CN112391291B

CN112391291B - 细胞内微生物的富集方法及试剂

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Publication number: CN112391291B
Application number: CN201910763833.6A
Authority: CN
Inventors: 许腾; 曾伟奇; 吴婉婷; 李永军; 王小锐; 苏杭
Original assignee: Guangzhou Vision Gene Technology Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Laboratory Co ltd; Shenzhen Weiyuan Medical Technology Co ltd; Weiyuan Shenzhen Medical Research Center Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Equipment Co ltd
Current assignee: Guangzhou Vision Gene Technology Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Equipment Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Laboratory Co ltd; Shenzhen Weiyuan Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN112391291A

Abstract

本发明涉及一种细胞内微生物的富集方法及试剂，属于微生物基因检测技术领域。该富集方法包括以下步骤：收集细胞：取待测样本，收集其中宿主细胞；释放微生物：以细胞处理剂处理上述宿主细胞，使所述宿主细胞膜破裂并保留宿主细胞核膜完整，释放胞内微生物；富集微生物：去除样本中宿主细胞残余物，即得。上述富集方法，通过使用细胞处理剂使样品中所含细胞的细胞膜通透性变大，释放胞内微生物，而后去除已不含微生物的细胞残余物，保留含微生物的部分，在释放胞内病原微生物的同时，去除宿主核酸，达到胞内病原微生物的分离及富集的目的。

Description

细胞内微生物的富集方法及试剂

技术领域

本发明涉及微生物基因检测技术领域，特别是涉及一种细胞内微生物的富集方法及试剂。

背景技术

临床用于病原诊断的方法包括形态学检测、抗原抗体检测、体外培养、血清学检测及分子生物学如PCR(Polymerase chain reaction)等方法，这些方法均有各自的优缺点。

传统的病原检测方法主要限制于通量低，每次检测只能识别一种或者几种病原体，通常情况下需要临床医生先根据经验判断，猜测可能的病原体是某一种或某几种，再根据这些病原体现有的检测方法分别做检测；另一方面，在现有技术条件下，仅有0.1％～1％的微生物是可培养的，即使可培养也面临周期长的问题，一般需要24-72小时，这使得临床医生无法及时对症下药，为了不让病情继续恶化，通常都会先使用广谱抗生素，这也造成了日益严峻的菌株耐药性问题。而宏基因组学技术的出现，可以在未知病原体的情况下，通过提取某一组织或样本中的所有微生物基因组、构建基因组文库及对文库进行测序和筛选，达到对病原微生物“一网打尽”的检测效果。

随着宏基因组测序技术的不断发展，其在临床疑难感染性疾病诊断方面的应用越来越广泛，包括但不限于败血症、脑膜炎、脑炎、呼吸道感染、肺部感染等感染性疾病。然而，大部分检测技术往往都要取病灶部位的特定样本才能进行检测，这给患者造成一定的身体负担。而游离DNA的发现使无创检测成为可能，现在游离DNA测序已经被应用于无创产前、肿瘤突变位点检测、以及最新的领域——临床病原诊断。在病原检测领域，虽然通过对血浆中的游离DNA检测可以得到曾经存活于体内病原微生物的信息，但也会面临丢失血液细胞内病原微生物信息的问题，尤其在败血症患者中更为明显。如果使用全血进行核酸提取及建库，细胞内的大量的人宿主基因组释放则会掩盖了极微量的病原微生物信息，使得不得不提高测序深度，以保证测到痕量的微生物信息，这在一定程度上增大了测序成本。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种细胞内病原微生物的富集方法及试剂，采用该方法对病原微生物的检测进行前处理，能够在富集细胞内微生物的同时，不引入大量的宿主背景，从而降低测序深度，节约成本并提高效率。

