なくとも１つのカオトロピック塩を含む第１の溶液（洗浄緩衝液１）で洗浄し、好ましくは、その後、（１）直鎖状または分枝状のＣ_１〜Ｃ_４アルコール、好ましくはエタノール、（２）濃度が１０〜２００ｍＭの範囲にある非カオトロピック塩、好ましくは塩化ナトリウム、および（３）１〜２５ｍＭの、トリス、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、またはこれらの混合物（ｐＨ７．５）であることが好ましい緩衝剤物質を含むが、カオトロピック物質を含まない第２の溶液（洗浄緩衝液２）により洗浄するステップと、
６ｄ）必要に応じて、好ましくは水、または（１）少なくとも１つの緩衝剤物質、および（２）金属イオン、より具体的には、二価金属イオンに対する、少なくとも１つの錯化剤を含む溶液（溶出緩衝液）により、該微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を溶出させるステップと
を含むことが好ましい。同様に、他の従来の溶出剤も用いることができる。

試料に添加される結合緩衝液の容量は、試料容量の１００〜５００％の範囲であることが好ましく、試料容量の２００〜４００％の範囲であることが好ましく、試料容量の３２０％であることが特に好ましい。その後、結果として得られる混合物を、−５〜５℃で１〜２０分間にわたり、特に好ましくは、０℃で２〜１０分間にわたり、より具体的には０℃で５分間にわたりインキュベートすることが好ましい。

得られた微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を、吸着により、好ましくは、適切な結合緩衝液を添加すると、溶液中に存在する核酸分子には実質的かつ選択的に結合する一方、該溶液中に存在するタンパク質およびさらなる細胞成分、ならびに塩、緩衝剤物質、界面活性剤などの緩衝液成分は溶液中に残存させ、洗浄溶液により、該結合させた核酸からこれらを除去しうる、シリカベースのマトリックスへの吸着により固体マトリックスに選択的に結合させることにより、該微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を、試料成分の残りから除去することが好ましい。本発明の目的では、マトリックスを介する核酸の「選択的結合」（「ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ」および「ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ」）という用語は、核酸分子のマトリックスとの特異的相互作用（複合体化、付着などを介する化学的結合または物理的結合）を意味する一方、マトリックスが、核酸ではないさらなる試料成分、例えば、塩、タンパク質などとは相互作用しないか、またはこれらと相互作用する程度が低いことを意味すると理解される。しかし、マトリックスが、由来の異なる核酸と異なる形で相互作用することは必要でない、すなわち、真核生物核酸と比較した場合に、微生物核酸との相互作用の種類および強度が異なる必要はない。適切なシステムは当業者に公知であり、例えばまた、試料中に存在するＤＮＡだけに選択的に結合する一方、試料中に存在するＲＮＡ分子、さらには、試料中に存在するタンパク質およびさらなる試料成分、ならびに緩衝液成分は溶液中に残存させるフォーマットにおいても、複数の構成で市販されている。単離するのがＤＮＡに限り、ＲＮＡではない場合は、この種のフォーマットが特に好ましい。本発明の目的では、例えば、洗浄および溶出が、遠心分離または真空の適用により単純かつ迅速に実施されうるスピンカラムの形態であることが好ましい、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に存在するＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＭｉｎｉカラムまたはＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムが特に好ましい。結合させた微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を必要に応じて洗浄するステップに用いられる洗浄緩衝液１および２の容量は、ステップ６ｂで用いられるクロマトグラフィー装置のサイズおよび寸法、さらには、アプライされる試料の量の関数である。対応する情報は、各々の製造元のプロトコールにおいて見出すことができる。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉカラムの場合、例えば、元の試料容量が１０ｍｌであるヒト全血から取得された試料を精製するのに好ましい洗浄溶液１および２の容量は、５００〜９００μｌの範囲にある。

結合させた核酸を洗浄した後で、カラムを乾燥させてから、本発明に従う方法のステップ６ｄ）において、カラムから核酸を必要に応じて溶出させうることが好ましい。この目的では、カラムを、例えば、５００〜９００μｌのエタノールですすぎ、その後、最大速度で遠心分離し、次いで、室温または高温（４０〜６５℃）で乾燥させることができる。

