CN101538567A - 过滤式微量核酸临床样品快速处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及各种核酸生物样品的快速处理方法。更具体地，本发明涉及采用针头式过滤器和临床一次性注射器组成的过滤式核酸提取装置快速处理和提取临床生物样品中微量核酸样品的方法，该方法无需任何仪器设备就可以完成包括临床生物样品中宿主细胞、细菌、细胞内的病毒的富集、清洗、裂解和核酸提取所有步骤。本发明还涉及用于快速处理微量核酸临床样品的试剂盒及其应用。

Description

过滤式微量核酸临床样品快速处理方法

技术领域

本发明涉及各种核酸生物样品的快速处理方法。更具体地，本发明涉及采用过滤方式快速处理和提取临床生物样品中微量核酸样品的方法，包括临床生物样品中细胞富集和裂解细胞提取核酸。

本发明还涉及用于快速处理微量核酸临床样品的试剂盒及其应用。

背景技术

临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA，应用核酸扩增技术测定其成分，这是用于病症的辅助性分析和诊断的一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，会干扰其下游扩增反应，故在进行检测反应前必须进行生物样品的处理和核酸提取。由于样本的处理及保存对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大，因此在核酸标本的适当的预处理及保存对核酸模板的成功提取具有决定性作用。临床常见的标本有血清(浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。以下是不同临床标本的处理方法及步骤：

1.痰标本

痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用液化液去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。

2.棉拭子

用核酸扩增方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)，临床标本一般为棉拭子。现在应用的处理棉拭子具体方法为，用棉拭子取分泌物，置无菌试管或EP管内，在样品管中加无菌生理盐水，充分震荡混匀后离心，弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀的离心，重复洗涤一次，弃上清，沉淀即可用于DNA提取。

3.体液

体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心5分钟，取沉淀物提取核酸。

血性胸腹水，可加等体积红细胞裂解液，震荡混匀后离心，可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取。

4.脓液

粘稠脓液：同痰标本处理，先将其液化，再离心取沉淀提取DNA。

水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。

5.血清(浆)标本

一些病原体，如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等的核酸扩增检测常采用血清或血浆标本。如HBV标本为血浆标本时一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳作抗凝剂。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。对于HCV，则检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快(2小时内)分离血清进行检测，或需在-20℃保存。

6.全血标本

通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。需要采用前处理，即加适量的红细胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的红细胞；随后再加适量的细胞核裂液(破核液)，裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来；最后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。

(二).核酸提取

核酸提取已经成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案纷繁浩渺。分子诊断市场的发展和测序市场、功能基因组计划的启动已经为核酸提取市场加足了油，传统的操作流程已经被更为简便和自动化的化学溶液代替，现在前市场上大部分核酸提取系统包括一个固体的纯化支持物，如离心柱里的薄膜，或者磁珠。有一些则设计成方便使用的微孔板的形式。

核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，在核酸提取过程中应根据不同研究需要，保证核酸结构的相应完整性；尽量排除其它大分子成分(蛋白质、多糖等)的污染；和保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。表1是对几种DNA提取方法比较：

表1：各种DNA提取方法比较

方法名称	DNA提取	适用范围	方法评价
				传统法	酚/氯仿等有机溶剂抽提	大多数标本DNA提取纯化	DNA纯度高、片段大、含量多，但比较费时，步骤繁琐，使用有机溶剂，有损操作者健康。
鳌合树脂法	Chelex 100树脂	培养及各种临床标本	可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸的提取。
				旋转离心柱法	硅载体吸附	大多数标本DNA提取纯化	DNA纯度高，但比较费时，步骤繁琐，洗脱的效率是关键。
玻璃粉法	玻璃粉吸附，离心分离	土壤标本	方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。
				磁珠法	磁珠吸附，磁场分离	冰冻、陈旧组织	简单、快速，整个过程不到2h，可以获得较纯的DNA。适于少量样本。
免疫亲和法	抗原抗体反应，磁场分离	冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标本	DNA纯度高，含量多，适于样本含量少的标本，抗DNA单克隆抗体的制备是关键。

发明内容

基因诊断试剂的发展可有两个方向，一是高通量、自动化、精密而复杂的仪器设备，满足高层次医院的需求；二是快速、低价、使用简单仪器或无仪器的诊断试剂，用于基层医疗单位，直接服务于广大人民大众。大多数欧美国家的生物公司选择开发利润丰厚的高级仪器，在大医院中形成激烈竞争。