一种细胞内微生物的富集方法，包括以下步骤：

收集细胞：取待测样本，收集其中宿主细胞；

释放微生物：以细胞处理剂处理上述宿主细胞，使所述宿主细胞膜破裂并保留宿主细胞核膜完整，释放胞内微生物；

富集微生物：去除样本中宿主细胞残余物，即得。

上述富集方法，通过使用细胞处理剂使样品中所含细胞的细胞膜通透性变大，释放胞内微生物，而后去除已不含微生物的细胞残余物，保留含微生物的部分，在释放胞内病原微生物的同时，去除宿主核酸，达到胞内病原微生物的分离及富集的目的。

可以理解的，本方法的检测目标为寄生于宿主细胞中的微生物，该宿主细胞的具体类型根据宿主的不同而不同，如人类、兽医学上的动物等。

在其中一个实施例中，待测样本可以选自全血、组织、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液等。可以理解的，收集宿主细胞按照不同样本的类型特点收集即可，如全血样本，可将内装有全血的采血管置于离心机内，1600g离心10min，吸取中间层白细胞。如是其他含细胞的临床感染样本，可取一定体积(如500-1000μl等)样本，10,000-12,000rpm离心5min，收集细胞。

在其中一个实施例中，所述释放微生物步骤中，向所述宿主细胞中加入细胞处理剂，混匀，低温孵育使所述宿主细胞膜破裂。

在其中一个实施例中，按照400～600μl/5×10⁶个细胞的量加入细胞处理剂，在0-15℃孵育5-20min。可以理解的，上述加入量、孵育温度和时间可以根据具体情况调整，但本发明人经试验摸索后发现，以上述条件处理，具有较好的选择性裂膜(破裂细胞膜而保留核膜完整)效果。

在其中一个实施例中，所述富集微生物步骤中，通过离心去除样本中宿主细胞残余物，上清液即为富集得到的微生物，所述离心力为400-2400g，离心时间为2-8min。优选的，离心力为500-3000g，通过上述低速离心条件，具有较好的分选效果，既能最大化保留微生物于上清中，又尽可能的将宿主细胞的细胞核沉淀。

在其中一个实施例中，该富集方法还包括核酸提取步骤，所述核酸提取步骤为：将上述富集后得到的微生物破壁后进行核酸提取。可以理解的，该核酸提取按照常规方式提取即可，例如，以玻璃珠破壁后，使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取等。

在其中一个实施例中，所述细胞处理剂包括：细胞稳定剂、低渗剂、消化酶和缓冲剂体系。

本发明还公开了一种细胞内微生物的富集试剂，包括细胞处理剂，所述细胞处理剂包括：细胞稳定剂、低渗剂、消化酶和缓冲剂体系。

上述细胞处理剂中，细胞稳定剂用于使细胞保持适宜进行选择性裂膜的形态，例如：MgCl₂、KCl、NaCl，CaCl₂等，低渗剂用于使细胞膜通透性变大而释放微生物，例如：离子去垢剂十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、CTAB、CHAPS/CHAPSO；非离子去垢剂聚氧乙烯二醇、麦芽糖苷、葡萄糖苷、Triton X-100、Tween 20、NP-40、IGEPAL CA-630，毛地黄皂苷等；消化酶用于消化贴壁细胞及使细胞在溶液中呈单个悬浮状态，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，或使样本中其他如粘液蛋白的成分降解，保持细胞呈单个悬浮状态而不聚集成团，例如：胰酶，胶原酶等；缓冲剂保持溶液环境稳定，例如：HEPES，PBS，TES,DIPSO,TAPSO等，细胞处理剂中各成分共同作用，达到较好的选择性裂膜效果。

在其中一个实施例中，所述细胞稳定剂选自：1-2mM的MgCl₂、8-15mM的KCl、8-15mM的NaCl、8-15mM的CaCl₂；

所述低渗剂选自：离子去垢剂和/或非离子去垢剂；所述离子去垢剂选自：十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、CHAPS和CHAPSO；所述非离子去垢剂选自：聚氧乙烯二醇、麦芽糖苷、葡萄糖苷、0.05％-0.5％Triton X-100、0.1-1％Tween20、0.1-1.5％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)、0.1-1％IGEPAL CA-630，0.015％-0.1％毛地黄皂苷；