本発明に従う方法のステップ６ｄ）において必要に応じて用いられる溶出緩衝液は、トリス−ＨＣｌおよびＥＤＴＡ、特に好ましくは２〜２０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび０．１〜１ｍＭのＥＤＴＡ、より具体的には１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むことが好ましい。溶出緩衝液の容量もまた、クロマトグラフィー装置の種類および寸法、ならびに該クロマトグラフィー装置にアプライされる試料の量の関数である。好ましい容量は、例えば、クロマトグラフィー装置の製造元による指示書において見出すことができる。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉカラムおよび出発試料量が約１０ｍｌの全血を用いる場合、溶出緩衝液の容量は、２０〜２００μｌであることが好ましい。例えば、溶出緩衝液を添加した後で、カラムを、室温で短時間にわたり（約１〜５分間にわたり）インキュベートしてから、例えば、２０，０００ｇで０．５〜３分間にわたる、最大速度の遠心分離により核酸を溶出することが好ましい。

しかし一般にはまた、先行する溶出なしに、結合させた核酸をさらに処理および／または解析することも可能である。

本発明は、微生物細胞および高等真核生物細胞、ならびに遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、さらには場合によって追加として、ウイルスの混合物を液体中に含む試料から、細胞内微生物核酸、さらには遊離の循環核酸、より具体的には細胞外微生物核酸、さらには任意のさらなるウイルス核酸を、選択的に蓄積および／または単離するためのキットであって、
１．溶解特性を有することが好ましい、上記で既に詳細に説明されている第１の緩衝液（緩衝液１）と、
２．溶解特性を有することが好ましい、少なくとも１つの第２の緩衝液（緩衝液２）、および／または溶解特性を有することが好ましく、同様に上記で既に詳細に説明されているさらなる緩衝液（緩衝液３）と、
３．直径が４００〜６００μｍの範囲にあることが好ましく、直径が５００μｍであることが特に好ましいガラスビーズと
を含むキットをさらに提供する。

好ましい実施形態では、キットが、微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を精製および／または濃縮するためのクロマトグラフィー装置、好ましくは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、吸着、特に好ましくはシリカベースの吸着により選択的に結合させるためのクロマトグラフィー装置をさらに含み、また、結合緩衝液、好ましくは、既に規定した結合緩衝液、必要に応じて１つ以上の洗浄緩衝液、好ましくは上記で既に規定した２つの洗浄緩衝液、および必要に応じて溶出緩衝液、好ましくは上記で既に規定した溶出緩衝液もさらに含む。必要に応じて、キットは、マルチプレックスアッセイで蓄積および／または単離された核酸を検出するための構成要素、例えば、マルチプレックスＰＣＲで得られたＤＮＡを検出するための複数のプライマー対、適切なＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、Ｍｇ^２＋イオンの供給源および／またはＰＣＲに適する緩衝剤溶液をさらに含みうる。

（実施例１）
全血試料からの真菌ＤＮＡの選択的な蓄積および単離
全血に、遊離ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＤＮＡ（全血１ｍｌ当たり、１×１０^４個のゲノム当量）、ならびにＣ． ａｌｂｉｃａｎｓおよびＩ． ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの細胞（各場合において、全血１ｍｌ当たり、１×１０^４個の細胞）をスパイクした。真菌ＤＮＡを単離するために、スパイクした血液の一部を、合計４つの異なる方法Ａ〜Ｄにより処理した。

Ａ（ヒト核酸を枯渇させず、機械的前溶解ステップを伴わない比較法）：スパイクした全血５００μｌに、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および０．５％のＲｅａｇｅｎｔ ＤＸを含む２５０μｌの溶解緩衝液２を添加し、これと混合した。得られた混合物に、市販のＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５００μｌ、さらには、５０μｌのＱｉａｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５６℃で１０分間にわたりインキュベートした。その後、製造元の指示書に従い、キット中に存在するミニカラムならびに洗浄緩衝液および溶出緩衝液を用いるＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて核酸を単離し、該カラムに結合させた核酸を、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２の各々７５０ｍｌにより洗浄し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥで溶出させた。