本申请人选择不同的发展方向，致力于开发满足基层医疗单位的系列产品。过滤式微量核酸临床样品快速处理技术就是以此为出发点，建立一种无需仪器的快速简单的微量核酸临床样品的处理办法，为快速核酸诊断提供了一个良好的基础，同时在真正意义上体现了申请人致力于完成的使命：作为沟通先进生物技术和人民大众间的桥梁，重点是开发快速、低价、使用简单仪器的诊断试剂。

结合细胞裂解技术，用无仪器过滤式样品处理装置对样品中的细胞进行抽滤富集以及在细胞裂解后提取核酸，用于病症的辅助性分析和诊断。

具体地说，本发明提供一种过滤式微量核酸临床样品快速处理方法，其包括以下步骤：

(a)用抽吸装置抽吸临床微量核实生物样品，样品经过滤器过滤后，临床生物样品中颗粒成分，包括：宿主细胞、细菌、细胞内的病毒和其它杂质由于过滤器中过滤膜的物理阻挡而被留在过滤膜上，滤液则不含有细胞和颗粒成分的废液，达到固液分离的作用；

(b)用抽吸装置抽吸生理盐水，清洗过滤膜上的细胞和颗粒成分，放弃滤液，完成了临床样品中细胞的富集和清洗；

(c)分离抽吸装置和过滤器，用抽吸装置抽吸裂解液，连接过滤器后冲洗在滤膜上的细胞进入单独的容器，如离心管，使得洗脱细胞在与细胞裂解液混合后裂解，得到混合液；

(d)用抽吸装置抽吸裂解后的混合液，经过滤器过滤，将裂解后的细胞碎片和杂质被留在过滤膜上而得到不含有其他杂质的核酸水溶液，用于核酸扩增。

本发明还提供用于本发明上述方法的过滤式微量核酸临床样品快速处理试剂盒，其包括针头式过滤器、注射器和细胞裂解液。

本发明还提供上述试剂盒在传染病病原体、宿主或病原体基因突变和单核苷酸多态性检测中的用途。

本发明提供一种无仪器过滤式微量核酸临床样品快速处理方法，其包括以下步骤：

(a)用抽吸装置抽吸临床微量核酸生物样品，样品经过滤器过滤后，临床生物样品中颗粒成分由于过滤器中过滤膜的物理阻挡而被留在过滤膜上，滤液则不含有细胞和其它颗粒成分的废液，达到固液分离的作用；

(b)用抽吸装置抽吸生理盐水，清洗过滤膜上的细胞和颗粒成分，放弃滤液，完成了临床样品中细胞的富集和清洗；

(c)分离抽吸装置和过滤器，用抽吸装置抽吸一定容量的裂解液，连接过滤器后冲洗在滤膜上的细胞进入单独的容器(试管)，使得洗脱细胞在与细胞裂解液混合后裂解，得到混合液；

(d)用抽吸装置抽吸裂解后的混合液，经过滤器过滤，将裂解后的细胞碎片和杂质被留在过滤膜上而得到不含有其他杂质的核酸水溶液，用于核酸扩增。在本发明的具体实施方案中，所述核酸为DNA或RNA。

在本发明的另一具体实施方案中，所述的抽吸装置为注射器，优选为普通临床用的一次性塑料注射器。

在本发明的另一具体实施方案中，所述的过滤器为针头式过滤器。

在本发明的另一具体实施方案中，所述的过滤膜选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜、混合纤维膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚四氟乙烯膜或聚醚砜膜。

在本发明的优选实施方案中，所述过滤膜的孔径为0.2-5.0微米。

在本发明的更优选实施方案中，所述述针头式过滤器选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器。

在本发明的最优选实施方案中，所述述针头式过滤器选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器，所述过滤膜孔径为0.2-5.0微米，所述注射器为普通临床用一次性塑料注射器。

以下结合附图1的装置结构示意图，简要说明本发明的方法的一项具体实施方案的操作方式。

在本发明方法中使用的装置结构如附图1所示。利用微量生物样本提取核酸，以针头式过滤器和注射器组成的过滤式样品快速处理装置的抽滤作用替代高转速离心机的离心沉降作用，以此为分离手段，从而达到液固分离的目的。本发明就是利用过滤式样品快速处理装置对临床样品进行过滤、清洗，以及在裂解后对DNA进行抽提。过滤式样品处理装置由三部分组成：尖口吸管1、针头式滤器2和注射器3，其中，尖口吸管1和针头式滤器2通过第一连接部分4连接，针头式滤器2和注射器3通过第二连接部分5连接。