所述消化酶选自：0.25-2.5g/ml胰酶、0.3～3g/ml胶原酶；

所述缓冲剂体系选自：8-12mM的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，PBS，TES,DIPSO，TAPSO，该缓冲剂体系的pH为7.5-8.2。

所述低渗剂选自：离子去垢剂和/或非离子去垢剂；所述非离子去垢剂选自：0.05％-0.5％的Triton X-100、0.1-1％的Tween 20、0.1-1.5％的NP-40、0.1-1％的IGEPALCA-630，0.015％-0.1％的毛地黄皂苷；

所述消化酶选自：0.25％-2.5％胰酶、0.3％～3％胶原酶；

所述缓冲剂体系选自：8-12mM的HEPES，PBS，TES,DIPSO,TAPSO，该缓冲剂体系的pH为7.5-8.2。

可以理解的，上述浓度均指工作浓度，在实践中，通常将富集试剂配置为10倍工作浓度的浓缩溶液，如工作浓度为1x，则配制10x溶液备用，具体使用的时候稀释至1x。即，无论该富集试剂在售卖或存储时选用何种浓度，使用时稀释至上述工作浓度，即属于本发明的保护范围。

在其中一个实施例中，所述细胞处理剂的pH为6.8-8.2，优选7.5-8.2，更优选7.9，所述细胞处理剂包括：8-12mM的HEPES，1-2mM的MgCl₂，8-15mM的KCl，0.25-2.5％的胰酶，0.5-1.5v/v％的NP40。

在其中一个实施例中，所述细胞处理剂的渗透压为513～667kpa。

本发明还公开了一种用于检测病原微生物的试剂盒，包括上述的富集试剂。

上述试剂盒可应用于各种微生物检测中，包括但不限于PCR及其衍生技术、核酸杂交法、微流控检测、POCT(point-of-care testing)、高通量测序、纳米孔测序等，通过对细胞内微生物进行富集以提高检测灵敏度，避免出现漏检情况。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种细胞内微生物的富集方法，可在释放细胞内的病原微生物的同时，通过离心的方法丢弃影响测序的宿主核酸背景，从而达到微生物富集的目的。对于全血样本，既不会丢掉血液细胞内的病原微生物信息，也不会因为使用血液细胞进行检测而引入大量宿主核酸背景，而使得病原微生物有效数据被核酸背景掩盖。对于临床感染细胞型样本，去除宿主背景相当于在同等测序深度下，人源宿主的序列比例下降，微生物的序列比例可获得一定的提高，达到了病原微生物富集后检测的目的。

该富集方法同样适用于其他分子生物学方法的病原微生物检测，如PCR及其衍生技术、核酸杂交法、免疫层析等技术。

本发明的一种细胞内微生物的富集试剂，通过细胞稳定剂、低渗剂、消化酶和缓冲剂等成分的共同作用，能够使所述宿主细胞膜破裂并保留宿主细胞核膜完整，从而达到释放胞内微生物并去除宿主核酸背景的目的。

附图说明

图1为实施例4中不同强度的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞效果对比图；

图2为实施例5中不同浓度的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞效果对比图；

图3为实施例6中不同类型消化酶的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞效果对比图；

图4为实施例7中不同浓度消化酶的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞效果对比图；

图5为实施例8中不同离心速度去除宿主核酸的效果对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用原料除特别说明外，均为市售购得。

实施例1

一种细胞内微生物的富集方法，包括以下步骤：

1、收集细胞

收集样本中的细胞组分。

1.1全血样本：将采血管(内装有全血，约5～10ml)置于离心机内，1600g离心10min，转移上层血浆后，使用移液枪吸取中间层白细胞。

1.2其他含细胞的临床感染样本：取500-1000μl的样本，10,000-12,000rpm离心5min，收集细胞。

2、释放微生物

使用细胞处理剂使细胞膜通透性变大，释放胞内微生物，具体为：

取步骤1中收集得到的细胞组分，使用400-600μl细胞处理剂处理细胞(约5x10⁶个)，冰上孵育5-20min，期间不间断震荡混匀，使细胞膜通透性变大，胞内微生物被释放。