Ｂ（ヒト核酸を枯渇させない比較法）：スパイクした全血１ｍｌに、５００μｌの溶解緩衝液２、さらには、直径５００μｍのガラスビーズ８００ｍｇを添加し、ボルテックスすることにより１０分間にわたり混合し、機械的破壊を達成した。得られた５００μｌの混合物に、市販のＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５００μｌ、さらには、５０μｌのＱｉａｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５６℃で１０分間にわたりインキュベートした。その後、製造元の指示書に従い、キット中に存在するミニカラムならびに洗浄緩衝液および溶出緩衝液を用いるＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて核酸を単離し、該カラムに結合させた核酸を、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２の各々７５０ｍｌにより洗浄し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥで溶出させた。

Ｃ：スパイクした全血５ｍｌに、１．５ＭのＧＴＣ、６．７％のＢｒｉｊ ５８、および３３ｍＭのトリス（ｐＨ８）を含む１．９ｍｌの溶解緩衝液１を添加し、この混合物を室温で１０分間にわたりインキュベートし、その後、５０００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後に得られた上清を廃棄し、約５０μｌの容量を残した。残るペレットを、約４５０μｌのＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、ならびにリン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素カリウムによる１２ｍＭの全リン酸塩を含む）に再懸濁させた。得られた混合物（約５００μｌ）を、２５０μｌの溶解緩衝液２、および直径約４２５〜６００μｍのガラスビーズ４００ｍｇを含有する新たな容器に移した。ボルテックスすることにより１０分間にわたり試料を混合し、機械的破壊を達成した。得られた５００μｌの上清に、市販のＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５００μｌ、さらには、５０μｌのＱｉａｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５６℃で１０分間にわたりインキュベートした。その後、製造元の指示書に従い、キット中に存在するミニカラムならびに洗浄緩衝液および溶出緩衝液を用いるＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて核酸を単離し、該カラムに結合させた核酸を、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２の各々７５０ｍｌにより洗浄しカラムを乾燥させてから、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥで溶出させた。

Ｄ．（本発明による方法）：スパイクした全血１０ｍｌを約５０００ｇで１０分間にわたり遠心分離し、血漿中に存在する細胞外核酸を含めた血漿を取り出した。遠心分離を実施した後で、上相の血漿（約４．５ｍｌ）を取り出し、新たな容器に移した。ＰＢＳ緩衝液を添加することにより、固体成分の容量を最大１０ｍｌとした。３．７５ｍｌの溶解緩衝液１を添加した後に、得られた混合物を、室温で１０分間にわたりインキュベートした。弱溶解緩衝液は、ヒト細胞だけを溶解させ、微生物細胞には依然として完全性を維持させる。その後、試料を約５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。２５０μｌの容量を残して、得られた上清を除去し、これを廃棄した。この上清は、特に、ヒトＤＮＡを含み、あるいはまた、別個の核酸分別精製手順にさらに用いることもできる。残るペレットに、各々２５０μｌのＰＢＳ緩衝液および溶解緩衝液２を添加した。サイズが４２５〜６００μｍのガラスビーズ４００ｍｇを添加し、その混合物を、ボルテックスするか、または５０ＨｚでＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴを用いることにより、１０分間にわたり混合し、機械的破壊を達成した。５００μｌの上清を、既に取り出した血漿画分に添加し（また、液体試料の材料の損失を最小限にするため、機械的に破壊された試料の混合物およびガラスビーズを、目の粗いフィルターを介して、該血漿画分に直接に濾過することも可能である）、４．５ＭのＧＴＣ、２０％のＢｒｉｊ ５８、および１００ｍＭのトリス（ｐＨ８）を含む４ｍｌの溶解緩衝液３、ならびに５００μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した。得られた混合物を、６０℃で２０分間にわたりインキュベートし、１．２ＭのＧＴＣ、５．５％のＢｒｉｊ ５８、２７．６ｍＭのトリス、および７２％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールを含む９ｍｌの結合緩衝液を添加し、ボルテックスすることにより混合し、氷上で５分間にわたりインキュベートした。その後、真空下において、カラムにアプライされる試料自体の容量より多い試料容量を可能とする補助カラム（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、例えば、２０ｍｌのＥｘｔｅｎｄｅｒ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の助けにより、試料をＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムに引き入れ、試料中に存在する核酸を、該カラムに選択的に結合させた。次いで、カラムに結合させた核酸を、市販のＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２の各々７５０ｍｌで洗浄し、カラムを乾燥させ、市販の５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でその核酸を溶出させた。ＵＶ−可視分光光度法により、溶出物中の全ＤＮＡ（ヒトＤＮＡおよび真菌ＤＮＡ）の量を決定した（図１）。真菌ＤＮＡを検出するには、各精製試料８μｌを採取し、マルチプレックスＰＣＲにかけた。その結果を図２に示す。