首先用注射器3抽吸临床微量核酸生物样品，样品经针头式过滤器2过滤后，临床生物样品中的颗粒成分，包括：宿主细胞、细菌、细胞内的病毒和杂质由于过滤器2中过滤膜的物理阻挡而被留在过滤膜上，进入注射器3的滤液则不含有细胞和其它颗粒有形成分的废液，达到固液分离的作用，替代传统的离心机；接着用注射器3抽吸生理盐水，清洗过滤膜上的细胞颗粒或有形成分，清洗后的生理盐水进入注射器3，从第二连接部分5断开过滤器2和注射器3，将废液和清洁液从注射器中弃掉，这样临床生物样品中细胞和其它颗粒有形成分由于滤器中滤膜的物理阻挡而被留在了滤膜上，液体成分被滤过，从而完成了样品中细胞的富集和清洗；用注射器抽取一定量的裂解液后，用第二连接部分5重新连接过滤器2和注射器3，通过反复抽吸裂解液，反复冲洗在过滤器2中的滤膜上的细胞，洗脱细胞在新的离心管中被裂解，然后抽吸裂解混合液，裂解后的细胞碎片和其它颗粒有形成分被阻隔在滤膜上，滤过的液体从第二连接部分5断开过滤器2和注射器3后被推到新的离心管中，从而用于核酸扩增。

在过滤式样品处理方法的整个过程中起到最关键作用的是一次性针头式滤器，针头式滤器主要应用于实验室少量样品的预滤、清除颗粒、液体和气体的除菌过滤。因为它对样品的吸附性小，因而保证少量或高价值样品的最大回收量，外壳材质为聚丙烯，不含粘合剂，因而不会污染样品。上、下部由超声波焊接成一体，耐高压，不存在样品的泄露问题。针头式滤器的滤膜的主要功能是从气相或者液相中截留微粒，细菌及其他杂质，以达到分离，净化，提纯的目的。

根据快速处理生物样本时所要达到的目的不同而选择不同的操作程序，对样品中的细胞或有形成分需要进行浓缩富集，生物样本，如血液、体液(脑脊液、胸水、腹水、尿液)、痰液和眼、鼻、喉、生殖道、尿道等拭样(Swabs)的洗脱液的液体成分中有很多有形成分，如细胞和包含于细胞内的一些微生物，这些有形成分正是我们所需要的物质，通常的样品处理办法中采用高转速离心机，对样品进行高转速长时间的离心沉降。

而采用过滤式样品快速处理装置时只要简单的“一抽一洗一弃”就可以完成所有操作：“一抽”：用注射器3抽吸上述生物样本液体，注射器3里的滤液是不含有细胞或其它颗粒成分的废液；“一洗”：继续抽吸生理盐水，从而完成清洗颗粒有形成分的目的；“一弃”：从第二连接部分5断开装置，将废液从注射器3中弃掉，这样细胞或颗粒有形成分由于滤器中滤膜的物理阻挡而被留在了滤膜上，液体成分被滤过，从而完成了生物样品中颗粒有形成分的富集和清洗。

样品经过浓缩和清洗后要进行细胞裂解以及核酸提取。通常情况下，裂解后的核酸提取需要在液相非均匀体系中，利用离心力来达到液-液分离，液-固分离的效果，含有目的核酸的水溶液就会被分离出来。而采用本发明的过滤式生物样品快速处理装置进行核酸抽提时只要简单的“一洗一抽一移”就可以完成所有操作：“一洗”，用注射器抽吸一定量的裂解液，将过滤式样品处理装置从第二连接部分5连接，冲洗滤膜上的细胞和颗粒有形成分进入新的离心管中，使细胞裂解；“一抽”，用注射器3抽吸裂解后的混合液，经过针头式滤器的注射器3内的液体即为不含有其他杂质的目的核酸水溶液，而裂解的细胞和杂质有形成分被滤膜阻隔；“一移”，就是将过滤式样品处理装置从第二连接部分5断开，将注射器3中的目的核酸水溶液从其出口转移到新的离心管中。

在本发明方法中使用的裂解液是临床上常用的TES(Tris-EDTA-Solution)溶液，经95度加热后，可使细胞裂解。

本发明还提供用于实施上述方法的过滤式微量核酸临床样品快速处理试剂盒，其包括针头式过滤器(2)、注射器(3)和细胞裂解液。

在本发明的另一实施方案中，所述注射器为普通临床用一次性塑料注射器。

在本发明的另一实施方案中，所述针头式过滤器(2)选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜、混合纤维膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚四氟乙烯膜或聚醚砜膜针头式过滤器。