该细胞处理剂的成分为：8-12mM HEPES,1-2mM的MgCl₂，8-15mM的KCl，0.25％-2.5％的胰酶(即0.25-2.5g/100ml，折算活力单位为62.5～750U/100ml)，0.1-1.5ml/100ml的NP40，该细胞处理剂pH＝7.9。

3、富集微生物

富集胞内微生物，去除人源宿主核酸，具体为：

将步骤2中处理完全的样本，低速离心(离心力为400-2400g，离心2-8min)后，去除宿主细胞残余物，转移含微生物的上清于新的离心管中。

4、核酸提取

提取胞内病原微生物的核酸，具体为：

对步骤3富集得到的含病原微生物的上清进行玻璃珠破壁后，使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取。

5、片段化

对提取好的核酸进行片段化处理，使用Covaris M220非接触式超声波破碎仪，在超声波破碎仪的配套反应管中加入体积为50-100μl步骤4中制备好的DNA样本，按此参数进行DNA片段化：Peak Power 50-75W,Duty Factor 20.0,Cycles/Burst 200,Time 155-300s。

6、文库制备

使用诺唯赞VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3(ND607)进行文库构建后上机测序。

实施例2

本实施例采用实施例1中的方法对全血样本进行检测。

1、样品准备。

将5ml全血样本均分为2份，其中一份使用离心机1600g离心10min，分别收集上层血浆及中间层白细胞样本到2.0ml EP管中，分别标记为A和B，另一份全血样本标记为C。

2、样品前处理及制备。

将样本B(白细胞)参照实施例1中的步骤2-6处理；样本A直接使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取后，参照实施例1中的步骤5-6处理；样本C参照实施例1中的步骤4-6处理。所有三个样本均构建为合格的高通量(NGS)测序文库。

3、检测

将上述步骤2中的A、B和C样品同时上机测序，并采取同样的测序深度，得到结果如下：

表1.A、B、C样品测序结果

注：reads指高通量测序平台产生的小片段的序列数据，即可视为测序深度的体现。

从上表可以看出，同样测序深度下，经过实施例1方法处理的B号样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物耶氏肺泡子虫、人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV)的检出比例均比未处理前提高约10倍，与C号样品的处理方法相比，其宿主占比降低了约1.75％。

此外，本发明采用的细胞内微生物的富集方法(B)相比现有临床使用游离DNA直接测序的方法(A)，可检出A中未检测到的细胞内细环病毒；而方案C使用全血样本检测，则由于宿主比率过高而掩盖了痕量病原微生物的信息。说明经过本方案的处理后，可成功释放并富集胞内微生物，且同时达到去除样本人源DNA的效果，提高了待检病原微生物的检测灵敏度且不会有漏检情况。

上述结果表明，在保证待测病原微生物检出的情况下，实施例1的方法和试剂可以采取较低的测序深度，即可降低测序的成本提高测序效率，且极大地降低了后续测序数据的分析难度。

实施例3

本实施例采用实施例1中的方法对下呼吸道样本(肺泡灌洗液)进行检测。

1、样品准备。

将2ml肺泡灌洗液样本均分为2份，其中一份取一定体积(500-1000μl)样本，10,000-12,000rpm离心5min，收集细胞，标记为D；另一份取与样本D相同体积的原始样本，标记为E。

2、样品前处理及制备。

将样本D参照实施例1中的步骤2-6处理；样本E参照实施例1中的步骤4-6处理。两个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。

3、检测

将上述步骤2中的D、E样品同时上机测序，并采取同样的测序深度，得到结果如下：

表2上述D、E样品测序结果

从上表可以看出，同样测序深度下，经过实施例1方法处理的D号样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物细菌鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌检出比例均比未处理前提高约10倍，真菌耶氏肺泡子虫的检出比例经富集处理后亦有所提高。与E样品未经富集的处理方法相比，其宿主占比降低了约0.73％，有助于减少宿主背景的序列干扰。