（実施例２）
全血試料からの細菌ＤＮＡの選択的な蓄積および単離
全血に、遊離のＳ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＤＮＡ（全血１ｍｌ当たり、１×１０^４個のゲノム当量）、ならびにＥ． ｃｏｌｉおよびＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓの細胞（各場合において、全血１ｍｌ当たり、１×１０^４個の細胞）をスパイクした。細菌ＤＮＡを単離するために、スパイクした血液の一部を、合計３つの異なる方法である、実施例１に記載したＡ、Ｂ、およびＤにより処理した。細菌ＤＮＡを検出するために、各精製試料７．５μｌを採取し、マルチプレックスＰＣＲにかけた。その結果を図３に示す。

（実施例３）
全血試料からのウイルス核酸の選択的な蓄積および単離
各場合において、血液試料中のウイルス濃度５．０×１０^４ＩＵ／ｍｌ（１ミリリットル当たりの国際単位）が得られるように、ヒト全血に、市販のＨＢＶ基準物質およびＨＣＶ基準物質（Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ Ｂｅｎｉｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）をスパイクした。

ウイルス核酸を単離するために、試料を２つの異なる方法で処理した。第１の場合には、スパイクした血液の一部を遠心分離することにより得られた５００μｌの血漿を、製造元の指示書に従い、市販のＱＩＡＧＥＮ ＤＳＰ Ｖｉｒｕｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理した。他の場合には、８ｍｌのスパイクした全血を、実施例１のＤにおいて記載した通り、本発明による方法に従い処理した。リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲにより、得られたウイルス核酸の検出および定量化を実施した。その結果を、図４に示す。

（実施例４）
結合緩衝液において異なるイソプロパノール濃度を用いる微生物核酸の単離
ヒト全血に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの遊離ＤＮＡ、またはＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＥ． ｃｏｌｉの生細胞をスパイクした。まず、上記のＤで説明した、本発明による方法に従い、ヒト血液細胞に由来するｇＤＮＡをこれらの試料から枯渇させ、それらを含有する試料中の微生物細胞を、上記の通りに破壊した。各場合において、４ｍｌの溶解緩衝液３および０．５ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液を、混合した血漿画分（各場合において、合計５ｍｌ）に添加した。得られた混合物を、６０℃で２０分間にわたりインキュベートし、１．２ＭのＧＴＣ、５．５％のＢｒｉｊ ５８、２７．６ｍＭのトリス、およびイソプロパノールを含む９ｍｌの結合緩衝液を添加し、ボルテックスすることにより混合し、イソプロパノール濃度が、該結合混合物中で約１９．５％のイソプロパノール濃度、または約４２％のイソプロパノール濃度をもたらす結合緩衝液と共に氷上で５分間にわたりインキュベートした（各場合において、結合緩衝液は当初、５．４ｍｌの溶解緩衝液、１．２ＭのＧＴＣ、５．５％のＢｒｉｊ ５８、２７．６ｍＭのトリス、および３．６ｍｌのイソプロパノールを含んだ。イソプロパノール濃度を増大させる混合物では、該混合物に、７ｍｌのさらなるイソプロパノールを添加した）。上記の通りに、その試料をさらに処理した。