根据本发明的优选实施方案，其中所述述针头式过滤器(2)选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器。

根据本发明更优选的实施方案，其中所述针头式过滤器滤膜孔径为0.2-5.0微米；

用于本发明的针头式过滤器是市售产品。

另外，本发明还提供所述的试剂盒在传染病病原体、宿主或病原体基因突变和单核苷酸多态性检测中的用途。

使用本发明的有益效果在于：本发明可以作为核酸扩增前对生物样品进行处理的一种简捷手段，提取出的样品纯度足够符合下一步核酸扩增的要求，同时不需要任何仪器、操作安全和简单、一次性使用，因而可以被广泛地应用于病原体或宿主核酸提取，用于临床检测和诊断，特别适合一些实验条件较差的基层医院和经济不发达地区或国家。

本发明的突出的有益效果是在处理生物样品的过程中取代了高转速离心机，利用过滤式样品处理装置就可以在液相非均匀体系中达到了液固分离的效果。过滤式样品处理装置成本低廉，操作简单同时又不需要任何特殊仪器，操作周期极短，大约只需要1-2分钟，因而本发明可以被广泛地应用于一些实验条件相对较差的基层医院和经济不发达地区或国家；本发明简便、快速、准确、经济，无需任何特殊仪器，可以适用于各级医疗机构，特别是一些落后地区和基层医院，同时，也可以很好地满足高层次医院的需求，特别是急诊室和床边的核酸快速诊断。下表是过滤式样品处理技术与离心机处理技术在对生物样品处理时各种性能的比较：

表2：离心机与过滤式样品处理性能比较

比较项目	离心机处理	过滤式样品处理
			液固分离	能	能
操作周期	长，约5-10分钟	短，约1-2分钟
			完成通量	大，根据离心机性能不等	小，每次只能完成一个样本
操作复杂性	低	极低
			对实验条件的要求	较高	极低(无仪器要求)

附图说明

图1是用于实施本发明方法的快速处理装置的结构示意图；

图2是本发明实施例1得到的TB扩增核酸试纸条检测结果；

图3是本发明的实施例2得到的CT扩增核酸试纸条检测结果；

图4是本发明的实施例2得到的UU扩增核酸试纸条检测结果；

图5是本发明的实施例3得到的HBV扩增核酸试纸条检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明：

实施例1：

痰液处理及TR DNA的提取

1.痰液液化

取TB待检者的痰液，将其转移至离心管中，加入1倍体积的痰液液化液充分震荡混匀；

2.抽滤

利用过滤式样品处理装置吸取1.5ml上述液化后的痰液，从第二连接部分处断开该装置，将注射器中的滤液弃掉；

3.洗涤

重新连接好装置，在装有清洗液(生理盐水)的离心管里抽吸，最后从第二连接部分处断开该装置，将注射器中的滤液弃掉；

4.裂解

重新连接好装置，在装有裂解液离心管里反复抽吸，最后将射器内的液体全部推回到该离心管中，99℃加热该离心管10分钟，冷却至室温；

5.DNA提取

继续使用步骤(4)中的过滤式样品处理装置将加热过后的管中液体吸出，从第二连接部分处将装置断开，把注射器中的液体转移至一新的离心管中，备用。

6.核酸扩增

应用TB恒温扩增试剂，扩增提取出的TB DNA，具体反应如下：

TB扩增反应液    10微升

提取DNA溶液     4微升

ddH₂O           6微升

                        

总体积为20微升

反应温度及时间：63℃，90分钟

7.结果检测

扩增产物应用核酸检测试纸条进行检测，结果如附图2。从附图2的结果可以看出，结核杆菌镜检结果阳性样品经扩增后核酸试纸条检测结果均为阳性。

注：4+、3+、2+、1+分别为结核杆菌镜检结果阳性样品。

实施例2

性传播疾病样本(棉拭子)的处理及病原体DNA的提取

1.洗脱

取待检患者(CT/UU)的样本，在其样本采集管中加入1ml生理盐水，振荡混匀，确保棉拭子上分泌物被充分洗脱，将洗脱液全部转移至1.5ml离心管中；

2.抽滤

应用过滤式样品处理装置抽取上述离心管中的全部洗脱液，最后从第二连接部分处断开该装置，将注射器中的滤液弃掉；

3.裂解

重新连接装置，使用装置反复吸取离心管中的裂解液，最后将射器内的液体全部推回到该离心管中，99℃加热该离管10分钟，冷却至室温；

4.DNA提取

继续使用装置将加热过后的管中液体吸出，从第二连接部分处将装置断开，把注射器中的液体转移至一新的离心管中，备用。

5.核酸扩增

应用CT和UU PCR扩增试剂，分别扩增提取出的DNA，具体反应如下：

CT/UU扩增反应液    10微升

提取DNA溶液        4微升

ddH₂O              6微升

                            