上述结果表明，实施例1的方法主要表现为通过去除宿主背景的部分干扰，而达到实现胞内病原微生物的富集目的。使用此方法进行处理可降低测序深度，达到与未处理组同样的检出效果，降低检测成本。

实施例4

对比不同强度的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞的效果。

1、样品制备。

购买商业化带荧光标签腺病毒(汉恒生物)，按相关操作手册使用腺病毒转染6孔板内293A细胞。感染24小时候观察细胞转染情况，确认感染成功后(90％以上细胞可观察到绿色荧光)，取15ml离心管，1000g离心5min后收集细胞。使用10ml无菌PBS重悬漂洗细胞，1000g离心5min，重复1次。

2、使用三种不同强度的细胞处理剂(去垢剂分别选用NP40、SDS、TritonX-100)对收集到的细胞进行实施例1中步骤2和步骤3处理，包括：

A、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1wt％SDS；

B、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1v/v％NP40；

C、10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1v/v％TritonX-100。

每种细胞处理剂做一式两份，分别平行处理6板孔内的2孔细胞。处理后使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取。另取一孔细胞直接提取，作为阴性对照。

3、检测。

使用人基因组引物和腺病毒基因组引物对步骤2所提取的等量核酸样本进行荧光定量qPCR检测。

人基因组引物：

Chr1_gDNA_RTF:5’-ATCAGCCACATTGGTCTCCTGGAG-3’(SEQ ID No.1)；

Chr1_gDNA_RTR:5’-GTGAGCCTTTGGGTTTGTCATTTGA-3’(SEQ ID No.2)；

腺病毒基因组引物：

Hexon-F:5’-GGTGGCCATTACCTTTGACTCTTC-3’(SEQ ID No.3)；

Hexon-R:5’-CCACCTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAGTATCATC-3’(SEQ ID No.4)。

qPCR检测结果如图1所示。

图1为不同强度的细胞处理剂裂解人胚肾上皮细胞效果示意图，其中，纵坐标为所检测物种基因组DNA相对内参比值，human为人基因组，Adv为腺病毒，Con为对照组，A、B、C分别表示A、B、C组(即SDS组、NP40组、TritonX-100组)，从图中可以看出，使用强去垢剂SDS(十二烷基硫酸钠)对细胞进行处理后(A)，细胞组分完全裂解，人与病毒的基因组DNA同时被释放；若使用弱去垢剂TritonX-100对细胞进行处理(C)，细胞成分几乎保持完整，无法成功检测到胞内腺病毒。采用本发明的细胞处理剂组分NP40(B)，既可以释放胞内微生物，亦可以去除大部分的宿主核酸背景，达到胞内微生物的富集目的。

实施例5

对比不同浓度的NP40裂解人胚肾上皮细胞的效果。

1、样品制备。

2、使用三种不同浓度的NP40对收集到的细胞进行实施例1中步骤2和步骤3处理，包括：

A、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，0.05v/v％NP40；

B、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1v/v％NP40；

C、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，2v/v％NP40。

3、检测。

人基因组引物：

Chr1_gDNA_RTF:5’-ATCAGCCACATTGGTCTCCTGGAG-3’(SEQ ID No.1)；

Chr1_gDNA_RTR:5’-GTGAGCCTTTGGGTTTGTCATTTGA-3’(SEQ ID No.2)；

腺病毒基因组引物：

Hexon-F:5’-GGTGGCCATTACCTTTGACTCTTC-3’(SEQ ID No.3)；

Hexon-R:5’-CCACCTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAGTATCATC-3’(SEQ ID No.4)。

qPCR检测结果如图2所示。

图2为不同浓度的NP40裂解人胚肾上皮细胞效果示意图，其中，纵坐标为所检测物种基因组DNA相对内参比值，human为人基因组，Adv为腺病毒，Con为对照组，A、B、C分别表示A、B、C组(即0.05v/v％组，1v/v％组和2v/v％组)，从图中可以看出，使用弱于所述细胞处理剂的低渗溶剂对细胞进行处理后(A)，细胞成分几乎保持完整，无法成功检测到胞内腺病毒。若使用强于所述细胞处理剂的等渗/高渗溶液对细胞进行处理(C)，细胞则会裂解过度，整个细胞结构被破坏，引入大量的人宿主背景，无法达到只释放并富集胞内微生物的目的。采用本发明的细胞处理剂，既可以释放胞内微生物，亦可以去除大部分的宿主核酸背景，达到胞内微生物的富集目的。