得られた該微生物核酸を検出および定量化するために、各精製試料から７．５μｌを採取し、マルチプレックスＰＣＲにかけた。その結果は、表１および図５で見ることができる。シリカカラムを通る試料の流過時間は、１９．５％イソプロパノールの場合が１０．５分間であり、４２％イソプロパノールの場合が６．５分間であった。

表１：ＣＴ値の平均

Claims (21)

1. 微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸の混合物を液体中に含む試料から、細胞内微生物核酸および細胞外微生物核酸を選択的に蓄積する、単離する、または蓄積することと単離することとの両方を行うための方法であって、
   １．該試料の液体成分中に溶解している該遊離の循環核酸を含めた、この液体成分を、該試料の固体成分から分離するステップと、
   ２．該試料の該固体成分中に存在する該高等真核生物細胞を、該微生物細胞を同時に溶解させることなく、選択的に溶解させるステップと、
   ３．ステップ２で得られた溶解物の液体成分中に溶解している物質を含めた、この液体成分から、該微生物細胞を含めた、固体成分を分離するステップと、
   ４．ステップ３で得られた該固体成分を再懸濁させるステップと、
   ５．ステップ４で得られた懸濁物中に存在する該微生物細胞を溶解させるステップと、
   ６．ステップ１で得られた該液体成分から、該遊離の循環核酸を精製する、濃縮する、もしくは精製することと濃縮することとの両方を行い、かつステップ５で得られた溶解物から、該細胞内微生物核酸を精製する、濃縮する、もしくは精製することと濃縮することとの両方を行うステップと
   を含む方法。
2. 前記高等真核生物細胞が、哺乳動物細胞を表わす、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料が、体液、その濃縮物もしくは希釈溶液、またはスワブにより取得された再懸濁細胞材料である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記微生物細胞が、細菌細胞、真菌細胞またはそれらの組み合わせである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 請求項１に記載の手順ステップ１、手順ステップ３、または手順ステップ１および手順ステップ３の両方における前記固体成分からの前記液体成分の分離が、前記試料の遠心分離、濾過、デカンテーションまたはそれらの組み合わせにより達成される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. １．少なくとも１つのカオトロピック物質と、
   ２．少なくとも１つの界面活性剤と、
   ３．少なくとも１つの緩衝剤物質と
   を含む混合物（緩衝液１）を添加した後の前記試料におけるこれらの物質の濃度が、（１）カオトロープ０．１〜２Ｍ；（２）界面活性剤０．５〜５％（ｗ／ｖ）；および（３）緩衝剤物質２〜５０ｍＭであるように、これらの物質を含む該混合物中で、請求項１に記載の手順ステップ２による前記高等真核生物細胞の選択的溶解を実施する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項１に記載の手順ステップ５における前記微生物細胞の溶解を、少なくとも部分的には機械的に実施する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項１に記載の手順ステップ５における前記微生物細胞の前記溶解を、緩衝剤溶液（緩衝液２）であって、
   １．少なくとも１つの緩衝剤物質と、
   ２．金属イオンのための少なくとも１つの錯化剤と、
   ３．少なくとも１つの界面活性剤と
   を含み、
   ｐＨが６〜１０であり、
   該緩衝剤溶液（緩衝液２）の物質が、機械的溶解の間では、（１）緩衝剤物質２〜２０ｍＭ、（２）錯化剤０．１〜５ｍＭ、および（３）界面活性剤０．１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、ｐＨ８．０で存在する、緩衝剤溶液（緩衝液２）中で実施する、請求項７に記載の方法。
9. 緩衝液２が発泡抑制剤をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 請求項１に記載の手順ステップ５における前記微生物細胞の前記溶解を、少なくとも部分的には、請求項１に記載の手順ステップ４からの前記懸濁物に、または請求項７から９のいずれか一項から結果として得られる溶解物に、プロテイナーゼと、緩衝剤溶液（緩衝液３）であって、
    １．少なくとも１つのカオトロピック物質、
    ２．少なくとも１つの界面活性剤、および
    ３．少なくとも１つの緩衝剤物質
    を含み、