总体积为20微升

反应程序：95℃，5分钟

72℃，5分钟

95℃，5分钟

6.结果检测

扩增产物应用核酸检测试纸条进行检测，结果如附图2和附图3。

从附图2和3的结果可以看出，不同病原体拷贝数的样品经过滤式样品处理装置处理后，检测结果均为阳性。

注：10⁶、10⁵、10⁴分别为处理样本的病原体的实际拷贝数(/ml)

实施例3

血清样本处理及HBV DNA的提取

1.裂解

取HBV血清样本100ul(冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀10秒钟)，加入等量DNA提取液，充分混匀，沸水浴10分钟，然后冷却至室温；

2.DNA提取

将过滤式样品处理装置的尖口吸管深入到上述煮沸过的离心管胶状物中，吸出液体且尽量吸净，从第二连接部分处将装置断开，把注射器中的液体转移至一新的离心管中，备用。

3.核酸扩增

应用HBV恒稳扩增试剂，扩增提取出的HBV DNA，具体反应如下：

HBV扩增反应液    10微升

提取DNA溶液      2微升

ddH₂O            8微升

                      

总体积为20微升

反应温度及时间：60℃，40分钟

4.结果检测

扩增产物应用核酸检测试纸条进行检测，结果如附图4。从附图4的结果可以看出，不同病原体拷贝数的样品经过滤式样品处理装置处理后，检测结果均为阳性。

注：10⁶、10⁵、10⁴分别为处理血清样本中病毒颗粒的实际拷贝数(/ml)

Claims (14)

1、过滤式微量核酸临床样品快速处理方法，其包括以下步骤：

(a)用抽吸装置抽吸临床微量核酸生物样品，样品经过滤器过滤后，临床生物样品中颗粒成分，包括：宿主细胞、细菌、细胞内的病毒和临床生物样品中其它杂质，由于过滤器中过滤膜的物理阻挡而被留在过滤膜上，滤液则不含有颗粒成分的废液，达到固液分离的作用；

(b)用抽吸装置抽吸生理盐水，清洗过滤膜上的颗粒成分，放弃滤液，完成了临床样品中细胞和颗粒成分的富集和清洗；

(c)分离抽吸装置和过滤器，用抽吸装置抽吸裂解液，连接过滤器后冲洗在滤膜上的细胞和颗粒成分进入单独的容器，使得洗脱细胞在与细胞裂解液混合后裂解，得到混合液；

(d)用抽吸装置抽吸裂解后的混合液，经过过滤器的过滤，将细胞裂解后的细胞碎片和杂质被留在过滤膜上而得到不含有其他杂质的核酸水溶液，用于核酸扩增。

2、根据权利要求1的方法，其中所述核酸为DNA或RNA。

3、根据权利要求1的方法，其中所述的抽吸装置为注射器。

4、根据权利要求1或3的方法，其中所述的过滤器为针头式过滤器。

5、根据权利要求4的方法，其中所述过滤膜选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜、混合纤维膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚四氟乙烯膜或聚醚砜膜。

6、根据权利要求5的方法，其中所述过滤膜的孔径为0.2-5.0微米。

7、根据权利要求5的方法，其中所述针头式过滤器选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器。

8、根据权利要求7的方法，其中所述针头式过滤器选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器；其中所述过滤膜孔径为0.2-5.0微米；其中所述注射器为普通临床用一次性塑料注射器。

9、用于实施权利要求1-8的任何一项方法的过滤式微量核酸临床样品快速处理试剂盒，其包括针头式过滤器(2)、注射器(3)和细胞裂解液。

10、根据权利要求9的试剂盒，其中所述注射器为普通临床用一次性塑料注射器。

11、根据权利要求9的试剂盒，其中所述针头式过滤器(2)选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜、混合纤维膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚四氟乙烯膜或聚醚砜膜针头式过滤器。

12、根据权利要求11的试剂盒，其中所述述针头式过滤器(2)选自尼龙膜针头式过滤器或混合纤维膜针头式过滤器。

13、根据权利要求9-11的任何一项的试剂盒，其中所述针头式过滤器滤膜孔径为0.2-5.0微米；

14、根据权利要求9-13中任一项所述的试剂盒在传染病病原体、宿主或病原体基因突变和单核苷酸多态性检测中的用途。

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