实施例6

对比不同类型的消化酶裂解人胚肾上皮细胞的效果。

1、样品制备。

2、使用两种不同强度的消化酶(胰酶vs胶原酶)对收集到的细胞进行实施例1中步骤2和步骤3处理，包括：

A、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1v/v％NP40；

B、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胶原酶，1v/v％NP40；

3、检测。

人基因组引物：

Chr1_gDNA_RTF:5’-ATCAGCCACATTGGTCTCCTGGAG-3’(SEQ ID No.1)；

Chr1_gDNA_RTR:5’-GTGAGCCTTTGGGTTTGTCATTTGA-3’(SEQ ID No.2)；

腺病毒基因组引物：

Hexon-F:5’-GGTGGCCATTACCTTTGACTCTTC-3’(SEQ ID No.3)；

Hexon-R:5’-CCACCTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAGTATCATC-3’(SEQ ID No.4)。

qPCR检测结果如图3所示。

图3为不同类型的消化酶裂解人胚肾上皮细胞效果示意图，其中，纵坐标为所检测物种基因组DNA相对内参比值，human为人基因组，Adv为腺病毒，Con为对照组，A、B分别表示A、B组(即胰酶组和胶原组)，从图中可以看出，使用胰酶对细胞进行处理后(A)，细胞间粘蛋白及糖蛋白被除去，成团细胞得以分散开来，细胞暴露于低渗剂的环境下，使得胞内的病毒被释放出来，可成功检测，同时保证较低的背景核酸污染；若使用胶原酶对细胞进行处理(B)，细胞结构几乎保持完整，无法成功检测细胞内微生物的准确含量。

实施例7

对比不同浓度的胰酶裂解人胚肾上皮细胞的效果。

1、样品制备。

2、使用三种不同浓度的胰酶对收集到的细胞进行实施例1中步骤2和步骤3处理，包括：

A、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，0.05％胰酶，1％v/vNP40；

B、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，2％胰酶，1％v/vNP40；

C、10mM HEPES,pH 7.9,1.5mM MgCl₂和10mM KCl，5％胰酶，1％v/vNP40。

3、检测。

人基因组引物：

Chr1_gDNA_RTF:5’-ATCAGCCACATTGGTCTCCTGGAG-3’(SEQ ID No.1)；

Chr1_gDNA_RTR:5’-GTGAGCCTTTGGGTTTGTCATTTGA-3’(SEQ ID No.2)；

腺病毒基因组引物：

Hexon-F:5’-GGTGGCCATTACCTTTGACTCTTC-3’(SEQ ID No.3)；

Hexon-R:5’-CCACCTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAGTATCATC-3’(SEQ ID No.4)。

qPCR检测结果如图4所示。

图4为不同浓度的胰酶裂解人胚肾上皮细胞效果示意图，其中，纵坐标为所检测物种基因组DNA相对内参比值，human为人基因组，Adv为腺病毒，Con为对照组，A、B、C分别表示A、B、C组(即0.05％胰酶组、2％胰酶组、5％胰酶组)，从图中可以看出，使用弱于所述细胞处理剂的胰酶浓度对细胞进行处理后(A)，成团细胞几乎保持完整，所述细胞处理剂未能起到很好的处理作用，无法完全检测到胞内腺病毒。若使用强于所述细胞处理剂的胰酶浓度对细胞进行处理(C)，细胞则会被消化过度，释放出大量的宿主核酸，无法达到只释放并富集胞内微生物的目的。采用含本发明所述浓度胰酶的细胞处理剂，既可以完全消化细胞达到释放胞内微生物的效果，亦可以去除大部分的宿主核酸背景，从而达到胞内微生物的富集目的。