    該緩衝剤溶液（緩衝液３）の物質が、該溶解の間では、（１）カオトロープ１〜５Ｍ、（２）界面活性剤５〜２０％（ｗ／ｖ）、および（３）緩衝剤物質２０〜１００ｍＭの濃度で存在し、ｐＨ８．０で存在する、緩衝剤溶液（緩衝液３）とを添加し、得られた混合物をインキュベートすることにより実施する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 緩衝液３が、請求項１に記載の手順ステップ１からの前記液体成分をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 微生物細胞、高等真核生物細胞、および遊離の循環核酸の混合物だけでなく、ウイルスも液体中に含む試料から、ウイルス核酸を蓄積する、単離する、または蓄積することと単離することとの両方を行うこともさらに含み、請求項１に記載の手順ステップ１における前記試料の前記液体成分と併せた前記試料の前記固体成分から該ウイルスを取り出す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 請求項１に記載の手順ステップ１において取り出され、前記細胞外微生物核酸、および在する場合はウイルス核酸を含む前記液体成分を、請求項１に記載の手順ステップ５において得られ、請求項１に記載の手順ステップ６による前記細胞内微生物核酸の精製、濃縮、もしくは精製と濃縮との両方の前の該細胞内微生物核酸を含む前記溶解物と混合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項１に記載の手順ステップ１において得られ、前記細胞外微生物核酸、および存在する場合はウイルス核酸を含む前記液体成分、ならびに請求項１に記載の手順ステップ５において得られ、前記細胞内微生物核酸を含む前記溶解物を、互いに独立して精製する、濃縮する、もしくは精製することと濃縮することとの両方を行う、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１に記載のステップ６による、前記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸の精製および濃縮が、
    ６ａ）請求項１に記載の手順ステップ５からの前記溶解物に、（１）直鎖状または分枝状のＣ_１〜Ｃ_４アルコールと、（２）（１）３〜６Ｍのカオトロープ、（２）１０〜３０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（３）５０〜１５０ｍＭの緩衝剤物質を含む、請求項１０に記載の緩衝液３との混合物を含む溶液（結合緩衝液）を添加し、結果として得られる混合物をインキュベートするステップと、
    ６ｂ）前記試料を、適切なクロマトグラフィー装置にアプライするステップと、
    を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ステップ６ａ）が、ステップ１からの前記液体成分に、溶液（結合緩衝液）を添加することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. ６ｃ）結合させた前記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を、１回以上にわたり洗浄するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
18. ６ｄ）前記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を溶出させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施するのに使用するためのキットであって、
    １．（１）０．２〜４Ｍのカオトロープ；（２）０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤；および（３）２〜１００ｍＭの緩衝剤物質を含む、請求項６に記載の第１の緩衝液と、
    ２．（１）５〜５０ｍＭの緩衝剤物質、（２）０．５〜１０ｍＭの錯化剤、（３）０．２〜１０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項８に記載の少なくとも１つの第２の緩衝液、または（１）３〜１０Ｍのカオトロープ、（２）１０〜４０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および（３）４０〜２００ｍＭの緩衝剤物質を含む、請求項１０に記載の少なくとも１つの第２の緩衝液、あるいはそれらの組み合わせと、
    ３．ガラスビーズと
    を含むキット。
20. 請求項８に記載の少なくとも１つの第２の緩衝液が、０．１〜３％（ｖ／ｖ）の発泡抑制剤をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
21. 前記微生物核酸および存在する場合はウイルス核酸を精製する、濃縮する、もしくは精製することと濃縮することとの両方を行うためのクロマトグラフィー装置をさらに含み、また、結合緩衝液もさらに含む、請求項１９に記載のキット。

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