实施例8

对比不同离心速度去除宿主核酸的效果

1、样品制备。

取5份等量293A细胞(～10⁶)，分别添加10⁴CFU/ml E.coli，其中1份为对照组，4份为实验组。

2、步骤1中的对照组直接使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取。4份实验组样品按实施例1中步骤2处理后，分别使用250g，500g，3000g及6500g对处理后样本进行离心，离心结束后取上清液使用天根生化科技(北京)有限公司的微量DNA提取试剂盒(DP316)进行核酸提取。

3、检测。

使用人基因组引物和E.coli基因组引物对步骤2所提取的等量核酸样本进行荧光定量qPCR检测。

人基因组引物：

Chr1_gDNA_RTF:5’-ATCAGCCACATTGGTCTCCTGGAG-3’(SEQ ID No.1)；

Chr1_gDNA_RTR:5’-GTGAGCCTTTGGGTTTGTCATTTGA-3’(SEQ ID No.2)；

E.coli基因组引物：

rrsB-F:5’-CACAATGGGCGCAAGCCTGA-3’(SEQ ID No.5)；

rrsB-R:5’-GCTGCTGGCACGGAGTTAGC-3’(SEQ ID No.6)；

qPCR检测结果如图5所示。

图5为不同离心速度去除宿主核酸的效果，从图中可以看出，当离心速度小于等于250g时，由于人的细胞骨架未完全去除，导致有较大量的人的核酸残留；当离心速度大于6200g时，人的核酸基本可以去除干净，但同时微生物(E.coli)也会同时被离心去除，影响病原微生物的检出。仅有在本发明所述离心转速时，可以保持混合模拟样品中微生物(细菌、真菌等)的检出，同时最大程度地去除背景核酸。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州微远基因科技有限公司

<120> 细胞内微生物的富集方法及试剂

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcagccaca ttggtctcct ggag 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgagccttt gggtttgtca tttga 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggccatt acctttgact cttc 24

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccacctgttg gtagtccttg tatttagtat catc 34

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacaatgggc gcaagcctga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgctggca cggagttagc 20

Claims

1.一种细胞内微生物的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

收集细胞：取待测样本，收集其中宿主细胞；

释放微生物：以细胞处理剂处理上述宿主细胞，使所述宿主细胞膜破裂并保留宿主细胞核膜完整，释放胞内微生物，所述细胞处理剂由：8-12mM的HEPES，1-2mM的MgCl₂，8-15mM的KCl，2-2.5％的胰酶，1％的NP40组成；

富集微生物：通过离心去除样本中宿主细胞残余物，上清液即为富集得到的微生物，所述离心的离心力为400-2400g，离心时间为2-8min。

2.根据权利要求1所述的细胞内微生物的富集方法，其特征在于，所述释放微生物步骤中，向所述宿主细胞中加入细胞处理剂，混匀，低温孵育使所述宿主细胞膜破裂。

3.根据权利要求2所述的细胞内微生物的富集方法，其特征在于，按照400～600μl/5×10⁶个细胞的量加入细胞处理剂，在0-15℃孵育5-20min。

4.根据权利要求1所述的细胞内微生物的富集方法，其特征在于，还包括核酸提取步骤，所述核酸提取步骤为：将上述富集后得到的微生物破壁后进行核酸提取。

5.一种用于权利要求1-4任一项所述的富集方法的细胞内微生物的富集试剂，其特征在于，包括细胞处理剂，所述细胞处理剂由：8-12mM的HEPES，1-2mM的MgCl₂，8-15mM的KCl，2-2.5％的胰酶，1％的NP40组成。

6.根据权利要求5所述的细胞内微生物的富集试剂，其特征在于，所述细胞处理剂的pH为6.8-8.2。

7.根据权利要求5所述的细胞内微生物的富集试剂，其特征在于，所述细胞处理剂的渗透压为513～667kpa。

8.一种用于检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5-7任一项所述的富集试剂。